靶向B‑细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其用途的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2014年12月5日提交的序列号为62/088,309的美国临时专利申请的优先权，在此将其全部内容引入本文以供参考，并要求其优先权。

本发明公开的主题提供用于治疗癌症的方法和组合物。其涉及特异性靶向b-细胞成熟抗原(bcma)的嵌合抗原受体(car)、包括该car的免疫应答细胞以及使用这些细胞用于治疗癌症(例如，多发性骨髓瘤)的方法。

背景技术：

基于细胞的免疫疗法是对癌症治疗具有治疗潜力的疗法。t细胞和其它免疫细胞可以通过引入编码针对抗原的人工或合成受体的遗传物质被修饰为靶向肿瘤抗原，所述受体称为嵌合抗原受体(car)，其对所选择的抗原具有特异性。使用car的靶向t细胞疗法已经显示最近在治疗恶性血液病中获得临床成功。

多发性骨髓瘤(mm)是第二常见的恶性血液病⁸。大约25％的患者具有高风险细胞遗传学，这预示着中位生存期小于2年^9,10。尽管最近取得进展，且不论细胞遗传学，在同种异体移植的移植物抗骨髓瘤(gvm)效应以外，该疾病仍被视为是不能治愈的。但是，同种异体移植受不适格(ineligibility)及移植相关的高致病率和高死亡率所限¹¹。与gvm效应类似，通过自体过继(adoptive)t细胞疗法，可能治愈的t细胞效应可以通过最小的毒性实现。

骨髓瘤可以是检验过继t细胞疗法的理想病症。首先，如上文所示，同种异体移植表明即使用最少的或无伴行的化疗例如在非清髓性移植或移植后供体淋巴细胞输注之后，t细胞也可以是治愈性治疗方式。第二，可能通过消耗调节性t细胞(tregs)而进行的调节化疗提高了过继t细胞疗法的效力^4,12，这样，刚完成自体移植后的期间可以是给予t细胞的最佳时间，骨髓瘤是为数不多的自体干细胞移植是标准治疗的疾病之一。第三，免疫调节药物来那度胺(lenalidomide)可以改善基于car的疗法，如已在小鼠中所示¹³，来那度胺常用于治疗mm。第四，当与实体瘤或髓外cll相比⁴，过继t细胞疗法在骨髓为主的疾病例如all中作用最好^6,7，与all类似，骨髓瘤是骨髓的疾病。

尽管有各种原因预计过继t细胞疗法可以在mm中作用良好，但将过继t细胞疗法扩展至骨髓瘤仍面临独特的挑战。与其他b细胞恶性肿瘤不类似，仅在2％的骨髓瘤患者中观察到cd19的表达¹⁴。而且，与cd19不类似，骨髓瘤中常见的细胞外免疫表型标志物(cd138、cd38和cd56)均在其他的基本的细胞类型中得以共表达，我们预料针对任何这些靶标的car将导致不能接受的“脱肿瘤/在靶(offtumor,ontarget)”毒性⁶，这即使在抗体良好耐受的靶标中也是致命的，靶向her2的car既是如此¹⁵。因此，需要有新的治疗策略以设计针对在mm细胞中高度表达而在正常组织中限制性表达的抗原的car用于治疗多发性骨髓瘤，该策略能够以最小的毒性和免疫原性诱导有效的肿瘤根除。

技术实现要素：

本发明公开的主题通常提供与b-细胞成熟抗原(bcma)特异性结合的嵌合抗原受体(car)、包括该car的免疫应答细胞以及这些car和免疫应答细胞用于治疗多发性骨髓瘤的用途。

本发明公开的主题提供car。在一非限定性实施例中，car包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外抗原结合结构域是与b细胞成熟抗原(bmca)特异性结合的人单链可变片段(scfv)。在某些实施方式中，人scfv以大约1x10^-9m至大约3x10^-6m的结合亲和力(kd)与bmca特异性结合。在某些实施方式中，人scfv以大约1x10^-9m至大约1x10^-8m的结合亲和力(kd)与bcma特异性结合。

在某些实施方式中，人scfv包括：包括与选自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的氨基酸序列的同源性为至少大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％或大约99％的氨基酸序列的重链可变区。

在某些实施方式中，人scfv包括：包括与选自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的氨基酸序列的同源性为至少大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％或大约99％的氨基酸序列的轻链可变区。

在某些实施方式中，人scfv包括：(a)包括与选自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的氨基酸序列的同源性为至少大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％或大约99％的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包括与选自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的氨基酸序列的同源性为至少大约80％、大约81％、大约82％、大约83％、大约84％、大约85％、大约86％、大约87％、大约88％、大约89％、大约90％、大约91％、大约92％、大约93％、大约94％、大约95％、大约96％、大约97％、大约98％或大约99％的氨基酸序列的轻链可变区。

在某些实施方式中，人scfv包括：包括选自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的氨基酸序列及其保守修饰的重链可变区。

在某些实施方式中，人scfv包括：包括选自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的氨基酸序列及其保守修饰的轻链可变区。

在某些实施方式中，人scfv包括：(a)包括选自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的氨基酸序列及其保守修饰的重链可变区；和(b)包括选自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的氨基酸序列及其保守修饰的轻链可变区。

在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有选自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的序列的氨基酸的重链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有选自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的序列的氨基酸的轻链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的重链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的重链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的重链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的重链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的重链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的轻链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的轻链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的轻链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的轻链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的轻链可变区。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：(a)包括具有seqidno:1所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:2所示序列的氨基酸的轻链可变区；(b)包括具有seqidno:5所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:6所示序列的氨基酸的轻链可变区；(c)包括具有seqidno:9所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:10所示序列的氨基酸的轻链可变区；(d)包括具有seqidno:13所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:14所示序列的氨基酸的轻链可变区；(e)包括具有seqidno:17所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:18所示序列的氨基酸的轻链可变区；(f)包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的轻链可变区；(g)包括具有seqidno:25所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:26所示序列的氨基酸的轻链可变区；(h)包括具有seqidno:29所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:30所示序列的氨基酸的轻链可变区；(i)包括具有seqidno:33所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:34所示序列的氨基酸的轻链可变区；(j)包括具有seqidno:37所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:38所示序列的氨基酸的轻链可变区；(k)包括具有seqidno:41所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:42所示序列的氨基酸的轻链可变区；(l)包括具有seqidno:45所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:46所示序列的氨基酸的轻链可变区；(m)包括具有seqidno:49所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:50所示序列的氨基酸的轻链可变区；(n)包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的轻链可变区；(o)包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的轻链可变区；(p)包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的轻链可变区；或(q)包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的重链可变区，和包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的轻链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的重链可变区；和包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的轻链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的重链可变区；和包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的轻链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的重链可变区；和包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的轻链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的重链可变区；和包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的轻链可变区。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的重链可变区；和包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的轻链可变区。

在某些非限定性实施方式中，人scfv包括所述重链和轻链二者，任选地具有接头(linker)序列，例如，在重链可变区和轻链可变区之间具有接头肽。例如，在某些非限定性实施方式中，人scfv包括(i)包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的重链可变区和(ii)包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的轻链可变区，任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头肽。在某些实施方式中，人scfv包括(i)包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的重链可变区和(ii)包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的轻链可变区，任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头肽。在某些实施方式中，人scfv包括(i)包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的重链可变区和(ii)包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的轻链可变区，任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头肽。在某些实施方式中，人scfv包括(i)包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的重链可变区和(ii)包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的轻链可变区，任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头肽。在某些实施方式中，人scfv包括(i)包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的重链可变区和(ii)包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的轻链可变区，任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头肽。

在某些实施方式中，人scfv包括：(a)包括选自seqidno:91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181和187的氨基酸序列的重链可变区cdr3；和(b)包括选自seqidno:94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184和190的氨基酸序列的轻链可变区cdr3。

在某些实施方式中，人scfv包括：(a)包括选自seqidno:90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180和186的氨基酸序列及其保守修饰的重链可变区cdr2；和(b)包括选自seqidno:93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183和189的氨基酸序列及其保守修饰的轻链可变区cdr2。

在某些实施方式中，人scfv包括：(a)包括选自seqidno:89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179和185的氨基酸序列及其保守修饰的重链可变区cdr1；和(b)包括选自seqidno:92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182和188的氨基酸序列及其保守修饰的轻链可变区cdr1。在某些实施方式中，人scfv包括：(a)包括选自seqidno:89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179和185的氨基酸序列的重链可变区cdr1；(b)包括选自seqidno:90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180和186的氨基酸序列的重链可变区cdr2；(c)包括选自seqidno:91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181和187的氨基酸序列的重链可变区cdr3；(d)包括选自seqidno:92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182和188的氨基酸序列的轻链可变区cdr1；(e)包括选自seqidno:93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183和189的氨基酸序列的轻链可变区cdr2；和(f)包括选自seqidno:94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184和190的氨基酸序列的轻链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：(a)包括具有seqidno:89所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:90所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:91所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(b)包括具有seqidno:95所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:96所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:97所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(c)包括具有seqidno:101所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:102所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:103所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(d)包括具有seqidno:107所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:108所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:109所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(e)包括具有seqidno:113所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:114所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:115所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(f)包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(g)包括具有seqidno:125所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:126所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:127所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(h)包括具有seqidno:131所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:132所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:133所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(i)包括具有seqidno:137所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:138所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:139所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(j)包括具有seqidno:143所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:144所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:145所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(k)包括具有seqidno:149所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:150所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:151所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(l)包括具有seqidno:155所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:156所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:157所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(m)包括具有seqidno:161所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:162所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:163所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(n)包括具有seqidno:167所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:168所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:169所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(o)包括具有seqidno:173所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:174所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:175所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；(p)包括具有seqidno:179所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:180所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:181所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3；或(q)包括具有seqidno:185所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:186所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:187所示序列的氨基酸或其保守修饰的重链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:167所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:168所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:169所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:173所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:174所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:175所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:179所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:180所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:181所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:185所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:186所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；和包括具有seqidno:187所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3。

在某些实施方式中，人scfv包括：(a)包括具有seqidno:92所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:93所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:94所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(b)包括具有seqidno:98所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:99所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:100所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(c)包括具有seqidno:104所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:105所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:106所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(d)包括具有seqidno:110所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:111所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:112所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(e)包括具有seqidno:116所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:117所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:118所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(f)包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(g)包括具有seqidno:128所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:129所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:130所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(h)包括具有seqidno:134所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:135所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:136所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(i)包括具有seqidno:140所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:141所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:142所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(j)包括具有seqidno:146所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:147所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:148所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(k)包括具有seqidno:152所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:153所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:154所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(l)包括具有seqidno:158所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:159所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:160所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(m)包括具有seqidno:164所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:165所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:166所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(n)包括具有seqidno:170所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:171所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:172所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(o)包括具有seqidno:176所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:177所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:178所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；(p)包括具有seqidno:182所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:183所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:184所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3；或(q)包括具有seqidno:188所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:189所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:190所示序列的氨基酸或其保守修饰的轻链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:170所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:171所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:172所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:176所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:177所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:178所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:182所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:183所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:184所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:188所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:189所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:190所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3。

在某些实施方式中，人scfv包括：(a)包括具有seqidno:89所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:90所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:91所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:92所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:93所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:94所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(b)包括具有seqidno:95所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:96所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:97所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:98所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:99所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:100所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(c)包括具有seqidno:101所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:102所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:103所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:104所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:105所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:106所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(d)包括具有seqidno:107所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:108所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:109所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:110所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:111所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:112所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(e)包括具有seqidno:113所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:114所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:115所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:116所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:117所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:118所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(f)包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(g)包括具有seqidno:125所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:126所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:127所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:128所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:129所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:130所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(h)包括具有seqidno:131所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:132所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:133所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:134所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:135所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:136所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(i)包括具有seqidno:137所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:138所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:139所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:140所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:141所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:142所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(j)包括具有seqidno:143所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:144所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:145所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:146所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:147所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:148所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(k)包括具有seqidno:149所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:150所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:151所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:152所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:153所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:154所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(l)包括具有seqidno:155所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:156所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:157所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:158所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:159所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:160所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(m)包括具有seqidno:161所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:162所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:163所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:164所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:165所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:166所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(n)包括具有seqidno:167所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:168所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:169所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:170所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:171所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:172所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(o)包括具有seqidno:173所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:174所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:175所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:176所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:177所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:178所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；(p)包括具有seqidno:179所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:180所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:181所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:182所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:183所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:184所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3；或(q)包括具有seqidno:185所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:186所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:187所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:188所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:189所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:190所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:167所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:168所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:169所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:170所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:171所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:172所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:173所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:174所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:175所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:176所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:177所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:178所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:179所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:180所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:181所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:182所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:183所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:184所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3。在某些实施方式中，人scfv包括：包括具有seqidno:185所示序列的氨基酸的重链可变区cdr1；包括具有seqidno:186所示序列的氨基酸的重链可变区cdr2；包括具有seqidno:187所示序列的氨基酸的重链可变区cdr3；包括具有seqidno:188所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr1；包括具有seqidno:189所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr2；和包括具有seqidno:190所示序列的氨基酸的轻链可变区cdr3。

在某些实施方式中，bcma包括seqidno:71所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，人scfv与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合。在某些实施方式中，与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合的人scfv包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的vl。在某些实施方式中，与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合的人scfv包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸的vlcdr3。

根据本发明公开的主题，细胞外抗原结合结构域与跨膜结构域共价连接。细胞外抗原结合结构域可以包括与细胞外抗原结合结构域的5’端共价连接的信号肽。在某些实施方式中，car的跨膜结构域包括cd8多肽、cd28多肽、cd3ζ多肽、cd4多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、ctla-4多肽、pd-1多肽、lag-3多肽、2b4多肽、btla多肽、合成肽(非基于与免疫应答有关的蛋白质)或其组合。在某些实施方式中，跨膜结构域包括cd8多肽。在某些实施方式中，跨膜结构域包括cd28多肽。

根据本发明公开的主题，细胞内结构域包括cd3ζ多肽。在某些实施方式中，细胞内结构域还包括至少一个信号区。在某些实施方式中，至少一个信号区包括cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽、pd-1多肽、ctla-4多肽、lag-3多肽、2b4多肽、btla多肽、合成肽(非基于与免疫应答有关的蛋白质)或其组合。在某些实施方式中，信号区是共刺激信号区。在某些实施方式中，共刺激信号区包括cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽或其组合。在某些实施方式中，至少一个共刺激信号区包括cd28多肽。在某些实施方式中，至少一个共刺激信号区包括4-1bb多肽。在一具体的非限定性实施方式中，跨膜结构域包括cd28多肽，细胞内结构域包括cd3ζ多肽，至少一个信号结构域包括cd28多肽。

在某些实施方式中，car被重组表达。car可以由载体表达。在某些实施方式中，载体是γ-逆转录病毒载体。

本发明公开的主题还提供分离的包括上述的car的免疫应答细胞。在某些实施方式中，分离的免疫应答细胞用car转导，例如，car在免疫应答细胞的表面上被组成性地表达。在某些实施方式中，分离的免疫应答细胞进一步用至少一种共刺激配体转导，使得免疫应答细胞表达至少一种共刺激配体。在某些实施方式中，至少一种共刺激配体选自4-1bbl、cd80、cd86、cd70、ox40l、cd48、tnfrsf14及其组合。在某些实施方式中，分离的免疫应答细胞进一步用至少一种细胞因子转导，使得免疫应答细胞分泌至少一种细胞因子。在某些实施方式中，至少一种细胞因子选自il-2、il-3、il-6、il-7、il-11、il-12、il-15、il-17、il-21及其组合。在某些实施方式中，分离的免疫应答细胞选自t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞、人胚胎干细胞、淋巴祖细胞、t细胞-前体细胞和可以由其分化出淋巴细胞的多能干细胞。在某些实施方式中，免疫应答细胞是t细胞。

本发明公开的主题进一步提供编码本发明公开的car的核酸分子、包括该核酸分子的载体以及表达该核酸分子的宿主细胞。在某些实施方式中，核酸分子包括具有seqidno:207所示序列的核酸。在某些实施方式中，核酸分子包括具有seqidno:208所示序列的核酸。在某些实施方式中，核酸分子包括具有seqidno:209所示序列的核酸。在某些实施方式中，核酸分子包括具有seqidno:229所示序列的核酸。在某些实施方式中，核酸分子包括具有seqidno:230所示序列的核酸。在某些实施方式中，核酸分子包括具有seqidno:231所示序列的核酸。在某些实施方式中，核酸分子包括具有seqidno:232所示序列的核酸。在某些实施方式中，核酸分子包括具有seqidno:233所示序列的核酸。在某些实施方式中，核酸分子包括具有seqidno:234所示序列的核酸。在某些实施方式中，核酸分子包括具有seqidno:235所示序列的核酸。在某些实施方式中，载体是γ-逆转录病毒载体。在某些实施方式中，宿主细胞是t细胞。

而且，本发明公开的主题提供使用上述免疫应答细胞降低受试者的肿瘤负荷的方法。例如，本发明公开的主题提供降低受试者的肿瘤负荷的方法，其中该方法包括将有效量的本发明公开的免疫应答细胞给予受试者，从而诱导受试者的肿瘤细胞死亡。在某些实施方式中，该方法降低肿瘤细胞的数量。在另一实施方式中，该方法减小肿瘤的尺寸。在再另一实施方式中，该方法根除受试者的肿瘤。在某些实施方式中，肿瘤选自多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、成胶质细胞瘤和waldenstrom氏巨球蛋白血症。在某些实施方式中，肿瘤是多发性骨髓瘤。在某些实施方式中，受试者是人。在某些实施方式中，免疫应答细胞是t细胞。

而且，本发明公开的主题提供使用上述免疫应答细胞增加或延长具有瘤形成的受试者的生存期的方法。例如，本发明公开的主题提供增加或延长具有瘤形成的受试者的生存期的方法，其中该方法包括将有效量的本发明公开的免疫应答细胞给予受试者，从而增加或延长受试者的生存期。在某些实施方式中，瘤形成选自多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、成胶质细胞瘤和waldenstrom氏巨球蛋白血症。在某些实施方式中，瘤形成是多发性骨髓瘤。在某些实施方式中，该方法降低或根除受试者的肿瘤负荷。

