本发明涉及一种相对于其野生型基因修饰的细胞,和一种细胞鉴定的方法,所述细胞的特征在于,具有通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白分泌,以及一种鉴定培养基成分的方法,所述培养基成分被优化以用于蛋白质的重组生产,以及一种鉴定培养条件的方法,所述培养条件被优化以用于蛋白质的重组生产,以及一种鉴定化合物的方法,所述化合物特征在于它的抗菌活性,因它拥有破坏细菌细胞膜的性质或具有分析这种化合物对基因不同的细菌细胞种群的影响的性质,以及一种细胞生产方法,所述细胞相对于其野生型已经被基因修饰且具有通过细胞质膜进入胞外空间的优化的蛋白分泌,一种通过这种方法所得的细胞,以及一种蛋白质的生产方法和一种混合物的制备方法。
蛋白质具有巨大的经济效益。例如,在化学合成的各类化合物中,尤其是在对映选择合成、清洁剂,或人或动物的食物中,酶常被用作生物催化剂。在药物成分中可发现其他蛋白质,如抗体、激素和免疫调节剂。
一种制备此类蛋白质的优选方法即是利用重组微生物的生物生产技术。在发酵的过程中,培养这些微生物,使它们通过细胞内蛋白合成产生所需的蛋白质。通过这种生物合成生产途径,可以直接得到天然蛋白质,并且所使用的原材料简单、廉价。例如枯草芽孢杆菌、巴斯德毕赤酵母、大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌或相关菌类,作为微生物常被用于生产蛋白质。
在生物技术过程中,生物和过程参数对生产蛋白质的效率和成本效益至关重要。这些参数例如包括,宿主微生物、菌株/载体组合、蛋白质编码基因的密码子使用、细胞壁传输蛋白质所必需的信号肽(分泌信号肽)、表达水平、诱导时间、温度、培养基成分和生产速度等。
为了用于蛋白质生产的有效生物技术过程的发展,这些参数必须是多样化和优化的。然而,问题在于,不仅上述的每一个参数在很大范围内是可变的,而且不同的参数之间也相互影响,其结果是,必须评估数量巨大的、可能的参数组合。根据现有的技术,仅对优化参数或参数组合的理论预测是不可能的,并且,对于每种特定的蛋白质而言,不同的参数和参数组合被认为是理想化的,因此,每个生产过程必须测试许多不同的参数组合。
为了在一定的菌株中生成不同的性质,所述菌株旨在用于所需蛋白质的重组生产,需运用常规化学或物理诱变步骤(例如mnng或uv),这样,随机突变被诱导至菌株(无向诱变)的基因组中。为了生产蛋白分泌改变的突变体,例如,生成蛋白质编码基因的文库,在所述文库中,蛋白质编码基因序列与不同的分泌信号肽编码序列相融合。为了分析不同培养条件或不同培养基成分的影响,需在这些不同的培养条件和/或这些不同的培养基中培养分泌特定蛋白质的蛋白质分泌菌株。
对基因修饰和优化的培养参数和培养基的搜索通常被称为“筛选”,这带来生产所需蛋白质的生物技术过程的高生产率、高效率和高经济效益。然而,这种筛选过程中的问题表现在:在一个包含多个基因不同的细胞的细胞悬浮液中或在一个各种参数已经被调整的实验装置中(或仅有一种参数发生变化,但也会影响其他参数),几乎不可能清晰地鉴定哪一种基因修饰或哪一个参数才是最终观察到的所需蛋白质生产上升的原因。评估此类所必需的筛选方法,不仅耗时,而且昂贵,并且对每种单独的蛋白质而言,这些方法也是高度特异性的且通常不具有适用性。此外,这些筛选方法取决于所需蛋白质实用筛选测定的可用性,因为只有通过检测培养基中或细胞内蛋白质的催化活性,才能确定特定实验装置中的所需蛋白质的生产量或分泌量。
本发明是基于克服有关基因修饰细胞检测而产生的缺陷这一目的,所述细胞分泌一种特殊的蛋白质。
本发明尤其基于提供一种基因修饰细胞这一目的,在所述基因修饰细胞中,在基因修饰后,或有关培养条件的参数发生变化后,或培养基的成分发生变化后,用一种简单的方式可以鉴定这些变体,这种方式的特征在于特定蛋白质分泌增加,其中也可能简单地将这些细胞从多个不同的细胞中分离出来。此外,鉴定这些不应该依赖于所需蛋白质的性质,所述细胞的特征在于具有增加的特定蛋白质分泌,因此应该适用于所有可在发酵过程中重组产生的蛋白质。
本发明还基于提供一种简单、快速、成本有效地鉴定一种细胞的方法这一目的,所述细胞的特征在于多种基因不同的细胞具有增加的特定蛋白质的分泌,并且特别是将这些细胞从多个基因不同的细胞中分离出来。
本发明还基于提供一种鉴定细胞的方法的目的,即所述细胞培养在特定培养条件或特定培养基中,其特征在于,与培养在不同培养条件下或不同培养基中的相同细胞相比,所述细胞具有增加的特定蛋白质分泌,从而允许以简单、快速、成本有效的方式确定优化的培养条件和/或优化的培养基。
本发明还基于提供一种具有优化的特定蛋白质分泌的基因修饰的细胞的目的,所述细胞中的基因或突变,尤其是这些基因中分泌信号肽的基因或突变的基因被有选择性地引入,通过上述增加细胞质膜的跨膜侧的特定蛋白质的分泌或特定蛋白质的浓度的筛选过程,所述细胞已经被鉴定为合适。
通过构成本发明权利要求书的范畴的主题,对实现上述的至少一个目的做出了贡献。进一步的贡献是由代表本发明具体实施方式的附属权利要求书的主题做出的。
实施方式:
(1)一种相对于其野生型基因修饰的细胞,其中所述细胞包含编码荧光蛋白的基因序列,其中荧光蛋白的表达取决于通过细胞质膜分泌至胞外空间中的蛋白质的量。
(2)根据实施方式(1)所述的细胞,其中所述编码荧光蛋白的基因序列受至少一种异源启动子的控制,所述异源启动子控制野生型细胞中的基因表达,该基因的表达取决于通过细胞质膜分泌至胞外空间中的蛋白质的量。
(3)根据实施方式(1)或(2)所述的细胞,其中所述细胞是棒状杆菌属、埃希氏杆菌属,芽孢杆菌属或分枝杆菌属中的一种细胞。
(4)根据以上任一项实施方式,其中所述启动子是选自于由cg0706启动子、cg0996启动子、cg0998启动子、cg1325启动子、htra启动子、lii启动子、mpra启动子或pepd启动子构成的组别。
(5)根据实施方式(1)至(4)中任一项所述的细胞,其中所述细胞是棒状杆菌属的一种细胞,且其中启动子是cg0706启动子、cg0996启动子、cg0998启动子或cg1325启动子。
(6)根据实施方式(5)所述的细胞,其中所述编码荧光蛋白的基因序列是受cg0996启动子和cg0998启动子组合的控制,该所述组合中,cg0996启动子位于cg0998启动子的上游。
(7)根据实施方式(1)至(4)中任一项所述的细胞,其中所述细胞是芽孢杆菌属中的一种细胞,且其中所述启动子是htra启动子或liai启动子。
(8)根据实施方式(1)至(4)中任一项所述的细胞,其中所述细胞是分枝杆菌属中的一种细胞,且其中所述启动子是mpra启动子或pepd启动子。
(9)根据施方式(1)至(4)中任一项所述的细胞,其中所述细胞是埃希氏杆菌属中的一种细胞,且其中所述启动子是htra启动子。
(10)根据以上所述任一项实施方式所述的细胞,其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白(gfp)或该蛋白的变体。
(11)一种用于鉴定细胞悬浮液中细胞的方法,所述细胞特征在于具有通过细胞质膜进入胞外空间中的增加的蛋白质分泌,包括以下方法步骤:
α1)提供包含实施方式(1)至(10)中任一项所述的细胞的细胞悬浮液;
α2)对细胞基因修饰获得细胞悬浮液,其中相对于通过细胞质膜至胞外空间的蛋白质分泌的量,各细胞均不同。
α3)细胞悬浮液中单个细胞的鉴定,所述细胞具有通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质的分泌。
(12)根据实施方式(11)所述的方法,其中所述方法步骤α2)中的基因修饰是由非靶向诱变或代谢工程进行。
(13)根据执行方式(11)或(12)所述的方法,还包括方法步骤:
α4)从细胞悬浮液中分离鉴定的细胞。
(14)根据实施方式(13)所述的方法,其中所述分离是通过流式细胞术进行。
(15)一种用于鉴定细胞悬浮液中细胞的方法,所述细胞的特征在于具有通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质的分泌,或鉴定包含细胞的细胞悬浮液方法,该细胞特征在于具有通过细胞质膜进入胞外空间的高的蛋白质的分泌,包括以下方法步骤:
β1)提供
-包含实施方式(1)至(10)中任一项所述的多个细胞的细胞悬浮液,其中相对于通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量,所述细胞悬浮液中的细胞彼此不同,
或
-多种细胞悬浮液,每种细胞悬浮液包含实施方式(1)至(10)中任一项所述的细胞,其中相对于通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量,所述细胞悬浮液彼此不同;
β2)在细胞悬浮液或不同的细胞悬浮液中培养不同的细胞;
β3)在细胞悬浮液中鉴定单个细胞,所述细胞具有通过细胞质膜进入胞外空间的高蛋白质分泌,或鉴定包含细胞的单个细胞悬浮液,所述细胞具有通过细胞质膜进入胞外空间的高蛋白质分泌。
(16)一种用于鉴定培养基成分的方法,该培养基成分被优化以用于蛋白质的重组生产,包括以下方法步骤:
γ1)提供多种培养基,所述培养基在成分上相互不同;
γ2)在不同培养基中培养实施方式(1)至(10)中任一项所述的细胞,从而获得多种细胞悬浮液,在所述细胞悬浮液中,由于培养基的成分不同,细胞悬浮液中的细胞在通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量方面彼此不同。
γ3)鉴定包括细胞的这些细胞悬浮液,所述细胞具有通过细胞质膜进入胞外空间的高蛋白质分泌。
(17)一种鉴定培养条件的方法,所述培养条件被优化以用于蛋白质的重组生产,包括以下方法步骤:
δ1)提供包括根据实施方式(1)至(10)中任一项所述的细胞的多种细胞悬浮液;
δ2)在不同培养条件下,在这些细胞悬浮液中培养这些细胞,这样,由于培养条件的不同,不同悬浮液中的细胞在通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量方面是彼此不同的;
δ3)鉴定包括细胞的这些细胞悬浮液,所述细胞具有通过细胞质膜进入胞外空间的高蛋白质分泌。
(18)一种鉴定化合物的方法,所述化合物特征在于其具有抗菌活性,因其具有破坏细菌胞膜的性质或具有分析此类化合物对在不同的生理状态或不同的生长阶段的基因不同的细菌细胞种群、或基因相同的细胞的影响的性质,包括以下方法步骤:
ε1)提供包含根据实施方法(1)至(10)中任一项所述的细胞的细胞悬浮液;
ε2)在化合物存在的前提下,在悬浮液中培养所述细胞;
ε3)通过检测细胞内荧光活性,确定化合物的抗菌活性和浓度相关的抗菌活性。
(19)一种生产细胞的方法,所述细胞相对于其野生型已被基因修饰,其具有通过细胞质膜进入胞外空间的优化的蛋白质分泌,包括以下方法步骤:
i)提供包含根据实施方法(1)至(10)任一项所述的细胞的细胞悬浮液;
ii)对细胞进行基因修饰获得细胞悬浮液,所述细胞悬浮液中的细胞在通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量上是彼此不同的,
