针对淋巴细胞活化基因3（LAG‑3）的抗体的制作方法
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背景技术：
淋巴细胞活化基因-3(lag-3)(也称为cd223)是免疫球蛋白超基因家族的成员，并且在结构和遗传学上与cd4相关。lag-3在t细胞、b细胞、自然杀伤(nk)细胞和浆细胞样树突状细胞(pdc)上表达。与cd4类似，lag-3已被证明与mhcii类分子相互作用(baixeras等,j.exp.med.,176:327-337(1992))，但在不同的位点结合(huard等,proc.natl.acad.sci.usa,94(11):5744-5749(1997))。例如，特别地，lag-3免疫球蛋白融合蛋白(slag-3ig)通过lag-3直接地且特异性地结合细胞表面上的mhcii类分子。
在t细胞活化后，lag-3上调并调节t细胞功能以及t细胞稳态(sierro等,expertopin.ther.targets,15(1):91-101(2011))。抗原特异性t细胞应答的体外研究证明，lag-3/mhcii类分子的相互作用可能在下调cd4+t淋巴细胞的抗原依赖性刺激中起作用，在该研究中，加入抗lag-3的抗体导致了升高的t细胞增殖，活化抗原(如，cd25)的更高表达，以及更高浓度的细胞因子(如，干扰素γ和白细胞介素4)((huard等,eur.j.immunol.,24:3216-3221(1994))。cd4+cd25+调节性t细胞(treg)也被证明在体外和体内条件下，在被激活时表达lag-3且抗lag-3的抗体抑制由经诱导的treg细胞导致的压制作用，表明lag-3有助于treg细胞的抑制子活性(huang等immunity,21:503-513(2004))。此外，lag-3已被证明通过调节性t细胞以t细胞依赖和不依赖型的机制负调节t细胞稳态(workman,c.j.和vignali,d.a.,j.immunol.,174:688-695(2005))。
常规t细胞中的无能的或者显示出功能受损的亚群表达lag-3，并且lag-3+t细胞在肿瘤部位和在慢性病毒感染期间富集。然而，虽然lag-3敲除小鼠已被证明产生正常的病毒特异性的cd4+和cd8+t细胞应答，从而表明lag-3的作用是非必需的，但是与单独阻断pd-l1相比，pd-1/pd-l1通路的阻断结合lag-3阻断改善了对病毒的控制(blackburn等,nat.immunol.,10:29-37(2009)；和richter等,int.immunol.,22:13-2(2010))。
在使得转基因cd8+t细胞在体内无应答/无能的自体耐受性/肿瘤小鼠模型中，cd8+t细胞中lag-3的阻断或缺陷增强了肿瘤部位的t细胞增殖、t细胞募集和效应子功能(grosso等,j.clin.invest.,117:3383-92(2007))。
在临床前研究的基础上，目前正在研究抑制lag-3的活性(例如，通过使用单克隆抗体)来治疗病毒感染和黑色素瘤的治疗方法。例如，加入与fc区融合的可溶性hulag-3增强了健康个体或癌症患者的pbmc中抗原特异性t细胞针对病毒和肿瘤抗原(例如，流感病毒基质蛋白或者t细胞识别的黑色素瘤抗原(mart-1))的增殖(casati等,j.immunol,180:3782-3788(2008))。
需要另外的以高亲和力结合lag-3并有效中和lag-3活性的lag-3拮抗剂(例如，抗体)。本发明提供了这样的lag-3结合剂。
发明简述
本发明提供了一种分离的免疫球蛋白重链多肽，其包括以下氨基酸序列gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalathrvallysilesercyslysalaserglyphexaa1ilexaa2aspasptyrilehistrpvalxaa3glnalaproglylysglyleuglutrpxaa4glytrpileaspxaa5xaa6asnxaa7aspserxaa8tyrxaa9serlysphexaa10glyargvalthrilethrvalaspthrserthrxaa11thralatyrmetxaa12leuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysthrtyralapheglyglytyrtrpglyglnglythrthrvalthrvalserser(seqidno:181)，其中(a)xaa1是天冬酰胺(asn)或丝氨酸(ser)，(b)xaa2是赖氨酸(lys)、酪氨酸(tyr)或天冬酰胺(asn)，(c)xaa3是赖氨酸(lys)或谷氨酰胺(gln)，(d)xaa4是异亮氨酸(ile)或甲硫氨酸(met)，(e)xaa5是丙氨酸(ala)或脯氨酸(pro)，(f)xaa6是谷氨酸(glu)或甲硫氨酸(met)，(g)xaa6是甘氨酸(gly)、天冬酰胺(asn)或天冬氨酸(asp)，(h)xaa8是谷氨酸(glu)或谷氨酰胺(q)，(i)xaa9是丙氨酸(ala)或丝氨酸(ser)，(j)xaa10是谷氨酰胺(gln)或精氨酸(arg)，(k)xaa11是天冬氨酸(asp)或天冬酰胺(asn)，以及(l)xaa12是谷氨酰胺(gln)或赖氨酸(lys)。
本发明提供了一种分离的免疫球蛋白重链多肽，其包括以下氨基酸序列：glnvalglnleuglnglntrpglyalaxaa1leuleulysprosergluthrleuserleuxaa2cysxaa3valtyrglyglyxaa4phexaa5glytyrtyrtrpxaa6trpileargglnproproxaa7lysglyleuglutrpileglygluileasnhisserglyxaa8thrasntyrasnproserleulysserargvalthrileservalaspthrserlysasnglnxaa9serleulysleuxaa10xaa11valthralaalaaspthralavaltyrtyrcysxaa12arggluglyxaa13tyrglyasptyrasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser(seqidno:35)，其中(a)xaa1是精氨酸(arg)或甘氨酸(gly)，(b)xaa2是苏氨酸(thr)或异亮氨酸(ile)，(c)xaa3是苏氨酸(thr)或丙氨酸(ala)，(d)xaa4是丝氨酸(ser)或苯丙氨酸(phe)，(e)xaa5是丝氨酸(ser)或苯丙氨酸(phe)，(f)xaa6是丝氨酸(ser)或异亮氨酸(ile)，(g)xaa7是甘氨酸(gly)或精氨酸(arg)，(h)xaa8是丝氨酸(ser)或天冬酰胺(asn)，(i)xaa9是苯丙氨酸(phe)或亮氨酸(leu)，(j)xaa10是天冬酰胺(asn)或丝氨酸(ser)，(k)xaa11是丝氨酸(ser)或苯丙氨酸(phe)，(l)xaa12是丙氨酸(ala)或缬氨酸(val)，以及(m)xaa13是天冬氨酸(asp)或天冬酰胺(asn)。
本发明还提供了一种分离的免疫球蛋白重链多肽，其包括seqidno:190或191。
本发明提供了一种分离的免疫球蛋白轻链多肽，其包括以下氨基酸序列：aspxaa1valmetthrglnthrproleuserleuservalthrproglyglnproalaserilesercysargxaa2serglnserleuvalhisseraspxaa3xaa4thrtyrleuhistrptyrleuglnlysproglyglnserproglnleuleuiletyrxaa5xaa6serasnargpheserglyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysileserargvalglualagluaspvalglyvaltyrphecysxaa7glnserthrxaa8valprotyralapheglyglyglythrlysvalgluilelysargthr(seqidno:57)，其中(a)xaa1是缬氨酸(val)或异亮氨酸(ile)，(b)xaa2是半胱氨酸(cys)或丝氨酸(ser)，(c)xaa3是甘氨酸(gly)或丝氨酸(ser)，(d)xaa4是天冬酰胺(asn)或天冬氨酸(asp)，(e)xaa5是赖氨酸(lys)、甘氨酸(gly)、天冬酰胺(asn)、丝氨酸(ser)或亮氨酸(leu)，(f)xaa6是缬氨酸(val)或异亮氨酸(ile)，(g)xaa7是丝氨酸(ser)、丙氨酸(ala)或甘氨酸(gly)，以及(h)xaa8是组氨酸(his)或酪氨酸(tyr)。
本发明提供了一种分离的免疫球蛋白轻链多肽，其包括以下氨基酸序列：aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalglyaspargvalthrilethrcysglnalaserglnaspileserasntyrleuasntrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuilexaa1xaa2xaa3xaa4xaa5leugluthrglyvalproserargpheserglyserglyserglythraspphethrphethrileserserleuglnprogluaspilealavaltyrtyrcysglnglnsertyrserxaa6leuilethrpheglyglnglythrargleugluilelysargthrvalalaalaproserval(seqidno:89)，其中(a)所述子序列xaa1xaa2xaa3xaa4xaa5缺失或者是tyr-asp-ala-ser-asn，以及(b)xaa6是苏氨酸(thr)或异亮氨酸(ile)。
本发明还提供了分离的免疫球蛋白轻链多肽，其包括seqidno:196或197。
此外，本发明提供了分离的或纯化的编码前述免疫球蛋白多肽的核酸序列，包含此类核酸序列的载体，包含前述免疫球蛋白多肽的lag-3结合剂，编码此类lag-3结合剂的核酸序列，包含此类核酸序列的载体，包含此类载体的分离的细胞，包含此类lag-3结合剂的或者此类载体及药学上可接受的运载体的组合物，以及通过向哺乳动物施用有效量的此类组合物在哺乳动物中治疗癌症或感染性疾病的方法。
附图简述
图1a是植入了colon26结肠腺癌细胞并且注射了所标识抗体的小鼠中平均肿瘤体积随时间的变化图。图中每个数据点代表所标识的处理组。