本发明公开的主题还提供产生与bcma结合的免疫应答细胞的方法。在一非限定性实施例中，该方法包括向免疫应答细胞中导入编码包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域的嵌合抗原受体(car)的核酸序列，其中细胞外抗原结合结构域包括与bcma特异性结合的人scfv。

本发明公开的主题进一步提供药物组合物，其包括有效量的本发明公开的免疫应答细胞和药学可接受的赋形剂。在某些实施方式中，药物组合物用于治疗瘤形成。在某些实施方式中，瘤形成选自多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、成胶质细胞瘤和waldenstrom氏巨球蛋白血症。在某些实施方式中，瘤形成是多发性骨髓瘤。

本发明公开的主题进一步提供用于治疗瘤形成的药盒，其包括本发明公开的免疫应答细胞。在某些实施方式中，药盒还包括用于使用免疫应答细胞治疗瘤形成的书面说明书。在某些实施方式中，瘤形成选自多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、成胶质细胞瘤和waldenstrom氏巨球蛋白血症。在某些实施方式中，瘤形成是多发性骨髓瘤。

附图说明

以下可以结合附图理解以举例方式给出的具体实施方式，但无意于将本发明限定为所描述的具体的实施方式。

图1表示根据本发明公开主题的一个非限定性实施方式的靶向bcma的嵌合抗原受体。

图2显示正常组织和人癌细胞系中的人bcma表达。

图3显示本发明公开的bcmacar在人t细胞上的表达。

图4显示靶向人bcma的人scfv与小鼠bcma的交叉反应活性。

图5显示本发明公开的bcma对于过量表达bcma的3t3细胞的杀伤活性。

图6显示本发明公开的bcma对于人多发性骨髓瘤细胞系的杀伤活性。

图7表示根据本发明公开主题的一个非限定性实施方式的靶向bcma的嵌合抗原受体。

图8显示根据本发明公开主题的一个非限定性实施方式的编码靶向bcma的car的核酸分子。

图9显示根据本发明公开主题的一个非限定性实施方式的编码靶向bcma的car的核酸分子。

图10显示根据本发明公开主题的一个非限定性实施方式的编码靶向bcma的car的核酸分子。

图11显示根据本发明公开主题的一个非限定性实施方式的编码靶向bcma的car的核酸分子。

图12显示根据本发明公开主题的一个非限定性实施方式的编码靶向bcma的car的核酸分子。

图13显示靶向bcma的cart细胞对于人多发性骨髓瘤细胞系的细胞毒性。

图14显示靶向bcma的cart细胞的细胞因子分泌的诱导。

图15显示靶向bcma的cart细胞的抗肿瘤活性。

图16a和16b显示靶向bcma的cart细胞的杀伤活性。(a)表示时间0时gfp⁺肿瘤系的百分比。(b)表示时间36小时时杀伤gfp⁺肿瘤系的百分比。

图17描述et140-3的表位定位。

图18描述et140-24的表位定位。

图19描述et140-54的表位定位。

图20描述et140-3、et140-24和et140-54的表位定位。

图21描述et140-3、et140-24、et140-37、et140-40和et140-54的elisa筛选数据。

图22描述et140-3、et140-24、et140-37、et140-40和et140-54的fcas筛选数据。

具体实施方式

本发明公开的主题通常提供靶向bcma的嵌合抗原受体(car)。在一非限定性实例中，car包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外抗原结合结构域与bcma特异性结合。本发明公开的主题还提供表达靶向bcma的car的免疫应答细胞(例如，t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞、人胚胎干细胞和可由其分化出淋巴样细胞的多能干细胞)，以及使用这些免疫应答细胞治疗肿瘤例如多发性骨髓瘤的方法。

i.定义

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考文献为本领域技术人员提供本发明中使用的许多术语的一般定义：singleton等，dictionaryofmicrobiologyandmolecularbiology(第二版，1994)；thecambridgedictionaryofscienceandtechnology(walker编，1988)；theglossaryofgenetics，第五版，r.rieger等(编)，springerverlag(1991)；和hale&marham，theharpercollinsdictionaryofbiology(1991)。除非另有说明，本文使用的以下术语具有下文给出的含义。

本文使用的术语“约”或“大约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于如何测量或确定该值，即测量系统的局限性。例如，根据本领域的惯例，“约”可以指在3个或多于3个标准偏差的范围内。或者，“约”可以表示给定值的高达20％、优选高达10％、更优选高达5％、再更优选高达1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可以表示在数值的一个数量级内、优选在5倍以内、更优选在2倍以内。

本文使用的术语“细胞群体”是指表达相似或不同表型的至少两种细胞的组。在非限定性实例中，细胞群体可以包括至少约10个、至少约100个、至少约200个、至少约300个、至少约400个、至少约500个、至少约600个、至少约700个、至少约800个、至少约900个、至少约1000个表达相似或不同表型的细胞。

本文使用的术语“抗体”不仅指完整的抗体分子，而且指保留免疫原结合能力的抗体分子片段。此类片段在本领域中也是众所周知的，并且在体外和体内常规使用。因此，本文使用的术语“抗体”不仅指完整的免疫球蛋白分子，而且指众所周知的活性片段f(ab')2和fab。缺少完整抗体的fc片段的f(ab')2和fab片段，更快地从循环中清除，并且可能具有更少的完整抗体的非特异性组织结合(wahl等，j.nucl.med.24：316～325(1983))。本发明的抗体包括完整天然抗体、双特异性抗体；嵌合抗体；fab、fab’、单链v区片段(scfv)、融合多肽和非常规抗体。

本文使用的术语“单链可变片段”或“scfv”是免疫球蛋白(例如小鼠或人)的重链(vh)和轻链(vl)的可变区的融合蛋白，其共价连接形成vh::vl异源二聚体。重链(vh)和轻链(vl)直接连接或通过肽编码接头(例如，10、15、20、25个氨基酸)连接，该肽编码接头将vh的n-端与vl的c-端连接，或者将vh的c-端与vl的n-端连接。接头通常富含用于柔性的甘氨酸，以及用于溶解性的丝氨酸或苏氨酸。接头可以连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。接头的非限定性的例子公开于以下文献中：shen等,anal.chem.80(6):1910-1917(2008)和wo2014/087010，在此将其内容全文并入作为参考。在某些实施方式中，接头是g4s接头。

在某些非限制性实例中，接头包括具有如下文所提供的seqidno:210所示序列的氨基酸：

ggggsggggsggggs[seqidno:210]。

在某些实施方式中，编码氨基酸序列seqidno:210的核酸序列在下面提供的seqidno:211中给出：

ggtggaggtggatcaggtggaggtggatctggtggaggtggatct[seqidno:211]。

在某些实施方式中，接头包括具有如下提供的seqidno:69中所示序列的氨基酸。

srggggsggggsggggslema[seqidno:69]。

在某些实施方式中，编码氨基酸序列seqidno:69的核酸序列在下面提供的seqidno:70中给出：

tctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgagatggcc[seqidno:70]。

尽管去除了恒定区并引入了接头，scfv蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链fv多肽抗体可以由包括vh-和vl-编码序列的核酸表达，如huston等人所述(proc.nat.acad.sci.usa，85：5879～5883，1988)。还可参见美国专利第5,091,513、5,132,405和4,956,778号；以及美国专利公开第20050196754和20050196754号。具有抑制活性的拮抗性scfv已有描述(参见例如，zhao等，hyrbidoma(larchmt)200827(6)：455～51；peter等，jcachexiasarcopeniamuscle2012年8月12日；shieh等，jimunol2009183(4)：2277～85；giomarelli等，thrombhaemost200797(6)：955～63；fife等，jclininvst2006116(8)：2252～61；brocks等，immunotechnology19973(3)：173～84；moosmayer等，therimmunol19952(10：31～40)。具有刺激活性的激动性scfv已有描述(参见，例如，peter等，jbioichern200325278(38)：36740～7；xie等，natbiotech199715(8)：768～71；ledbetter等，critrevimmunol199717(5-6)：427～55；ho等，biochimbiophysacta20031638(3)：257～66)。

本文使用的“f(ab)”是指结合抗原、但是是单价的并且不具有fc部分的抗体结构的片段，例如，由木瓜蛋白酶消化的抗体产生两个f(ab)片段和一个fc片段(例如，重(h)链恒定区；不结合抗原的fc区)。

本文使用的“f(ab')2”是指由胃蛋白酶消化完整igg抗体产生的抗体片段，其中该片段具有两个抗原结合(ab')(二价)区，其中每个(ab')区包括两条分开的氨基酸链，h链的一部分通过s-s键与轻(l)链连接用于结合抗原，其中h链的剩余部分连接在一起。“f(ab')2”片段可以分裂成两个单独的fab'片段。

本文使用的术语“载体”是指任何遗传元件，例如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒颗粒等，其当关联有适当的控制元件时能够复制，并且其可以将基因序列转移到细胞中。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体和质粒载体。

本文使用的术语“表达载体”是指一种重组核酸序列，即重组dna分子，其含有所需的编码序列和在特定宿主生物体中表达可操作地连接的编码序列所必需的适当的核酸序列。用于在原核生物中表达所必需的核酸序列通常包括启动子、操纵子(可选的)和核糖体结合位点，通常伴有其它序列。已知真核细胞利用启动子、增强子和终止子及聚腺苷酸化信号。

本文使用的术语“cdr”定义为抗体的互补决定区氨基酸序列，其为免疫球蛋白重链和轻链的高变区。参见例如，kabat等人,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,4thu.s.departmentofhealthandhumanservices,nationalinstitutesofhealth(1987)。通常，抗体在可变区中包括三个重链和三个轻链cdr或cdr区。cdr提供了大多数使抗体与抗原或表位结合的接触残基。在某些实施方式中，cdr区利用kabat系统加以界定(kabat,e.a.等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242)。

本文使用的术语“亲和力”(affinity)是指结合强度的量度。不受理论的束缚，亲和力取决于抗体结合位点和抗原决定簇之间的立体化学匹配的紧密程度、它们之间接触区域的大小以及带电和疏水基团的分布。亲和力还包括术语“亲合力”(avidity)，其是指形成可逆复合物后抗原-抗体键的强度。用于计算抗体对抗原的亲和力的方法在本领域是已知的，包括使用结合实验来计算亲和力。功能试验(例如，流式细胞术试验)中的抗体活性也反映抗体亲和力。可以使用功能试验(例如，流式细胞术试验)对抗体和亲和力进行表型鉴定和比较。

可用于本发明方法的核酸分子包括任何编码本发明多肽或其片段的核酸分子。此类核酸分子不需要与内源核酸序列100％相同，但通常表现出基本同一性。与内源序列具有“基本同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”是指在各种严格条件下，在互补多核苷酸序列(例如，本文所述的基因)或其部分之间配对形成双链分子。(参见，例如，wahl，g.m.和s.l.berger(1987)methodsenzymol，152：399；kimmel，a.r.(1987)methodsenzymol，152：507)。

例如，严格的盐浓度通常小于约750mmnacl和75mm柠檬酸三钠，优选小于约500mmnacl和50mm柠檬酸三钠，更优选小于约250mmnacl和25mm柠檬酸三钠。低严格杂交可以在不存在有机溶剂例如甲酰胺的情况下获得，而高严格杂交可以在至少约35％甲酰胺、更优选至少约50％甲酰胺的存在下获得。严格温度条件通常包括至少约30℃、更优选至少约37℃、最优选至少约42℃的温度。改变其它参数，例如杂交时间、洗涤剂例如十二烷基硫酸钠(sds)的浓度、以及载体dna的包含或排除，对本领域技术人员来说是公知的。通过根据需要组合这些不同条件来实现各种严格的水平。在优选的实施方式中，杂交将在30℃在750mmnacl、75mm柠檬酸三钠和1％sds中发生。在更优选的实施方式中，杂交将在37℃在500mmnacl、50mm柠檬酸三钠、1％sds、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精子dna(ssdna)中发生。在最优选的实施方式中，杂交将在42℃在250mmnacl、25mm柠檬酸三钠、1％sds、50％甲酰胺和200μg/mlssdna中发生。这些条件的有用改变对于本领域技术人员将是显而易见的。

对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤也将在严格性上变化。洗涤严格性条件可以通过盐浓度和温度来定义。如上文，可以通过降低盐浓度或通过升高温度来提高洗涤严格性。例如，洗涤步骤的严格的盐浓度优选小于约30mmnacl和3mm柠檬酸三钠，最优选小于约15mmnacl和1.5mm柠檬酸三钠。洗涤步骤的严格温度条件通常包括至少约25℃、更优选至少约42℃、甚至更优选至少约68℃的温度。在优选的实施方式中，洗涤步骤将在25℃在30mmnacl、3mm柠檬酸三钠和0.1％sds中发生。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将在42℃在15mmnacl、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％sds中发生。在更优选的实施方式中，洗涤步骤将在68℃在15mmnacl、1.5mm柠檬酸三钠和0.1％sds中发生。这些条件的其他变化对于本领域技术人员将是显而易见的。杂交技术是本领域技术人员公知的，并且描述于例如benton和davis(science196：180，1977)；grunstein和rogness(proc.natl.acad.sci.，usa72：3961，1975)；ausubel等(currentprotocolsinmolecularbiology，wileyinterscience，newyork，2001)；berger和kimmel(guidetomolecularcloningtechniques，1987，academicpress，newyork)；和sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratorypress，newyork。

“基本同一性”是指与参照氨基酸序列(例如，本文所述的任何一种氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文所述的任何一种核酸序列)表现出至少50％同一性的多肽或核酸分子。优选地，此类序列在氨基酸水平或核酸水平上与用于比较的序列的同一性为至少60％，更优选80％或85％，更优选90％、95％或甚至99％相同。

序列同一性通常使用序列分析软件(例如，sequenceanalysissoftwarepackageofthegeneticscomputergroup，universityofwisconsinbiotechnologycenter，1710universityavenue，madison，wis.53705、blast、bestfit、gap或pileup/prettybox程序)测量。此类软件通过对各种取代、缺失和/或其它修饰指定同源性程度来匹配相同或相似的序列。在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，e-3和e-100之间的概率得分表示密切相关的序列。

本文使用的术语“类似物”是指结构相关的多肽或核酸分子，其具有参照多肽或核酸分子的功能。

本文使用的术语“配体”是指结合受体的分子。具体地，配体结合另一个细胞上的受体，使细胞-细胞识别和/或相互作用。

本文使用的术语“疾病”是指破坏或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何病症或障碍。疾病的实例包括瘤形成或细胞的病原体感染。

本文使用的术语“有效量”是指足以具有治疗效果的量。在某些实施方式中，“有效量”是足以阻止、改善或抑制瘤形成的持续增殖、生长或转移(例如，侵袭或迁移)的量。

本文使用的术语“异源性核酸分子或多肽”是指在正常情况下不存在于细胞或获自细胞的样品中的核酸分子(例如cdna、dna或rna分子)或多肽。该核酸可以来自另一有机体，或者其可以是，例如，在细胞或样品中通常不表达的mrna分子。

如本文所用，术语“免疫应答细胞”是指在免疫应答中发挥功能的细胞或其祖细胞或子代。

如本文所用，术语“调节”是指正向或负向地改变。示例性调节包括约1％、约2％、约5％、约10％、约25％、约50％、约75％或约100％的变化。

如本文所用，术语“增加”是指正向地改变至少约5％，包括但不限于正向地改变约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％、或约100％。

如本文所用，术语“减少”是指负向地改变至少约5％，包括但不限于负向地改变约5％、约10％、约25％、约30％、约50％、约75％或约100％。

如本文所用，术语“分离的细胞”是指与天然地伴随细胞的分子和/或细胞组分分离的细胞。

如本文所用，术语“分离的”、“纯化的”或“生物纯的”是指材料不同程度地不含在其天然状态下发现的通常伴随其的组分。“分离”表示与原始来源或环境的分开程度。“纯化”表示比分离更高的分开程度。“纯化的”或“生物纯的”蛋白质充分地不含其它物质，使得没有任何杂质对蛋白质的生物特性产生实质影响或引起其他不利后果。也就是说，如果本发明的核酸或肽在通过重组dna技术产生时基本上不含细胞物质、病毒物质或培养基，或化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品，则其是纯化的。纯度和均一性通常使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法测定。术语“纯化的”可以表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生基本上一条带。对于可以进行修饰例如磷酸化或糖基化的蛋白质，不同的修饰可以产生不同的分离蛋白，其可以分别纯化。

如本文所用，“分泌的”是指多肽通过内质网、高尔基体经由分泌通路从细胞中释放，以及作为暂时融合在细胞质膜处并将蛋白质释放到细胞外部的囊泡而释放。

如本文所用，术语“特异性结合”或“特异性与…结合”或“特异性靶向”是指多肽或其片段识别并结合所关注的生物分子(例如多肽)，但基本上不识别并结合样品中的其他分子，例如天然地包括本发明多肽的生物样品中的其他分子。

如本文所用，术语“治疗(treating、treatment)”是指试图改变所治疗的个体或细胞的疾病进程的临床干预，并且可以用于预防，或在临床病理过程期间进行。治疗的治疗效果包括，但不限于，预防疾病的发生或复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理学后果、防止转移、降低疾病进展的速度、改善或减轻疾病状态、以及缓解或改善预后。通过预防疾病或病症的进展，治疗可以防止受影响或经诊断的受试者或疑似患有该病症的受试者中的病症引起的恶化，而且治疗还可以防止具有该病症风险或疑似患有该病症的受试者中病症的发作或病症症状。

如本文所用，术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，其包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物等(例如，其将是特定治疗的接受者、或从其中收获细胞)。

ii.b细胞成熟抗原(bcma)

bcma是过继t细胞疗法(例如car疗法)的理想靶标，因为bcma参与b细胞分化和信号转导，并且已知在非恶性分化的b细胞和浆细胞上表达。尽管诱导b细胞发育不全可能有风险，cd19car诱导的b细胞发育不全已经显著地耐受良好。一些研究小组已经确认了bcma的多发性骨髓瘤(mm)表面表达，一个研究小组发现它是作为来自新鲜或冷冻的患者骨髓样品中的恶性浆细胞的facs标志物的cd138的替代物，平均相对平均荧光强度(mfi)为9-16(n＝35)^1,2。