iii)在细胞悬浮液中鉴定单个细胞,该细胞具有通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质分泌;
iv)从细胞悬浮液中分离鉴定的细胞;
v)在已鉴定和分离的细胞中鉴定那些基因修饰的基因g1至gn,或哪些基因修饰的突变m1至mn,所述基因修饰的基因或突变导致通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质分泌;
vi)生产相关于其野生型基因修饰的细胞,所述细胞具有通过细胞质膜进入胞外空间的优化的蛋白质分泌,所述细胞的基因组合包含至少一种g1至gn的基因和/或至少一种g1至gn的突变。
(20)根据实施方式(19)所述的方法,其中方法步骤ii)中的基因修饰由非靶向诱变或代谢工程进行。
(21)根据实施方式(19)或(20)所述的方法获得的细胞;
(22)一种蛋白质生产的方法,包括以下方法步骤:
(a)根据实施方式(19)至(20)所述的方法生产一种相对于其野生型基因修饰的细胞,,所述细胞具有通过细胞质膜进入胞外空间的优化的蛋白质分泌;
(b)在细胞从营养素中产生蛋白质的条件下,在含有营养素的培养基中培养所述细胞。
(23)根据实施方式(22)所述的方法,其中所述的蛋白质是一种激素、毒素、抗体、结构蛋白、酶、转运蛋白、储藏蛋白、通道蛋白、调节蛋白、荧光蛋白或具有选择性结合、聚合、涂层、稳定、修复、同位素容量的蛋白质。
(24)一种混合物的制备方法,包括以下方法步骤:
(a)通过实施方式(22)或(23)任一项中的方法生产蛋白质;
(b)将蛋白质与所述蛋白质相异的混合物成分相混合。
(25)根据实施方式(24)所述方法,其中所述混合物是一种食物、动物饲料、药物组合物、用于食物生产的组合物、胶合组合物、纺织整理组合物或木质纤维分解组合物。
本发明涉及一种相对于其野生型基因修饰的细胞,所述细胞包含编码荧光蛋白的基因序列,其中荧光蛋白的表达取决于通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量。
所述胞外空间通过细胞质膜与细胞质空间(细胞质)分离。本文所用的短语“胞外空间”通常包括细胞质膜上或细胞质膜之外的任何体积元素(当从细胞质空间观察时),包括肽聚糖层及周质和细菌外膜(在革兰氏阴性菌和二层(diderm)革兰氏阳性菌,或具有外膜的革兰氏阳性菌的情况下)。短语“胞外空间”还包含距细胞质膜的直接周边更远的区域,包括培养上清液的总体积。
细胞的“野生型”优选地理解为,基因组以例如通过进化自然形成的状态而存在的细胞。所述术语用于整个细胞及个体基因。因此,特别是那些基因序列已经至少部分通过重组的方法为人类所修饰的细胞或基因,不能被归入术语“野生型”。
根据本发明,所述被修饰的细胞优选地是一种通过细胞质膜将特定蛋白质分泌进入胞外空间的细胞。本文所用的术语“蛋白质”,最广义地理解为,包含两个或以上通过肽键连接的氨基酸的化合物,所述化合物是细胞蛋白质生物合成的产物。因此,短语“蛋白质”不仅包括更高分子量的蛋白质(例如,具有大于10,000da分子量的蛋白质),而且还包括二肽、三肽、四肽、五肽,以及包含多达10个氨基酸的寡肽、包含10至100个氨基酸的多肽和包含100个以上氨基酸的大分子肽。此外,根据蛋白质的性质,除聚合氨基酸之外,所述蛋白质可能还包括,例如由共转译或转译后的糖基化产生的残糖基等另外的成分。
所述蛋白质,例如,可以是一种激素、毒素、抗体、结构蛋白(例如胶原)、酶、转运蛋白或调节蛋白等。合适的蛋白质可以选自以下组别:人生长激素、去n-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素;生长因素释放因子;甲状旁腺激素;甲状腺素;脂蛋白;α1抗胰蛋白酶;胰岛素a链;胰岛素b链;胰岛素原;促卵泡激素;降钙素;黄体生成素;胰高血糖素;凝血因子如因子viiic、因子ix,组织因子和假性血友病因子;抗凝血因子如蛋白c;心房利钠因子;肺表面活性剂;纤溶酶原激活物,如尿激酶或人尿或组织型纤溶酶原激活物(t-pa);蛙皮素;凝血酶;造血生长因子;肿瘤坏死因子-α和肿瘤坏死因子-β,脑啡肽;血清白蛋白,如人血清白蛋白;抑菌物质;松弛素a链;松弛素b链;松弛素原;小鼠促性腺激素相关肽;微生物蛋白,如β-内酰胺酶;dna酶;抑制素;激活素;血管内皮生长因子;激素或生长因子受体;整合素;血小板生成素;蛋白a或d;类风湿因子;神经营养因子,如骨源神经营养因子(bdnf),神经营养因子-3,-4,-5或-6(nt-3,nt-4,nt-5或nt-6)或神经生长因子如ngf-β;血小板衍生生长因子(pdgf);成纤维细胞生长因子如afgf和bfgf;表皮生长因子(egf);转化生长因子(tgf)如tgf-β和tgf-β,包括tgf-β1,tgf-β2,tgf-β3,tgf-β4或tgf-β5;胰岛素生长因子-i和-ii(igf-i和igf-ii);胰岛素生长因子结合蛋白;cd蛋白如cd-3,cd-4,cd-8和cd-19;促红细胞生成素;骨诱导因子;免疫毒素;骨形态发生蛋白(bmp);生长激素;诸如干扰素-α,β-和γ-的干扰素;集落刺激因子(csf),例如m-csf,gm-csf和g-csf;白细胞介素(il),例如il-1至il-10;超氧化物歧化酶;t细胞受体;表面膜蛋白;衰变加速因子;病毒抗原,例如艾滋病包膜的一部分;转运蛋白;归巢受体;地址素;调节蛋白;抗体;以及上述列出任何一项多肽片段。合适的酶包括转谷氨酰胺酶,脱氢酶(例如醇脱氢酶),单加氧酶,脂肪酶,蛋白酶,纤维素酶,糖苷酶(例如淀粉酶,木聚糖酶,蔗糖酶,麦芽糖酶,阿拉伯糖酶,异麦芽糖酶或果糖酶),核酸酶(例如核糖核酸酶,脱氧核糖核酸酶,外切核酸酶,内切核酸酶,拓扑异构酶或连接酶),磷酸酶(例如植酸酶或碱性磷酸酶),聚合酶(例如dna-聚合酶或rna-聚合酶)以及裂解酶。
根据本发明,特别优选的细胞指的是下列菌属中这些细胞:棒状杆菌属,短杆菌属,芽孢杆菌属,乳杆菌属,乳球菌属,假丝酵母属,毕赤酵母属,克鲁维酵母属,酵母属,埃希氏杆菌属,发酵单胞菌属,耶氏酵母属,分枝杆菌属,甲基杆菌属,罗尔斯通菌属和假单胞菌属,其中特别优选的是黄色短杆菌,乳糖发酵短杆菌,大肠杆菌,酿酒酵母,乳酸克鲁维酵母,布朗克假丝酵母,皱落假丝酵母,谷氨酸棒杆菌,有效棒杆菌,运动发酵单胞菌,解脂耶氏酵母,扭脱甲基杆菌,罗尔斯通氏菌和巴斯德毕赤酵母。根据本发明,最优选的细胞是棒状杆菌属,芽孢杆菌属,分枝杆菌属,埃希氏杆菌属,酵母属和毕赤酵母属的细胞,其中谷氨酸棒杆菌,枯草芽孢杆菌和大肠杆菌是非常特别优选的菌株。
特别适合的细胞是选自由以下杆菌构成的组别:谷氨酸棒状杆菌atcc13032,乙酰谷氨酸棒杆菌atcc15806,嗜醋酸棒杆菌atcc13870,栖糖蜜棒杆菌atcc17965,嗜热氨基棒状杆菌fermbp-1539,黄色短杆菌atcc14067,乳发酵短杆菌atcc13869和短枝短杆菌atcc14020,以及突变体和由其产生的分泌蛋白质的菌株。
根据本发明,相对于其野生型基因修饰的细胞特征在于,它们包含编码荧光蛋白的基因序列,其中荧光蛋白的表达取决于通过细胞质膜分泌到胞外空间的蛋白质的量。
本领域技术人员已知的所有编码荧光蛋白的基因序列可能是一种编码荧光蛋白的基因序列。编码自发荧光蛋白的aequora基因属的基因序列特别合适,例如在不同波长范围内荧光的绿色荧光蛋白(gfp)及其变体(例如黄色荧光蛋白,yfp;蓝色荧光蛋白,bfp;青色荧光蛋白,cfp),或者荧光增强的绿色荧光蛋白(gfp)及其变体(例如增强的gfp或egfp,或eyfp,ebfp或ecfp)。然而,编码其他荧光蛋白的基因序列可用的还有,例如出自美国franklinlakes,bdbiosciences的dsred,hcred,asred,amcyan,zsgreen,acgfp,zsyellow。合适的编码荧光蛋白的基因序列还有,例如基于荧光蛋白(fbfp)的黄素单核苷酸,所述黄素单核苷酸可从德国蒙海姆的evocatalgmbh公司获得。
根据该特征,荧光蛋白的表达取决于通过细胞质膜分泌到胞外空间的蛋白质的量,并且根据本发明的转译水平,因该蛋白可以实现分泌功能,因此荧光蛋白的表达受细胞的控制。根据通过细胞质膜分泌到胞外空间的蛋白质的量,所以,可以形成能在该糖体中被翻译形成荧光蛋白的或多或少的mrna。
在这方面,表达的控制在翻译水平上会受到至少一种异源启动子控制的编码荧光蛋白的基因序列的影响,在野生型细胞中,该异源启动子控制基因表达,而野生型细胞中该基因的表达则取决于通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量。随后,编码荧光蛋白且受所述启动子控制的dna序列被称为“传感器”。
术语“受至少一种异源启动子控制”表示自然方式的启动子不会调节编码荧光蛋白的基因序列的表达,特别是在源细胞中有至少一种启动子被分离和选择性地被基因修饰以进一步提高启动子效率。在这方面,术语“源于此启动子”指的是,至少一种根据本发明包含在被基因修饰的细胞(如包含传感器的细胞)中的启动子以及调节编码荧光蛋白的基因序列的表达的启动子,不必是源细胞中拥有相同核酸序列的启动子。相反,为了提高启动子效率,所述启动子序列可以通过插入、删除或交换单个碱基的方式被修饰,例如单个核酸序列的回文。至少一种调节编码荧光蛋白的基因序列的表达的启动子也不一定是一种被包含在已经被基因修饰的细胞本身的基因组(例如,根据本发明包含传感器的细胞基因组)中的启动子或源于该启动子的启动子。然而,如果至少一种启动子是包含在已经被基因修饰的细胞本身的基因组中的启动子或源于该启动子的启动子,且在该已经被基因修饰的细胞中,启动子控制基因表达,而基因表达取决于通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量,那么它可能被证明完全是有利的。
根据本发明,细胞中编码荧光蛋白的基因序列受至少一种启动子的控制。本文中所述术语“受至少一种启动子的控制”优选地理解为,编码荧光蛋白的基因序列与至少一种启动子功能性地连接。如果这两种序列以及任选的进一步调节元素(例如终止子)被依次排列,使每个调节元素能在核酸序列的转基因表达中实现其功能,那么所述至少一种启动子和编码荧光蛋白的基因序列会被功能性地连接起来。为此,化学意义上的直接连接并非绝对必要的。基因控制序列,例如强化因子序列,也可以在从进一步移除的位置的靶序列上或甚至从其它dna分子上发挥其功能。优选编码荧光蛋白的基因序列的排列位于启动子序列(如3’末端)之后,以使两个序列彼此共价连接。编码荧光蛋白的基因序列和启动子也可能被功能性地彼此连接起来,这样,在这两个基因序列之间,仍然有同源基因的部分序列(也就是说,野生型细胞的基因表达受启动子的调节)。在这样的dna构建体的表达中,可获得源自于荧光蛋白和氨基酸序列的融合蛋白质,所述氨基酸序列由相应的同源基因的部分序列编码。同源基因的部分序列的长度并非关键,只要用特定波长的光激发其荧光属性时,其荧光蛋白的功能能力没有明显受损。