图1b是植入了colon26结肠腺癌细胞并且注射了所标识抗体的三个处理组的小鼠中各个动物的肿瘤体积随时间的变化图。图中每个数据点代表所述处理组中的各个动物。
图2a显示了在不同浓度的抗pd-1或抗lag-3抗体的条件下，在混合淋巴细胞反应(mlr)测定法中cd4+t细胞分泌il-2的量。
图2b显示了在暴露于树突状细胞之前(初始)或之后(24、48和72小时之后)，cd4+t细胞上lag-3和pd-1的表达量。
发明详述
本发明提供了一种分离的免疫球蛋白重链多肽和/或一种分离的免疫球蛋白轻链多肽，或其片段(例如，其抗原结合片段)。本文所用的术语“免疫球蛋白”或“抗体”是指发现于脊椎动物的血液或其他体液中的蛋白质，其被免疫系统用来识别和中和异物(如，细菌和病毒)。所述多肽是“分离的”，是指将其移出其天然环境。在优选的实施方案中，免疫球蛋白或抗体是包括至少一个互补决定区(cdr)的蛋白质。所述cdr形成抗体的“高变区”，其负责结合抗原(下文做进一步讨论)。整个免疫球蛋白通常由四个多肽组成：两个相同的重(h)链多肽拷贝和两个相同的轻(l)链多肽拷贝。每条重链含有一个n端可变(vh)区和三个c端恒定(ch1、ch2和ch3)区，并且每条轻链含有一个n端可变(vl)区和一个c端恒定(cl)区。基于其恒定结构域的氨基酸序列，抗体的轻链可以被归属于或为kappa(κ)或为lambda(λ)的两种不同类型中的一种。在典型的免疫球蛋白中，每条轻链通过二硫键与重链连接，并且两条重链通过二硫键相互连接。轻链可变区与重链的可变区对齐，并且轻链恒定区与重链的第一恒定区对齐，重链剩下的恒定区彼此对齐。
每个轻链和重链对的可变区形成抗体的抗原结合位点。vh和vl区具有相同的基本结构，每个区包括四个框架(fw或fr)区。本文所用的术语“框架区”是指可变区内相对保守的氨基酸序列，其位于所述的高变或互补决定区(cdrs)之间。每个可变结构域中有四个框架区，分别命名为fr1、fr2、fr3和fr4。框架区形成提供可变区的结构框架的β片层(参见，例如，c.a.janeway等(eds.),immunobiology,第5版,garlandpublishing,newyork,ny(2001))。
多个框架区经由三个互补决定区(cdr)连接。如上所述，被称为cdr1、cdr2和cdr3的三个cdr形成抗体的“高变区”，负责抗原结合。多个cdr形成连接由框架区形成的β-片层结构的或者在某些情况下包括部分由框架区形成的β-片层结构的环。虽然轻链和重链的恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是恒定区可以影响可变区的排布(orientation)。恒定区还表现出多种效应子功能，例如通过与效应分子和细胞的相互作用参与抗体依赖的补体介导的裂解或者抗体依赖的细胞毒性。
本发明所述分离的免疫球蛋白重链多肽和分离的免疫球蛋白轻链多肽理想地能结合由淋巴细胞活化基因-3(lag-3)编码的蛋白质(本文中也称为“lag-3蛋白”)。如上所述，lag-3是由498个氨基酸组成的能负调节t细胞功能和稳态的蛋白(triebel等,j.exp.med.,171(5):1393-1405(1990)；和triebelf.,trendsimmunol.,24(12):619-22(2003))。lag-3是免疫球蛋白超基因家族的成员并且在结构和遗传学上与cd4相关。已证明lag-3的胞质内区域与被称为lap的蛋白质相互作用，lap被认为是参与下调cd3/tcr活化通路的信号转导分子(iouzalen等,eur.j.immunol.,31:2885-2891(2001))。此外，已证明不管在体外还是在体内，cd4+cd25+调节性t细胞(treg)在激活时都表达lag-3并且抗lag-3的抗体都抑制了经诱导的treg细胞的压制作用，表明lag-3有助于treg细胞的抑制子活性(huang等,immunity,21:503-513(2004)))。然而，最近的研究表明，cd4+t细胞上的lag-3表达会使其更易被treg抑制，而并非使treg更具抑制性(参见durham等,plosone,9(11):e109080(2014))。在某些情况下，lag-3也被证明具有免疫刺激效应(参见，例如，prigent等,eur.j.immunol.,29:3867-3876(1999))；elmir和triebel,j.immunol.,164:5583-5589(2000))；以及casati等,cancerres.,66:4450-4460(2006))。本发明的分离的免疫球蛋白重链多肽和本发明的分离的免疫球蛋白轻链多肽可以形成结合lag-3和另一抗原的试剂，获得“双反应性”的结合剂(例如，双反应性抗体)。例如，所述试剂可以结合lag-3和免疫系统的另一负调节子，例如，程序性死亡因子1(pd-1)和/或t细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3蛋白(tim-3)。
结合lag-3的抗体，及其组分，是本领域已知的(参见，例如，美国专利申请公开号2010/0233183、2011/0150892和2014/0093511)。抗lag-3的抗体也可以从诸如abcam(剑桥，美国马萨诸塞州)和r&dsystems，inc.(明尼阿波利斯，美国明尼苏达州)等来源商购获得。
本发明提供了一种分离的免疫球蛋白重链多肽，其包括以下氨基酸序列：gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalathrvallysilesercyslysalaserglyphexaa1ilexaa2aspasptyrilehistrpvalxaa3glnalaproglylysglyleuglutrpxaa4glytrpileaspxaa5xaa6asnxaa7aspserxaa8tyrxaa9serlysphexaa10glyargvalthrilethrvalaspthrserthrxaa11thralatyrmetxaa12leuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysthrtyralapheglyglytyrtrpglyglnglythrthrvalthrvalserser(seqidno:181)，其中(a)xaa1是天冬酰胺(asn)或丝氨酸(ser)，(b)xaa2是赖氨酸(lys)、酪氨酸(tyr)或天冬酰胺(asn)，(c)xaa3是赖氨酸(lys)或谷氨酰胺(gln)，(d)xaa4是异亮氨酸(ile)或甲硫氨酸(met)，(e)xaa5是丙氨酸(ala)或脯氨酸(pro)，(f)xaa6是谷氨酸(glu)或甲硫氨酸(met)，(g)xaa6是甘氨酸(gly)、天冬酰胺(asn)或天冬氨酸(asp)，(h)xaa8是谷氨酸(glu)或谷氨酰胺(q)，(i)xaa9是丙氨酸(ala)或丝氨酸(ser)，(j)xaa10是谷氨酰胺(gln)或精氨酸(arg)，(k)xaa11是天冬氨酸(asp)或天冬酰胺(asn)，以及(l)xaa12是谷氨酰胺(gln)或赖氨酸(lys)。
在另一方面，所述免疫球蛋白重链多肽包括以下氨基酸序列，由以下氨基酸序列组成，或者基本上由以下氨基酸序列组成：gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyalathrvallysilesercyslysalaserglyphexaa1ilexaa2aspasptyrilehistrpvalxaa3glnalaproglylysglyleuglutrpxaa4glytrpileaspxaa5gluasnxaa6aspserglutyrxaa7serlysphexaa8glyargvalthrilethrvalaspthrserthrxaa9thralatyrmetgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcysthrtyralapheglyglytyrtrpglyglnglythrthrvalthrvalserser(seqidno:1)，其中(a)xaa1是天冬酰胺(asn)或丝氨酸(ser)，(b)xaa2是赖氨酸(lys)，酪氨酸(tyr)或天冬酰胺(asn)，(c)xaa3是赖氨酸(lys)或谷氨酰胺(gln)，(d)xaa4是异亮氨酸(ile)或甲硫氨酸(met)，(e)xaa5是丙氨酸(ala)或脯氨酸(pro)，(f)xaa6是甘氨酸(gly)、天冬酰胺(asn)或天冬氨酸(asp)，(g)xaa7是丙氨酸(ala)或丝氨酸(ser)，(h)xaa8是谷氨酰胺(gln)或精氨酸(arg)，以及(i)xaa9是天冬氨酸(asp)或天冬酰胺(asn)。
在一个实施方案中，所述分离的免疫球蛋白重链多肽包括以下任一项所示的氨基酸序列，由以下任一项所示的氨基酸序列组成，或者基本上由以下任一项所示的氨基酸序列组成：seqidno:2、seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5、seqidno:6、seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9、seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12、seqidno:13、seqidno:14、seqidno:15、seqidno:16、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19、seqidno:20、seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23、seqidno:24、seqidno:25、seqidno:26、seqidno:27、seqidno:28、seqidno:29、seqidno:30、seqidno:31、seqidno:32、seqidno:33、seqidno:34、seqidno:182、seqidno:183、seqidno:184、seqidno:185、或seqidno:186。