在某些非限定性实施方式中，bcma是具有seqidno:71所示氨基酸序列的人bcma或其片段。

seqidno:71提供如下：

mlqmagqcsqneyfdsllhacipcqlrcssntppltcqrycnasvtnsvkgtnailwtclglsliislavfvlmfllrkinseplkdefkntgsgllgmanidleksrtgdeiilprgleytveectcedcikskpkvdsdhcfplpameegatilvttktndyckslpaalsateieksisar[seqidno:71]。

iii.嵌合抗原受体(car)

嵌合抗原受体(car)是工程化的受体，其将感兴趣的特异性移植或赋予到免疫效应细胞。car可以用于通过逆转录病毒载体促进其编码序列的转移将单克隆抗体的特异性移植到t细胞上。

具有三代car。“第一代”car通常由细胞外抗原结合结构域(例如单链可变片段(scfv))与跨膜结构域融合、再与t细胞受体链的胞质/细胞内结构域融合而构成。“第一代”car通常具有来自cd3ζ链的细胞内结构域，其是来自内源性tcr的信号转导的主要传递者。“第一代”car可以提供从头(denovo)的抗原识别，并通过其在单个融合分子中的cd3ζ链信号结构域导致cd4⁺和cd8⁺t细胞的激活，而不依赖于hla介导的抗原递呈。“第二代”car将来自各种共刺激分子(例如cd28、4-1bb、icos、ox40)的细胞内结构域添加到car的胞质尾区，以向t细胞提供额外的信号。“第二代”car包括既提供共刺激(例如cd28或4-1bb)又提供激活(cd3ζ)的那些car。临床前研究表明，“第二代”car可以提高t细胞的抗肿瘤活性。例如，在慢性淋巴细胞白血病(cll)和急性淋巴细胞白血病(all)患者中，靶向cd19分子的临床试验证实了“第二代”car修饰的t细胞的强烈功效。“第三代”car包括提供多种共刺激(例如cd28和4-1bb)和激活(cd3ζ)的那些car。

根据本发明公开的主题，car包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，其中细胞外抗原结合结构域与bcma结合。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是scfv。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是任选地交联的fab。在某些实施方式中，细胞外结合结构域是f(ab)2。在某些实施方式中，任何前述分子均可以包括在具有异源序列的融合蛋白中以形成细胞外抗原结合结构域。在一具体的非限定性实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括与人bcma特异性结合的人scfv。

在某些非限定性实施方式中，car的细胞外抗原结合结构域对bcma具有高结合特异性以及高结合亲和力。例如，在这些实施方式中，car的细胞外抗原结合结构域(例如以人scfv或其类似物实施者)以约3x10^-6m或更低的解离常数(kd)与bcma结合。在某些实施方式中，kd为约1x10^-6m或更低、约1x10^-7m或更低、约1x10^-8m或更低、约1x10^-9m或更低、约1x10^-10m或更低、或者约1x10^-11m或更低。在某些实施方式中，kd为约1x10^-8m或更低。在某些实施方式中，kd为约1x10^-11m至约3x10^-6m，例如约1x10^-11m至约1x10^-10m、约1x10^-10m至约1x10^-9m、约1x10^-9m至约1x10^-8m、约1x10^-8m至约1x10^-7m、或者约1x10^-7m至约1x10^-6m、或者约1x10^-6m至约3x10^-6m。在某些实施方式中，kd为约1x10^-9m至约1x10^-8m。在某些实施方式中，kd为约1x10^-9m至约1.5x10^-9m。在某些实施方式中，kd为约1.2x10^-9m。在某些实施方式中，kd为约4x10^-9m至约5x10^-9m。在某些实施方式中，kd为约5x10^-9m。在某些实施方式中，kd为约4.8x10^-9m。在某些实施方式中，kd为约8x10^-9m至约9x10^-9m。在某些实施方式中，kd为约8x10^-9m。在某些实施方式中，kd为约8.1x10^-9m。

本发明公开的car的细胞外抗原结合结构域(例如以人scfv或其类似物的实施方式)与bcma的结合可以通过例如酶联免疫吸附法(elisa)、放射免疫法(ria)、facs分析、生物检测法(例如，生长抑制)或westernblot检测来确认。这些检测中的每一种通常通过使用对目的复合物具有特异性的标记试剂(例如，抗体或scfv)来检测特定目的蛋白质-抗体复合物的存在。例如，scfv可以被施加放射性标记，并用于放射免疫法(ria)(见例如weintraub，b.，principlesofradioimmunoassays，seventhtrainingcourseonradioligandassaytechniques，theendocrinesociety，march，1986，其引入本文以供参考)。放射性同位素可以通过例如使用γ计数器或闪烁计数器或者通过放射自显影术的方法检测。在某些实施方式中，用荧光标志物标记bcma靶向的细胞外抗原结合结构域。荧光标志物的非限定性实例包括绿色荧光蛋白(gfp)、蓝色荧光蛋白(例如ebfp、ebfp2、azurite和mkalama1)、青色荧光蛋白(例如ecfp、cerulean和cypet)和黄色荧光蛋白(例如yfp、citrine、venus和ypet)。在某些实施方式中，用gfp标记靶向bcma的人scfv。

在某些实施方式中，本发明公开的car的细胞外抗原结合结构域包括单链可变片段(scfv)。在一具体的非限定性实施方式中，本发明公开的car的细胞外抗原结合结构域包括与人bcma特异性结合的人scfv。在某些实施方式中，通过用bcma-fc融合蛋白筛选scfv噬菌体文库来鉴定scfv。

car的细胞外抗原结合结构域

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)包括：包括具有选自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的序列的氨基酸的重链可变区。编码氨基酸序列seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的核酸序列分别为seqidno:3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、51、55、59、63和67。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)包括：包括具有选自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的序列的氨基酸的轻链可变区。编码氨基酸序列seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的核酸序列分别为seqidno:4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52、56、60、64和68。序列seqidno:1-68示于下表1-17中。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域(例如scfv)包括：包括与本文所述并如表1-17所公开的氨基酸序列同源的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区。例如，不加以任何限定，细胞外抗原结合结构域(例如scfv)包括：包括与选自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的氨基酸序列的同源性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的重链可变区。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域(例如scfv)包括：包括与选自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的氨基酸序列的同源性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的轻链可变区。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域(例如scfv)包括：(a)包括与选自seqidno:1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、49、53、57、61和65的氨基酸序列的同源性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的重链可变区；和(b)包括与选自seqidno:2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、50、54、58、62和66的氨基酸序列的同源性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的轻链可变区。

本发明公开的主题进一步提供包括如本文表1-17所公开的重链可变区和轻链可变区cdr例如cdr1、cdr2和cdr3的细胞外抗原结合结构域(例如scfv)。cdr结构域使用kabat系统加以界定(kabat,e.a.等人(1991)sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第5版,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nihpublicationno.91-3242)。本发明公开的主题进一步提供包括本文公开的抗体序列的保守修饰的细胞外抗原结合结构域(例如scfv)。例如，不加以任何限定，本发明公开主题的细胞外抗原结合结构域(例如scfv)包括：包括cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变区和包括cdr1、cdr2和cdr3序列的轻链可变区，其中这些cdr序列中的一个或多个包括本文公开的特定氨基酸序列或其保守修饰，其中细胞外抗原结合结构域保留所需的功能特性。

在某些实施方式中，本发明公开的主题提供一种包括重链可变区的细胞外抗原结合结构域(例如scfv)，其中重链可变区包括：(a)包括选自seqidno:89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179和185的氨基酸序列及其保守修饰的cdr1；(b)包括选自seqidno:90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150、156、162、168、174、180和186的氨基酸序列及其保守修饰的cdr2；和(c)包括选自seqidno:91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181和187的氨基酸序列及其保守修饰的cdr3。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域(例如scfv)包括轻链可变区，其中轻链结构区包括：(a)包括选自seqidno:92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182和188的氨基酸序列及其保守修饰的cdr1；(b)包括选自seqidno:93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183和189的氨基酸序列及其保守修饰的cdr2；和(c)包括选自seqidno:94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184和190的氨基酸序列及其保守修饰的cdr3。

本发明公开的主题提供一种细胞外抗原结合结构域(例如scfv)，其包括：包括cdr1、cdr2和cdr3序列的重链可变区和包括cdr1、cdr2和cdr3序列的轻链可变区，其中：(a)重链可变区cdr3包括选自seqidno:91、97、103、109、115、121、127、133、139、145、151、157、163、169、175、181和187的氨基酸序列及其保守修饰；且(b)轻链可变区cdr3包括选自seqidno:94、100、106、112、118、124、130、136、142、148、154、160、166、172、178、184和190的氨基酸序列及其保守修饰；其中细胞外抗原结合结构域与bcma多肽(例如人bcma多肽)特异性结合。在某些实施方式中，重链可变区cdr2包括选自seqidno:125、131、137、143、149、155、161、167、173、179、185、191、197、203、209、215、221、227、233、239、245、251、257、263、305、317、329、341、353、365、377和389的氨基酸序列及其保守修饰；且(b)轻链可变区cdr2包括选自seqidno:93、99、105、111、117、123、129、135、141、147、153、159、165、171、177、183和189的氨基酸序列及其保守修饰；其中细胞外抗原结合结构域与bcma多肽(例如人bcma多肽)特异性结合。在某些实施方式中。重链可变区cdr1包括选自seqidno:89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149、155、161、167、173、179和185的氨基酸序列及其保守修饰；且(b)轻链可变区cdr1包括选自seqidno:92、98、104、110、116、122、128、134、140、146、152、158、164、170、176、182和188的氨基酸序列及其保守修饰；其中细胞外抗原结合结构域与bcma多肽(例如人bcma多肽)特异性结合。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:72，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-192scfv(也称作“et140-42scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:1所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:2所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表1的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:1所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表1所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：具有seqidno:1所示序列的氨基酸的vh，如表1所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:2所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表1所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:2所示序列的氨基酸的vl，如表1所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:1所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:2所示序列的氨基酸的vl，如表1所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:89所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:90所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:91所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表1所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:92所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:93所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:94所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表1所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:89所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:90所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:91所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:92所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:93所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:94所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表1所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:89所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:90所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:91所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:92所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:93所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:94所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表1

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:73，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-197scfv(也称作“et140-47scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:5所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:6所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表2的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:5所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表2所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:5所示序列的氨基酸的vh，如表2所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:6所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表2所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:6所示序列的氨基酸的vl，如表2所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:5所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:6所示序列的氨基酸的vl，如表2所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:95所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:96所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:97所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表2所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:98所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:99所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:100所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表2所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:95所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:96所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:97所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:98所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:99所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:100所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表2所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:95所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:96所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:97所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:98所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:99所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:100所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表2

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:74，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-180scfv(也称作“et140-30scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:9所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:10所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表3的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:9所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表3所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:9所示序列的氨基酸的vh，如表3所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:10所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表3所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:10所示序列的氨基酸的vl，如表3所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:9所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:10所示序列的氨基酸的vl，如表3所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:101所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:102所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:103所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表3所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:104所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:105所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:106所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表3所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:101所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:102所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:103所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:104所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:105所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:106所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表3所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:101所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:102所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:103所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:104所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:105所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:106所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表3

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:75，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-172scfv(也称作“et140-22scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:13所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:14所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表4的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:13所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表4所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:13所示序列的氨基酸的vh，如表4所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:14所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表4所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:14所示序列的氨基酸的vl，如表4所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:13所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:14所示序列的氨基酸的vl，如表4所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:107所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:108所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:109所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表4所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:110所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:111所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:112所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表4所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:107所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:108所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:109所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:110所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:111所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:112所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表4所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:107所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:108所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:109所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:110所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:111所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:112所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表4

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:76，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-157scfv(也称作“et140-7scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:17所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:18所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表5的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:17所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表5所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:17所示序列的氨基酸的vh，如表5所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:18所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表5所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:18所示序列的氨基酸的vl，如表5所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:17所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:18所示序列的氨基酸的vl，如表5所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:113所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:114所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:115所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表5所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:116所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:117所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:118所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表5所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:113所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:114所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:115所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:116所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:117所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:118所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表5所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:113所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:114所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:115所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:116所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:117所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:118所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表5

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:77，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-153scfv(也称作“et140-3scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表6的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:21所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表6所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的vh，如表6所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:22所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表6所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的vl，如表6所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的vl，如表6所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表6所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表6所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表6所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表6

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:78，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-201scfv(也称作“et140-51scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:25所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:26所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表7的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:25所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表7所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:25所示序列的氨基酸的vh，如表7所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:26所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表7所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:26所示序列的氨基酸的vl，如表7所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:25所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:26所示序列的氨基酸的vl，如表7所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:125所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:126所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:127所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表7所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:128所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:129所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:130所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表7所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:125所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:126所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:127所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:128所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:129所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:130所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表7所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:125所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:126所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:127所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:128所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:129所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:130所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表7

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:79，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-167scfv(也称作“et140-17scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:29所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:30所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表8的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:29所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表8所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:29所示序列的氨基酸的vh，如表8所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:30所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表8所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:30所示序列的氨基酸的vl，如表8所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:29所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:30所示序列的氨基酸的vl，如表8所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:131所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:132所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:133所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表8所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:134所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:135所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:136所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表8所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:131所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:132所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:133所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:134所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:135所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:136所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表8所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:131所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:132所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:133所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:134所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:135所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:136所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表8

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:80，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-163scfv(也称作“et140-13scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:33所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:34所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表9的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:33所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表9所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:33所示序列的氨基酸的vh，如表9所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:34所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表9所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:34所示序列的氨基酸的vl，如表9所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:33所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:34所示序列的氨基酸的vl，如表9所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:137所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:138所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:139所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表9所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:140所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:141所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:142所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表9所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:137所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:138所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:139所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:140所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:141所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:142所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表9所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:137所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:138所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:139所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:140所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:141所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:142所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表9

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:81，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-127scfv(也称作“et140-57scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:37所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:38所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:98所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表10的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:37所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表10所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:37所示序列的氨基酸的vh，如表10所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:38所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表10所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:38所示序列的氨基酸的vl，如表10所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:37所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:38所示序列的氨基酸的vl，如表10所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:143所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:144所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:145所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表10所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:146所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:147所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:148所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表10所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:143所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:144所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:145所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:146所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:147所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:148所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表10所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:143所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:144所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:145所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:146所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:147所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:148所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表10

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:82，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-165scfv(也称作“et140-15scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:41所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:42所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表11的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:41所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表11所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:41所示序列的氨基酸的vh，如表11所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:42所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表11所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:42所示序列的氨基酸的vl，如表11所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:41所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:42所示序列的氨基酸的vl，如表11所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:149所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:150所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:151所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表11所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:152所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:153所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:154所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表11所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:147所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:150所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:151所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:152所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:153所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:154所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表11所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:149所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:150所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:151所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:152所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:153所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:154所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表11

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:83，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-188scfv(也称作“et140-38scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:45所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:46所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表12的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:45所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表12所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:45所示序列的氨基酸的vh，如表12所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:46所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表12所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:46所示序列的氨基酸的vl，如表12所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:45所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:46所示序列的氨基酸的vl，如表12所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:155所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:156所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:157所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表12所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:158所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:159所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:160所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表12所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:155所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:156所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:157所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:158所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:159所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:160所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表12所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:155所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:156所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:157所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:158所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:159所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:160所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表12

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:84，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-196scfv(也称作“et140-46scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:49所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:50所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表13的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:49所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表13所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:49所示序列的氨基酸的vh，如表13所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:50所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表13所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:50所示序列的氨基酸的vl，如表13所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:49所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:50所示序列的氨基酸的vl，如表13所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:161所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:162所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:163所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表13所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:164所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:165所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:166所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表13所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:161所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:162所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:163所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:164所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:165所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:166所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表13所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:161所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:162所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:163所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:164所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:165所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:166所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表13

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:85，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-204scfv(也称作“et140-54scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表14的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:53所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表14所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的vh，如表14所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:54所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表14所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的vl，如表14所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的vl，如表14所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:167所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:168所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:169所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表14所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:170所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:171所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:172所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表14所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:167所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:168所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:169所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:170所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:171所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:172所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表14所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:167所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:168所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:169所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:170所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:171所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:172所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表14

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:86，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-190scfv(也称作“et140-40scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表15的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:57所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表15所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的vh，如表15所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:58所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表15所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的vl，如表15所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的vl，如表15所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:173所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:174所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:175所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表15所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:176所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:177所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:178所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表15所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:173所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:174所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:175所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:176所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:177所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:178所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表15所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:173所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:174所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:175所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:176所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:177所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:178所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表15

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:87，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-187scfv(也称作“et140-37scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表16的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:61所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表16所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的vh，如表16所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:62所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表16所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的vl，如表16所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的vl，如表16所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:179所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:180所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:181所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3，如表16所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:182所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:183所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:184所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表16所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:179所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:180所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:181所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:182所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:183所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:184所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表16所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:179所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:180所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:181所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:182所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:183所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:184所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表16

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括氨基酸序列seqidno:88，并与bcma多肽(例如，具有氨基酸序列seqidno:71的bcma多肽或其片段)特异性结合，其命名为et140-174scfv(也称作“et140-24scfv”)。

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是人scfv，其包括：包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是具有选自表17的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:65所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh，如表17所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的vh，如表17所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括与seqidno:66所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl，如表17所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的vl，如表17所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的vl，如表17所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:185所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:186所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:187所示序列或的氨基酸其保守修饰的vhcdr3，如表17所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:188所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:189所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:190所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表17所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:185所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:186所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:187所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:188所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:189所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:190所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3，如表17所示。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域包括：包括具有seqidno:185所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:186所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:187所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:188所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:189所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:190所示序列的氨基酸的vlcdr3。