除了至少一种启动子和编码荧光蛋白的基因序列外,根据特定实施方式,依据本发明,细胞也可以包含编码调节子的基因序列,其中所述调节子优选地是一种以任何方式直接或间接地与通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质相互作用的蛋白质,或与此类蛋白质的变体相互作用的蛋白质,尤其是与错误折叠的蛋白质相互作用的蛋白质。调节子和蛋白质之间这种直接或间接的相互作用会对dna聚合酶的启动子序列的亲和配基产生影响,并依赖于通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量。在这方面,调节子原则上可以是一种活化剂或抑制剂。
根据本发明,可能的启动子在原则上是通常通过功能性连接控制基因序列的所有启动子,所述基因的表达取决于通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量。此类基因编码的蛋白质优选地属于包含以下物质的组别:蛋白酶,肽酶,热休克蛋白,噬菌体休克蛋白,σ因子,抗σ因子,双组份信号转导系统,三组分信号转导系统,abc转运蛋白,膜结合蛋白,周质蛋白,假定分泌蛋白,调节蛋白(通过其自身进一步调节的蛋白),涉及细胞壁生物发生的蛋白质,参与磷壁酸生物起源的蛋白,青霉素结合蛋白,涉及外膜生物发生的蛋白,膜相关分子伴侣,周质分子伴侣,对细胞壁抗生素(如杆菌肽,万古霉素)有反应的蛋白,对碱性休克有反应的蛋白,对洗涤剂有反应的蛋白,对苯酚有反应的蛋白,对有机溶剂有反应的蛋白,涉及渗透保护的蛋白,或对sec依赖性蛋白分泌、细胞壁抗生素。碱性休克、洗涤剂、苯酚或有机溶剂等有反应的功能未知的蛋白等。
所述启动子进一步还可以是在具有通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质分泌的情况下,与特定活化剂相互作用并用这种方式引起编码荧光蛋白的基因序列表达的启动子,或是受抑制子抑制的启动子,在蛋白质通过细胞质膜被分泌至胞外空间的情况下,所述抑制子从启动子扩散开,结果抑制子对启动子的抑制被消除,编码荧光蛋白的基因序列表达受到影响。
根据本发明,下面将对细胞合适的例子作更详细的描述。然而,在这一点上应强调的是,本发明不局限于以下实施例。
所述基因修饰的细胞可能是一种基因修饰的棒状杆菌细胞,其包含受以下启动子控制的编码荧光蛋白的序列:cg0706启动子(pcg0706)或其变体,cg0996启动子(pcg0996)或其变体,cg0998启动子(pcg0998)或其变体,cg1325启动子(pcg1325)或其变体或这些启动子或变体的组合,特别是cg0996启动子(pcg0996)或其变体和cg0998启动子(pcg0998)或其变体的组合,在该组合中,cg0996启动子(pcg0996)或其变体位于cg0998启动子(pcg0998)或其变体的上游,其本身被融合至编码荧光蛋白基因序列的序列。如果编码荧光蛋白的序列受cg0996启动子(pcg0996)或其变体和cg0998启动子(pcg0998)或其变体的组合的控制,且在这个组合中,通过多达2500个碱基对,优选地多达1000个碱基对,更优选地多达200个碱基对,cg0996启动子(pcg0996)或其变体位于cg0998启动子(pcg0998)或其变体的上游,cg0998启动子或其变体的序列可以直接被连接到cg0996启动子或其变体,或可以与cg0996启动子,或其变体分离。
在这种情况下,通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质的分泌导致荧光蛋白的表达。在cg0706启动子、cg0998启动子、cg1325启动子或这些启动子的变体的情况下,除所述启动子和受所述启动子控制的荧光蛋白序列外,细胞进一步包含编码cg0706-cg1325-调节子的基因序列或该序列变体、或编码cg0996-cg0998-调节子的基因序列或该序列变体。cg0706启动子的dna序列与seqidno.01相对应,cg0996启动子的dna序列与seqidno.02相对应,cg0998启动子的dna序列与seqidno.03相对应,cg1325启动子的dna序列与seqidno.04相对应。cg0706-cg1325-调节子的dna序列编码与seqidno.05相对应,cg0996-cg0998-调节子的dna序列编码与seqidno.06相对应。
所述基因修饰的细胞可能是一种基因修饰的芽孢杆菌细胞,其包含受htra-启动子(phtra)或其变体控制的编码荧光蛋白的序列。在这种情况下,通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质分泌也会导致荧光蛋白的表达。在htra启动子的情况下,除所述启动子和受所述启动子控制的荧光蛋白序列外,细胞进一步包含一种编码css-调节子的基因序列或所述序列变体。受css-调节子调节的htra-启动子的dna序列与seqidno.07相对应,css-调节子的dna序列编码与seqidno.08相对应。
所述基因修饰的细胞可能是一种基因修饰的芽孢杆菌细胞,其包含受lial-启动子(plial)或其变体控制的、编码荧光蛋白的序列。在这种情况下,通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质分泌也会导致荧光蛋白的表达。在lial-启动子的情况下,除所述启动子和受所述启动子控制的荧光蛋白序列外,细胞进一步包含编码liar-蛋白的基因序列或所述序列变体,编码liaf-蛋白的基因序列或所述序列变体,编码lias-蛋白的基因序列或所述序列变体,或这些序列中两者或多者的组合。受liar-调节子调节的lial-启动子的dna序列与seqidno.09相对应,编码liar-调节子的dna序列与seqidno.10相对应,编码liaf-调节子的dna序列与seqidno.11相对应,编码lias-调节子的dna序列与seqidno.12相对应。
所述基因修饰的细胞可能是一种基因修饰的分枝杆菌属细胞,其包含受mpra-启动子(pmpra)或其变体控制的、编码荧光蛋白的序列。在这种情况下,通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质分泌也会导致荧光蛋白的表达。在pmpra-启动子的情况下,除所述启动子和受所述启动子控制的荧光蛋白序列外,细胞进一步包含编码mprb-调节子的基因序列或所述序列变体,编码σ因子σe(sige)的基因序列或所述序列变体,或这两种序列的组合。以σ因子σe(sige)的方式受mprb-调节子调节的mpra-启动子的dna序列与seqidno.13相对应,编码mprb-调节子的dna序列与seqidno.14相对应,编码σ因子σe(sige)的dna序列与seqidno.15相对应。
所述基因修饰的细胞可能是一种基因修饰的埃希氏菌属细胞,其包含受htra-启动子或其变体控制的编码荧光蛋白的序列。在这种情况下,通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质分泌也会导致荧光蛋白的表达。在htra-启动子的情况下,除所述启动子和受所述启动子控制的荧光蛋白序列外,细胞进一步包含编码cpxr-调节子的基因序列或其序列变体。受cpxr-调节子调节的htra-启动子的dna序列与seqidno.16相对应,编码cpxr-调节子的dna序列与seqidno.17相对应。
以上在描述特定启动子x或特定编码调节子的基因序列y时所用的术语“变体”,包括:
(1)所有的核酸,所述核酸至少70%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,至少99.5%,至少99.6%,至少99.7%,至少99.8%或至少99.9%,最优选100%分别与基因序列x和y相同,所述同一性为对应核酸的总长度的同一性;
(2)在编码一种特定调节子的基因序列y的情况下,所有的核酸编码氨基酸序列,所述氨基酸序列至少70%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,至少99%,至少99.5%,至少99.6%,至少99.7%,至少99.8%或至少99.9%,最优选100%与对应的调节子的氨基酸序列相同;
(3)在一种编码特定调节子的基因序列y的情况下,所有核酸编码同一种调节子,但由于基因编码的退化,与基因序列y相异;
(4)在严格的条件下,所有核酸分别与序列x和y的互补序列杂交。
本文所用的术语“杂交”包括“核酸分子链通过碱基配对与互补链相结合的任何过程”(j.coombs(1994)dictionaryofbiotechnology,stocktonpress,newyork)。杂交和杂交的强度(即核酸分子之间的关联强度)受以下因素的影响:如核酸和分子之间的互补程度,所涉及条件的严格性,所形成的杂交体tm,以及核酸分子内g:c比例。
如本文所用,术语“tm”用于指“熔融温度”。熔融温度是指一个双链核酸分子半解离为单链时的温度。用于计算核酸分子tm的反应式是本领域中已知的。如标准参考文献所示,当核酸分子在1mnacl(参见例如andersonandyoung,quantitativefilterhybridization,innucleicacidhybridization(1985))的水溶液中时,tm值的简单估算可以通过以下等式计算:tm=81.5±0.41(%g+c)。其他参考文献包括更复杂的计算,所述计算考虑了结构和序列特征。严格条件是本领域技术人员所熟知的,并且能在currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,n.y.(1989),6.3.1-6.3.6.中查询到。
特别地,术语“严格条件”指的是这种条件:其中作为互补核酸分子(dna、rna、ssdna或ssrna)的片段或与互补核酸分子相同的100个连续核苷酸或更多、150个连续核苷酸或更多、200个连续核苷酸或更多或者250个连续核苷酸或更多在下述条件下与特定核酸分子(dna、rna、ssdna或ssrna)杂交,所述条件等价于在7%十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4、1mmedta中于50℃杂交,用2xssc、0.1%sds于50℃条件下洗涤,优选为65℃条件下洗涤。优选地,杂交条件等价于在7%十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4、1mmedta中于50℃条件下杂交,用1xssc、0.1%sds于50℃或65℃、优选于65℃条件下洗涤;更优选地,杂交条件等价于在7%十二烷基硫酸钠(sds)、0.5mnapo4、1mmedta中于50℃杂交,用0.1xssc、0.1%sds于50℃或65℃、优选于65℃条件下洗涤。优选地,互补核苷酸与整个frua核酸或其片段杂交。可选地,优选的杂交条件涵盖于1xssc中在65℃或于1xssc和50%甲酰胺中在42℃条件下杂交,并随后于0.3xssc中在65℃条件下洗涤,或于4xssc中在50℃条件下或于6xssc和50%甲酰胺中在40℃条件下杂交,并随后于2xssc中在50℃条件下洗涤。其它优选的杂交条件为0.1%sds、0.1ssd和65℃。