本发明还提供了一种免疫球蛋白重链多肽，其包括以下氨基酸序列，由以下氨基酸序列组成，或者基本上由以下氨基酸序列组成：glnvalglnleuglnglntrpglyalaxaa1leuleulysprosergluthrleuserleuxaa2cysxaa3valtyrglyglyxaa4phexaa5glytyrtyrtrpxaa6trpileargglnproproxaa7lysglyleuglutrpileglygluileasnhisserglyxaa8thrasntyrasnproserleulysserargvalthrileservalaspthrserlysasnglnxaa9serleulysleuxaa10xaa11valthralaalaaspthralavaltyrtyrcysxaa12arggluglyxaa13tyrglyasptyrasptyrtrpglyglnglythrleuvalthrvalserser(seqidno:35)，其中(a)xaa1是精氨酸(arg)或甘氨酸(gly)，(b)xaa2是苏氨酸(thr)或异亮氨酸(ile)，(c)xaa3是苏氨酸(thr)或丙氨酸(ala)，(d)xaa4是丝氨酸(ser)或苯丙氨酸(phe)，(e)xaa5是丝氨酸(ser)或苯丙氨酸(phe)，(f)xaa6是丝氨酸(ser)或异亮氨酸(ile)，(g)xaa7是甘氨酸(gly)或精氨酸(arg)，(h)xaa8是丝氨酸(ser)或天冬酰胺(asn)，(i)xaa9是苯丙氨酸(phe)或亮氨酸(leu)，(j)xaa10是天冬酰胺(asn)或丝氨酸(ser)，(k)xaa11是丝氨酸(ser)或苯丙氨酸(phe)，(l)xaa12是丙氨酸(ala)或缬氨酸(val)，以及(m)xaa13是天冬氨酸(asp)或天冬酰胺(asn)。在一个实施方案中，所述分离的免疫球蛋白重链多肽包括以下任一项所示的氨基酸序列，由以下任一项所示的氨基酸序列组成，或者基本上由以下任一项所示的氨基酸序列组成：seqidno:36、seqidno:37、seqidno:38、seqidno:39、seqidno:40、seqidno:41、seqidno:42、seqidno:43、seqidno:44、seqidno:45、seqidno:46、seqidno:47、seqidno:48、seqidno:49、seqidno:50、seqidno:51、seqidno:52、seqidno:53、seqidno:54、seqidno:55、或seqidno:56。
在另一实施方案中，提供了一种分离的免疫球蛋白重链多肽，其包括seqidno:190或191。这种多肽的实例包括包含seqidno:192-195中任一项的多肽。
当本发明的免疫球蛋白重链多肽基本上由seqidno:1-seqidno:56、seqidno:182-186、或seqidno:190-195中的任一项所示的氨基酸序列组成时，所述多肽可以包括另外的在本质上不影响所述多肽的组分(例如，蛋白质部分，如辅助纯化或分离的生物素)。当本发明的免疫球蛋白重链多肽由seqidno:1-seqidno:56中的任一项所示的氨基酸序列组成时，所述多肽不包括任何另外的组分(即，对于本发明的免疫球蛋白重链多肽来说不是内源性的组分)。
本发明提供了一种分离的免疫球蛋白重链多肽，其包括与seqidno:1-56中的任一项具有至少90％同一性(例如，至少91％％、至少92％％、至少93％％、至少94％％、至少95％％、至少96％％、至少97％％、至少98％％、至少99％％或100％％同一性)的氨基酸序列。本文所述的核酸或氨基酸序列的“同一性”可以通过将目的核酸或氨基酸的序列与参考核酸或氨基酸的序列进行比较来确定。百分比同一性是用目的序列和参照序列之间同一的(即，一样的)核苷酸或氨基酸残基的数目除以最长序列的长度(即，目的序列或参照序列的长度，以较长者为准)。用于获得两个或多个序列之间的最优比对以及计算同一性的许多数学算法是已知的并且并入了多个可用的软件程序中。这些程序的实例包括clustal-w、t-coffee和align(用于比对核酸和氨基酸序列)、blast程序(例如，blast2.1、bl2seq及其更新版本)和fasta程序(例如，fasta3x、fastm和ssearch)(用于序列比对和序列相似性搜索)。在例如，altschul等,j.molecularbiol.,215(3):403-410(1990)，beigert等,proc.natl.acad.sci.usa,106(10):3770-3775(2009)，durbin等,eds.,biologicalsequenceanalysis:probalisticmodelsofproteinsandnucleicacids,cambridgeuniversitypress,cambridge,uk(2009)，soding,bioinformatics,21(7):951-960(2005)，altschul等,nucleicacidsres.,25(17):3389-3402(1997)，以及gusfield,algorithmsonstrings,treesandsequences,cambridgeuniversitypress,cambridgeuk(1997))中，也公开了序列比对算法。
在另一实施方案中，本发明提供了一种免疫球蛋白轻链多肽，其包括以下氨基酸序列，由以下氨基酸序列组成，或者基本上由以下氨基酸序列组成：aspxaa1valmetthrglnthrproleuserleuservalthrproglyglnproalaserilesercysargxaa2serglnserleuvalhisseraspxaa3xaa4thrtyrleuhistrptyrleuglnlysproglyglnserproglnleuleuiletyrxaa5xaa6serasnargpheserglyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysileserargvalglualagluaspvalglyvaltyrphecysxaa7glnserthrxaa8valprotyralapheglyglyglythrlysvalgluilelysargthr(seqidno:57)，其中(a)xaa1是缬氨酸(val)或异亮氨酸(ile)，(b)xaa2是半胱氨酸(cys)或丝氨酸(ser)，(c)xaa3是甘氨酸(gly)或丝氨酸(ser)，(d)xaa4是天冬酰胺(asn)或天冬氨酸(asp)，(e)xaa5是赖氨酸(lys)、甘氨酸(gly)、天冬酰胺(asn)、丝氨酸(ser)或亮氨酸(leu)，(f)xaa6是缬氨酸(val)或异亮氨酸(ile)，(g)xaa7是丝氨酸(ser)、丙氨酸(ala)或甘氨酸(gly)，以及(h)xaa8是组氨酸(his)或酪氨酸(tyr)。
在一个实施方案中，所述分离的免疫球蛋白轻链多肽包括以下任一项所示的氨基酸序列，由以下任一项所示的氨基酸序列组成，或者基本上由以下任一项所示的氨基酸序列组成：seqidno:58、seqidno:59、seqidno:60、seqidno:61、seqidno:62、seqidno:63、seqidno:64、seqidno:65、seqidno:66、seqidno:67、seqidno:68、seqidno:69、seqidno:70、seqidno:71、seqidno:72、seqidno:73、seqidno:74、seqidno:75、seqidno:76、seqidno:77、seqidno:78、seqidno:79、seqidno:80、seqidno:81、seqidno:82、seqidno:83、seqidno:84、seqidno:85、seqidno:86、seqidno:87、seqidno:88、seqidno:187、seqidno:188、或seqidno:189。
本发明提供了一种分离的免疫球蛋白轻链多肽，其包括以下氨基酸序列，基本上由以下氨基酸序列组成，或者由以下氨基酸序列组成：aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalglyaspargvalthrilethrcysglnalaserglnaspileserasntyrleuasntrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuilexaa1xaa2xaa3xaa4xaa5leugluthrglyvalproserargpheserglyserglyserglythraspphethrphethrileserserleuglnprogluaspilealavaltyrtyrcysglnglnsertyrserxaa6leuilethrpheglyglnglythrargleugluilelysargthrvalalaalaproserval(seqidno:89)，其中(a)子序列xaa1xaa2xaa3xaa4xaa5缺失或者是tyr-asp-ala-ser-asn，以及(b)xaa6是苏氨酸(thr)或异亮氨酸(ile)。
本发明的免疫球蛋白轻链多肽当xaa6是苏氨酸(thr)或异亮氨酸(ile)时，可以包括或缺失seqidno:89的49-53位点处的子序列xaa1xaa2xaa3xaa4xaa5。当本发明所述免疫球蛋白轻链多肽包括所述子序列xaa1xaa2xaa3xaa4xaa5时，xaa1、xaa2、xaa3、xaa4和xaa5各自可以是任意合适的氨基酸残基。优选地，xaa1是酪氨酸(tyr)，xaa2是天冬氨酸(asp)，xaa3是丙氨酸(ala)，xaa4是丝氨酸(ser)，以及xaa5是天冬酰胺(asn)。免疫球蛋白轻链多肽的优选的包括xaa1xaa2xaa3xaa4xaa5子序列的氨基酸序列包括seqidno:90。当免疫球蛋白轻链多肽缺少子序列xaa1xaa2xaa3xaa4xaa5时，所述免疫球蛋白轻链多肽优选地包括seqidno:91或seqidno:92所示的氨基酸序列。
在另一实施方案中，提供了一种分离的免疫球蛋白轻链多肽，其包括seqidno:196或197。这种多肽的实例包括包含seqidno:198-200中的任一项的多肽。
当本发明的免疫球蛋白轻链多肽基本上由seqidno:57-seqidno:92、seqidno:187-189、或seqidno:196-200中的任一项所示的氨基酸序列组成时，所述多肽可以包括另外的不会在本质上影响所述多肽的组分(例如，蛋白质部分，如辅助纯化或分离的生物素)。当本发明的免疫球蛋白轻链多肽由seqidno:57-seqidno:92中的任一项所示的氨基酸序列组成时，所述多肽不包括任何另外的组分(即，对于本发明所述免疫球蛋白轻链多肽来说不是内源性的组分)。