表17

包括与上述序列的vh和vl区具有高度(即80％或更高)同源性的vh和/或vl区的细胞外抗原结合结构域(例如scfv)可以通过突变(例如，定点突变或pcr介导的突变)获得，然后使用本文所述的结合试验测试所编码的改变的scfv保留的功能(即结合亲和力)。在某些实施方式中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vh序列相对于参照序列含有取代(例如，产生序列保守修饰的保守取代)、插入或缺失，但是细胞外抗原结构域(例如scfv)包括保持与bcma多肽结合的能力的序列。在某些实施方式中，具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的vl序列相对于参照序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但是细胞外抗原结构域(例如scfv)包括保持与bcma多肽结合的能力的序列。在某些实施方式中，在公开的序列中共计大约1至大约10个氨基酸已被取代、插入和/或缺失。例如，不加以任何限定，vh序列或vl序列可以具有至多大约1个、至多大约2个、至多大约3个、至多大约4个、至多大约5个、至多大约6个、至多大约7个、至多大约8个、至多大约9个或至多大约10个修饰和/或取代的氨基酸残基。保守修饰的非限定性例子提供如下，例如提供于表18。

如本文所用，术语“保守序列修饰”是指不会显著影响或改变包括氨基酸序列的本发明公开的car(例如细胞外抗原结合结构域)的结合特征的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，比如定点突变和pcr介导的突变，将修饰引入到本发明公开主题的人scfv中。可以根据氨基酸的物理化学性质如电荷和极性将氨基酸分组。保守氨基酸取代是其中氨基酸残基被相同组内的氨基酸取代。例如，氨基酸可以通过电荷分类：带正电荷的氨基酸包括赖氨酸、精氨酸、组氨酸，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸、谷氨酸，中性电荷氨基酸包括丙氨酸、天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。此外，氨基酸可以通过极性分类：极性氨基酸包括精氨酸(碱性极性)、天冬酰胺、天冬氨酸(酸性极性)、谷氨酸(酸性极性)、谷氨酰胺、组氨酸(碱性极性)、赖氨酸(碱性极性)、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸；非极性氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸和缬氨酸。因此，cdr区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同组的其他氨基酸残基替换，并且可以使用本文所述的功能试验检测改变的抗体保留的功能(即，以上(c)至(l)中所述的功能)。在某些实施方式中，在特定序列或cdr区内改变不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个残基。示例性保守氨基酸取代示于表18中。

表18

在某些非限定性实施方式中，car的细胞外抗原结合结构域可以包括连接细胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区的接头。本文使用的术语“接头(linker)”是指共价连接两个或多个多肽或核酸使得它们彼此连接的官能团(例如，化学的或多肽)。本文使用的“肽接头”是指用于将两个蛋白偶联在一起(例如，偶联vh和vl结构域)的一个或多个氨基酸。肽接头的非限定性例子公开于shen等人,anal.chem.80(6):1910-1917(2008)和wo2014/087010。

在一非限定性实例中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，编码氨基酸序列seqidno:69的核苷酸序列示于seqidno:70中。在一非限定性实例中，接头包括具有seqidno:210所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，编码氨基酸序列seqidno:98的核苷酸序列示于seqidno:211中。

在某些实施方式中，包括具有seqidno:212所示序列的氨基酸的接头如下文提供：

ggggs[seqidno:212]。

在某些实施方式中，包括具有seqidno:213所示序列的氨基酸的接头如下文提供：

sggsggs[seqidno:213]。

在某些实施方式中，包括具有seqidno:214所示序列的氨基酸的接头如下文提供：

ggggsgggs[seqidno:214]。

在某些实施方式中，包括具有seqidno:215所示序列的氨基酸的接头如下文提供：

ggggsggggs[seqidno:215]。

在某些实施方式中，包括具有seqidno:216所示序列的氨基酸的接头如下文提供：

ggggsggggsgggggggs[seqidno:216]。

在某些实施方式中，包括具有seqidno:217所示序列的氨基酸的接头如下文提供：

ggggsggggsggggsggggs[seqidno:217]。

在某些实施方式中，包括具有seqidno:218所示序列的氨基酸的接头如下文提供：

ggggsggggsggggsggggsggggs[seqidno:218]。

在某些实施方式中，包括具有seqidno:219所示序列的氨基酸的接头如下文提供：

ggggsggggsggggsggggsggggsggggs[seqidno:219]。

在某些实施方式中，包括具有seqidno:220所示序列的氨基酸的接头如下文提供：

ggggsggggsggggsggggsggggsggggsggggs[seqidno:220]。

在某些实施方式中，包括具有seqidno:220所示序列的氨基酸的接头如下文提供：

epkscdkthtcppcp[seqidno:220]。

在某些实施方式中，包括具有seqidno:221所示序列的氨基酸的接头如下文提供：

ggggsgggsepkscdkthtcppcp[seqidno:222]。

在某些实施方式中，包括具有seqidno:223所示序列的氨基酸的接头如下文提供：

elktplgdtthtcprcpepkscdtpppcprcpepkscdtpppcprcpepkscdtpppcprcp[seqidno:223]。

在某些实施方式中，包括具有seqidno:224所示序列的氨基酸的接头如下文提供：

gsgsgs[seqidno:224]。

在某些实施方式中，包括具有seqidno:225所示序列的氨基酸的接头如下文提供：

aaa[seqidno:225]。

此外，细胞外抗原结合结构域可以包括将新生蛋白质导入内质网的前导序列或信号肽。如果car要被糖基化并锚定在细胞膜中，信号肽或前导序列可能是必需的。信号序列或前导序列可以是存在于新合成的蛋白质n-端的肽序列(长度约5、约10、约15、约20、约25或约30个氨基酸)，其引导新合成的蛋白质进入分泌通路。在非限定性实例中，信号肽与细胞外抗原结合结构域的5’端共价连接。在某些实施方式中，信号肽包含cd8多肽，其包括具有如下文所提供的seqidno:191所示序列的氨基酸。

malpvtalllplalllhaar[seqidno:191]。

编码氨基酸序列seqidno:191的核苷酸序列如下文所提供的seqidno:192所示：

atggctctcccagtgactgccctactgcttcccctagcgcttctcctgcatgcagctcgt[seqidno:192]

在另一实施方式中，信号肽包括具有如下文所提供的seqidno:205所示序列的氨基酸。

metdtlllwvlllwvpgstg[seqidno:205]

编码氨基酸序列seqidno:205的核苷酸序列如下文所提供的seqidno:206所示：

atggaaaccgacaccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccaggatccacagga[seqidno:206]

在某些实施方式中，人scfv包括重链可变区、轻链可变区、重链可变区和轻链可变区之间的接头肽、以及his-标签和ha-标签。在某些实施方式中，his-标签和ha-标签的氨基酸序列包括如下文提供的氨基酸序列seqidno:275：

tsgqagqhhhhhhgaypydvpdyas[seqidno:275]

编码seqidno:275的核苷酸序列是下文提供的seqidno:276：

actagtggccaggccggccagcaccatcaccatcaccatggcgcatacccgtacgacgttccggactacgcttct[seqidno:276]

在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)与包括seqidno:71所示氨基酸序列的人bcma多肽结合。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)与seqidno:71所示氨基酸序列的一个或多个部分结合。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)与选自seqidno:71的氨基酸8-22、9-23、10-24、11-25、12-26、13-27、14-28和8-28的1、2、3、4、5、6或7个表位区结合。在某些实施方式中，与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合的细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:9所示序列的氨基酸的重链可变区和包括具有seqidno:10所示序列的氨基酸的轻链可变区，其任选地在重链可变区和轻链可变区之间具有(iii)接头序列，例如接头多肽。在某些实施方式中，接头包括具有seqidno:69所示序列的氨基酸。在某些实施方式中，与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合的细胞外抗原结合结构域是具有选自表6的vh和vl区或cdr的人scfv。在某些实施方式中，与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合的细胞外抗原结合结构域是具有选自表6的vh和vl区或cdr的人scfv-fc融合蛋白或全长人igg。在某些实施方式中，与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合的细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)包括：包括与seqidno:21所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vh。在某些实施方式中，与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合的细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的vh。在某些实施方式中，与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合的细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)包括：包括与seqidno:22所示氨基酸序列的同一性为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列的vl。在某些实施方式中，与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合的细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的vl。在某些实施方式中，与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合的细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的vh和包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的vl。在某些实施方式中，与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合的细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、和包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3。在某些实施方式中，与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合的细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3。在某些实施方式中，与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合的细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr1、包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr2、包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸或其保守修饰的vhcdr3、包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr1、包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr2、和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸或其保守修饰的vlcdr3。在某些实施方式中，与包括seqidno:71的氨基酸14-22的表位区结合的细胞外抗原结合结构域(例如人scfv)包括：包括具有seqidno:119所示序列的氨基酸的vhcdr1、包括具有seqidno:120所示序列的氨基酸的vhcdr2、包括具有seqidno:121所示序列的氨基酸的vhcdr3、包括具有seqidno:122所示序列的氨基酸的vlcdr1、包括具有seqidno:123所示序列的氨基酸的vlcdr2、和包括具有seqidno:124所示序列的氨基酸的vlcdr3。在某些实施方式中，细胞外抗原结合结构域是et140-3(或“et140-153”)scfv。

car的跨膜结构域

在某些非限定性实施方式中，car的跨膜结构域包括跨越至少一部分膜的疏水性α螺旋。不同的跨膜结构域导致不同的受体稳定性。在抗原识别之后，受体聚簇且信号被传送至细胞。根据本发明公开的主题，car的跨膜结构域可以包括cd8多肽、cd28多肽、cd3ζ多肽、cd4多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、ctla-4多肽、pd-1多肽、lag-3多肽、2b4多肽、btla多肽、合成肽(非基于与免疫应答有关的蛋白质)或其组合。

在某些实施方式中，本发明公开的car的跨膜结构域包括cd28多肽。cd28多肽可以具有与序列ncbi参照no:p10747或np_006130(seqidno:193)的同源性为至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任选地包括至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，cd28多肽可以具有作为seqidno:193保守部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或者至少30、或者至少40、或者至少50并且至多220个氨基酸。另外可选地或者额外地，在非限定性的各种实施方式中，cd28多肽具有seqidno:193的氨基酸1-220、1-50、50-100、100-150、150-200或200-220的氨基酸序列。在某些实施方式中，本发明公开的car包括：包括cd28多肽的跨膜结构域和包括有包括cd28多肽的共刺激信号区的细胞内结构域。在某些实施方式中，跨膜结构域和细胞内结构域中包括的cd28具有seqidno:193的氨基酸114-220的氨基酸序列。

seqidno:193提供如下：

根据本发明公开的主题，“cd28核酸分子”是指编码cd28多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，编码本发明公开的car的跨膜结构域和细胞内结构域(例如共刺激信号区)中包括的cd28多肽(seqidno:193的氨基酸114-220)的cd28核酸分子包括具有下文提供的seqidno:194所示序列的核酸。

attgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctcc[seqidno:194]

在某些实施方式中，本发明公开的car的跨膜结构域包括cd8多肽。cd8多肽可以具有与序列ncbi参照no:aah25715(seqidno:226)的同源性为至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任选地包括至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。在非限定性实施方式中，cd8多肽可以具有作为seqidno:226保守部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或者至少30、或者至少40、或者至少50、或者至少70、或者至少100、或者至少150、或者至少200并且至多235个氨基酸。另外可选地或者额外地，在非限定性的各种实施方式中，cd28多肽具有seqidno:226的氨基酸1-235、1-50、50-100、100-150、150-200、130-210或200-235的氨基酸序列。在某些实施方式中，跨膜结构域中包括的cd8多肽具有seqidno:226的氨基酸137-207的氨基酸序列。

seqidno:226提供如下：

根据本发明公开的主题，“cd8核酸分子”是指编码cd8多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，编码本发明公开的car跨膜结构域中包括的cd8多肽(seqidno:226的氨基酸137-207)的cd8核酸分子包括具有下文提供的seqidno:227所示序列的核酸。

cccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaaccccggcgcccacgatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccctggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaac[seqidno:227]

在某些非限定性实施方式中，car还可以包括连接细胞外抗原结合结构域与跨膜结构域的间隔区。间隔区的柔性可以足以使抗原结合结构域在不同的方向取向，以促进抗原识别。间隔区可以是来自igg1的铰链区，或者免疫球蛋白的ch2ch3区和cd3部分。

car的细胞内结构域

在某些非限定性实施方式中，car的细胞内结构域可以包括可以激活或刺激细胞(例如，淋巴样谱系细胞如t细胞)的cd3ζ多肽。cd3ζ包括3个itam，在结合抗原之后将激活信号传送至细胞(例如，淋巴样谱系细胞如t细胞)。cd3ζ多肽可以具有与seqidno:195所示序列的同源性为至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任选地包括至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。在非限定性实施方式中，cd3ζ肽可以具有作为seqidno:195保守部分的氨基酸序列，其长度为至少20、或者至少30、或者至少40、或者至少50并且至多163个氨基酸。另外可选地或者额外地，在非限定性的不同实施方式中，cd3ζ多肽具有seqidno:195的氨基酸1-163、1-50、50-100、100-150或150-163的氨基酸序列。在某些实施方式中，本发明公开的car的细胞内结构域中包括的cd3ζ具有seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列。

seqidno:195提供如下：

根据本发明公开的主题，“cd3ζ核酸分子”是指编码cd3ζ多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，编码本发明公开的car的细胞内结构域中包括的cd3ζ多肽(seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列)的cd3ζ核酸分子包括具有下文提供的seqidno:196所示序列的核酸。

agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa[seqidno:196]

在某些非限定性实施方式中，car的细胞内结构域进一步包括至少一个信号区。至少一个信号区可以包括cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽、pd-1多肽、ctla-4多肽、lag-3多肽、2b4多肽、btla多肽、合成肽(非基于与免疫应答有关的蛋白质)或其组合。

在某些实施方式中，信号区是共刺激信号区。在某些实施方式中，共刺激区包括至少一个共刺激分子，其可以提供最佳的淋巴细胞激活。如本文所用，“共刺激分子”是指淋巴细胞对抗原有效响应所需的抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。至少一种共刺激信号区可以包括cd28多肽、4-1bb多肽、ox40多肽、icos多肽、dap-10多肽或其组合。共刺激分子可以与共刺激配体结合，该共刺激配体是一经与其受体结合便产生共刺激响应的在细胞表面上表达的蛋白质，上述共刺激响应即为当抗原与其car分子结合时提供的影响刺激的细胞内响应。共刺激配体包括，但不限于cd80、cd86、cd70、ox40l、4-1bbl、cd48、tnfrsf14和pd-l1。作为一实例，4-1bb配体(即4-1bbl)可以与4-1bb(也称作“cd137”)结合，用于提供与car信号结合诱导car⁺t细胞的效应细胞功能的细胞内信号。包括具有包括4-1bb、icos或dap-10的共刺激信号区的细胞内结构域的car公开于u.s.7,446,190中(例如，编码4-1bb的核苷酸序列示于seqidno:15，编码icos的核苷酸序列示于seqidno:16，编码dap-10的核苷酸序列示于seqidno:17)，在此将其全文并入作为参考。在某些实施方式中，car的分子内结构域具有包括cd28多肽的共刺激信号区。在某些实施方式中，car的分子内结构域具有包括两种共刺激分子cd28和4-1bb或者cd28和ox40的共刺激信号区。

4-1bb可以作为肿瘤坏死因子(tnf)配体发挥作用，并具有刺激活性。4-1bb多肽可以具有与序列ncbi参考号p41273或np_001552的序列(seqidno:197)的同源性为至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任选地包括至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。在某些实施方式中，本发明公开的car的细胞内结构域中包括的4-1bb多肽具有seqidno:197的氨基酸214-255的氨基酸序列。

seqidno:197提供如下：

根据本发明公开的主题，“4-1bb核酸分子”是指编码4-1bb多肽的多核苷酸。在某些实施方式中，编码本发明公开的car的细胞内结构域中包括的4-1bb多肽(seqidno:197的氨基酸214-255)的4-1bb核酸分子包括具有如下提供的seqidno:228所示序列的核酸。

aaacggggcagaaagaagctcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg[seqidno:228]

ox40多肽可以具有与序列ncbi参考号p43489或np_003318(seqidno:198)的同源性为至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任选地包括至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。

seqidno:198提供如下：

根据本发明公开的主题，“ox40核酸分子”是指编码ox40多肽的多核苷酸。

icos多肽可以具有与序列ncbi参考号np_036224(seqidno:199)的同源性为至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任选地包括至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。

seqidno:199提供如下：

根据本发明公开的主题，“icos核酸分子”是指编码icos多肽的多核苷酸。

ctla-4是激活的t细胞所表达的抑制性受体，其在被其对应的配体(分别为cd80和cd86；b7-l和b7-2)占据时介导激活的t细胞抑制或无免疫反应性。在临床前和临床研究中，ctla-4经由全身性抗体输注的阻断，尽管会增强内源性抗肿瘤应答，但在临床环境中具有重大无法预料的毒性。

ctla-4含有细胞外v结构域、跨膜结构域和胞质尾区。编码不同的同种型的可替代的剪接变体已经被鉴定。膜结合的同种型作为由二硫键互连的同型二聚体发挥功能，而可溶性同种型作为单体发挥作用。细胞内结构域与cd28的细胞内结构域类似，在于其没有固有的催化活性，含有一个能够结合pi3k、pp2a和shp-2的yvkm基序和一个能够结合含sh3蛋白质的富含脯氨酸的基序。ctla-4在抑制t细胞反应中的一个作用似乎是直接经由tcr-近端的信号蛋白质例如cd3和lat的shp-2和pp2a去磷酸化。ctla-4也可以经由与cd28竞争结合cd80/86而间接影响信号转导。另外已经显示ctla-4与pi3k、cd80、ap2m1和ppp2r5a结合和/或相互作用。

根据本发明公开的主题，ctla-4多肽可以具有与uniprotkb/swiss-protref.no.:p16410.3(seqidno:200)的同源性为至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的氨基酸序列(本文的同源性可以使用标准软件例如blast或fasta确定)或其片段，和/或可以任选地包括至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。

seqidno:200提供如下：

根据本发明公开的主题，“ctla-4核酸分子”是指编码ctla-4多肽的多核苷酸。

pd-1是在与其对应的表达在内源性巨噬细胞和树突细胞上的配体pd-l1和pd-l2接合时的活化t细胞的负性免疫调节物。pd-l是268个氨基酸的i型膜蛋白。pd-1具有两种配体，pd-l1和pd-l2，其为b7家族的成员。蛋白质的结构包括细胞外igv结构域，然后是跨膜区和胞内尾区。胞内尾区含有两个位于基于免疫受体酪氨酸的抑制性基序内和基于免疫受体酪氨酸的开关基序内的磷酸化位点，该pd-1对tcr信号进行负调节。shp-i和shp-2磷酸酶在配体结合时与pd-1的胞质尾区结合。pd-l1的上调是肿瘤细胞可以逃避(evade)宿主免疫系统的一种机制。在临床前和临床试验中，拮抗性抗体所引起的pd-1阻断诱发经宿主内源性免疫系统介导的抗肿瘤应答。