因此,原则上,根据本发明,生产包含上述启动子和核酸的细胞的各种可能性是存在的,所述核酸编码荧光蛋白并受该启动子的控制。
第一种可能性包括,例如开始于一种细胞,所述细胞基因组已经包含上述的一种启动子,优选地为编码相应调节子的基因序列,然后引入到编码荧光蛋白的基因序列的基因组中,如此一来,所述基因序列受到启动子的控制。在适当的情况下,在编码荧光蛋白的基因序列整合前或整合后,启动子本身的核酸序列可被修饰,方法是通过一个或更多核苷酸交换、核苷酸缺失或核苷酸插入,目的是为了提升启动子效率。
第二种可能性包括,例如向细胞引入一个或更多个包含启动子序列和基因序列的核酸构建体,所述基因序列编码蛋白质并受所述启动子的控制,此处为了提升启动子效率,也可能通过一个或多个核苷酸交换、核苷酸缺失或核苷酸插入来修饰启动子本身的核酸序列。核酸构建体插入可以在染色体上或染色体外进行,例如在染色体外复制载体上。合适的载体是指在特定菌株中复制的载体。许多已知的质粒载体,如pz1(menkeletal.,appliedandenvironmentalmicrobiology(1989)64:549-554),pekex1(eikmannsetal.,gene102:93-98(1991)),或phs2-1(sonnenetal.,gene107:69-74(1991)),其是基于隐蔽性质粒phm1519,pbl1orpga1。其他质粒载体,如基于pcg4(us4,489,160)或png2(serwold-davisetal.,femsmicrobiologyletters66,119-124(1990)),或pag1(us5,158,891)的质粒载体,则可以同样的方式使用。然而,所述列表并不限制本发明。
用于生产基因构建体的方法说明是本领域中技术人员所熟知的,如martin等人(bio/technology5,137-146(1987)),guerrero等人(gene138,35-41(1994)),tsuchiya和morinaga(bio/technology6,428-430(1988)),eikmanns等人(gene102,93-98(1991)),美国专利申请us4,601,893中的ep-a-0472869,schwarzer和pühler(bio/technology9,84-87(1991),remscheid等人(appliedandenvironmentalmicrobiology60,126-132(1994)),labarre等人(journalofbacteriology175,1001-1007(1993)),wo-a-96/15246,malumbres等人(gene134,15-24(1993)),jp-a-10-229891,jensen和hammer(biotechnologyandbioengineering58,191-195(1998))以及已知的基因学和分子生物学教科书。所述方法说明包括一种启动子和一种受该启动子控制的基因序列,和将这种构建体整合到细胞的染色体中,或将包含所述基因构建体的染色体外复制载体转移到细胞中。
本发明还涉及鉴定细胞的方法,所述细胞特征在于具有通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质分泌,包括以下方法步骤:
α1)提供一种包含所述细胞的细胞悬浮液,根据本发明该细胞相对于其野生型已经被基因修饰且包括一种编码荧光蛋白的基因序列,其中荧光蛋白的表达取决于通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量;
α2)通过细胞的基因修饰可获取细胞悬浮液,该细胞悬浮液中的细胞在通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量上是不同的;
α3)在细胞悬浮液中鉴定个体细胞,该细胞具有通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质的分泌;
α4)将所述鉴定的细胞从细胞悬浮液中有选择地分离开。
根据本发明,在方法的步骤α1)中,首先提供一种包含营养素培养基和大量上述已经基因修饰细胞的细胞悬浮液。
根据本发明,在方法的步骤α2)中,为了获取一种细胞悬浮液,所述细胞悬浮液中一种或多种细胞然后被基因修饰,在该细胞悬浮液中的细胞在通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量上不同;
细胞悬浮液的基因修饰可以通过靶向或非靶向诱变、或通过代谢工程尤其为非靶向诱变而进行。
在靶向诱变中,尤其是细胞基因的突变是以受控的方式而生成。可能的突变为转变、颠换、插入和缺失。根据氨基酸交换对酶活性的影响,可以参考“错义突变”或“无义突变”。基因中至少一个碱基对的插入或缺失会导致“框架疑为突变”,其结果是错误的氨基酸被包含在内或翻译过早中断。几个密码子的缺失通常导致酶活性完全丧失。产生这种突变的方法说明是一种先进技术且可以在已知的基因学和分子生物教科书中找到,例如knapp(“molekularegenetik”,6thedition,georgthieme-verlag,stuttgart,germany,1995)、winnacker(“geneundklone”,vchverlagsgesellschaft,weinheim,germany,1990)或hagemann(“allgemeinegenetik”,gustavfischer-verlag,stuttgart,1986)主编的教科书。涉及靶向诱变方法的细节,尤其是有用的文献参考,可以在例如de-a-10224088中找到。
然而,如果方法步骤α2)中的基因修饰由非靶向诱变进行,那么根据本发明,这种情况是优选的。所述非靶向诱变的实施例是用化学物质处理细胞,如n-甲基-n-硝基-n亚硝基胍或紫外线照射细胞。诱导突变的这种方法通常是已知的,并且可以特别在miller(“ashortcourseinbac-terialgenetics,alaboratorymanualandhandbookforescherichiacoliandrelatedbacte-ria”(coldspringharborlaboratorypress,1992))或美国细菌学协会手册“manualofmethodsforgeneralbacteriology”(washingtond.c.,usa,1981)。
根据本发明中另一个过程的实施例,如果在方法步骤α2)中的基因修饰是通过代谢工程实现的,那么它也是可能的。本文所述的术语“代谢工程”指的是基因细胞信息的靶向基因修饰。这种修饰包括将基因引入到不属于该物种的物种中(如异源基因),天然基因(如同源基因)的复制,基因缺失,同源或异源基因的重排,或调节序列,例如信号序列、衰减子、启动子或终止子的引入。进行代谢工程的方法是本领域中已知的,且可以从已知的基因学和分子生物学教科书中获得,例如mülhardt的“theexperimenter:molecularbiology/genomics”,6thedition,spektrumakademischerverlag,heidelberg,germany,2009,及wink的“molecularbiotechnology:concepts,methodsandapplications”,2ndedition,wiley-vchverlaggmbh&co.kgaa,weinheim,germany,2011。
代谢工程的一个实施例是调节序列的引入,该调节序列编码sec-信号肽,以及当与编码蛋白序列的基因直接或间接融合时,会导致从细胞中分泌融合蛋白(ruschandkendall,2007,“interactionsthatdrivesec-dependentbacterialproteintransport”,biochemistry46,9665e9673;bendtsenetal.,2004:“improvedpredictionofsignalpeptides:signalp3.0”,j.mol.biol.340,783e795;nielsenetal.,1997:identificationofprokaryoticandeukaryoticsignalpeptidesandpredictionoftheircleavagesites”,proteineng.10,1e6;vonheijneandabrahmsen,1989:“thestructureofsignalpeptidesfrombacteriallipoproteins”,proteineng.2,531e534;vonheijne,1989:“species-specificvariationinsignalpeptidedesign:implicationsforproteinsecretioninforeignhosts”,febslett.244,439e446;dalbeyetal.,2012:“membraneproteasesinthebacterialproteinsecretionandqualitycontrolpathway”,microbiol.mol.biol.rev.76,311e350)。代谢工程的其他实施例是蛋白编码基因的密码子使用的变化,受蛋白编码基因控制的启动子的变化,或蛋白编码基因上游区域中核糖体结合点位的变化。
通过方法步骤α2)中的细胞基因修饰,根据细胞中发生的突变的性质,尤其在特定细胞中,例如作为酶活性增加或下降、特定酶表达增加或下降、特定转运蛋白活性上升或下降、特定转运蛋白表达上升或下降的结果,以及作为调节蛋白中的突变、调节序列的突变、结构蛋白的突变、rna调控因子的突变、新的(异源的)酶活性的引入、新的(异源的)调节蛋白的引入、新的(异源或合成)调节序列的引入、新的(异源的)结构蛋白引入、或新的(异源的)rna调控因子的引入的结果,通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质可能会增加,通过启动子与相应调节蛋白相互作用,这会影响荧光蛋白的表达。因此,作为突变的结果,通过细胞质膜至胞外空间的蛋白质分泌增加的细胞的区别在于,所述细胞中形成了荧光蛋白。因此,对通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质分泌而言,荧光蛋白基因扮演着报告基因的角色。