本发明提供了一种分离的免疫球蛋白轻链多肽，其包括与seqidno:57-seqidno:92中的任一项具有至少90％同一性(例如，至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或者100％同一性)的氨基酸序列。核酸或氨基酸序列的“同一性”可以通过使用本文所描述的方法来确定。
上述免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸替代或取代。氨基酸的“替代”或“取代”是指多肽序列内在给定位置或残基处的一个氨基酸被另一氨基酸在相同位置或残基处替代。
氨基酸大致分为“芳香族”或“脂肪族”。芳香族氨基酸包括芳环。“芳香族”氨基酸的实例包括组氨酸(h或his)、苯丙氨酸(f或phe)、酪氨酸(y或tyr)和色氨酸(w或trp)。非芳香族氨基酸大致分为“脂肪族”。“脂肪族”氨基酸的实例包括甘氨酸(g或gly)、丙氨酸(a或ala)、缬氨酸(v或val)、亮氨酸(l或leu)、异亮氨酸(i或ile)、甲硫氨酸(m或met)、丝氨酸(s或ser)、苏氨酸(t或thr)、半胱氨酸(c或cys)、脯氨酸(p或pro)、谷氨酸(e或glu)、天冬氨酸(a或asp)、天冬酰胺(n或asn)、谷氨酰胺(q或gln)、赖氨酸(k或lys)和精氨酸(r或arg)。
脂肪族氨基酸可以细分为四个亚组。“大脂肪族非极性亚组”由缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸组成。“脂肪族微极性亚组”由甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸组成。“脂肪族极性/带电亚组”由谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸和精氨酸组成。“小残基亚组”由甘氨酸和丙氨酸组成。带电/极性氨基酸组可以细分为三个亚组：由赖氨酸和精氨酸组成的“带正电荷亚组”、由谷氨酸和天冬氨酸组成的“带负电荷亚组”、以及由天冬酰胺和谷氨酰胺组成的“极性亚组”。
芳香族氨基酸可以细分为两个亚组：由组氨酸和色氨酸组成的“氮环亚组”以及由苯丙氨酸和酪氨酸组成的“苯基亚组”。
氨基酸的替代或取代可以是保守的、半保守的或者不保守的。术语“保守的氨基酸取代”或“保守的突变”是指用另一个具有共同特性的氨基酸替代一个氨基酸。确定单个氨基酸之间共同特性的一种功能性方法是分析相应的同源生物体蛋白之间氨基酸变化的归一化的频率(schulz和schirmer,principlesofproteinstructure,springer-verlag,newyork(1979))。根据这种分析，可以如下定义氨基酸组：当组内的氨基酸优选地彼此间交换，并且因此在其对整个蛋白质结构的影响方面彼此最为相似(schulz和schirmer,同上)。
保守的氨基酸取代的实例包括上述的亚组内氨基酸间的取代，例如精氨酸取代赖氨酸(反之亦然)从而使得可以保持正电荷，天冬氨酸取代谷氨酸(反之亦然)使得可以保持负电荷，苏氨酸取代丝氨酸使得可以保留自由的-oh，以及天冬酰胺取代谷氨酰胺使得可以保留自由的-nh2。
“半保守突变”包括上面列出的在相同组内但不在相同亚组内的氨基酸间的氨基酸取代。例如，天冬酰胺取代天冬氨酸或者赖氨酸取代天冬酰胺涉及同一组但不同亚组内的氨基酸。“不保守突变”涉及不同组之间的氨基酸取代，例如色氨酸取代赖氨酸，或者丝氨酸取代苯丙氨酸等。
此外，可将一个或多个氨基酸插入上述免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽中。可以将任意数量的任何合适的氨基酸插入到所述免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽的氨基酸序列中。就这方面而言，可以将至少一个氨基酸(例如，2个或更多、5个或更多、或10个或更多氨基酸)但不超过20个氨基酸(例如18个或更少、15个或更少、或12个或更少氨基酸)插入到所述免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽的氨基酸序列中。优选将1-10个氨基酸(例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸)插入到所述免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽的氨基酸序列中。就这方面而言，可以将氨基酸插入到任一上述免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽的任何合适的位置。优选地，将氨基酸插入免疫球蛋白重链多肽和/或轻链多肽的cdr(例如，cdr1、cdr2或cdr3)中。
本发明的分离的免疫球蛋白重链多肽和轻链多肽不限于包括本文所述特定氨基酸序列的多肽。实际上，所述免疫球蛋白重链多肽或轻链多肽可以是与本发明的免疫球蛋白重链多肽或轻链多肽竞争结合lag-3的任何重链多肽或轻链多肽。就这方面而言，例如，所述免疫球蛋白重链多肽或轻链多肽可以是与本发明的重链多肽或轻链多肽所识别的lag-3表位相同的表位结合的任意重链多肽或轻链多肽。可以用利用elisa、western印迹或免疫组化方法的常规的肽竞争测定法来测定抗体竞争(参见，例如，美国专利号4,828,981和8,568,992；以及braitbard等,proteomesci.,4:12(2006))。
本发明提供了一种分离的lag-3结合剂，其包括本文所述的本发明的分离的氨基酸序列中的一个或多个，基本上由其组成，或者由其组成。“lag-3结合剂”是指与lag-3蛋白特异性结合的分子，优选地为蛋白质类分子。优选地，所述lag-3结合剂是抗体或其片段(例如，其免疫原性片段)。本发明的lag-3结合剂包括本发明的分离的免疫球蛋白重链多肽和/或本发明分离的免疫球蛋白轻链多肽、基本上由其组成、或者由其组成。在一个实施方案中，lag-3结合剂包括本发明的免疫球蛋白重链多肽或本发明的免疫球蛋白轻链多肽、基本上由其组成、或者由其组成。在另一实施方案中，lag-3结合剂包括本发明的免疫球蛋白重链多肽和本发明的免疫球蛋白轻链多肽、基本上由其组成、或者由其组成。
本发明的免疫球蛋白重链多肽和/或本发明的免疫球蛋白轻链多肽的任意氨基酸残基可以以任意组合的形式，被不同的氨基酸残基替换，或者缺失或者被插入，只要所述氨基酸替代、插入和/或缺失能够导致增强或改善所述lag-3结合剂的生物活性即可。lag-3结合剂的“生物学活性”是指，例如，对特定lag-3表位的结合亲和力，对lag-3与其受体结合的中和作用或抑制作用，在体内对lag-3活性的中和作用或抑制作用(例如，ic50)，药代动力学和交叉反应性(例如，与lag-3蛋白的非人同源物或直系同源物的交叉反应性，或者与其他蛋白或组织的交叉反应性)。本领域认可的抗原结合剂的其它生物学特性或特征包括，例如，亲合力、选择性、可溶性、折叠、免疫毒性、表达和制剂。可以使用标准技术来观察、测量和/或评估上述特性或特征，包括但不限于elisa、竞争性elisa、表面等离子体共振分析(biacoretm)或kinexatm、体外或体内中和测定法、受体-配体结合测定法、细胞因子或生长因子生成和/或分泌测定法、以及信号转导和免疫组织化学测定法。
本文中所使用的关于lag-3结合剂的活性的术语“抑制”或“中和”是指能够基本上拮抗、禁止、预防、限制、减缓、破坏、改变、消除、停止或逆转(例如，lag-3的生物活性或者与lag-3相关的疾病或病症的)进展或严重程度。本发明的分离的lag-3结合剂优选地对lag-3的活性抑制或中和至少约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约100％，或者由上述任意两个值限定的范围。
本发明的分离的lag-3结合剂可以是如本文所述完整的抗体或者是抗体片段。术语“抗体的片段”、“抗体片段”和“抗体的功能性片段”在本文中可互换使用，以表示保留特异性结合抗原的能力的一个或多个抗体片段(大体参见，holliger等,nat.biotech.,23(9):1126-1129(2005))。所述分离的lag-3结合剂可以含有结合lag-3的任意抗体片段。理想地，所述抗体片段包括，例如，一个或多个cdr、可变区(或其部分)、恒定区(或其部分)、或其组合。抗体片段的实例包括，但不限于，(i)fab片段，其是由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段，(ii)f(ab’)2片段，其是包括在铰链区通过二硫键连接的两个fab片段的二价片段，(iii)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段，(iv)fab'片段，其通过用温和的还原条件破坏f(ab’)2片段的二硫桥而生成，(v)经二硫键稳定的fv片段(dsfv)，和(vi)结构域抗体(dab)，其是特异性结合抗原的抗体单可变区结构域(vh或vl)多肽。
在分离的lag-3结合剂包括免疫球蛋白重链或轻链多肽的片段的实施方案中，只要所述片段与lag结合并且优选地抑制lag-3的活性，那么所述片段可以是任意的大小。从这方面来说，免疫球蛋白重链多肽的片段理想地包括约5个到18个之间的(例如，约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个，或者由任意两个前述值定义的范围的)氨基酸。类似地，免疫球蛋白轻链多肽的片段理想地包括约5个到18个之间的(例如，约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个，或者由任意两个前述值定义的范围的)氨基酸。
当lag-3结合剂是抗体或抗体片段时，所述抗体或抗体片段理想地包括任意合适类别的重链恒定区(fc)。优选地，所述抗体或抗体片段包括基于野生型igg1、igg2或igg4抗体或其变体的重链恒定区。在一些实施方案中，所述lag-3结合剂包括fc区，所述fc区被改造成减少或消除所述抗体的效应子功能。如同用于改造fc区以减少或消除效应子功能的技术一样，具有降低或废除的效应子功能的改造过的fc区也是本领域已知的并且可以商购获得，其中任何一种都可以与本发明结合使用。
lag-3结合剂也可以是单链抗体片段。单链抗体片段的实例包括，但不限于，(i)单链fv(scfv)，其是由fv片段的两个结构域(即，vl和vh)通过合成的接头连接组成的单价分子，所述接头使得两个结构域能够被合成为单个多肽链(参见，例如，bird等,science,242:423-426(1988)；huston等,proc.natl.acad.sci.usa,85:5879-5883(1988)；和osbourn等,nat.biotechnol.,16:778(1998))和(ii)双价抗体，其是多肽链的二聚体，其中每个多肽链包括vh通过肽接头连接vl，所述接头太短以至于不能让同一条多肽链上的vh和vl之间发生配对，从而驱使不同的vh-vl多肽链上的互补结构域之间发生配对，以产生具有两个功能性抗原结合位点的二聚体分子。抗体片段是本领域已知的并且在例如美国专利申请公开号2009/0093024a1中有更详细的描述。