根据本发明公开的主题，pd-1多肽可以具有与ncbi编号np_005009.2(seqidno:201)的同源性为至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任选地包括至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。

seqidno:201提供如下：

根据本发明公开的主题，“pd-1核酸分子”是指编码pd-1多肽的多核苷酸。

淋巴细胞激活蛋白3(lag-3)是免疫细胞的负免疫调节物。lag-3属于免疫球蛋白(ig)超家族并含有4个细胞外ig样结构域。lag3基因含有8个外显子。序列数据、外显子/内含子结构和染色体定位均表明lag3与cd4有密切关系。lag3也称作cd223(分化簇223)。

根据本发明公开的主题，lag-3多肽可以具有与uniprotkb/swiss-protref.no.:p18627.5(seqidno:202)的同源性为至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任选地包括至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。

seqidno:202提供如下：

根据本发明公开的主题，“lag-3核酸分子”是指编码lag-3多肽的多核苷酸。

自然杀伤细胞受体2b4(2b4)介导在nk细胞和t细胞亚型上的非mhc限制的细胞杀死。迄今为止，2b4的功能仍在研究中，据认为2b4-s同种型是激活性受体，据认为2b4-l同种型是免疫细胞的负性免疫调节物。2b4在与其高亲和性配体cd48结合时被占据。2b4含有酪氨酸类开关基序，即使蛋白质与各种磷酸酶结合的分子开关。2b4也被称作cd244(分化簇244)。

根据本发明公开的主题，2b4多肽可以具有与uniprotkb/swiss-protref.no.:q9bzw8.2(seqidno:203)的同源性为至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任选地包括至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。

seqidno:203提供如下：

根据本发明公开的主题，“2b4核酸分子”是指编码2b4多肽的多核苷酸。

b-和t-淋巴细胞衰减因子(btla)在t细胞的激活过程中被诱导，btla保持在th1细胞上表达，但在th2细胞上不表达。类似于pd1和ctla4，btla与b7同系物b7h4相互作用。但是，与pd-1和ctla-4不同，btla经由与肿瘤坏死家族受体(tnf-r)、而不仅仅是细胞表面受体的b7家族相互作用表现出t-细胞抑制。btla是肿瘤坏死因子(受体)超家族成员14(tnfrsf14)也称作单纯疱疹病毒侵入介导子(hvem)的配体。btla-hvem复合物对t-细胞免疫应答进行负调节。btla激活已经显示抑制人cd8⁺癌症特异性t细胞的功能。btla也称作cd272(分化簇272)。

根据本发明公开的主题，btla多肽可以具有与uniprotkb/swiss-protref.no.:q7z6a9.3(seqidno:204)的同源性为至少约85％、约90％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％的氨基酸序列或其片段，和/或可以任选地包括至多1个或至多2个或至多3个保守氨基酸取代。

seqidno:204提供如下：

根据本发明公开的主题，“btla核酸分子”是指编码btla多肽的多核苷酸。

在某些实施方式中，car包括：包括与人bcma特异性结合的人scfv的细胞外抗原结合区、包括cd28多肽的跨膜结构域、以及包括cd3ζ多肽和包括cd28多肽的共刺激信号区的细胞内结构域，如图1所示。如图1所示，car还包括与细胞外抗原结合结构域的5’端共价连接的信号肽或前导序列。在某些实施方式中，信号肽包括具有seqidno:205所示序列的氨基酸。

在某些实施方式中，car包括：包括与人bcma特异性结合的人scfv的细胞外抗原结合区、包括cd8多肽的跨膜结构域、以及包括cd3ζ多肽和包括4-1bb多肽的共刺激信号区的细胞内结构域，如图7所示。如图7所示，car还包括与细胞外抗原结合结构域的5’端共价连接的信号肽或前导序列。在某些实施方式中，信号肽包括具有seqidno:205所示序列的氨基酸。

在某些实施方式中，本发明公开主题的car可以进一步包括诱导型启动子，用于在人细胞中表达核酸序列。用于表达car基因的启动子可以是组成型启动子，例如泛素c(ubicc)启动子。

本发明公开的主题还提供分离的核酸分子，其编码本文所述的靶向bcma的car或其功能性部分。在某些实施方式中，分离的核酸分子编码本发明公开的靶向bcma的car，该car包括：与人bcma特异性结合的人scfv、包括cd28多肽的跨膜结构域、以及包括cd3ζ多肽和包括cd28多肽的共刺激信号区的细胞内结构域。在一具体的非限定性实施例中，分离的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:207所示序列的核酸：

caatctgccctgactcagcctgcctccgtgtctgcgtctcctggacagtcgatcgccatctcctgcactggaaccagcagtgacgttggttggtatcaacagcacccaggcaaagcccccaaactcatgatttatgaggacagtaagcggccctcaggggtttctaatcgcttctctggctccaagtctggcaacacggcctccctgaccatctctgggctccaggctgaggacgaggctgattattactgcagctcaaatacaagaagcagcactttggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgagatggccgaagtgcagctggtgcagtctggggctgagatgaagaagcctggggcctcactgaagctctcctgcaaggcttctggatacaccttcatcgactactatgtatactggatgcgacaggcccctggacaagggcttgagtccatgggatggatcaaccctaacagtggtggcacaaactatgcacagaagtttcagggcagggtcaccatgaccagggacacgtccatcagcacagcctacatggagctgagcaggctgagatctgacgacaccgccatgtattactgtgcgcgctcccagcgtgacggttacatggattactggggtcaaggtactctggtgaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc[seqidno:207]

在一具体的非限定性实施例中，分离的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:208所示序列的核酸：

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在一具体的非限定性实施例中，分离的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:209所示序列的核酸：

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在一具体的非限定性实施例中，分离的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:229所示序列的核酸：

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[seqidno:229]

在一具体的非限定性实施例中，分离的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:230所示序列的核酸：

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在一具体的非限定性实施例中，分离的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:231所示序列的核酸：

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在一具体的非限定性实施例中，分离的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:232所示序列的核酸：

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ctctcccccttgaacctcctcgttcgaccccgcctcgatcctccctttatccagccctcact[seqidno:232]

在一具体的非限定性实施例中，分离的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:233所示序列的核酸：

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gttcgaccccgcctcgatcctccctttatccagccctcact[seqidno:233]

在一具体的非限定性实施例中，分离的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:234所示序列的核酸：

atggaaaccgacaccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccaggatccacaggactgcctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgttctggacgcagttccaacatcgggagtaattctgttaactggtatcgacaactcccaggagcggcccccaaactcctcatctatagtaataatcagcggcccccaggggtccctgtgcgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccagtctgaagatgaggccacttattactgtgcaacatgggatgacaatctgaatgttcactatgtcttcggaactgggaccaaggtcaccgtcctaggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgagatggcccaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggaggcaccttcagcagctatgctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaaggatcatccctatccttggtatagcaaactacgcacagaagttccagggcagagtcacgattaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgcggtggttactactctcatgacatgtggtctgaagattggggtcaaggtactctggtgaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa[seqidno:234]

在一具体的非限定性实施例中，分离的核酸分子包括具有以下提供的seqidno:235所示序列的核酸：

atggaaaccgacaccctgctgctgtgggtgctgctgctgtgggtgccaggatccacaggacaggctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgttctggaagcagctccaacatcggaagtaattacgtattctggtaccagcagctcccaggaacggcccccaaactcctcatctatagtaataatcagcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccatcagtgggctccggtccgaggatgaggctgattattactgtgcagcatgggatgacagcctgagtgcctcttatgttttcggaactgggaccaaggtcaccgtcctaggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgagatggcccaggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggaggcaccttcagcagctatgctatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaaggatcatccctatccttggtacagcaaactacgcacagaagttccagggcagagtcacgattaccgcggacgaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgcgctctggttacggttcttaccgttgggaagattcttggggtcaaggtactctggtgaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaa[seqidno:235]

具有seqidno:207所示核苷酸序列的分离的核酸分子编码靶向bcma的car(称作靶向bcma的28zcar54)，该car包括人scfv、包括cd28多肽的跨膜结构域、以及包括有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括cd28多肽的共刺激信号区的细胞内结构域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的重链可变区、包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的轻链可变区和位于重链可变区和轻链可变区之间的具有氨基酸序列seqidno:69的接头，其中包括跨膜结构域和共刺激信号区的cd28区包括seqidno:193的氨基酸114-220。

具有seqidno:208所示核苷酸序列的分离的核酸分子编码靶向bcma的car(称作靶向bcma的28zcar40)，该car包括人scfv、包括cd28多肽的跨膜结构域、以及具有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括cd28多肽的共刺激信号区的细胞内结构域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的重链可变区、包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的轻链可变区和位于重链可变区和轻链可变区之间的具有氨基酸序列seqidno:69的接头，其中包括跨膜结构域和共刺激信号区的cd28区包括seqidno:193的氨基酸114-220。

具有seqidno:209所示核苷酸序列的分离的核酸分子编码靶向bcma的car(称作靶向bcma的28zcar24)，该car包括人scfv、包括cd28多肽的跨膜结构域、以及具有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括cd28多肽的共刺激信号区的细胞内结构域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的重链可变区、包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的轻链可变区和位于重链可变区和轻链可变区之间的具有氨基酸序列seqidno:69的接头，其中包括跨膜结构域和共刺激信号区的cd28区包括seqidno:193的氨基酸114-220。

具有seqidno:234所示核苷酸序列的分离的核酸分子编码靶向bcma的car(称作靶向bcma的28zcar3)，该car包括人scfv、包括cd28多肽的跨膜结构域、以及具有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括cd28多肽的共刺激信号区的细胞内结构域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的重链可变区、包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的轻链可变区和位于重链可变区和轻链可变区之间的具有氨基酸序列seqidno:69的接头，其中包括跨膜结构域和共刺激信号区的cd28区包括seqidno:193的氨基酸114-220。

具有seqidno:235所示核苷酸序列的分离的核酸分子编码靶向bcma的car(称作靶向bcma的28zcar37)，该car包括人scfv、包括cd28多肽的跨膜结构域、以及具有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括cd28多肽的共刺激信号区的细胞内结构域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的重链可变区、包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的轻链可变区和位于重链可变区和轻链可变区之间的具有氨基酸序列seqidno:69的接头，其中包括跨膜结构域和共刺激信号区的cd28区包括seqidno:193的氨基酸114-220。

具有seqidno:229所示核苷酸序列的分离的核酸分子编码靶向bcma的car(称作靶向bcma的bbzcar3)，该car包括人scfv、包括具有seqidno:226的氨基酸137-207的cd8多肽的跨膜结构域、以及包括有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括具有seqidno:197的氨基酸214-255的4-1bb多肽的共刺激信号区的细胞内结构域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:21所示序列的氨基酸的重链可变区、包括具有seqidno:22所示序列的氨基酸的轻链可变区和位于重链可变区和轻链可变区之间的具有氨基酸序列seqidno:69的接头。seqidno:229的核苷酸序列270-1031编码人scfv。seqidno:229的核苷酸序列1041-1253编码跨膜结构域中包括的cd8多肽。seqidno:229的核苷酸序列1254-1379编码细胞内结构域中包括的4-1bb多肽。seqidno:229的核苷酸序列1380-1718编码细胞内结构域中包括的cd3ξ多肽。seqidno:229的其他部分示于表19中。

表19

具有seqidno:230所示核苷酸序列的分离的核酸分子编码靶向bcma的car(称作靶向bcma的bbzcar24)，该car包括人scfv、包括具有seqidno:226的氨基酸137-207的cd8多肽的跨膜结构域、以及包括有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括具有seqidno:197的氨基酸214-255的4-1bb多肽的共刺激信号区的细胞内结构域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:65所示序列的氨基酸的重链可变区、包括具有seqidno:66所示序列的氨基酸的轻链可变区和位于重链可变区和轻链可变区之间的具有氨基酸序列seqidno:69的接头。seqidno:230的核苷酸序列270-1015编码人scfv。seqidno:230的核苷酸序列1023-1235编码跨膜结构域中包括的cd8多肽。seqidno:230的核苷酸序列1236-1361编码细胞内结构域中包括的4-1bb多肽。seqidno:230的核苷酸序列1362-1700编码细胞内结构域中包括的cd3ξ多肽。seqidno:230的其他部分示于表20中。

表20

具有seqidno:231所示核苷酸序列的分离的核酸分子编码靶向bcma的car(称作靶向bcma的bbzcar37)，该car包括人scfv、包括具有seqidno:226的氨基酸137-207的cd8多肽的跨膜结构域、以及包括有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括具有seqidno:197的氨基酸214-255的4-1bb多肽的共刺激信号区的细胞内结构域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:61所示序列的氨基酸的重链可变区、包括具有seqidno:62所示序列的氨基酸的轻链可变区和位于重链可变区和轻链可变区之间的具有氨基酸序列seqidno:69的接头。seqidno:231的核苷酸序列270-1028编码人scfv。seqidno:231的核苷酸序列1038-1250编码跨膜结构域中包括的cd8多肽。seqidno:231的核苷酸序列1251-1376编码细胞内结构域中包括的4-1bb多肽。seqidno:231的核苷酸序列1377-1715编码细胞内结构域中包括的cd3ξ多肽。seqidno:231的其他部分示于表21中。

表21

具有seqidno:232所示核苷酸序列的分离的核酸分子编码靶向bcma的car(称作靶向bcma的bbzcar40)，该car包括人scfv、包括具有seqidno:226的氨基酸137-207的cd8多肽的跨膜结构域、以及包括有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括具有seqidno:197的氨基酸214-255的4-1bb多肽的共刺激信号区的细胞内结构域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:57所示序列的氨基酸的重链可变区、包括具有seqidno:58所示序列的氨基酸的轻链可变区和位于重链可变区和轻链可变区之间的具有氨基酸序列seqidno:69的接头。seqidno:232的核苷酸序列270-1024编码人scfv。seqidno:232的核苷酸序列1032-1244编码跨膜结构域中包括的cd8多肽。seqidno:232的核苷酸序列1245-1370编码细胞内结构域中包括的4-1bb多肽。seqidno:232的核苷酸序列1371-1709编码细胞内结构域中包括的cd3ξ多肽。seqidno:232的其他部分示于表22中。

表22

具有seqidno:233所示核苷酸序列的分离的核酸分子编码靶向bcma的car(称作靶向bcma的bbzcar54)，该car包括人scfv、包括具有seqidno:226的氨基酸137-207的cd8多肽的跨膜结构域、以及包括有包括seqidno:195的氨基酸52-163的氨基酸序列的cd3ξ多肽和包括具有seqidno:197的氨基酸214-255的4-1bb多肽的共刺激信号区的细胞内结构域，上述人scfv包括：包括具有seqidno:53所示序列的氨基酸的重链可变区、包括具有seqidno:54所示序列的氨基酸的轻链可变区和位于重链可变区和轻链可变区之间的具有氨基酸序列seqidno:69的接头。seqidno:233的核苷酸序列270-1003编码人scfv。seqidno:233的核苷酸序列1011-1223编码跨膜结构域中包括的cd8多肽。seqidno:233的核苷酸序列1224-1349编码细胞内结构域中包括的4-1bb多肽。seqidno:233的核苷酸序列1350-1688编码细胞内结构域中包括的cd3ξ多肽。seqidno:233的其他部分示于表23中。

表23

在某些实施方式中，分离的核酸分子编码本发明公开的靶向bcma的car的功能性部分。如本文所用，术语“功能性部分”是指本发明公开的靶向bcma的car的保留靶向bcma的car(亲本car)的生物活性的任意部分(portion)、一部分(part)或片段。例如，功能性部分包括靶向bcma的car在与亲本car类似、相同甚至更高的程度上保留识别靶标细胞、治疗疾病例如多发性骨髓瘤的能力的部分、一部分或片段。在某些实施方式中，编码本发明公开的靶向bcma的car的功能性部分的分离的核酸分子可以编码包括例如亲本car的约10％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％或更多的蛋白质。

美国国家癌症研究所(nationalcancerinstitute，nci)进行的一项i期临床试验(nct02215967)使用抗bcmacar-转导的t细胞治疗多发性骨髓瘤^33,34。nci的临床试验中应用的抗bcmacar包括与人bcma结合的小鼠scfv。使用小鼠抗体或小鼠scfv治疗人可以导致抗小鼠抗体(hama)应答，这可能是威胁生命的。不与nci的临床试验类似，在某些实施方式中，本发明公开的靶向bcma-的car包括人scfv，因此，与包括鼠科动物抗体的car相比较(参见maus等人,cancerimmunolres(2003)；1(1):26-31，该文献报道了源自鼠科动物抗体的car潜在的免疫原性可能造成mrnacar的安全性问题)提供了大大降低的免疫原性风险。

iii.免疫应答细胞

本发明公开的主题提供了表达包括细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域的car的免疫应答细胞，如上所述，其中细胞外抗原结合结构域与bcma(例如人bcma)特异性结合。免疫应答细胞可以用本发明公开的car来转导，使得细胞表达car。本发明公开的主题还提供了使用此类细胞治疗肿瘤例如多发性骨髓瘤(mm)的方法。本发明公开主题的免疫应答细胞可以是淋巴谱系细胞。包括b细胞、t细胞和自然杀伤(nk)细胞的淋巴谱系细胞，提供抗体的产生、细胞免疫系统的调节、血液中外来物质的检测、对宿主外源细胞的检测等。淋巴谱系细胞的非限定性实例包括t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、调节性t细胞、胚胎干细胞和多能干细胞(例如，可分化成淋巴样细胞的多能干细胞)。t细胞可以是在胸腺中成熟的淋巴细胞，并且主要负责细胞介导的免疫。t细胞参与获得性免疫系统。本发明公开主题的t细胞可以是任何类型的t细胞，包括但不限于辅助性t细胞、细胞毒性t细胞、记忆t细胞(包括中心记忆t细胞、干细胞样记忆t细胞(或干样记忆t细胞)和两种类型的效应记忆t细胞(例如，tem细胞和temra细胞)、调节性t细胞(也称为抑制性t细胞)、自然杀伤t细胞、粘膜相关恒定t细胞、和γδt细胞。在某些实施方式中，表达car的t细胞表达foxp3以实现和维持t调节表型。自然杀伤(nk)细胞可以是作为细胞介导的免疫的一部分、并且在先天免疫应答过程中发挥作用的淋巴细胞。nk细胞不需要预先激活，以便对靶细胞发挥其细胞毒性作用。细胞毒性t细胞(ctl或杀伤t细胞)是能够诱导受感染的体细胞或肿瘤细胞死亡的t淋巴细胞的亚型。