根据本发明,在方法步骤α3)中,细胞悬浮液中的细胞因此可以通过检测细胞内荧光活性而被鉴定,所述细胞具有通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质分泌。为此,细胞悬浮液暴露在高频电磁辐射中可以激发荧光蛋白发光。
根据本发明所述方法的独特结构,优选地直接在方法步骤α3)中的细胞鉴定之后,进一步执行方法步骤α4),在该方法步骤中,所述鉴定的细胞从细胞悬浮液中被分离,此分离过程优选地以流式细胞术(facs=荧光激活细胞分选术)的方式进行,特别优选地以高效流式细胞术(ht-facs=高通量荧光激活细胞分选术)的方式进行。流式细胞术方法分析细胞悬浮液的细节可以在以下文献中找到,例如,在sacku,tarnoka,rotheg(eds.):
通过本发明所述的方法,在细胞已经产生靶向或非靶向突变或者代谢工程已经改变基因信息的细胞悬浮液中,因此以靶向、不会影响所述细胞活力的方式来分离这些细胞是可能的,在所述细胞中,突变导致了通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质的分泌。
根据本发明,传感器不仅可以用来鉴定基因修饰,所述基因修饰导致通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白质的分泌,而且还可以用来:
-在包含多个基因不同的细胞悬浮液中鉴定细胞,所述细胞的特征在于具有通过细胞质膜进入胞外空间的很高的蛋白质的分泌;
-为通过细胞质膜进入胞外空间的蛋白质分泌优化细胞培养条件;
-为通过细胞质膜进入胞外空间的蛋白质分泌优化细胞培养基;
-鉴定化合物,该化合物特征在于其具有抗菌活性,原因是其能破坏细菌细胞膜的性质或其能分析此类化合物对基因不同的细菌细胞的影响的性质。
所述方法包括方法步骤β1)至β3),γ1)至γ3),(δ1)至δ3)或ε1)至ε3),如下所述:
本发明还涉一种及细胞悬浮液中细胞鉴定的方法,所述细胞特征在于具有通过细胞质膜进入胞外空间的高蛋白质分泌,或鉴定包含细胞的细胞悬浮液的方法,所述细胞的特征在于具有通过细胞质膜进入胞外空间的高蛋白质分泌,包括以下方法步骤:
β1)提供
-包含多个细胞的细胞悬浮液,根据本发明,所述细胞相对于其野生型已经被基因修饰且包含一种编码荧光蛋白的基因,其中荧光蛋白的表达取决于通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量,其中细胞悬浮液中的细胞在通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量上彼此不同,
或
-多种细胞悬浮液,每种细胞悬浮液包括根据本发明所述的相关于其野生型方面已经被基因修饰且包含一种编码荧光蛋白的基因的细胞,其中荧光蛋白的表达取决于通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量,其中细胞悬浮液中的细胞在通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量上彼此不同;
β2)在细胞悬浮液中或在不同细胞悬浮液中培养不同的细胞;
β3)在细胞悬浮液中鉴定个体细胞,所述细胞具有通过细胞质膜进入胞外空间的高蛋白质分泌,或鉴定包含具有通过细胞质膜进入胞外空间的高蛋白质分泌的细胞的单个细胞悬浮液。
与所述特定过程一起使用的术语“具有通过细胞质膜进入胞外空间的高蛋白质分泌的细胞”指的是,与其他细胞悬浮液中的细胞相比,或与其他细胞悬浮液相比,所述细胞或细胞悬浮液特征在于通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质量特别高。
本发明还涉及一种鉴定培养基成分的方法,该培养基成分在蛋白质重组生产方面得到优化,包括以下方法步骤:
γ1)提供多种在成分上彼此不同的培养基;
γ2)根据本发明,培养相关于其野生型已经被基因修饰且包含一种编码荧光蛋白的基因的细胞,其中荧光蛋白的表达取决于通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量,从而获得多种细胞悬浮液。由于培养基的成分不同,所述细胞悬浮液中的细胞在通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量均不同。
γ3)鉴定这些包含具有通过细胞质膜进入胞外空间的高蛋白质分泌的细胞的细胞悬浮液。
与所述特定过程一起使用的术语“具有通过细胞质膜进入胞外空间的高蛋白质分泌的细胞”指的是,与其他细胞悬浮液相比,所述细胞悬浮液特征在于,通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质分泌特别高。因此,所述细胞中通过细胞质膜进入胞外空间的高蛋白质分泌意味着,用于该特定的细胞悬浮液中的培养基尤其有利于细胞的培养,所述细胞旨在通过细胞质膜进入胞外空间的高蛋白质分泌。
方法步骤γ1)过程中提供的培养基在碳源的种类和数量、氮源的种类和数量、磷源的种类和数量、微量元素的种类和数量、盐的种类和用量、洗涤剂的种类和数量、维生素的种类和数量、缓冲液的种类和数量等方面是彼此不同的。
本发明还涉及一种鉴定培养条件的方法,所述培养条件被优化以用于蛋白质的重组生产,包括以下方法步骤:
δ1)提供多种根据本发明包含细胞的细胞悬浮液,所述细胞相对于其野生型已经被基因修饰且包含一种编码荧光蛋白的基因,其中荧光蛋白的表达取决于通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质的量;
δ2)在这些细胞悬浮液中以不同的条件培养这些细胞,这样,由于培养条件的不同,所述在不同细胞悬浮液中的细胞在通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质分泌量方面也是不同的;
δ3)鉴定这些包含具有通过细胞质膜进入胞外空间的高的蛋白质的分泌的细胞的细胞悬浮液。
与该特定过程相关的这一表述“具有通过细胞质膜进入胞外空间的高蛋白分泌的细胞”指的是那些细胞悬浮液,与其它细胞悬浮液相比,其特征在于其通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白质分泌特别高。因此,通过细胞质膜分泌至该细胞悬浮液中的胞外空空间的高蛋白分泌表明本实验装置中所选择的培养条件对于旨在通过细胞质膜分泌大量蛋白至胞外空间的细胞的培养特别有利。
处理步骤δ2)中培养条件的变化可以涉及,例如温度,搅拌速率,供氧量,进料速率,添加诱发物的时间点,培养时间和进行细胞培养方式的变化(分批处理,连续发酵等)。
本发明还涉及一种鉴定化合物的方法,由于该种化合物具有抗菌活性,其是由于具有破坏细菌细胞膜的性质,或分析这种化合物对处于不同生理状态或不同生长阶段的基因不同的细菌细胞群体或基因相同的细胞群体产生影响的性质,所述方法包括以下方法步骤:
ε1)根据本发明,提供一种细胞悬浮液,该细胞悬浮液包括许多细胞,其是相对于其野生型经基因修饰的细胞,并且其包含一种编码一种荧光蛋白的基因序列,其中荧光蛋白的表达取决于通过细胞质膜分泌到胞外空间中的蛋白的量;
ε2)在所述化合物存在的情况下,对这些细胞悬浮液中的细胞进行培养;
ε3)通过鉴定细胞内荧光活性来判断所述化合物的抗菌活性。
惊奇地发现本发明中的传感器也可以用于鉴定一种化合物,该种化合物由于其破坏细菌细胞膜的性质而具有抗菌活性的特征。如果这种化合物破坏了一种含有本发明中的传感器的细胞的膜,则可以观察到细胞内荧光蛋白的表达有所增加。
包含本发明中的传感器的细胞因此也可以用于,例如用于判断给定的化合物是否具有破坏细菌细胞膜的能力,或者在哪种浓度下,给定化合物具有破坏细菌细胞膜的能力。为此,根据本发明,将化合物以一种或不同浓度加入到包含传感器的细胞悬浮液中,并且在该化合物存在的情况下培养该细胞,通过鉴定细胞内荧光活性来判断该化合物是否破坏细胞膜,且在哪种浓度下该化合物会破坏细胞膜。
包含本发明中的传感器的细胞因此也可以用于,例如用于判断细胞悬浮液中的哪种细胞易受一种特定化合物的影响,该种化合物会破坏细菌细胞膜,其中该细胞悬浮液包括多个处于不同生理状态或不同生长阶段的基因不同或基因相同的细胞。为此,将该化合物添加到处于不同生理状态或不同生长阶段的一种基因不同的细胞悬浮液中或基因相同的细胞中,其中根据本发明,每个细胞都包括该传感器,并且在该种化合物存在的情况下,对细胞进行培养,以通过鉴定细胞内荧光活性来判断哪种细胞易受该化合物的影响。
本发明还涉及一种生产相对于其野生型经基因修饰的细胞的方法,其具有通过细胞质膜进入胞外空间中的优化的蛋白分泌,所述方法包括以下方法步骤:
i)提供一种包含本发明中细胞的细胞悬浮液,其中所述细胞是相对于其野生型经基因修饰的细胞,包含编码荧光蛋白的基因序列,其中所述荧光蛋白的表达取决于通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白的量。
ii)对细胞进行基因修饰以获得一种细胞悬浮液,其中细胞悬浮液中的细胞就通过细胞质膜分泌到胞外空间的蛋白量而言会有所不同;
iii)鉴定细胞悬浮液中的个体细胞,这些细胞具有通过细胞质膜进入至胞外空间的增加的蛋白分泌;
iv)从细胞悬浮液中分离出已鉴定的细胞;
v)鉴定已被鉴定及分离出来的细胞中那些经基因修饰的g1至gn基因或那些经突变的m1至mm基因,其中上述基因导致通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白分泌;
vi)生产相对于其野生型经基因修饰的细胞,其具有通过细胞质膜进入胞外空间的优化的蛋白分泌,其中基因组包含至少一个g1至gn基因和/或至少一个突变m1至mm基因。
根据方法步骤i)至iv),通过突变或通过代谢工程首先产生细胞,其具有通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白分泌,并从细胞悬浮液中将细胞分离出来。关于这些处理步骤的细节,参考如上所述的处理步骤i)至iv)。
在方法步骤v)中,在被鉴定和分离出来的细胞中,那些经基因修饰的基因g1至gn或那些经突变的基因m1至mm然后通过本领域技术人员已知的遗传方得以鉴定,其中上述经基因修饰的基因g1至gn或那些经突变的基因m1至mm导致通过细胞质膜进入胞外空间的增加的蛋白分泌,n和m的数值取决于观察到的修饰基因的数目,以及在鉴定和分离出的细胞中分别观察到的突变基因的数量。优选地,在本上下文中的步骤是这样的,首先分析那些基因的序列或那些已知能够促进蛋白质通过细胞质膜进入胞外空间的细胞中的启动子序列。如果没有在这些基因中的任何一个中识别突变,则按照顺序分析已被鉴定和分离的细胞的整个基因组,以便在适当的情况下鉴定进一步修饰的基因gi或进一步的突变mi。可以以这种方式鉴定有利的修饰基因序列gi或有利的突变mi,其中有利的修饰基因序列gi或有利的突变mi使得通过细胞质膜分泌至胞外空间的蛋白有所增加。