分离的lag-3结合剂还可以是胞内抗体(intrabody)或其片段。胞内抗体是在细胞内表达的并且在细胞内起作用的抗体。胞内抗体通常缺乏二硫键并且能通过其特异性结合活性来调节靶基因的表达或活性。胞内抗体包括单结构域片段，如分离的vh和vl结构域和scfv。胞内抗体可以包括连在胞内抗体的n末端或c末端的亚细胞运送信号，以允许其在靶蛋白所处的亚细胞区室中高浓度表达。在与靶基因相互作用时，胞内抗体调节靶蛋白的功能和/或通过例如封存于非生理性的亚细胞隔室中的机制来实现表型/功能性的敲除。胞内抗体介导的基因失活的其他机制可以依赖于胞内抗体所靶向的表位，例如与靶蛋白上的催化位点或参与蛋白-蛋白、蛋白-dna或蛋白-rna的相互作用的表位的结合。
分离的lag-3结合剂也可以是抗体缀合物。就这方面而言，所述分离的lag-3结合剂可以是(1)抗体、替代支架、或其片段的缀合物，和(2)包括所述lag-3结合剂的蛋白质或非蛋白质部分的缀合物。例如，lag-3结合剂可以是与肽、荧光分子或化学治疗剂缀合的抗体的全部或部分。
分离的lag-3结合剂可以是人抗体、非人抗体或嵌合抗体，或者可以从人抗体、非人抗体或嵌合抗体获得。“嵌合的”是指包括人和非人区域的抗体或其片段。优选地，分离的lag-3结合剂是人源化抗体。“人源化”抗体是包括人抗体支架和至少一个获自或来源于非人抗体的cdr的单克隆抗体。非人抗体包括分离自任何非人动物比如例如啮齿动物(例如，小鼠或大鼠)的抗体。人源化抗体可以包括一个、两个或三个获自或来源于非人抗体的cdr。在本发明的一个实施方案中，本发明的lag-3结合剂的cdrh3获自或来源于小鼠单克隆抗体，而本发明的lag-3结合剂的其他可变区和恒定区获自或来源于人单克隆抗体。
可以通过任意方式获得人抗体、非人抗体、嵌合抗体或人源化抗体，包括通过体外来源(例如，以重组的方式生产抗体的杂交瘤或细胞系)和体内来源(例如，啮齿动物)的方式获得。用于产生抗体的方法是本领域已知的并且在，例如，
在一个实施方案中，通过使用蛋白质化学或重组dna技术，可以将本文所述免疫球蛋白重链多肽和/或免疫球蛋白轻链多肽的cdr(例如，cdr1、cdr2或cdr3)或可变区移植(即，嫁接(grafted))到另一个分子(例如，抗体或非抗体多肽)上。就这方面而言，本发明提供了一种分离的lag-3结合剂，其包括本文所述的免疫球蛋白重链和/或轻链多肽的至少一个cdr。如本文所述，分离的lag-3结合剂可以包括免疫球蛋白重链和/或轻链可变区的一个、两个或三个cdr。
在优选的实施方案中，lag-3结合剂结合lag-3的表位，其阻断了lag-3与mhcii类分子的结合并抑制了lag-3介导的信号传导。例如，所述lag-3结合剂可以与lag-3蛋白的四个ig样胞外结构域(d1-d4)中的一个或多个结合(参见，例如，triebel等,j.exp.med.,171(5):1393-1405(1990)；和bruniquel等,immunogenetics,47:96-98(1997))。优选地，所述lag-3结合剂结合lag-3蛋白的结构域1(d1)和/或结构域2(d2)。本发明还提供了分离的或纯化的lag-3表位，其以间接或变构的方式阻断lag-3与mhcii类分子的结合。
本发明还提供了一种或多种分离的或纯化的核酸序列，所述序列编码本发明的免疫球蛋白重链多肽、本发明的免疫球蛋白轻链多肽和本发明的lag-3结合剂。
术语“核酸序列”旨在涵盖dna或rna的聚合物，即多核苷酸，其可以是单链或双链并且其可以含有非天然的或改变的核苷酸。本文所用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指任意长度的核苷酸(核糖核苷酸(rna)或脱氧核糖核苷酸(dna))聚合形式。这些术语是指所述分子的一级结构，并且因此包括双链和单链dna，以及双链和单链rna。作为等同物，所述术语包括从核苷酸类似物和经修饰的多核苷酸(例如，但不限于，甲基化的和/或封端的多核苷酸)制得的rna或dna的类似物。尽管本领域中已知许多其它连接(例如，硫代磷酸酯phosphorothioate、硼烷磷酸酯boranophosphate等)，但是核酸通常通过磷酸键连接以形成核酸序列或多核苷酸。
本发明还提供了一种载体，所述载体包括一种或多种编码本发明的免疫球蛋白重链多肽、本发明的免疫球蛋白轻链多肽和/或本发明的lag-3结合剂的核酸序列。所述载体可以是，例如，质粒、附加体(episome)、粘粒、病毒载体(例如，逆转录病毒或腺病毒)或噬菌体。合适的载体和载体制备方法是本领域熟知的(参见，例如，sambrook等,molecularcloning,alaboratorymanual,3rdedition,coldspringharborpress,coldspringharbor,n.y.(2001),和ausubel等,currentprotocolsinmolecularbiology,greenepublishingassociatesandjohnwiley&sons,newyork,n.y.(1994))。
除了编码本发明的免疫球蛋白重多肽、本发明的免疫球蛋白轻链多肽和/或本发明的lag-3-结合剂的核酸序列之外，所述载体优选地还包括表达控制序列，例如启动子、增强子、多聚腺苷酸化信号、转录终止子、信号肽(例如，骨粘连蛋白信号肽)、内部核糖体进入位点(ires)等，所述表达控制序列使得编码序列能够在宿主细胞中表达。示例性的表达控制序列是本领域已知的并且在，例如，goeddel,geneexpressiontechnology:methodsinenzymology,vol.185,academic出版社,sandiego,calif.(1990)中有描述。
来自多种不同来源的大量启动子，包括组成型启动子、诱导型启动子和阻抑性启动子是本领域熟知的。启动子的代表性来源包括例如病毒、哺乳动物、昆虫、植物、酵母和细菌，并且来自这些来源的合适的启动子较易获得或者可以基于可公开获得的序列(例如，从诸如atcc等文库以及其他商业或个人来源公开获得的序列)合成制得。启动子可以是单向的(即，在一个方向上启动转录)或者双向的(即，在或3'或5'方向上启动转录)。启动子的非限制性实例包括，例如，t7细菌表达系统、pbad(araa)细菌表达系统、巨细胞病毒(cmv)启动子、sv40启动子、rsv启动子。诱导型启动子包括，例如，tet系统(美国专利号5,464,758和5,814,618)、ecdysone诱导系统(no等,proc.natl.acad.sci.,93:3346-3351(1996))、t-rextm系统(invitrogen,卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州)、lacswitchtm系统(stratagene,sandiego,ca)和cre-ert他莫昔芬可诱导的重组酶系统(indra等,nuc.acid.res.,27:4324-4327(1999)；nuc.acid.res.,28:e99(2000)；美国专利号7,112,715；以及kramer&fussenegger,methodsmol.biol.,308:123-144(2005))。
本文使用的术语“增强子”是指这样的dna序列：其提高(例如，其以可操作的方式所连接的核酸序列)的转录。增强子可以处于远离所述核酸序列的编码区几千碱基的地方，并且可以介导调节因子的结合、dna甲基化的模式或者dna结构的变化。来自各种不同来源的大量的增强子是本领域公知的，并且可以(从，例如，诸如atcc等的文库以及其他商业或个人来源)以克隆的多核苷酸形式获得或者以存在于克隆的多核苷酸内的形式获得。一些包括启动子(例如，常用的cmv启动子)的多核苷酸还包括增强子序列。增强子可以位于编码序列的上游、内部或下游。
载体也可以包括“选择性标记基因”。本文使用的术语“选择性标记基因”是指这样的核酸序列：在存在相应的选择剂的条件下，其允许特异性地选择或剔除表达所述核酸序列的细胞。合适的选择性标记基因是本领域已知的，并且在，例如，国际专利申请公开wo1992/008796和wo1994/028143；wigler等,proc.natl.acad.sci.usa,77:3567-3570(1980)；o'hare等,proc.natl.acad.sci.usa,78:1527-1531(1981)；mulligan&berg,proc.natl.acad.sci.usa,78:2072-2076(1981)；colberre-garapin等,j.mol.biol.,150:1-14(1981)；santerre等,gene,30:147-156(1984)；kent等,science,237:901-903(1987)；wigler等,cell,11:223-232(1977)；szybalska&szybalski,proc.natl.acad.sci.usa,48:2026-2034(1962)；lowy等,cell,22:817-823(1980)；以及美国专利号5,122,464和5,770,359中有描述。
在一些实施方案中，所述载体是“附加型表达载体”或“附加体”，其能够在宿主细胞中复制，并且在存在适当的选择压力的条件下作为dna的染色体外段在所述宿主细胞内持续存在(参见，例如，conese等,genetherapy,11:1735-1742(2004))。代表性的可商购获得的附加型表达载体包括，但不限于，利用爱泼斯坦巴尔核抗原1(ebna1)和爱泼斯坦巴尔病毒(ebv)复制起点(orip)的附加型质粒。来自invitrogen(卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州)的prep4、pcep4、prep7和pcdna3.1载体以及来自stratagene(拉由拉市，美国加利福尼亚州)的pbk-cmv载体代表了使用t-抗原和sv40复制起点来代替ebna1和orip的附加型载体的非限制性实例。