本发明公开主题的免疫应答细胞可以表达与bcma(例如人bcma)特异性结合的细胞外抗原结合结构域(例如人scfv、任选交联的fab、或f(ab)2)，用于治疗多发性骨髓瘤。此类免疫应答细胞可以给予对其有需求的受试者(例如人受试者)，用于治疗多发性骨髓瘤。在某些实施方式中，免疫应答细胞是t细胞。t细胞可以是cd4⁺t细胞或cd8⁺t细胞。在某些实施方式中，t细胞是cd4⁺t细胞。在某些实施方式中，t细胞是cd8⁺t细胞。

本公开的免疫应答细胞可以进一步用至少一种共刺激配体转导，使得免疫应答细胞共表达或者诱导成共表达靶向bcma的car和至少一种共刺激配体。靶向bcma的car和至少一种共刺激配体之间的相互作用提供了对于免疫应答细胞(例如t细胞)的完全激活而言很重要的非抗原特异性信号。共刺激配体包括，但不限于，肿瘤坏死因子(tnf)超家族成员和免疫球蛋白(ig)超家族配体。tnf是参与全身性炎症并刺激急性期反应的细胞因子。它的主要作用是调节免疫细胞。tnf超家族的成员具有许多共同的特征。大多数tnf超家族成员被合成作为含有短胞质链段和相对长的细胞外区域的ii型跨膜蛋白(细胞外c端)。tnf超家族成员包括，但不限于，神经生长因子(ngf)、cd40l(cd40l)/cd154、cd137l/4-1bbl、tnf-α、cd134l/ox40l/cd252、cd27l/cd70、fas配体(fasl)、cd30l/cd153、肿瘤坏死因子β(tnfβ)/淋巴毒素-α(ltα)、淋巴毒素-β(ltβ)、cd257/b细胞激活因子(baff)/blys/thank/tall-1、糖皮质激素诱导的tnf受体配体(gitrl)和tnf相关的细胞凋亡诱导配体(trail)、light(tnfsf14)。免疫球蛋白(ig)超家族是一大类参与细胞识别、结合或粘附过程的细胞表面蛋白和可溶性蛋白。这些蛋白与免疫球蛋白共享结构特征——它们具有免疫球蛋白结构域(折叠)。免疫球蛋白超家族配体包括，但不限于，cd80和cd86、cd28的两个配体、pd-1的配体pd-l1/(b7-h1)。在某些实施方式中，至少一种共刺激配体选自4-1bbl、cd80、cd86、cd70、ox40l、cd48、tnfrsf14、pd-l1及其组合。在某些实施方式中，免疫应答细胞用一种共刺激配体4-1bbl转导。在某些实施方式中，免疫应答细胞用两种共刺激配体4-1bbl和cd80转导。用至少一种共刺激配体转导的car描述于美国专利第8,389,282号中，在此将其全文并入作为参考。

而且，本发明公开的免疫应答细胞可以进一步用至少一种细胞因子转导，使得免疫应答细胞分泌至少一种细胞因子并且表达靶向bcma的car。在某些实施方式中，至少一种细胞因子选自il-2、il-3、il-6、il-7、il-11、il-12、il-15、il-17和il-21。在某些实施方式中，细胞因子是il-12。

bcma特异性或者靶向bcma的人淋巴细胞可以用于外周供体淋巴细胞，例如以下文献中所公开：sadelain,m.等人,2003natrevcancer3:35-45(公开了遗传修饰成表达car的外周供体淋巴细胞)；morgan,r.a.等人,2006science314:126-129(公开了遗传修饰成表达包括α和β异质二聚体的全长肿瘤抗原识别t细胞受体复合物)；panelli,m.c.等人,2000jimmunol164:495-504；panelli,m.c.等人,2000jimmunol164:4382-4392(公开了源自肿瘤活组织检查中的肿瘤浸润性淋巴细胞(til)的淋巴细胞培养物)；和dupont,j.等人,2005cancerres65:5417-5427；papanicolaou,g.a.等人,2003blood102:2498-2505(公开了使用人工抗原呈递细胞(aapc)或脉冲树突细胞选择性地在体外扩增的抗原特异性外周血白细胞)。免疫应答细胞(例如t细胞)可以是自体的、非自体的(例如同种异体的)或者在体外得自工程化的祖细胞或干细胞。

在某些实施方式中，本发明公开的免疫应答细胞(例如t细胞)表达约1至约4、约2至约4、约3至约4、约1至约2、约1至约3、或约2至约3个载体拷贝数/细胞的本发明公开的靶向bcma的car。

ctl的未纯化来源可以是本领域任何已知的，例如骨髓、胎儿、新生儿或成人或其他造血细胞来源，例如胎肝、外周血或脐带血。可以采用各种技术来分离细胞。例如，阴性选择方法可以在最初除去非ctl。对于阳性选择和阴性选择，单克隆抗体对于识别与特定细胞谱系和/或分化阶段相关的标志物特别有用。

较大比例的终末分化的细胞可以通过相对较粗的分离在最初除去。例如，最初可以使用磁珠分离，以除去大量不相关的细胞。优选地，至少约80％、通常至少70％的总造血细胞将在细胞分离之前被除去。

分离方法包括，但不限于，密度梯度离心；重调(resetting)；与改变细胞密度的颗粒结合；用涂有抗体的磁珠进行磁性分离；亲和色谱；与mab结合或联合使用的细胞毒性剂，其包括但不限于补体和细胞毒素；和用附着于例如板、芯片的固体基质的抗体淘选、淘析或任何其他传统的技术。

分离和分析技术包括，但不限于，流式细胞术，其可以具有不同程度的改进，例如多种色彩通道、低角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道。

可以通过使用与死细胞相关的染料比如碘化丙啶(pi)，相对于死细胞来选择细胞。优选地，将细胞收集在包括2％胎牛血清(fcs)或0.2％牛血清白蛋白(bsa)的培养基或任何其它合适的优选为无菌的等渗介质中。

iv.载体

免疫应答细胞(例如，t细胞、ctl细胞、nk细胞)的遗传修饰可以通过将基本上均质的细胞组成用重组dna或rna构建体转导来实现。载体可以是逆转录病毒载体(例如，γ逆转录病毒)，其用于将dna或rna构建体引入到宿主细胞基因组中。例如，可以将编码靶向bcma的car的多核苷酸克隆到逆转录病毒载体中，并且可以由其内源性启动子、逆转录病毒长末端重复序列或者替代的内部启动子驱动表达。

也可使用非病毒载体或rna。可以使用随机染色体整合或靶向整合(例如使用核酸酶、转录激活子样效应因子核酸酶(talen)、锌指核酸酶(zfn)、和/或成簇的规律间隔的短回文重复物(crispr)或转基因表达(例如使用天然或化学修饰的rna)。

对于细胞的初始遗传修饰以提供表达靶向bcma的car的细胞，通常使用逆转录病毒载体进行转导，然而可以使用任何其它合适的病毒载体或非病毒递送系统。对于细胞的后续遗传修饰以提供包括有包括至少两种共刺激配体的抗原递呈复合物的细胞，逆转录病毒基因转移(转导)同样证明是有效的。逆转录病毒载体和合适的包装系的组合也是合适的，其中衣壳蛋白作用于感染人细胞。已知各种产生双嗜性病毒的细胞系，其包括但不限于pa12(miller等人(1985)mol.cell.biol.5：431～437)；pa317(miller等人(1986)mol.cell.biol.6：2895～2902)；和crip(danos等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa85：6460～6464)。非嗜性颗粒也是合适的，例如，用vsvg、rd114或galv外壳假型化的颗粒和本领域已知的任何其它颗粒。

可能的转导方法还包括将细胞与生产细胞直接共培养，例如，通过bregni等人(1992)blood80：1418～1422的方法，或者在存在或不存在合适的生长因子和聚阳离子的情况下与单独的病毒上清液或浓缩载体储备液一起培养，例如通过xu等人(1994)exp.hemat.22：223～230；和hughes等人(1992)j.clin.invest.89：1817的方法。

转导病毒载体可用于在免疫应答细胞中表达共刺激共刺激配体(例如4-1bbl和il-12)。优选地，所择的载体表现出高的感染效率和稳定的整合和表达(参见例如cayouette等人，humangenetherapy8：423～430，1997；kido等人，currenteyeresearch15：833～844，1996；bloomer等人，journalofvirology71：6641～6649，1997；naldini等人，science272：263～267，1996；和miyoshi等人，proc.natl.acad.sci.usa94：10319，1997)。可以使用的其他病毒载体包括例如腺病毒、慢病毒和腺相关病毒载体、牛痘病毒、牛乳头瘤病毒或疱疹病毒，例如epstein-barr病毒(另外参见例如，以下的载体：miller，humangenetherapy15-14，1990；friedman，science244：1275～1281，1989；eglitis等人，biotechniques6：608～614，1988；tolstoshev等人，currentopinioninbiotechnology1：55～61，1990；sharp，thelancet337：1277～1278,1991；cornetta等人，nucleicacidresearchandmolecularbiology36：311～322，1987；anderson，science226：401～409，1984；moen，bloodcells17：407～416，1991；miller等，biotechnology7：980～990，1989；legallasalle等，science259：988～990，1993；和johnson，chest107：77s～83s，1995)。逆转录病毒载体已被特别好地开发，并已用于临床环境中(rosenberg等人，n.engl.j.med323：370，1990；anderson等人，美国专利第5,399,346号)。

在某些非限定性实施方式中，表达本发明公开的靶向bcma的car的载体是逆转录病毒载体，例如，293galv9逆转录病毒载体。

也可以使用非病毒方法在细胞中表达蛋白质。例如，通过在脂质转染的存在下给予核酸(feigner等人,proc.nat’l.acad.sci.u.s.a.84:7413,1987；ono等人,neuroscienceletters17:259,1990；brigham等人,am.j.med.sci.298:278,1989；staubinger等人.,methodsinenzymology101:512,1983)，通过脱唾液酸血清类粘蛋白-多赖氨酸缀合(wu等人,journalofbiologicalchemistry263:14621,1988；wu等人,journalofbiologicalchemistry264:16985,1989)，或者通过在外科手术条件下微注射(wolff等人,science247:1465,1990)，可以将核酸分子引入到细胞中。其他用于基因转移的非病毒方式包括使用磷酸钙、deae葡聚糖、电穿孔和原生质体融合在体外转染。脂质体对于将dna递送至细胞中也可以是潜在有益的。通过将正常核酸转移至可培养的细胞型(例如，自体或异种原代细胞或其子代)中，之后将细胞(或其后代)注射到靶标组织中或全身注射，也可以实现将正常基因移植到受试者的受感染组织中。也可以使用转座酶或靶向核酸酶(例如，锌指核酸酶、大范围核酸酶或tale核酸酶)得到或获得重组受体。通过rna电穿孔可以获得暂时的表达。

用于多核苷酸治疗方法的cdna表达可以由任何合适的启动子(例如人巨细胞病毒(cmv)、猿猴病毒(sv40)或金属硫蛋白启动子)指导，并可以通过任何合适的哺乳动物调控元件或内含子(例如延长因子1α增强子/启动子/内含子结构)调节。例如，如果需要，可以使用已知偏好在特定细胞类型中指导基因表达的增强子，以指导核酸的表达。使用的增强子可以包括，但不限于，鉴定为组织或细胞特异性增强子的那些增强子。另外可选地，如果使用基因组克隆作为治疗构件，则可以通过同源的调控序列，或者如果需要的话通过源自异源性来源的调控序列，包括任意上述的启动子或调控元件，对调节进行介导。

所得的细胞可以在与未修饰细胞类似的条件下生长，从而可以将修饰的细胞扩增，并用于多种目的。

v.多肽和类似物和多核苷酸

本发明公开的主题中还包括与bcma(例如人bcma)特异性结合的细胞外抗原结合结构域(例如，scfv(例如人scfv)、fab或(fab)2)、cd3ζ、cd8、cd28等多肽或其片段、以及编码其的多核苷酸，它们以当在免疫应答细胞中表达时增强其抗肿瘤活性的方式被修饰。本发明公开的主题提供了通过产生序列中的改变来优化氨基酸序列或核酸序列的方法。此类改变包括某些突变、缺失、插入或翻译后修饰。本发明公开的主题还包括本发明公开主题的任何天然存在的多肽的类似物。类似物可以通过氨基酸序列差异、通过翻译后修饰或通过两者而不同于本发明公开主题的天然存在的多肽。本发明公开主题的类似物通常可以表现出与本发明公开主题的天然存在的氨基酸序列的全部或部分至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的同一性。序列比较的长度为至少5、10、15、20、25、50、75、100或更多个氨基酸残基。此外，在确定同一性程度的示例性方法中，可以使用blast程序，e^-3和e^-100之间的概率得分表示密切相关的序列。修饰包括多肽的体内和体外化学衍生，例如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化；此类修饰可以在多肽合成或用分离的修饰酶的处理中或处理之后发生。类似物还可以通过一级序列的改变而不同于本发明公开主题的天然多肽。这些改变包括天然和诱导的遗传变体(例如，产生自通过照射或暴露于甲磺酸乙酯的随机突变，或者通过定点突变，如以下文献所述：sambrook，fritsch和maniatis，molecularcloning:alaboratorymanual(第二版)cshpress，1989；或ausubel等人，同上)。另外包括的是含有除l-氨基酸外的残基例如d-氨基酸或非天然存在的或合成的氨基酸例如β或γ氨基酸的环肽、分子和类似物。

除全长多肽以外，本发明公开的主题还提供本发明公开主题的多肽或肽结构域中任一者的片段。片段可以是至少5、10、13或15个氨基酸。在某些实施方式中，片段是至少20个连续氨基酸、至少30个连续氨基酸或至少50个相连的氨基酸。在某些实施方式中，片段是至少60至80、100、200、300或更多个相连的氨基酸。本发明公开主题的片段可以通过本领域普通技术人员已知的方法产生，或者可以由普通的蛋白质加工产生(例如从新生多肽中除去生物活性不需要的氨基酸，或者通过另外可选的mrna剪接或另外可选的蛋白质加工事件除去氨基酸)。

非蛋白质类似物具有设计成模拟本发明蛋白质的功能活性的化学结构。这些类似物根据本发明公开主题的方法而施用。这些类似物可以超过原始多肽的生理活性。类似物设计方法是本领域公知的，并且可以根据这些方法通过修饰化学结构进行类似物的合成，使得当在免疫应答细胞中表达时，所生成的类似物增加原始多肽的抗肿瘤活性。这些化学修饰包括但不限于取代另外可选的r基团，和改变参考多肽特定碳原子的饱和度。蛋白质类似物可以相对耐受体内降解，导致施用时治疗效果更加延长。用于测量功能活性的试验包括但不限于下面实施例中描述的那些。

根据本发明公开的主题，编码与bcma(例如，人bcma)特异性结合的细胞外抗原结合结构域(例如scfv(例如人scfv)、fab或(fab)2)、cd3ζ、cd8、cd28)的多核苷酸可以通过密码子优化进行修饰。密码子优化可以改变天然存在的和重组的基因序列，以在任何给定的表达系统中实现最高可能水平的生产能力。涉及蛋白质表达不同阶段的因素包括密码子适应性、mrna结构以及转录和翻译中的各种顺式元件。本领域技术人员已知的任何合适的密码子优化方法或技术均可用于修饰本发明公开主题的多核苷酸，其包括，但不限于，optimumgene^tm、encor优化和blueheron。.

vi.给药

可以全身性地或直接地向受试者提供本发明公开主题的靶向bcma的car和表达它的免疫应答细胞，用于治疗或预防瘤形成。在某些实施方式中，将靶向bcma的car和表达它的免疫应答细胞直接注射到所关注的器官(例如，受瘤形成影响的器官)中。另外可选地或额外地，将靶向bcma的car和表达它的免疫应答细胞通过例如施用到循环系统中(例如，肿瘤血管系统)间接地提供至所关注的器官。可以在细胞和组合物给药之前、过程中或之后，提供扩增剂和分化剂，以增加体外或体内t细胞的产生。

本发明公开主题的靶向bcma的car和表达它的免疫应答细胞可以在任何生理学可接受的媒介物中给药，通常是血管内给药，尽管它们也可以被引入骨或细胞可以找到合适的再生和分化位点的其他方便的位点中(例如，胸腺)。通常，可以施用至少1×10⁵个细胞，最终达到1×10¹⁰个或更多。包括表达靶向bcma的car的免疫应答细胞的细胞群可以包括纯化的细胞群。本领域技术人员可以很容易地使用各种公知的方法例如荧光激活细胞分选(facs)确定细胞群中免疫应答细胞的百分比。包含经遗传修饰的表达bcma特异性car的免疫应答细胞的细胞群中的纯度范围可以是约50％至约55％、约55％至约60％、约65％至约70％、约70％至约75％、约75％至约80％、约80％至约85％、约85％至约90％、约90％至约95％或约95至约100％。本领域技术人员可以容易地调整剂量(例如，纯度降低可能需要增加剂量)。免疫应答细胞可通过注射、导管等引入。如果需要，还可以包括因子，其包括，但不限于，白细胞介素，例如il-2、il-3、il6、il-11、il-7、il-12、il-15、il-21以及其它白细胞介素，集落刺激因子，例如g-、m-和gm-csf，干扰素，例如γ-干扰素。