在另一种方法步骤vi)中,相对于其野生型经基因修饰的细胞,具有通过细胞质膜进入胞外空间的优化的蛋白分泌,其中基因组包含至少一个基因g1至gn和/或可以产生的至少一个突变m1至mm。为此,有针对性地将在方法步骤v)中观察到的一个或多个有利的修饰基因g和/或修饰突变m引入细胞中。特定突变的这种针对性引入可以,例如通过“基因替换”的方式得以实现。在该方法中,一种突变,例如删除,插入或碱基交换,在目的基因的体外产生。产生的等位基因又被克隆到载体上,其对目标主体来说是不可复制的,然后通过转化或缀合将其转移到目标主体内。在通过影响整合的第一“交叉”事件和影响靶基因或靶序列中的切除的一个合适的第二“交叉”事件进行同源重组之后,实现突变或等位基因的合并。
本发明还涉及一种细胞,其具有通过细胞质膜进入胞外空间的优化的蛋白分泌,这也已经通过上述方法获得。
本发明也涉及到一种生产蛋白的过程,该过程包括以下方法步骤:
(a)通过上述方法生产相对于其野生型经基因修饰的细胞,其具有通过细胞质膜进入胞外空间的优化的蛋白分泌;
(b)在一种能从所述营养物质产生蛋白质的条件下的包含营养物质的培养基中培养所述细胞。
可以通过该方法制备的合适的蛋白质包含激素,毒素,抗体,结构蛋白,酶,转运蛋白或调节蛋白。特别合适的是那些已经提及的,与本发明中的细胞有关联的蛋白质。
根据本发明,按照方法步骤(a)的生产的经基因修饰的细胞,其具有通过细胞质膜进入胞外空间的优化的蛋白分泌,可在方法步骤(b)的营养培养基中以分批处理的方法(分批培养)或以补料分批的方法(进料方法)或重复补料分批的方法(重复进料方法)连续不断或间断地培养,以产生蛋白质。还可以想到如gb-a-1009370中所述的半连续方法。chmiel的教科书(“bioprozesstechnik1.einführungindiebioverfahrenstechnik”,gustavfischerverlag,,stuttgart,1991),或在storhas的教科书(“bioreaktorenundperiphereeinrichtungen”,viewegverlag,braunschweig/wiesbaden,1994)中都有描述已知的培养方法的概述。
使用的营养培养基必须以合适的方式满足特定菌株的要求。各种微生物培养基的描述包含在美国细菌学协会的手册“普通细菌学方法手册”中(美国,华盛顿,1981)中。
营养培养基可以包含碳水化合物,例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素,油和脂肪,例如大豆油、葵花油、花生油和椰子脂,脂肪酸,例如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸,醇,例如甘油和甲醇,烃,例如甲烷,氨基酸,例如l-谷氨酸或l-缬氨酸,或有机酸,例如乙酸,作为碳源。这些物质可单独使用或以混合物形式使用。
营养培养基可以包含有机含氮化合物,例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽提取物、玉米液、大豆粉和尿素,或无机化合物,例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸盐和硝酸铵,作为氮源。所述氮源可以单独使用或以混合物形式使用。
营养培养基可以包含磷酸,磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐作为磷源。所述营养培养基必须另外含有生长所必须的金属盐,例如硫酸镁或硫酸铁。最后,除了上述物质以外,还可使用生长必须物质,例如氨基酸和维生素。另外,可向营养培养基中添加合适的前体。可在培养期间将提及的起始物质以单批次形式添加到培养物中或以合适方式给料。
为了控制培养物的ph值,可以以合适的方式使用碱性化合物,例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水,或酸性化合物,例如磷酸或硫酸。为了控制泡沫继续产生,可使用消泡剂,例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定,可向培养基中添加合适的选择性作用的物质,例如抗生素。为了维持有氧条件,向培养物中引入氧气或含氧气体混合物,例如空气,培养物的温度通常为15℃到45℃,优选为25℃到40℃。
本发明还涉及一种制备混合物的方法,包括以下方法步骤:
(a)通过上述方法制备蛋白质;
(b)将蛋白质及与蛋白质不同的混合物组分混合。
所述混合物可以是食品、动物饲料、药物组合物、用于食品生产的组合物,例如包含淀粉水解酶和脂肪水解酶的混合物,其用作酶促单甘油酯的替代物,使得酵母发酵的烘焙食品、胶合组合物、纺织整理组合物或木质纤维分解组合物具有碎屑结构轮廓。
现借助附图和非限制性实施例对本发明做进一步说明。
图1示出根据菌株atcc13032psen0706(见实施例1c)中杆菌肽(bac)浓度来鉴定荧光。
图2示出根据菌株atcc13032psen0706(见实施例1c)中万古霉素(van)浓度来鉴定荧光。
图3示出根据菌株atcc13032psen0706pclton2-amye(见实施例1e)中amye的分泌水平或细胞质膜跨膜侧的amye的浓度来鉴定荧光。
图4示出根据菌株atcc13032psen0996_8pclton2(见实施例3d)中角质酶的分泌水平或细胞质膜跨膜侧的角质酶的浓度来鉴定荧光。
图5根据amya的分泌水平示出菌株c.谷氨酸棒杆菌atcc13032psen0706spekex2-amya的细胞的体内荧光,其中所述细胞已经在具有或不具有山梨醇的营养培养基中培养(实施例1g))。
图6示出了根据角质酶的分泌水平或细胞质膜跨膜侧的角质酶浓度的体内荧光,其中已经使用了具有不同遗传背景的菌株(atcc13032gsen0996_8和mb001gsen0996_8)(实施例3f))。
图7示出了根据角质酶的分泌水平或细胞质膜跨膜侧的角质酶浓度的体内荧光,其中已经使用了不同的分泌信号肽(实施例3i))。
图8示出了通过荧光激活细胞分选术(facs)对谷氨酸棒状杆菌atcc13032psen0996_8pclton2-fscut(npre)(图8a),谷氨酸棒杆菌atcc13032psen0996_8pclton2_fscut(ywmc)(图8b)和含有比例为1:1的两种菌株的混合培养物(图8c)体内荧光发射进行检测。(实施例3k))。
实施例1
根据本发明中的第一实施例,通过一个细胞的例子来生产细胞,其中编码荧光蛋白的基因序列受cg0706启动子的控制,并且其中荧光蛋白的表达取决于是否有化合物存在,及该化合物的浓度,这种化合物的特征在于:其具有抗菌活性,这归因于破坏细菌细胞膜的性质,或取决于细胞质膜的跨膜侧的α-淀粉酶(amye)的浓度。
a)构建载体psen0706andpsen0706s
通过pcr扩增启动子序列并随后克隆到载体psenlys(binder等人,“ahigh-throughputapproachtoidentifygenesvariantsofbacterialmetaboliteproducerinthesingle-celllevel”;基因组生物学13(5),r40,2002),来实现启动子p(cg0706)与报告基因eyfp(seqidno.18;eyfp的蛋白质序列:seqidno.19)的融合的构建。将谷氨酸棒杆菌atcc13032的基因组dna用作模板,寡核苷酸o706-sal-fii(seqidno.20)和0706-rbsnde-r(seqidno.21)则用作引物。psenlys已经包含了编码eyfp的序列。
0706-rbsnde_r:
gcgcatatgatatctccttcttctagcgggtctgccacatttgctg
0706-sal-fii:
gcggtcgacgggtaaacgtgggatataaa
在从0.8%琼脂糖凝胶上纯化扩增的片段后,用限制酶sali和ndei消化片段,纯化所述反应混合物后,将片段连接到已经用saliandndei打开并去磷酸化的载体psenlys中。连接混合物直接用于转化大肠杆菌xl1-blue,并且在含有50μg/ml卡那霉素的lb平板上进行转化体的选择。在这些平板上生长,对卡那霉素具有抗性的32个菌落从而可用于菌落pcr。使用引物sencas-fw(seqidno.24)和tkp-seq-rv(seqidno.25)处理菌落pcr,以检查启动子片段是否插入到载体psenlys中。对琼脂糖凝胶中的菌落pcr的分析显示了已经分析的样品中具有大小为343bp的pcr产物,于是培养4个菌落,用于更大规模的质粒制备。培养16个小时后,通过离心分离收集这些培养物,制备质粒dna。这些质粒制备物中的两种用菌落pcr中使用的引物进行测序,插入的序列与预期序列显示100%同一性。所得质粒命名为psen0706(seqidno.35)。
通过pcr扩增壮观霉素抗性介导序列,及随后将pcr产物克隆到载体psen0706中,得到质粒psen0706s,其是psen0706的变异体,其表达了壮观霉素抗性而不是卡那霉素抗性。质粒pekex3用作pcr的模板,寡核苷酸spcsacii-f(seqidno.22)和spcbgl-r(seqidno.23)用作引物。
spcsacii-f:
gcgccgcggactaataacgtaacgtgactggcaagag
spcbgl-r:
gcgagatcttctgcctcgtgaagaaggtgttgctgac
从0.8%琼脂糖凝胶中纯化扩增的片段后,用限制酶sacii和bglii消化片段,纯化反应混合物后,将该片段连接到已经用sacii和bglii消化且去磷酸化的载体psen0706中。将连接混合物直接用于转化大肠杆菌xl1-blue,并在含有100μg/ml壮观霉素的lb平板上进行转化体的选择。在这些平板上生长并因此具有壮观霉素抗性的4个菌落被用于接种液体培养物(5ml含有100μg/ml壮观霉素的lb培养基)。培养16小时后,将这些培养物离心,制备质粒dna。使用引物sencas-fw(seqidno.24)和tkp-seq-rv(seqidno.25)对这些质粒制备物中的2个进行测序,并且插入片段的序列与预期序列显示100%同一性。所得质粒命名为psen0706s。
sencas-fw:
gtcgccgtccagctcgaccaggatg
tkp-seq-rv:
cgggaagctagagtaagtagttcg
b)用psen0706转化谷氨酸棒杆菌
按照tauch等人,在2002(currmicrobiol.45(5)(2002),第362-7页)所述制备谷氨酸棒状杆菌菌株atcc13032的感受态细胞,如tauch等人所述用psen0706通过电穿孔转化这些细胞。用含有25μg/ml的卡那霉素在bhis平板上进行转化体的选择,由此获得的克隆命名为atcc13032psen0706。
c)根据一种化合物的浓度检测荧光,其中该化合物的特征在于抗菌性,这种特性源于其具有破坏细菌细胞膜的性质。
通过在微型生物反应器系统中,用微量滴定仪(
d)用pclton-amye转化atcc13032psen0706。