其它合适的载体包括整合型表达载体，其可以随机整合到宿主细胞的dna中，或者可以包括重组位点从而使得所述表达载体和所述宿主细胞的染色体之间能够进行特异性重组。这种整合型表达载体可以利用所述宿主细胞染色体的内源性表达控制序列来影响目标蛋白的表达。以位点特异性的方式整合的载体的实例包括，例如，invitrogen(卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州)的flp-in系统的组分(例如，pcdnatm5/frt)，或者cre-lox系统，例如在来自stratagene(拉由拉市，美国加利福尼亚州)的pexchange-6核心载体中存在的cre-lox系统。可以随机整合进宿主细胞染色体中的载体的实例包括，例如，lifetechnologies(卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州)的pcdna3.1(当在不存在t抗原的情况下引入时)，millipore公司(比尔里卡，美国马萨诸塞州)的ucoe，以及promega公司(麦迪逊，美国威斯康星州)的pci或pfn10a(act)flexitm。
也可以使用病毒载体。代表性的可商购获得的病毒表达载体包括，但不限于，从crucell公司(莱顿，荷兰)购得的基于腺病毒的per.c6系统，来自invitrogen(卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州)的基于慢病毒的plp1，以及来自stratagene(拉由拉市，美国加利福尼亚州)的pfb-erv+pcfb-egsh逆转录病毒载体。
可以将编码本发明的多个氨基酸序列的多个核酸序列放在同一个载体上提供给细胞(即，以顺式的方式)。单向启动子可被用于控制每个核酸序列的表达。在另一实施方案中，可以使用双向和单向启动子的组合来控制多个核酸序列的表达。或者，可以将编码本发明的多个氨基酸序列的多个核酸序列各自放在单独的载体(即，以反式的方式)上提供给细胞群。每个所述在单独载体中的核酸序列可以包括相同或不同的表达控制序列。可以将各单独的载体同时或依次提供给细胞。
可以将包含编码本发明的氨基酸序列的核酸的载体导入能够就此表达被编码的多肽的宿主细胞中，所述宿主细胞包括任何合适的原核细胞或真核细胞。因此，本发明提供了包括本发明的载体的分离的细胞。优选的宿主细胞是这样的细胞：其可以容易且稳定地(reliably)生长，具有还算快的生长速率，具有良好表征的表达系统，并且可以容易且有效地进行转化或转染。
合适的原核细胞的实例包括，但不限于，来自芽孢杆菌属(例如，枯草芽孢杆菌和短芽孢杆菌)、大肠杆菌属(例如，e.coli)、假单胞菌属、链霉菌属、沙门氏菌属和欧文氏菌属的细胞。特别有用的原核细胞包括多种大肠杆菌菌株(例如，k12、hb101(atccno.33694)、dh5α、dh10、mc1061(atccno.53338)和cc102)。
优选地，将载体导入真核细胞。合适的真核细胞是本领域已知的并且包括，例如，酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。合适的酵母细胞的实例包括来自克鲁维酵母属(kluyveromyce)、毕赤酵母属(pichia)、鼻孢子菌属(rhino-sporidium)、酿酒酵母属(saccharomyces)和裂殖酵母属(schizosaccharomyces)的细胞。优选的酵母细胞包括例如酿酒酵母(saccharomycescerivisae)和巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)。
合适的昆虫细胞在，例如，kitts等,biotechniques,14:810-817(1993)；lucklow,curr.opin.biotechnol.,4:564-572(1993)；和lucklow等,j.virol.,67:4566-4579(1993)中有描述。优选的昆虫细胞包括sf-9和hi5(invitrogen,卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州)。
本发明优选地使用哺乳动物细胞。许多合适的哺乳动物宿主细胞是本领域已知的，并且很多可从美国典型培养物保藏中心(atcc，马纳萨斯，美国弗吉尼亚州)获得。合适的哺乳动物细胞的实例包括，但不限于，中国仓鼠卵巢细胞(cho)(atccno.ccl61)、chodhfr细胞(urlaub等,proc.natl.acad.sci.usa,97:4216-4220(1980))、人类胚胎肾(hek)293或293t细胞(atccno.crl1573)和3t3细胞(atccno.ccl92)。其它合适的哺乳动物细胞系是猴cos-1(atccno.crl1650)和cos-7细胞系(atccno.crl1651)以及cv-1细胞系(atccno.ccl70)。其它示例性哺乳动物宿主细胞包括灵长类动物细胞系和啮齿动物细胞系，包括转化的细胞系。正常二倍体细胞、源自原代组织的体外培养的细胞株、以及原代外植体也是合适的。其他合适的哺乳动物细胞系包括，但不限于，小鼠成神经细胞瘤n2a细胞、hela、小鼠l-929细胞以及bhk或hak仓鼠细胞系，所有这些都可从atcc获得。用于选择合适的哺乳动物宿主细胞的方法以及用于转化、培养、扩增、筛选和纯化细胞的方法是本领域已知的。
在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是人细胞。例如，所述哺乳动物细胞可以是人淋巴样细胞或从淋巴样细胞衍生出来的细胞系，例如具有前b淋巴细胞起源的细胞系。人淋巴样细胞系的实例包括，但不限于，ramos(crl-1596)、daudi(ccl-213)、eb-3(ccl-85)、dt40(crl-2111)、18-81(jack等,proc.natl.acad.sci.usa,85:1581-1585(1988))、raji细胞(ccl-86)、per.c6细胞(crucellhollandb.v.,莱顿,荷兰)、及其衍生物。
可以通过“转染”、“转化”或“转导”将编码本发明的氨基酸序列的核酸序列引入细胞。本文所用的“转染”、“转化”或“转导”是指通过使用物理或化学方法将一种或多种外源性多核苷酸引入宿主细胞。很多转染技术是本领域已知的并且包括，例如，磷酸钙dna共沉淀法(参见，例如，murraye.j.(ed.),methodsinmolecularbiology,vol.7,genetransferandexpressionprotocols,humanapress(1991))；deae-葡聚糖法；电穿孔法；阳离子脂质体介导的转染法；钨颗粒促进的微粒轰击法(johnston,nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶dna共沉淀法(brash等，mol.cellbiol.,7:2031-2034(1987))。在感染性颗粒在合适的包装细胞(其有很多可以通过商购获得)中生长了之后，可将噬菌体或病毒载体导入宿主细胞。
本发明提供了一种组合物，所述组合物包括有效量的本发明的免疫球蛋白重链多肽、本发明的免疫球蛋白轻链多肽、本发明的lag-3结合剂、本发明的编码前述任何一种的核酸序列、或者包括本发明的核酸序列的本发明的载体。优选地，所述组合物是药学上可接受的(例如，生理上可接受的)组合物，其包括运载体，优选地药学上可接受的(例如，生理上可接受的)运载体，以及本发明的氨基酸序列、抗原结合剂或载体。任何合适的运载体都可以在本发明的背景下使用，并且这种运载体是本领域熟知的。运载体的选择部分取决于组合物可以施用的特定部位和用于施用组合物的特定方法。任选地，组合物可以是无菌的。可以将组合物冷冻或冻干储存并且于使用前在合适的无菌运载体中重构。可以根据在，例如，remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第21版,lippincottwilliams&wilkins,philadelphia,pa(2001)中所描述的常规技术来生成所述组合物。
本发明还提供了一种在哺乳动物中治疗对lag-3的抑制或中和有应答的疾病的方法。所述方法包括向患有对lag-3的抑制或中和有应答的疾病的哺乳动物施用前述组合物，从而在该哺乳动物中治疗所述疾病。“对lag-3的抑制有应答的”或者“对lag-3的中和有应答”的疾病是指任意以下疾病或紊乱：其中哺乳动物(优选人)中lag-3水平或活性的降低具有治疗益处，或者lag-3的不正常表达(例如，过表达)或增加的活性导致或促成所述疾病或紊乱的病理效应。对lag-3的抑制有应答的疾病包括，例如，癌症和感染性疾病。本发明的方法可用于治疗本领域已知的任何类型的癌症，比如例如，黑色素瘤、肾细胞癌、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、胆囊癌、喉癌、肝癌、甲状腺癌、胃癌、唾液腺癌、前列腺癌、胰腺癌或默克尔细胞癌(参见，例如，bhatia等,curr.oncol.rep.,13(6):488-497(2011))。本发明的方法可用于治疗任何类型的感染性疾病(即，由细菌、病毒、真菌或寄生虫引起的疾病或紊乱)。可以通过本发明的方法治疗的感染性疾病的实例包括，但不限于，由人类免疫缺陷病毒(hiv)、呼吸道合胞病毒(rsv)、流感病毒、登革热病毒、乙型肝炎病毒(hbv，或丙型肝炎病毒(hcv))引起的疾病。施用包括本发明的免疫球蛋白重链多肽、本发明的免疫球蛋白轻链多肽、本发明的lag-3结合剂、编码前述任何一种的本发明的核酸序列、或者包括本发明的核酸序列的本发明的载体的组合物，能在哺乳动物中诱导针对癌症或感染性疾病的免疫应答。“免疫应答”可能涉及，例如，抗体的产生和/或免疫效应细胞(例如，t细胞)的激活。
本文使用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等是指获得所想要的药理学和/或生理学效应。优选地，所述效应是治疗性的，即，所述效应部分地或完全地治愈疾病和/或可归因于所述疾病的不利症状。为此，本发明的方法包括施用“治疗有效量的”lag-3结合剂。“治疗有效量”是指在必要的时间段内以各种剂型有效达到所想要的治疗结果的量。治疗有效量可以根据多种因素而变化，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及lag-3结合剂在个体中引发所需应答的能力。例如，本发明的lag-3结合剂的治疗有效量是降低人体中lag-3生物活性的量。
或者，所述药理学和/或生理学效应可以是预防性的，即，所述效应完全地或部分地防止疾病或其症状。就这方面而言，本发明的方法包括施用“预防性有效量的”lag-3结合剂。“预防性有效量”是指在必要的时间段内以各种剂型有效达到所想要的预防结果(例如，预防疾病发作)的量。