本发明公开主题的组合物包括药物组合物，其包括表达靶向cmma的car的免疫应答细胞和药学可接受的载体。给药可以是自体的或非自体的。例如，表达靶向bcma的car的免疫应答细胞和包含它的组合物可以从一个受试者获得，并施用给相同受试者或不同的相容的受试者。可以通过局部注射，包括导管给药、全身性注射、局部注射、静脉内注射或胃肠外给药来给予本发明公开主题的源自外周血的t细胞或其子代(例如，体内、先体外后体内或体外获得的)。当施用本发明公开主题的药物组合物(例如，包括表达靶向bcma的car的免疫应答细胞的药物组合物)时，可以将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、混悬液、乳液)。

vii.制剂

本发明公开主题的通常表达靶向bcma的car的免疫应答细胞和包含其的组合物可以方便地作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、混悬液、乳液、分散液或粘性组合物，其可以缓冲至选定的ph。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物在一定程度上更方便给药，特别是通过注射。另一方面，粘性组合物可以在适当的粘度范围内配制，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包括载体，其可以是含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)及其适当混合物的溶剂或分散介质。

无菌可注射溶液可以通过以下方法来制备：将包括表达本发明公开主题的靶向bcma的car的免疫应答细胞的组合物引入到所需量的合适溶剂与如果需要的各种量的其它成分中。这些组合物可以与合适的媒介物、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等混合。组合物也可以冻干。根据给药途径和所需制剂，组合物可以含有辅助性物质，例如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、ph缓冲剂、凝胶化或增粘添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等。可以参考标准教科书，例如在此并入本文以供参考的“remington’spharmaceuticalscience”，第17版，1985，以制备合适的制剂，而无需过度的实验。

可以加入增强组合物稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以确保防止微生物的作用。可注射药物形式的延长吸收可以通过使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶实现。然而，根据本发明，使用的任何载体、稀释剂或添加剂必须与本发明公开主题的通常表达靶向bcma的car的免疫应答细胞相容。

组合物可以是等渗的，即它们可以具有与血液和泪液相同的渗透压。本发明公开主题的组合物所需的等渗性可以使用氯化钠或其它药学上可接受的试剂例如右旋糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质实现。氯化钠对于含有钠离子的缓冲液来说特别优选。

如果需要，组合物的粘度可以使用药学上可接受的增稠剂保持在选定的水平。可以使用甲基纤维素，因为它容易购得且经济可行并且易于操作。其它合适的增稠剂包括，例如，黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆等。增稠剂的浓度可以取决于所选择的试剂。要点在于使用将会实现所选粘度的量。显然，合适的载体和其它添加剂的选择将取决于确切的给药途径和特定剂型例如液体剂型的性质，(例如，是否将组合物配制成溶液、混悬液、凝胶或其他液体形式，例如延时释放形式或液体填充形式)。

本领域技术人员会认识到，组合物的组分应当选择成在化学上呈惰性，并且不会影响如本发明公开主题所述的免疫应答细胞的存活力或功效。这一点对于化学和药学原理的技术人员来说将不存在问题，或者从本公开内容和本文引用的文献通过参考标准教科书或通过简单实验(不涉及过度实验)，可以容易地避免问题。

关于本发明公开主题的免疫应答细胞的治疗用途的一个考虑是获得最佳效果所必需的细胞的量。要施用的细胞的量将根据所治疗的受试者而变化。在某些实施方式中，将约10⁴至约10¹⁰、约10⁵至约10⁹或约10⁶至约10⁸个本发明公开主题的免疫应答细胞施用至受试者。更有效的细胞可以以甚至更少的量施用。在某些实施方式中，将至少约1x10⁸、至少约2x10⁸、约3x10⁸至约4x10⁸和约5x10⁸个本发明公开的免疫应答细胞施用至人类受试者。何为有效剂量的精确确定可以基于对于每个受试者而言独立的因素，包括具体受试者的体型大小、年龄、性别、体重和病症。剂量可以由本领域技术人员从本公开内容和本领域的知识中容易地确定。

本领域技术人员可以容易地确定组合物中以及要在本发明公开主题的方法中施用的细胞和任选的添加剂、媒介物和/或载体的量。通常，任何添加剂(除了活性细胞和/或试剂之外)在磷酸盐缓冲盐水中以约0.001wt％至约50wt％的溶液的量存在，活性成分以微克至毫克的数量级存在，例如约0.0001wt％至约5wt％、约0.0001wt％至约1wt％、约0.0001wt％至约0.05wt％、约0.001wt％至约20wt％、约0.01wt％至约10wt％或者约0.05wt％至约5wt％。对于要给予动物或人的任何组合物，以及对于任何具体的给药方法，应当确定毒性，例如通过在合适的动物模型例如啮齿动物如小鼠中测定致死剂量(ld)和ld50；和引起适当应答的组合物的剂量、其中组分的浓度和给予组合物的时机来确定毒性。此类确定根据本领域技术人员的知识、本公开内容和本文引用的文献并不需要过度实验。并且，可以在没有过度实验的情况下确定依序给药的时间。

viii.治疗方法

肿瘤微环境。肿瘤具有敌对于宿主免疫应答的微环境，其涉及恶性细胞一系列机制以保护自身免于免疫识别和清除。这种“敌对的肿瘤微环境”包括多种免疫抑制因子，包括浸润性调节性cd4⁺t细胞(treg)、骨髓衍生抑制细胞(mdsc)、肿瘤相关巨噬细胞(tam)、包括il-10和tgf-β的免疫抑制性细胞因子，以及靶向由活化t细胞(ctla-4和pd-1)表达的免疫抑制性受体的配体的表达。这些免疫抑制机制在维持耐受性和抑制不适当的免疫应答中起作用，然而在肿瘤微环境内，这些机制阻止有效的抗肿瘤免疫应答。总之，在遇到靶向的肿瘤细胞时这些免疫抑制因子可以诱导过继转移的car修饰的t细胞显著的无效能化或凋亡。

肿瘤免疫学的挑战。有效的肿瘤免疫需要肿瘤抗原识别和免疫效应细胞的无对抗的肿瘤清除。肿瘤抗原必须包含由肿瘤递呈并且可以被特异性细胞毒性t淋巴细胞(ctl)识别的肽表位。引发的ctl必须扩增到足够数量并迁移至肿瘤位点，在其中它们成熟为效应物以发挥其功能，这种功能通过辅助性t细胞增强并被treg和抑制性巨噬细胞抑制。

用改造的t淋巴细胞的靶向t细胞治疗。t细胞改造是开创性的策略，以潜在解决许多以前观察到的早期免疫治疗方法的缺陷。在过去一年中，研究人员报道了用靶向指定抗原(分别为cd19和ny-eso-1)的自体外周血t细胞获得了在复发^16,17、化学耐药性(chemorefractory)白血病和转移性黑色素瘤^18-20中的显著的完全缓解。

遗传方法的原理：细胞工程可以用于将t细胞重定向至肿瘤抗原并增强t细胞功能。遗传性t细胞修饰的一个动力是增强t细胞存活和扩增并抵消t细胞死亡、无效能化和免疫抑制的潜力。还可以改进t细胞的遗传靶向以防止正常组织的不期望的破坏。

嵌合抗原受体(car)：通过转移编码car的基因，可以产生肿瘤特异性t细胞^21-26。第二代car包括与能够激活t细胞的细胞内信号转导结构域融合的肿瘤抗原结合结构域，以及设计成增强t细胞效能和持续性的共刺激结构域²⁷。因此car设计可以协调抗原识别与信号转导——生理上由两个单独的复合物tcr异质二聚体和cd3复合物承担的两种功能。car的细胞外抗原结合结构域通常来源于鼠单克隆抗体(mab)或来自受体或其配体。因此，抗原识别是非mhc限制的^28，29，因此使用相同的car可以适用于表达靶标抗原的任何患者。通过car的抗原结合触发细胞内结构域中基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的磷酸化，启动溶细胞诱导、细胞因子分泌和增殖所需的信号转导级联。由于抗原识别的mhc限制被绕开，car靶向t细胞的功能不受hla下调或抗原加工机制中缺陷的影响。

t细胞对于扩增和存活的要求：肿瘤特异性t细胞的增殖在体内外(exvivo)是需要的，并且在体内可以说是希望有的。t细胞增殖必须伴随有t细胞的存活，以允许绝对的t细胞扩增和持续。为了响应于抗原而增殖，t细胞必须接收两种信号。一种是由抗原递呈细胞(apc)表面上展示的抗原肽/mhc复合物的tcr识别提供²⁵。另一种由t细胞共刺激受体例如cd28或4-1bb受体提供。虽然t细胞的溶细胞活性不需要伴随的共刺激，但如先前所证明，对于提供共刺激信号以维持过继转移t细胞的抗肿瘤功能，存在关键需求^23,27,30-32。

免疫监测：淋巴细胞是多功能“药物”，其在输注后表现出动态变化效应。在遇到抗原时，肿瘤特异性t细胞激活和/或释放多种可以触发肿瘤杀伤、t细胞增殖和其它免疫细胞的募集或免疫调节的蛋白质。因此，测量哪些蛋白质从哪些细胞以什么数量及在什么时间点分泌，对于具体患者为什么应答或不应答可以提供深入理解，并且为设计更有效的试验提供关键反馈。这些试验系统将允许直接和有意义的临床方法比较，从而有助于设计合理的下一代治疗策略。

对于治疗，给予的量是产生所需效果有效的量。可以在一次或系列给药中提供有效量。可以在推注或通过连续灌注提供有效量。

“有效量”(或“治疗有效量”)是足以在治疗时影响有益或期望的临床结果的量。有效的量可以在一个或多个剂量中给予受试者。在治疗方面，有效量是足以减轻、改善、稳定、逆转或减缓疾病的进展或以其它方式减少疾病的病理学后果的量。有效量通常由医生根据具体情况确定，并且在本领域技术范围内。当确定合适剂量以达到有效量时，通常考虑若干因素。这些因素包括受试者的年龄、性别和体重、所治疗的病症、病症的严重程度以及给予的免疫应答细胞的剂型和有效浓度。

对于使用抗原特异性t细胞的过继免疫治疗，通常输注约10⁶至约10¹⁰(例如约10⁹)范围内的细胞剂量。当免疫应答细胞被给予受试者并随后分化时，免疫应答细胞诱导为特异性地针对一种特定抗原(例如，bcma)。t细胞的“诱导”可以包括例如通过缺失或无效能化实现的抗原特异性t细胞的失活。失活对于建立或重建比如在自身免疫性疾病中的耐受性特别有用。本发明公开主题的免疫应答细胞可以通过本领域已知的任何方法给药，包括但不限于胸膜给药、静脉内给药、皮下给药、结节内给药、肿瘤内给药、鞘内给药、胸膜内给药、腹膜内给药和直接施用于胸腺。在某些实施方式中，免疫应答细胞和包括其的组合物在静脉内施用于需要的受试者。

本发明公开的主题提供使用表达靶向bcma的car的免疫应答细胞(例如，t细胞)的各种方法。例如，本发明公开的主题提供减少受试者的肿瘤负荷的方法。在一个非限定性实例中，减少肿瘤负荷的方法包括将有效量的本发明公开的免疫应答细胞给予受试者，从而在受试者中诱导肿瘤细胞死亡。本发明公开的免疫应答细胞可以减少受试者的肿瘤细胞的数量、减小肿瘤尺寸和/或根除肿瘤。合适的肿瘤的非限定性例子包括多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、成胶质细胞瘤和waldenstrom氏巨球蛋白血症。

本发明公开的主题还提供增加或延长患有瘤形成的受试者的存活的方法。在一非限定性实例中，增加或延长患有瘤形成的受试者的存活的方法包括将有效量的本发明公开的免疫应答细胞给予受试者，从而增加或延长受试者的存活。该方法可以减少或根除受试者的肿瘤负荷。本发明公开的主题进一步提供用于治疗或预防受试者的瘤形成的方法，其包括将本发明公开的免疫应答细胞给予受试者。

本文使用的术语“瘤形成”是指特征在于细胞或组织的病理增殖及其随后向其它组织或器官迁移或侵袭的疾病。瘤形成生长通常是不受控制的和进行性的，并且在不会引起或将导致正常细胞繁殖停止的条件下发生。瘤形成可以影响多种细胞类型、组织或器官，包括但不限于选自膀胱、结肠、骨、脑、乳腺、软骨、神经胶质、食管、输卵管、胆囊、心脏、肠、肾脏、肝脏、肺、淋巴结、神经组织、卵巢、胸膜、胰腺、前列腺、骨骼肌、皮肤、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、泌尿生殖道、输尿管、尿道、子宫、和阴道的器官，或其组织或细胞类型。瘤形成包括癌症，例如肉瘤(sarcomas)、癌(carcinoma)或浆细胞瘤(浆细胞的恶性肿瘤)。

使用本发明公开主题的免疫应答细胞可以抑制其生长的癌症包括通常对免疫治疗有应答的癌症。治疗的癌症的非限定性例子包括多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病(cll)、成胶质细胞瘤和waldenstrom氏巨球蛋白血症。在某些实施方式中，癌症是多发性骨髓瘤。

另外，本发明公开的主题提供响应于受试者中的癌细胞而增加免疫激活细胞因子产生的方法。在一非限定性实例中，该方法包括将本发明公开的免疫应答细胞给予受试者。免疫激活细胞因子可以是粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、tnf-α、il-2、il-3、il-6、il-11、il-7、il-12、il-15、il-21、干扰素调节因子7(irf7)及其组合。在某些实施方式中，本发明公开主题的包括bcma特异性car的免疫应答细胞增加gm-csf、ifn-γ和/或tnf-α的产生。

进行治疗的合适的人受试者通常包括可以通过临床标准区分的两个治疗组。具有“重度疾病”或“高肿瘤负荷”的受试者是具有临床可测量的肿瘤(例如多发性骨髓瘤)的受试者。临床可测量的肿瘤是可以基于肿瘤质量而检测(例如通过触诊、cat扫描、声波图、乳房x线照片或x射线；阳性生化或组织病理学标志物本身不足以识别该群体)的肿瘤。将本发明公开主题所包含的药物组合物给予这些受试者，以引起抗肿瘤应答，目的是减轻他们的病症。理想地，结果是发生肿瘤质量的减少，但是任何临床改善均构成益处。临床改善包括降低风险或进展速率或者减少肿瘤(例如多发性骨髓瘤)的病理后果。

第二组合适的受试者在本领域中称为“辅助组”。他们是具有瘤形成史(例如多发性骨髓瘤)、但已对另一治疗方式有响应的个体。先前的治疗可以包括，但不限于，手术切除、放疗和传统化疗。结果，这些个体没有临床可测量的肿瘤。然而，他们被怀疑在原始肿瘤位点附近或通过转移而处于疾病进展的风险中。该组可以进一步细分为高风险个体和低风险个体。根据在初始治疗之前或之后观察到的特征进行细分。这些特征在临床领域是已知的，并且针对每种不同的瘤形成有适当的定义。通常的高风险亚组典型的特征是肿瘤(例如多发性骨髓瘤)已侵入邻近组织或者显示牵涉到淋巴结的那些。另一组具有瘤形成(例如多发性骨髓瘤)的遗传易感性，但尚未证实瘤形成的临床体征。例如，对于在乳腺癌相关的基因突变测试中呈阳性、但仍处于育龄年纪的妇女，可以希望预防性地接受本文所述的一种或多种抗原结合片段以防止瘤形成的发生，直到适合于进行预防性手术。

受试者可以具有进展形式的疾病(例如多发性骨髓瘤)，在这种情况下，治疗目标可以包括缓解或逆转疾病进展和/或减轻副作用。受试者可以具有病史，例如他们已经经过治疗，在这种情况下，治疗目标通常包括复发风险的降低或延迟。

可以对表达靶向bcma的car的免疫应答细胞(例如，t细胞)引入进一步修饰，以避免或最小化免疫并发症(被称为“恶性t细胞转化”)例如移植物抗宿主病(gvhd)的风险，或者当健康组织表达与肿瘤细胞相同的靶标抗原时，导致与gvhd相似的结果的风险。这个问题的潜在解决方案是将自杀基因改造到表达car的t细胞中。合适的自杀基因包括，但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)、诱导型半胱天冬酶9自杀基因(icasp-9)和截短的人表皮生长因子受体(egfrt)多肽。在某些实施方案中，自杀基因是egfrt多肽。egfrt多肽可以通过施用抗egfr单克隆抗体(例如西妥昔单抗(cetuximab))来使t细胞清除。egfrt可以共价连接到靶向bcma的car的细胞内结构域的3’端。自杀基因可以包括在包括编码本发明公开的靶向bcma的car的核酸的载体中。以这种方式，施用设计成在恶性t细胞转化期间(例如gvhd)激活自杀基因的前药(例如，可以激活icasp-9的ap1903)，引发自杀基因激活的表达car的t细胞的凋亡。ix.药盒

本发明公开的主题提供用于治疗或预防瘤形成(例如多发性骨髓瘤)的药盒。在某些实施方式中，药盒包括治疗性或预防性组合物，该组合物包括有效量的单位剂量形式的包含靶向bcma的car的免疫应答细胞。在具体实施方式中，细胞进一步表达至少一种共刺激配体。在一些实施方式中，药盒包括含有治疗性或预防性疫苗的无菌容器；此类容器可以是盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋子、小袋、泡罩或本领域已知的其它合适的容器形式。此类容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适合于容纳药物的其它材料制成。

如果需要，将免疫应答细胞与用于将细胞施用至具有瘤形成(例如多发性骨髓瘤)或有其发生风险的受试者的说明书一起提供。说明书通常包括关于组合物用于治疗或预防瘤形成(例如多发性骨髓瘤)的使用的信息。在其它实施方式中，说明书包括以下中的至少一种：对治疗剂的说明；用于治疗或预防瘤形成(例如多发性骨髓瘤)或其症状的剂量方案和给药方法；注意事项；警告；适应症；禁忌症；过量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考文献。说明书可以直接印在容器上(当存在时)，或作为标签贴到容器上，或作为单独的纸张、小册子、卡片或折叠式印刷品，在容器中或与容器一起提供。