如上所述,用载体pclton2-amye通过电穿孔转化上述谷氨酸棒杆菌atcc13032psen0706的感受态细胞。该载体包含核酸序列,用于编码来自枯草芽孢杆菌的淀粉水解酶α-淀粉酶(amye)和sec特异性天然信号肽,以便能够在谷氨酸棒杆菌的sec途径上输出蛋白质。通过用引物amye-hpai-f(seqidno.33)和amye-saci-r(seqidno.34)扩增来自枯草芽孢杆菌的染色体dna的amye编码序列,用hpai和sacl限制并连接在smai/saci切割的pclton2载体中,该载体是pclton1的壮观霉素抗性赋予衍生物(谷氨酸棒杆菌的四环素诱导型表达载体,其允许紧密调节的基因表达。lausbergf,chattopadhyayar,heyera,eggelingl,freudlr.plasmid。201268(2):142-7)。由此获得的克隆命名为atcc13032psen0706pclton2-amye。
amye-hpa-f:
gcgcgttaaccgaaggagatatagatatgtttgc
amye-sac-r:
cagtgaattcgagctcctagtg
e)根据amye分泌水平或细胞质膜的跨膜侧的amye的浓度来检测荧光(参数变化)
通过在biolector系统(m2p-labsgmbh,52499baesweiler,德国)中,用微量滴定仪中(
f)用pekex2-amya转化谷氨酸棒杆菌atcc13032psen0706s。
如上所述,用载体pekex2-amya通过电穿孔转化上述谷氨酸棒杆菌atcc13032psen0706s的感受态细胞。该载体包含核酸序列,用于编码来自枯草芽孢杆菌的淀粉水解酶α-淀粉酶(amya)和sec特异性天然信号肽,以便能够在谷氨酸棒杆菌的sec途径上输出蛋白质。通过用引物amya-bamhi-f(seqidno.40)和amya-saci-r(seqidno.41)扩增来自枯草芽孢杆菌的染色体dna的amya编码序列,用bamhi和saci进行限制saci和连接在bamhi/saci切割的pe-kex2-载体中(eikmanns等人,基因102:93-98(1991)),以制备pekex2-amya。由此获得的克隆命名为atcc13032psen0706spekex2-amya。
amya-bamhi-f:
cgcggatccaaggagaatgacgatgagaaaacgtaaaaatggattaatc
amya-saci-r:
gcggagctctaattatttacccatatagatacagacccac
g)根据amya的分泌水平或细胞质膜跨膜侧的amya的浓度来检测荧光,其作为营养培养基中山梨醇含量变化的实施例。
通过在biolector系统(m2p-labsgmbh,52499baesweiler,德国)中,在微量滴定仪中添加或不添加91g/l的山梨醇,用0.8ml“difco脑心浸液”培养基(difco,bectondikinsonbd,1bectondrive,franklinlakes,美国,纽约)培养谷氨酸帮杆菌atcc13032psen0706spekex2-amya的细胞,来鉴定体内荧光。将4株具有菌株atcc13032psen0706spekex2-amya的细胞的培养物接种至0.1的光密度(od)并培养24小时。4小时后,通过加入异丙基硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)诱导amye的表达。将iptg-浓度调节至10或50μm以引起不同的表达强度。每10分钟测量培养物的细胞密度和荧光。用波长485nm的光激发荧光,eyfp的荧光发射测量在520/10nm进行。通过biolectionv.2.4.1.0软件对培养物的荧光进行了数字记录。观察到不同诱导的培养物的荧光发射也不同,且生长于含有或不含有山梨醇的营养培养基中的培养物的荧光发射不同(图5)。24小时后,将flowerplate中的培养物离心,以沉淀细胞并获得无细胞的培养物上清液。通过淀粉酶测定法(phadebasamylasetest,magleab,瑞典,隆德),每种培养物上清液的中的20μl用于定量分泌的amye的酶活性。观察到在这些选择的培养条件下由atc浓度诱导的培养物上清液中淀粉酶的活性较高,这不得不认为其与更高的荧光发射有关。
实施例2
根据本发明中的第一实施例,通过一个细胞的例子来制备细胞,其中用于编码荧光蛋白的基因序列受cg1325启动子的控制,并且其中荧光蛋白的表达取决于是否存在一种化合物,及该化合物的浓度,这种化合物的特征在于:其具有抗菌活性,这归因于破坏细菌细胞膜的性质,或取决于细胞质膜的跨膜侧的某一蛋白质的浓度。
a)构建载体psen1325
通过pcr扩增启动子序列并随后克隆到载体psenlys(binder等人,“ahigh-throughputapproachtoidentifygenomicvariantsofbacterialmetaboliteproduceratthesingle-celllevel”;基因组生物学13(5),r40,2012),实现启动子p(cg1235)与报告基因eyfp(seqidno.18;eyfp的蛋白质序列:seqidno.19)的融合的构建;将谷氨酸棒杆菌atcc13032的基因组dna用作模板,寡核苷酸1325-sal-f(seqidno.26)and1325-rbsnde-r(seqidno.27)则用作引物。psenlys已经包含了编码eyfp的序列。
1325-sal-f:
gcggtcgacgagctgtaagggtttacttg
1325-rbsnde-r:
gcgcatatgatatctccttcttctaaccagcgacgccgccgatcc
在从1%琼脂糖凝胶上纯化扩增的片段后,用限制酶saliandndei和消化片段,纯化所述反应混合物后,将片段连接到已经经saliandndei消化且去磷酸化的载体psenlys中。连接混合物直接用于转化大肠杆菌xl1-blue,并且在含有50μg/ml卡那霉素的lb平板上进行转化体的选择。在这些平板上生长,对卡那霉素具有抗性的48个菌落从而可用于菌落pcr。使用引物sencas-fw(seqidno.24)和tkp-seq-rv(seqidno.25)处理菌落pcr,以检查启动子片段是否插入到载体psenlys中。对琼脂糖凝胶中的菌落pcr的分析显示了已经分析的样品中具有大小为250bp的pcr产物,于是培养4个菌落,用于更大规模的质粒制备。经过16个小时的培养,通过离心分离法收集这些培养物,制备质粒dna。这些质粒制备物中的2种用菌落pcr中使用的引物进行测序,插入的序列与预期序列显示100%同一性。所得质粒命名为psen1325(seqidno.36)。
b)用psen1325转化谷氨酸棒杆菌。
按照tauch等人,2002(currmicrobiol.45(5)(2002),第362-7页)所述制备谷氨酸棒状杆菌菌株atcc13032的感受态细胞,如tauch等人所述用psen1325通过电穿孔转化这些细胞。用含有50μg/ml的卡那霉素在bhis平板上选择转化体,由此获得的克隆命名为atcc13032psen1325。
c)根据一种化合物的浓度检测荧光,其中该化合物的特征在于抗菌活性,这种特性源于其具有破坏细菌细胞膜的性质。
通过在biolector系统(mplate-48-b)(m2p-labsgmbh,52499baesweiler,德国)中,用微量滴定仪中(
实施例3
根据本发明中的第一实施例,通过一个细胞的例子来制备细胞,其中编码荧光蛋白的基因序列受cg0996启动子和cg0998启动子的控制,并且其中荧光蛋白的表达取决于细胞质膜的跨膜侧的某一蛋白质的浓度。
a)构建载体psen0996_8,psen0996_8candpsen0996_8e。
通过化学合成的合成dna-片段(seqidno.28forpsen0996_8,seqidno.29forpsen0996_8candseqidno.30forpsen0996_8e)且将它们连接到载体psenly(binder等人,“ahigh-throughputapproachtoidentifygenomicvariantsofbacterialmetaboliteproduceratthesingle-celllevel”;基因组生物学13(5),r40,2012),实现启动子p(cg0996)和p(cg0998)与报告基因eyfp(seqidno.18;eyfp的蛋白质序列:seqidno.19)的融合的构建。psenlys已经包含了编码eyfp的序列。
用限制酶sali和ndei裂解合成的dna片段后,随后纯化反应混合物,将已经切出的dna片段与已用sali/ndei消化并去磷酸化的载体psenlys进行单独连接反应。连接混合物可直接用于大肠杆菌xl1-blue的转化,并在含有50μg/ml卡那霉素的lb平板上进行转化体的选择。在这些平板上生长的8个菌落,因此具有卡那霉素抗性,可用于菌落pcr。使用引物sencas-fw(seqidno.24)和tkp-seq-rv(seqidno.25)进行菌落pcr,以验证合成的dna片段已经插入psenlys。
在琼脂糖凝胶中的菌落pcr的分析显示在已经分析过的样品中,在psen0996_8的情况下,预期有大小为872bp的pcr产物,在psen0996_8c的情况下,预期有413bp的pcr产物,在psen0996_8e的情况下,预期有大小为2774bp的pcr产物,于是培养8个菌落用于大规模的质粒制备。培养16个小时后,离心收集培养物,制备质粒dna。使用引物jps0003(seqidno.31)和jps0004(seqidno.32)对这些质粒制备物中的每一个进行测序,并且插入序列与预期序列显示100%同一性。所得质粒命名为psen0996_8(seqidno.37),psen0996_8c(seqidno.38)和psen0996_8e(seqidno.39)。
jps0003:
ctgaacttgtggccgtttac
jps0004:
ttgttgccgggaagctagag
b)用psen0996_8、psen0996_8c和psen0996_8e转化谷氨酸棒杆菌。
如tauch等人,2002(currmicrobiol.45(5)(2002),第362-7页中所述制备谷氨酸棒状杆菌菌株atcc13032的感受态细胞。正如tauch等人所述,用psen0996_8或psen0996_8c或psen0996_8c或psen0996_8e通过电穿孔转化这些细胞。
c)用pclton2-fscut转化atcc13032psen0996_8或atcc13032,psen0996_8c或atcc13032psen0996_8e