典型的剂量可以是，例如，以动物或人体重计算1pg/kg到20mg/kg的范围；然而，低于或高于该示例性范围的剂量也在本发明范围内。每日肠胃外剂量可以是以总体重计算约0.00001μg/kg到约20mg/kg(例如，约0.001μg/kg、约0.1μg/kg、约1μg/kg、约5μg/kg、约10μg/kg、约100μg/kg、约500μg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg，或由前述值中的任意两个定义的范围)，优选以总体重计算从约0.1μg/kg到约10mg/kg(例如，约0.5μg/kg、约1μg/kg、约50μg/kg、约150μg/kg、约300μg/kg、约750μg/kg、约1.5mg/kg、约5mg/kg，或由前述值中的任意两个定义的范围)，更优选以总体重计算从约1μg/kg到5mg/kg(例如，约3μg/kg、约15μg/kg、约75μg/kg、约300μg/kg、约900μg/kg、约2mg/kg、约4mg/kg、或由前述值中的任意两个定义的范围)，以及甚至更优选以体重计算从约0.5到15mg/kg/天(例如，约1mg/kg、约2.5mg/kg、约3mg/kg、约6mg/kg、约9mg/kg、约11mg/kg、约13mg/kg、或由前述值中的任意两个定义的范围)。可以通过定期评估所治疗的患者来监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复施用，可以根据病情，重复所述治疗直到发生所想要的对疾病症状的抑制。然而，其它剂量方案也可能有用并且在本发明范围内。可以通过单次推注施用组合物、通过多次推注施用组合物、或者通过连续输注施用组合物来递送所需剂量。
可以使用标准的施用技术，包括口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、经皮、肌内、鼻内、口腔、舌下或栓剂将组合物施用给哺乳动物，所述组合物包括有效量的本发明的免疫球蛋白重链多肽、本发明的免疫球蛋白轻链多肽、本发明的lag-3结合剂、本发明的编码前述任意一种的核酸序列、或者本发明所述包括本发明的核酸序列的载体。组合物优选适用于肠胃外施用。本文使用的术语“肠胃外”包括静脉内施用、肌内施用、皮下施用、直肠施用、阴道施用和腹膜内施用。更优选地，使用通过静脉内注射、腹膜内注射或皮下注射的外周全身性递送将所述组合物施用给哺乳动物。
一旦施用给了哺乳动物(例如，具有交叉反应性的人)，就可以通过本领域已知的任何合适的方法来测量本发明的lag-3结合剂的生物学活性。例如，可以通过确定特定lag-3结合剂的稳定性来评估生物学活性。在本发明的一个实施方案中，lag-3结合剂(例如，抗体)具有在约30分钟和45天之间(例如，约30分钟、约45分钟、约1小时、约2小时、约4小时、约6小时、约10小时、约12小时、约1天、约5天、约10天、约15天、约25天、约35天、约40天、约45天、或者由任意两个前述值定义的范围)的体内半衰期。在另一实施方案中，lag-3结合剂具有在约2小时和20天之间(例如，约5小时、约10小时、约15小时、约20小时、约2天、约3天、约7天、约12天、约14天、约17天、约19天、或者由任意两个前述值定义的范围)的体内半衰期。在另一实施方案中，lag-3结合剂具有在约10天和约40天之间(例如，约10天、约13天、约16天、约18天、约20天、约23天、约26天、约29天、约30天、约33天、约37天、约38天、约39天、约40天、或者由任意两个前述值定义的范围)的体内半衰期。
也可以通过确定特定的lag-3结合剂与lag-3或其表位的结合亲和力来评估其生物学活性。术语“亲和力”是指两种试剂可逆性结合的平衡常数并且以解离常数(kd)表示。结合剂对配体的亲和力(例如，抗体对表位的亲和力)可以是，例如，约1皮摩尔(pm)到约100微摩尔(μm)(例如，从约1皮摩尔(pm)到约1纳摩尔(nm)，从约1nm到约1微摩尔(μm)，或者从约1μm到约100μm)。在一个实施方案中，lag-3结合剂可以以小于或等于1纳摩尔的kd结合lag-3蛋白(例如，0.9nm、0.8nm、0.7nm、0.6nm、0.5nm、0.4nm、0.3nm、0.2nm、0.1nm、0.05nm、0.025nm、0.01nm、0.001nm、或者由任意两个前述值定义的范围)。在另一实施方案中，lag-3结合剂可以以小于或等于200pm的kd结合lag-3(例如，190pm、175pm、150pm、125pm、110pm、100pm、90pm、80pm、75pm、60pm、50pm、40pm、30pm、25pm、20pm、15pm、10pm、5pm、1pm、或者由任意两个前述值定义的范围)。可以使用任何本领域认可的测定法来测量对目的抗原或表位的免疫球蛋白亲和力。这样的方法包括，例如，荧光激活细胞分选法(facs)、可分离珠(例如，磁珠)法、表面等离子体共振法(spr)、液相竞争法(kinexatm)、抗原淘选法和/或elisa(参见，例如，janeway等(eds.),immunobiology,5thed.,garlandpublishing,newyork,ny,2001)。
可以单独施用或者与其它药物(例如，作为佐剂的药物)组合施用本发明的lag-3结合剂。例如，可以将lag-3结合剂与其它药物组合施用，用于治疗或预防本文中所公开的疾病。就这方面而言，可以将lag-3结合剂与至少一种其他抗癌剂(包括，例如，本领域已知的任何化学治疗剂)、电离辐射、小分子抗癌剂、癌症疫苗、生物疗法(例如，其他单克隆抗体、杀癌病毒、基因疗法和过继性t细胞转移)和/或手术组合使用。当用本发明的方法治疗感染性疾病时，可以将lag-3结合剂与至少一种抗菌剂或至少一种抗病毒剂组合施用。就这方面而言，所述抗菌剂可以是本领域已知的任何合适的抗生素。所述抗病毒剂可以是特异性靶向特定病毒的任何合适类别的任意疫苗(例如，活减毒疫苗、亚单位疫苗、重组载体疫苗和小分子抗病毒疗法(例如，病毒复制抑制剂和核苷类似物))。
在另一实施方案中，可以将本发明的lag-3结合剂与抑制免疫检查点通路的其它试剂组合施用。例如，可以将本发明的lag-3结合剂与抑制或拮抗程序性死亡1(pd-1)通路、t细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3蛋白(tim-3)通路和细胞毒性t淋巴细胞相关蛋白4(ctla-4)通路的试剂组合施用。已经证明，同时靶向这些免疫检查点通路中的两种或多种的组合治疗具有改善的并且潜在协同性的抗肿瘤活性(参见，例如，sakuishi等,j.exp.med.,207:2187-2194(2010)；ngiow等,cancerres.,71:3540-3551(2011)；和woo等,cancerres.,72:917-927(2012))。在一个实施方案中，将本发明的lag-3结合剂与结合tim-3的抗体和/或结合pd-1的抗体组合施用。就这方面而言，本发明的治疗哺乳动物的癌症或感染性疾病的方法还可以包括向所述哺乳动物施用包括(i)结合tim-3蛋白的抗体和(ii)药学上可接受的运载体的组合物，或者包括(i)结合pd-1蛋白的抗体和(ii)药学上可接受的运载体的组合物。
除治疗用途外，本文的lag-3结合剂可应用于诊断或研究。就这方面而言，lag-3结合剂可用在紊乱或疾病的诊断方法中，其中在所述紊乱或疾病中，lag-3的不适当表达(例如，过表达)或者升高的活性会导致或有助于产生所述疾病或紊乱的病理学效应。在被用来测试对lag-3的抑制有应答的疾病或紊乱的受试者中，可以以类似的方式，在监测受试者中lag-3蛋白水平的测定法中使用lag-3结合剂。研究上的应用包括，例如，利用lag-3结合剂和标记物来检测样品中(例如，在人的体液中或者在细胞或组织提取物中)lag-3蛋白的方法。可以对lag-3结合剂进行修饰或者不做修饰(例如，被可检测部分共价地或非共价地标记)，进行使用。例如，所述可检测部分可以是放射性同位素(例如，3h、14c、32p、35s或125i)、荧光化合物或化学发光化合物(例如，异硫氰酸荧光素、罗丹明或荧光素)、酶(例如，碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶)、或者假体基团。本领域已知的用于将抗原结合剂(例如，抗体)单独缀合到可检测部分上的任何方法都可以在本发明的背景下使用(参见，例如，hunter等,nature,194:495-496(1962)；david等,biochemistry,13:1014-1021(1974)；pain等,j.immunol.meth.,40:219-230(1981)；和nygren,j.histochem.andcytochem.,30:407-412(1982))。
可以使用本发明的lag-3结合剂，通过本领域已知的任何合适的方法来测量lag-3的蛋白水平。这些方法包括，例如，放射免疫测定法(ria)和facs。可以使用任何合适的技术，例如，通过在适合于形成抗原-抗体复合物的条件下将包括(或者疑似包括)lag-3的样品与lag-3特异性抗体组合，来确立lag-3的正常表达值或标准表达值。将所述抗体用可检测物质直接或间接标记，以便于检测结合的或者未结合的抗体。合适的可检测物质包括各种酶、假体基团、荧光材料、发光材料和放射性材料(参见，例如，zola,monoclonalantibodies:amanualoftechniques,crcpress,inc.(1987))。然后将样品中表达的lag-3多肽的量与标准值进行比较。
可以在试剂盒(即，预定量的试剂的包装组合并且带有用于执行诊断测定法的说明书)中提供lag-3结合剂。如果用酶标记所述lag-3结合剂，则所述试剂盒理想地包括底物和所述酶所需的辅因子(例如，提供可检测的发色团或荧光团的底物前体)。此外，试剂盒中可以包括其它添加物，例如稳定剂、缓冲液(例如，封闭缓冲液或裂解缓冲液)等。可以改变各种试剂的相对量，使得试剂的溶液浓度基本上能优化测定法的灵敏度。提供的试剂可以是干粉形式(通常是冻干形式)，包括一旦溶解将会提供具有适当浓度的试剂溶液的赋形剂。
以下实施例进一步说明本发明，但是当然不应被理解成以任何方式限制其范围。
实施例1
本实施例展示了一种产生针对人lag-3的单克隆抗体的方法。