实施例

除非另有说明，本发明的实施采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，其均在本领域技术人员知晓的范围内。此类技术在文献中有充分解释，比如“molecularcloning:alaboratorymanual”，第二版(sambrook，1989)；“oligonucleotidesynthesis”(gait，1984)；“animalcellculture”(freshney，1987)；“methodsinenzymology”“handbookofexperimentalimmunology”(weir，1996)；“genetransfervectorsformammaliancells”(miller和calos，1987)；“currentprotocolsinmolecularbiology”(ausubel，1987)；“pcr:thepolymerasechainreaction”，(mullis，1994)；“currentprotocolsinimmunology”(coligan，1991)。这些技术适用于生产本发明的多核苷酸和多肽，因此可以在制备和实施本发明时考虑。在下面的部分中将讨论用于具体实施方式的特别有用的技术。

给出以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供如何进行和利用本发明的试验、筛选和治疗方法的充分公开和说明，并且无意于限定发明人视作其发明的范围。

实施例1-不同组织中的bcma表达

通过考察数据库例如癌细胞系百科全书和biogps中的基因表达图谱，在各种恶性和正常组织中评价人bcma的表达。如图2所示，人bcma在淋巴瘤和多发性骨髓瘤中得到高度表达，但在其他恶性组织中没有。正常表达似乎限于b-细胞和浆细胞。基于发明人的靶向cd19的cart细胞的患者经验，这些正常细胞类型潜在的靶向bcma的cart细胞根除可能没有显著的不良反应。任何生理抗体产生的缺乏可以用静脉内免疫球蛋白治疗来解决。

实施例2-bcma特异性28zcar的构建

产生多种独特的针对bcma的完整人scfv，并产生基于这些scfv的car。通过用bcma-fc融合蛋白然后是表达人bcma的3t3细胞筛选完整人scfv噬菌体文库(>6x10¹⁰scfv)，识别出多种scfv。进行测序之后，从79个测序的阳性克隆中发现57个独特的bcma-fc阳性克隆；独特克隆率为72％。针对bcma-3t3的噬菌体抗体克隆和亲代3t3细胞系的facs分析导致确认了25个独特的阳性克隆。

分别使用et140-153scfv(或“et140-3scfv”)、et140-174scfv(或“et140-24scfv”)、et140-187scfv(或“et140-37scfv”)、et140-190scfv(或“et140-40scfv”)和et140-204scfv(或“et140-54scfv”)产生靶向bcma的28zcar3、24、37、40和54。这些靶向bcma的28zcar具有类似的结构，例如，各自均具有包括cd28多肽的跨膜结构域、和细胞内结构域，该细胞内结构域包括：cd3ξ多肽和包括cd28多肽的共刺激信号区，如图1所示。将各个这些靶向bcma的car克隆到逆转录病毒载体中。然后可以将这些病毒载体转导到hek293galv9病毒包装细胞中，以产生用于产生car⁺t细胞的稳定的包装系。

将人t细胞(来自健康供体的未选择的(cd4和cd8)人t细胞)用逆转录病毒转导，以表达这些靶向bcma的car中的每一种，使得t细胞表达这些靶向bcma的28zcar。靶向bcma的car在人t细胞的细胞表面表达通过结合缀合a647的bcma-fc融合蛋白确定。评价靶向bcma的28zcar24的细胞表面表达，并通过流式细胞术验证细胞表面检测，如图3所示。

评价17种人scfv在人bcma和小鼠bcma之间的交叉反应活性。如图4所示，某些scfv例如et140-153scfv(或“et140-3scfv”)和et140-192scfv(或“et140-42scfv”)与小鼠bcma交叉反应，因此，该scfv可以用于同系小鼠研究。

实施例3-bcma特异性car的活性

对本发明公开的bcma特异性28zcar的抗肿瘤活性进行评价。体外数据显示，bcma特异性car特异性地杀死呈递bcma的细胞，包括mm细胞系。例如，如图5所示，表达bcma特异性28zcar24的t细胞杀死过量表达bcma的3t3细胞(但不杀死过量表达无关抗原的对照3t3)。如图6所示，表达bcma特异性28zcar24、40和54的t细胞杀死人mm细胞系。

实施例4-抗bcma抗体的筛选数据

elisa筛选：图21显示了使用特异性scfv噬菌体抗体克隆(et140-3、et140-24、et140-37、et140-40和et140-54)针对bcma抗原进行蛋白质elisa筛选的代表性结果。将elisa板分别用人bcmaecd-fc融合蛋白、对照-fc融合蛋白或者作为空白对照的仅pbs涂覆。将来自针对bcmaecd-fc融合蛋白富集的噬菌体展示淘选池的各个噬菌体克隆在涂覆的板中孵育。通过缀合hrp的抗m13抗体检测噬菌体克隆的结合，并使用tmb底物显色。读取在450nm的吸光度。

facs筛选：图22显示了bcma特异性噬菌体抗体克隆et140-3、et140-24、et140-37、et140-40和et140-54的facs分析的代表性的图。将噬菌体克隆与3t3-bcma细胞系一起孵育，然后与抗m13小鼠抗体一起孵育。最后，再次洗涤之后，将apc标记的抗小鼠igg第二抗体加入到反应中。利用facs测量结合，并表示为平均荧光强度(mfi)。将细胞与单独的第二抗体、与m13k01辅助噬菌体一起孵育、以及仅细胞用作阴性对照。

实施例5-bcma特异性bbzcar的构建

产生多种独特的针对bcma的完整人scfv，如实施例2所述。分别使用et140-153scfv(或“et140-3scfv”)、et140-174scfv(或“et140-24scfv”)、et140-187scfv(或“et140-37scfv”)、et140-190scfv(或“et140-40scfv”)和et140-204scfv(或“et140-54scfv”)产生靶向bcma的28zcar3、24、37、40和54。这些靶向bcma的bbzcar各自均具有包括cd8多肽的跨膜结构域、和细胞内结构域，该细胞内结构域包括：cd3ξ多肽和包括4-1bb多肽的共刺激信号区，如图7所示。将各个这些靶向bcma的car克隆到sfg逆转录病毒载体中，作为例子，含有car载体的4-1bb如图8-12所示。

实施例6-靶向bcma的cart细胞的活性

如图13所示，与无关地靶向4h11-28zmuc16的靶向cart细胞相比较，bcma特异性28zcar24溶解人mm细胞系l363、ncl-h929和u266。所观察的bcma特异性28zcar24表现出的细胞毒性对bcma有特异性，因为它并不溶解bcma阴性、cd19阳性的rajiburkett淋巴瘤细胞系，如图13所示。

实施例7-通过靶向bcma的cart细胞诱导细胞因子分泌

将靶向bcma的28zcar24t细胞特异性地与mm细胞系共培养，诱导与t细胞激活一致的细胞因子分泌图谱。图14显示了将cart细胞与人肿瘤细胞系共培养24h(e:t比1:1)之后的il-2分泌。具有靶向cd19的cart细胞(阳性对照)的淋巴浆细胞性淋巴瘤(cd19⁺)和具有靶向bcma的28zcar24t细胞的mm细胞系显示细胞因子产生的增加。ifng、il-6、tnfa、scd40l、gm-csf均具有类似的分泌图谱(数据未示出)。

实施例8-靶向bcma的cart细胞的抗肿瘤活性

1x10⁷u266人骨髓瘤细胞系细胞在第0天将iv注射到nsg小鼠。在第4天将1x10⁶靶向bcma或靶向cd19的二代cart细胞注射iv。第11天的图像(第7天s/pcart细胞注射)显示与不相关的靶向(cd19)的cart细胞，靶向bcma28zcar54t细胞可以介导抗肿瘤应答。参见图15。

实施例9-靶向bcma的cart细胞的活性

测试了靶向bcma的cart细胞的特异性溶解人骨髓瘤细胞系(hmcl)的能力。靶向cd19的cart细胞或靶向bcma的28zcar24t细胞与表达gfp的肿瘤细胞系set2(急性骨髓性白血病(aml),cd19^-bcma^-)；bcwm1(淋巴浆细胞淋巴瘤(lpl),cd19^-bcma^-)；l363(多发性骨髓瘤(mm),cd19^-bcma⁺)一起孵育。在时间0，gfp⁺肿瘤系的百分比示于图16a。在36小时阳性对照靶向cd19的cart细胞已经特异性地杀死了gfp⁺lpl系，并且类似地靶向bcma的28zcar24t细胞已经特异性地杀死了gfp⁺mm系。参见图16b。

实施例10-抗bcma抗体的表位定位

基于具有n-端生物素+sgsg接头+具有1个氨基酸间隔的15个氨基酸的ecd序列对bcma多肽进行排序。肽库示于表24中。

表24

将肽在pbst(pbs+0.05％tween-20)中以2ug/ml涂覆在链霉亲和素板上。洗涤并用3％bsa阻断之后，进行洗涤，然后分别向孔中加入1ug/mlet140-3、et140-24、et140-54或et901migg1。所有实施例中使用的“migg1”表示可变区是完整人序列且fc部分是小鼠igg1。然后将hrp抗小鼠igg检测抗体加入到每个孔中。最后，使用tmb底物显色。记录a450用于数据分析。结果示于图17-20。如图17和图20所示，et140-3与seqidno:71的多肽7-13(即，氨基酸8-22、9-23、10-24、11-25、12-26、13-27和14-28)结合。如图18和图19所示，对于et140-24或et140-54没有发现线性表位。

总结：将3et140抗体(migg1)与同种型对照et901migg1一起测试其对于bcma-ecd的结合表型。使用由39种肽(n-端生物素+sgsg接头+15个氨基酸，1个氨基酸偏移)组成的肽库用于表位定位elisa。这使得可以搜索bcma-ecd的线性结合表位。使用et901migg1作为每个肽的背景参考。仅et140-3可以识别其表位区：包括seqidno:71的氨基酸14-22的区域，例如seqidno:71的氨基酸8-28。

et140-24和et140-54没有显示任何显著的对于肽库的结合。这表明这两种抗体识别构象表位，而不是bcma的线性表位。

实施例11-通过表面等离子体共振的抗bcma抗体重组抗原

et140-153migg1(或“et140-3migg1”)、et140-174migg1(或“et140-24migg1”)、et140-204migg1(或“et140-54migg1”)和bcma重组抗原之间相互作用的动力学使用biacorex100仪器测量。简言之，通过使biotincapture试剂以2μl/min流过流动池5分钟，将50μg/ml修饰的链霉亲和素固定在传感芯片chipcap上。将10ug/ml生物素酰化bcma-fc蛋白质以30μl/min的速率上样到流动池上3分钟。按照动力学标准方案，进行0.6至15μg/ml的esk1系列注射，每一步由以30μl/min注射3分钟和解离3分钟组成。之后，将表面用由75％v/v8m胍-hcl和25％v/v1mnaoh组成的溶液再生2分钟。使用biacorex100评价软件(2.0.1版)通过全局拟合(1:1langmuir结合模型)得出动力学常数。结合亲和力数据示于表25。

表25

尽管前述本发明公开的主题已经出于清楚理解的目的通过说明和实施例进行了相当程度的说明，说明书和实施例均不应当理解成对本发明公开的主题进行限定。在此将本文引用的所有专利和科学文献的公开内容明确地全文并入作为参考。

参考文献

1.frigyesi,i.,etal.robustisolationofmalignantplasmacellsinmultiplemyeloma.blood123,1336-1340(2014).

2.tai,y.t.,etal.novelafucosylatedanti-bcellmaturationantigen-monomethylauristatinfantibody-drugconjugate(gsk2857916)inducespotentandselectiveanti-multiplemyelomaactivity.blood(2014).

3.carpenter,r.o.,etal.b-cellmaturationantigenisapromisingtargetforadoptivet-celltherapyofmultiplemyeloma.clinicalcancerresearch:anofficialjournaloftheamericanassociationforcancerresearch19,2048-2060(2013).

4.brentjens,r.j.,etal.safetyandpersistenceofadoptivelytransferredautologouscd19-targetedtcellsinpatientswithrelapsedorchemotherapyrefractoryb-cellleukemias.blood118,4817-4828(2011).

5.brentjens,r.j.,etal.eradicationofsystemicb-celltumorsbygeneticallytargetedhumantlymphocytesco-stimulatedbycd80andinterleukin-15.naturemedicine9,279-286(2003).

6.brentjens,r.j.,etal.cd19-targetedtcellsrapidlyinducemolecularremissionsinadultswithchemotherapy-refractoryacutelymphoblasticleukemia.sciencetranslationalmedicine5,177ra138(2013).

7.davila,m.l.,etal.efficacyandtoxicitymanagementof19-28zcartcelltherapyinbcellacutelymphoblasticleukemia.sciencetranslationalmedicine6,224ra225(2014).

8.siegel,r.,naishadham,d.&jemal,a.cancerstatistics,2013.ca:acancerjournalforclinicians63,11-30(2013).

9.boyd,k.d.,etal.theclinicalimpactandmolecularbiologyofdel(17p)inmultiplemyelomatreatedwithconventionalorthalidomide-basedtherapy.genes,chromosomes&cancer50,765-774(2011).

10.shaughnessy,j.d.,jr.,etal.avalidatedgeneexpressionmodelofhigh-riskmultiplemyelomaisdefinedbyderegulatedexpressionofgenesmappingtochromosome1.blood109,2276-2284(2007).

11.gahrton,g.,etal.allogeneicbonemarrowtransplantationinmultiplemyeloma.europeangroupforbonemarrowtransplantation.thenewenglandjournalofmedicine325,1267-1273(1991).

12.pegram,h.j.,etal.tumor-targetedtcellsmodifiedtosecreteil-12eradicatesystemictumorswithoutneedforpriorconditioning.blood119,4133-4141(2012).

13.sabrinabertilaccio,m.t.,etal.low-doselenalidomideimprovescar-basedimmunotherapyincllbyrevertingt-celldefectsinvivo.blood122,4171(2013).

14.bataille,r.,etal.thephenotypeofnormal,reactiveandmalignantplasmacells.identificationof"manyandmultiplemyelomas"andofnewtargetsformyelomatherapy.haematologica91,1234-1240(2006).

15.morgan,r.a.,etal.casereportofaseriousadverseeventfollowingtheadministrationoftcellstransducedwithachimericantigenreceptorrecognizingerbb2.moleculartherapy:thejournaloftheamericansocietyofgenetherapy18,843-851(2010).

16.brentjens,r.j.,etal.safetyandpersistenceofadoptivelytransferredautologouscd19-targetedtcellsinpatientswithrelapsedorchemotherapyrefractoryb-cellleukemias.blood118,4817-4828(2011).

17.brentjens,r.j.,etal.cd19-targetedtcellsrapidlyinducemolecularremissionsinadultswithchemotherapy-refractoryacutelymphoblasticleukemia.sciencetranslationalmedicine5,177ra138(2013).

18.hunder,n.n.,etal.treatmentofmetastaticmelanomawithautologouscd4+tcellsagainstny-eso-1.n.engl.j.med.358,2698-2703(2008).

19.rosenberg,s.a.,restifo,n.p.,yang,j.c.,morgan,r.a.&dudley,m.e.adoptivecelltransfer:aclinicalpathtoeffectivecancerimmunotherapy.nat.rev.cancer8,299-308(2008).

20.dudley,m.e.,etal.adoptivecelltherapyforpatientswithmetastaticmelanoma:evaluationofintensivemyeloablativechemoradiationpreparativeregimens.jclinoncol26,5233-5239(2008).

21.brentjens,r.j.,etal.geneticallytargetedtcellseradicatesystemicacutelymphoblasticleukemiaxenografts.clin.cancerres.13,5426-5435(2007).

22.gade,t.p.,etal.targetedeliminationofprostatecancerbygeneticallydirectedhumantlymphocytes.cancerres.65,9080-9088(2005).

23.maher,j.,brentjens,r.j.,gunset,g.,riviere,i.&sadelain,m.humant-lymphocytecytotoxicityandproliferationdirectedbyasinglechimerictcrzeta/cd28receptor.nat.biotechnol.20,70-75(2002).

24.kershaw,m.h.,etal.gene-engineeredtcellsasasuperioradjuvanttherapyformetastaticcancer.jimmunol173,2143-2150(2004).

25.sadelain,m.,brentjens,r.&riviere,i.thepromiseandpotentialpitfallsofchimericantigenreceptors.curropinimmunol(2009).

26.hollyman,d.,etal.manufacturingvalidationofbiologicallyfunctionaltcellstargetedtocd19antigenforautologousadoptivecelltherapy.jimmunother32,169-180(2009).

27.sadelain,m.,brentjens,r.&riviere,i.thebasicprinciplesofchimericantigenreceptordesign.cancerdiscovery3,388-398(2013).

28.riviere,i.,sadelain,m.&brentjens,r.j.novelstrategiesforcancertherapy:thepotentialofgeneticallymodifiedtlymphocytes.currhematolrep3,290-297(2004).

29.stephan,m.t.,etal.tcell-encodedcd80and4-1bblinduceauto-andtransco-stimulation,resultinginpotenttumorrejection.nat.med.13,1440-1449(2007).

30.krause,a.,etal.antigen-dependentcd28signalingselectivelyenhancessurvivalandproliferationingeneticallymodifiedactivatedhumanprimarytlymphocytes.jexpmed188,619-626(1998).

31.gong,m.c.,etal.cancerpatienttcellsgeneticallytargetedtoprostate-specificmembraneantigenspecificallylyseprostatecancercellsandreleasecytokinesinresponsetoprostate-specificmembraneantigen.neoplasia.1,123-127(1999).

32.lyddane,c.,etal.cuttingedge:cd28controlsdominantregulatorytcellactivityduringactiveimmunization.j.immunol.176,3306-3310(2006).

33.carpenteretal.,b-cellmaturationantigenisapromisingtargetforadoptivet-celltherapyofmultiplemyeloma.clincancerres.2013apr15；19(8):2048-60.

34.wo2013/154760

35.mausetal.,cancerimmunolres(2003)；1(1):26-31

从前面的描述中，显然可以对本文所述的本发明进行变化和修改，以使它适用于各种用途和条件。这些实施方式也在所附权利要求的范围内。

本说明书中提到的所有专利和出版物以及通过登录号或参考号提到的序列均并入本文以供参考，其程度如同每个独立的专利和出版物以及序列被具体地单独指明并入本文以供参考。