如上所述,用载体pclton2-fscut通过电穿孔转化上述谷氨酸棒杆菌atcc13032psen0996_8或atcc13032psen0996_8c或atcc13032psen0996_8e的感受态细胞。该载体包含核酸序列,用于编码来自茄病镰刀菌的脂肪酶角质酶(fscut)和sec特异性天然信号肽,以便能够在谷氨酸棒杆菌的sec途径上输出蛋白质。通过化学合成合成的dna片段(seqidno.33),用psti/saci限制合成的dna片段,并将限制性片段连接到等位消化的载体pclton2,该载体是pclton2的壮观霉素抗性赋予的衍生物(谷氨酸棒状杆菌的四环素诱导型表达载体,允许密切调节基因表达。lausbergf,chattopadhyayar,heyera,eggelingl,freudlr.plasmid。201268(2):142-7)。如此获得的克隆命名为atcc13032psen0996_8pclton2-fscut,atcc13032psen0996_8cpclton2-fscut或atcc13032psen0996_8epclton2-fscut。
d)根据amye分泌水平或细胞质膜的跨膜侧的amye的浓度来检测荧光(参数变化)
通过在biolector系统(m2p-labsgmbh,52499baesweiler,德国)中,用微量滴定仪中(
e)构建载体pk19-psen0996_8e
通过将谷氨酸棒状杆菌atcc13032的基因组dna作为模板和用引物0998up-f(seqidno.42)和0998up-r(seqidno.43)扩增cg0998-上游区,扩增pk19-psen0996_8e,将谷氨酸棒状杆菌atcc13032的基因组dna作为模板和用引物0998dw-f(seqidno.44)和0998dw-r(seqidno.45)扩增cg0998-下游区,将psen0996_8e作为模板和用引物eyfp-ol-f(seqidno.46)和eyfp-ol-r(seqidno.47)扩增eyfp编码序列,随后将上述pcr反应的pcr产物作为模板和用引物0998up-f和0998dw-r重叠延伸pcr。最后,重叠延伸pcr的产物用t4多核苷酸激酶磷酸化并连接到smai切割质粒pk19(seqidno.48)中。
0998up-f:gaagaaaccgccgaaacgtcaagc
0998up-r:cgatgcacggtccgggttctc
0998dw-f:gtttaaaagagttaatctgcatctaatcaagtagcc
0998dw-r:gccatcacgaattgccgaacgag
eyfp-ol-f:
gagaacccggaccgtgcatcgtagaagaaggagatatcatatgg
eyfp-ol-r:
gcagattaactcttttaaacttattacttgtacagctcgtccatgccg
连接混合物直接用于转化大肠杆菌xl1-blue,并且通过蓝/白筛选,在含有50μg/ml卡那霉素和100μg/mlxgal(5-溴-4-氯-3-吲哚酚-β-d-吡喃半乳糖苷)的lb平板上进行转化体的选择。培养4个菌落,分别用于大规模的质粒制备。培养16小时后,通过离心分离收集培养物,质粒dna制备完成,并使用引物m13uni(-43)(seqidno.49)和m13rev(-49)(seqidno.50)将质粒dna用于测序。插入序列与预期序列显示100%的同一性。所得质粒命名为pk19-psen0996_8e(seqidno.51)
m13uni(-43):agggttttcccagtcacgacgtt
m13rev(-49):gagcggataacaatttcacacagg
f)构建菌株谷氨酸棒杆菌atcc13032gsen0996_8和谷氨酸棒杆菌mb001gsen0996_8。
按照tauch等人,在2002(currmicrobiol.45(5)(2002),第362-7页)中所述制备谷氨酸棒状杆菌菌株atcc13032和谷氨酸棒状杆菌mb001gsen0996_8的感受态细胞,如tauch等人所述用psen0706通过电穿孔转化这些细胞。因为该载体不能在谷氨酸棒状杆菌中复制,所以含有卡那霉素的琼脂平板上的菌落只能从那些细胞处生长,其通过同源重组将含有psen0996_8e序列的载体整合到其染色体中。在第二次同源重组中,所述载体可以再次从染色体中去除,仅在基因组中留下引入的psen0996_8e序列。为了选择那些细胞,选择了在含有卡那霉素的琼脂平板上生长的菌落,这些菌落在复杂的培养基中培养并被铺在含有10%蔗糖的琼脂平板上。载体pk19含有来自枯草芽孢杆菌的sacb基因的修饰变体,用于编码蔗糖果聚糖酶,该蔗糖果聚糖酶催化蔗糖到果聚糖的反应,后者对谷氨酸棒状杆菌具有毒性。因此,含有琼脂的蔗糖上的菌落只能从那些细胞生长,其中第二次同源重组中去除整合的载体序列,仅在基因组中留下引入的psen0996_8e序列。由此获得的克隆命名为atcc13032gsen0996_8和mb001gsen0996_8。(
g)用pclton2-fscut转化谷氨酸棒状杆菌atcc13032gsen0996_8和mb001gsen0996_8,这一转化作为细菌菌株遗传背景变异的一个实施例。
按照tauch等人,2002(currmicrobiol.45(5)(2002),第362-7页)所述制备谷氨酸棒状杆菌菌株atcc13032gsen0996_8andmb001gsen0996_8的感受态细胞。如上所述,用载体pclton2-fscut通过电穿孔转化这些细胞。由此获得的克隆命名为atcc13032gsen0996_8pclton2-fscutandmb001gsen0996_8pclton2-fscut.
h)根据角质酶分泌水平或细胞质膜的跨膜侧的角质酶浓度来鉴定荧光。
通过在biolector系统(m2p-labsgmbh,52499baesweiler,德国)中,用微量滴定仪中(
i)用pclton2-fscut(npre)和pclton2-fscut(ywmc)转化谷氨酸棒状杆菌atcc13032gsen0996_8,这一转化作为分泌信号肽的一个实施例。
如tauch等人,2002(currmicrobiol.45(5)(2002),第362-7页)所述制备了谷氨酸棒状杆菌菌株atcc13032gsen0996_8的感受态细胞。如上所述,用载体pclton2-fscut(npre)和pclton2-fscut(ywmc)通过电穿孔转化这些细胞。这些载体是上述的pclton2-fscut的变体,用npre-或ywmc信号序列(seqidno.52,seqidno.53)替代角质酶的天然分泌信号序列。由此获得的克隆命名为atcc13032gsen0996_8pclton2-fscut(npre)和atcc13032gsen0996_8pclton2-fscut(ywmc).
j)根据角质酶分泌水平或细胞质膜的跨膜侧的角质酶浓度来鉴定荧光。
通过在biolector系统(m2p-labsgmbh,52499baesweiler,德国)中,用微量滴定仪中(
另外,通过荧光激活细胞分选术(facs)进行体内荧光发射鉴定。将谷氨酸棒状杆菌atcc13032psen0996_8pclton2-fscut(npre)和谷氨酸棒状杆菌atcc13032psen0996_8pclton2-fscut(ywmc)的培养物,及含有比例为1:1和1:100的两种菌株(npre:ywmc)的混合培养物接种在0.8mlcgxii培养基(keilhauer等人,1993,j.bacteriol.175:5595-603)中,并在biolector系统(m2p-labsgmbh,52499baesweiler,德国)中,用微量滴定仪(flowerplatemtp-48-b)培养。4小时后,通过加入250mm脱水四环素(atc)来诱导角质酶的表达。进一步培养10小时后,分析所有培养物的光学性质。观察到表达与不同分泌信号肽融合的角质酶的菌株的荧光发射也不同(图8a和8b)。通过使用出自美国bd公司(美国bd公司,美国,新泽西州,富兰克林湖,)的facsaria细胞分选仪iii,含有两株菌株atcc13032psen0996_8pclton2-fscut(npre)和atcc13032psen0996_8pclton2-fscut(ywmc)(图8c)的细胞的混合培养物细胞被用来分类细胞。针对“前向散射”和“侧向散射”,200是facs设置的阀值,“前向散射”(nd过滤器1.0)的电子增益为16mv,“侧向散射”为269mv时。在488nm的波长下激发增强型黄色荧光蛋白(eyfp),并且利用上游连接的发射带路径滤波器530/30nm,通过400mv的“参数增益”pmt进行鉴定。将每个混合培养物的44个细胞相对于eyfp荧光进行分选,并使用facsaria细胞分选仪iii将其储存在96孔微量滴定板中(每孔含有200μlcgxii培养基)中(图8c)。培养16个小时后,通过离心分离收集培养物,制备质粒dna。质粒制备物用引物pekex2-fw(seqidno.54)和pekex2-rv(seqidno.55)进行测序。在1:1混合培养的情况下,观察到46个分选细胞中有44个细胞是atcc13032psen0996_8pclton2-fscut(npre),46个细胞中有2个细胞是atcc13032psen0996_8pclton2-fscut(ywmc)。在1:100混合培养的情况下,观察到46个分选细胞中有16个细胞是atcc13032psen0996_8pclton2-fscut(npre),46个细胞中有30个细胞是atcc13032psen0996_8pclton2-fscut(ywmc)。
pekex2-fw:ctcgtataatgtgtggaattg
pekex2-rv:cagaccgcttctgcgttc
l)谷氨酸棒状杆菌atcc13032psen0996_8pclton2-fscut(npre)的突变
将谷氨酸棒状杆菌atcc13032psen0996_8pclton2-fscut(npre)在30℃的“difcobrainheartinfusion”培养基(difco,bectondikinsonbd,1bectondrive,franklinlakes,njusa)中过夜生长,并将5ml该培养物与溶解在1ml二甲基亚砜中的0.5mgn-甲基-n-亚硝基-n'-硝基胍的0.1ml溶液合并。将该培养物在30℃下振荡15分钟。随后,将细胞在4℃和2500×g下离心,并重新悬浮于5ml的0.9%氯化钠中。重复离心步骤和再悬浮步骤。将7.5ml80%甘油添加到由此获得的细胞悬浮液中,并将该突变细胞悬浮液的等分试样储存在-20℃。将200μl的细胞悬浮液用于接种0.8mlcgxii培养基(keilhauer等人,1993,j.bacteriol.175:5595-603)。在30℃和1000rpm下,在微量滴定仪中((
序列表
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<110>于利希研究中心有限公司
<120>用于微生物蛋白质分泌检测和定量的传感器
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