将编码人lag-3的胞外结构域(ecd)的基因与小鼠igg2a(人lag-3migg2afc)或失效形式的芥末绿(wasabi)荧光蛋白(dwfp人lag-3)融合以产生抗原，用于小鼠免疫和杂交瘤筛选。具体地，雌性瑞士韦伯斯特(swisswebster,swr)小鼠购自harlanlaboratories公司(印第安纳波利斯，美国印第安纳州)并且分成两组。经过6天的环境适应后，使用弗氏完全佐剂(cfa)或弗氏不完全佐剂(ifa)，对一组小鼠以50μg/小鼠的剂量以三到四周的间隔施用四到六次纯化的人lag-3migg2afc进行免疫。第二组动物以三到四周的间隔交替注射四到六次人lag-3migg2afc或dwfp人lag-3ecd。在第二组中也将cfa或ifa用作佐剂。将动物放血，用于评估针对人lag-3的血清滴度，其中通过测量与细胞表面人lag-3的结合来进行评估。用与h-2kk跨膜结构域融合的全长人lag-3胞外结构域转染cho-s细胞(cho-shulag-3ecd细胞)。以1:1,000–1:1,000,000稀释血清，并在4℃下与cho-shulag-3ecd细胞一起孵育30分钟。将细胞离心，用pbs/1％bsa洗涤一次，并与pe缀合的(southernbiotech，伯明翰，美国阿拉巴马州)或者alexafluortm647-(jacksonimmunoresearch，西格罗夫，美国宾夕法尼亚州)标记的山羊抗小鼠igg(h+l)在4℃下共孵育30分钟。将细胞在pbs/1％bsa中洗涤两次，重悬于pbs/1％bsa中，并在bdfacsarraytm生物分析仪(bdbiosciences，franklinlakes，nj)上分析。根据滴度读数，每组有1只动物在收集脾脏前3天进行免疫加强。从脾脏组织制备单细胞悬浮液，并且用于使用标准技术通过细胞融合产生杂交瘤。使用两种不同的骨髓瘤细胞系进行融合，f0(描述于dest.groth和scheidegger,j.immunol.methods,35:1-21(1980)中)和p3x63ag8.653(描述于kearney等,j.immunol.,123:1548-1550(1979)中)。
如上所述，筛选了杂交瘤上清液与cho-shulag-3ecd细胞的结合情况并且与其和未转染的cho-s细胞的结合情况进行比较。在结合cho-shulag-3ecd细胞的基础上，将杂交瘤转移到48孔板并扩增。
然后测试了上清液对dyl650标记的人lag-3migg2afc(人lag-3migg2afcdyl650)与daudi细胞结合的阻断能力，其中daudi细胞是内源性表达高水平mhcii(lag-3受体)的b细胞系。简言之，在加入daudi细胞之前，将人lag-3migg2afcdyl650与对照igg或抗人lag-3的候选单克隆抗体预孵育。使用bdfacsarraytm生物分析仪，通过daudi细胞的荧光降低来测量阻断作用。然后将这些杂交瘤进一步克隆并扩增到平板上用于产生排液上清(exhaustsupernatant)。随后纯化并重新测试抗体以确认与cho-shulag-3ecd细胞的结合和在daudi测定法中的阻断能力。
本实施例的结果证实使用杂交瘤细胞技术能生产抗lag-3的单克隆抗体。
实施例2
本实施例描述了cdr移植和嵌合的抗lag-3单克隆抗体的设计和生成。
对来自实施例1中所描述的杂交瘤的抗体进行同种型检测，进行rt-pcr以克隆抗体重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)并对其进行测序。具体地，使用rneasytm试剂盒(qiagen，芬洛，荷兰)从杂交瘤克隆的细胞团(1x106细胞/团)中分离rna，并使用以oligo-dt为引物的superscripttmiii第一链合成系统(lifetechnologies，卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州)制备cdna。vl的pcr扩增利用了简并的小鼠vl正向引物池(参见kontermann和dubel,eds.,antibodyengineering,springer-verlag,berlin(2001))和小鼠κ恒定区反向引物。vh的pcr扩增利用了简并的小鼠vh正向引物池(kontermann和dubel，同上)和小鼠γ1或γ2a恒定区反向引物(基于来自每个克隆的纯化抗体测定的同种型)，使用了superscripttmiii第一链合成系统(lifetechnologies，卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州)中推荐的方案进行。将pcr产物纯化并克隆到pcdna3.3-topo(lifetechnologies，卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州)中。
从每个细胞团中选择独立菌落并使用标准的sanger测序法(genewiz，inc.，southplainfield，nj)进行测序。检测可变区序列并将其与最接近的人重链或轻链v区种系序列进行比对。选择三个抗体用于cdr移植，分别命名为(1)5.b11、(2)5.d7和(3)1.e10。
通过将来自上述每种小鼠抗体的cdr残基克隆到最接近的人种系同源物中来设计cdr移植的抗体序列。合成cdr移植的抗体可变区，并与人igg1/κ恒定区一起表达用于分析。另外，使用上述小鼠抗体的可变区与人igg1/κ恒定区连接来构建小鼠：人嵌合抗体。对于嵌合的和cdr移植的抗体，就其与cho-shulag-3ecd细胞的结合以及在上述人lag-3ecd/daudi阻断测定法中的活性方面，对其进行了表征。
还在人cd4+t细胞：树突细胞混合的淋巴细胞反应(mlr)测定法中测试了嵌合的和cdr移植的抗体的功能拮抗剂活性，其中在所述mlr测定法中，在存在抗lag-3抗体的情况下通过测量il-2的分泌来评估cd4+t细胞的活化。由于lag-3是t细胞功能的负调节因子，所以预期对lag-3的拮抗作用可以导致t细胞活化的升高，其中t细胞活化的升高可以通过il-2产量的升高而测得。通过测得il-2活性的升高发现，移植了5.b11、5.d7和1.e10的cdr的抗体在mlr测定法中显示出了拮抗活性。
本实施例的结果展示了一种生成嵌合的和cdr移植的单克隆抗体的方法，所述单克隆抗体特异性结合并抑制lag-3。
实施例3
本实施例展示了针对人lag-3的人源化单克隆抗体的亲和力成熟。
通过生物信息学预测(insilico)体细胞高频突变(ishm)来对衍生自实施例2所述的5.d7和1.e10两种原始的鼠单克隆抗体的cdr移植抗体进行亲和力成熟。该方法集合了通过计算分析比较了从ncbi下载的体内成熟的抗体序列，并且将其与人种系ighv、igkv和iglv序列及其等位基因形式进行比较(如bowers等,j.biol.chem.,288(11):7688-7696(2013)中所述)所预测的突变。使用表面等离子体共振法(spr)测定了所得抗体针对lag-3的结合特性以及测定了如前所述的与cho-shulag-3ecd细胞结合的能力。还使用kinexatm3000测定法(sapidyneinstruments，博伊西，美国爱达荷州)执行了基于溶液的亲和力分析，并使用3.2.6版本的kinexatmpro软件分析结果。对实验参数进行了选择使得在0.8和1.2v之间抗体单独存在时达到最大信号，同时将单独存在缓冲液时的非特异性结合信号限制到小于最大信号的10％。通过使用溶解在50mmna2co3中的人或食蟹猴wfp-lag-3(1ml中50μg/ml)溶液稀释吖内酯小珠(azlactonebeads)(50mg)来使其被抗原包被。将所述溶液在室温下旋转2小时，在picofuge离心机中沉淀小珠并用封闭液(10mg/mlbsa，1mtris-hcl，ph8.0)洗涤两次。将小珠重新悬浮在封闭液(1ml)中，在室温下旋转1小时，并在25份体积的pbs/0.02％nan3中稀释。用于亲和力测定的二抗是alexfluortm647染料标记的抗人igg(500ng/ml)。使样品抗体的浓度保持不变(50pm或75pm)，但是对人或食蟹猴wfp-lag-3抗原用从1μm到17pm的三倍倍比稀释进行了滴定。所有样品在pbs、0.2％nan3、1mg/mlbsa中稀释，并使其在室温下平衡30小时。另外，测试了仅含有抗体和仅含有缓冲液的样品，以分别确定最大信号和非特异性结合信号。
使用如mcconnell等,proteineng.des.sel.,26:151(2013)中所描述的thermofluor测定法来评估所选抗体的热稳定性。该测定法通过疏水性荧光染料结合蛋白质表面上的随蛋白质解折叠而暴露出来的疏水性补丁(patches)的能力评估稳定性。确定50％的蛋白质解折叠时的温度(tm)以测量热稳定性。该测定法证明，5.d7单克隆抗体变体具有适合于药物开发的可接受的熔解温度(tm)(即，大于70℃)。
通过评估与阴性靶细胞的非特异性结合来消除与所测抗体的体内药物动力学相关的潜在问题带来的风险(参见，例如，hotzel等，mabs,4:753-760(2012))。使用基于流式细胞术的测定法测试了抗体与hek293f细胞的结合。结果表明，对于5.d7来说非特异性结合较低并且可以通过第二步纯化进一步消除。
本实施例的结果证实了一种针对lag-3的人源化单克隆抗体的亲和性成熟方法。
实施例4
本实施例展示了一种从可进化文库中鉴定针对人lag-3的抗体的方法。
根据bowers等.proc.natl.acad.sci.usa,108(51):20455-20460(2011)中的描述，构建了基于种系序列v基因区段连接衍生自人供体的重组(d)j区的igg可进化文库。将igg重链(hc)和轻链(lc)克隆进单独的附加型载体(horlick等,gene,243(1-2):187-194(2000))中，并且每个载体编码不同的抗生素选择标记。格式化hc载体使得抗体既能递呈于细胞表面上也能分泌到组织培养基中(horlick等,j.biol.chem.,288(27):19861-19869(2013))。将不同的hc和lc组合共转染进hek293细胞中并扩增至约109个细胞。然后针对单独的链霉亲和素(sa)偶联磁珠(目录号11047，lifetechnologies，卡尔斯巴德，美国加利福尼亚州)和经sa偶联磁珠包被的不相关的生物素化抗原，分别对细胞文库进行两轮阴性筛选。然后使用被人lag-3migg2afc直接包被的磁珠或者用被生物素化的lag-3ecdmigg1fc包被的sa偶联磁珠执行一轮阳性筛选。将通过阳性筛选出来的细胞稀释并以1-10个细胞/孔的近似密度进行96孔铺板。将所得克隆在子板上扩增，并且通过facsarraytm分析测试每个群落中的一部分与lag-3ecdmigg1fcdyl650的结合情况。对于分泌到上清液中的抗体，也通过biacoretm测试其与lag-3ecdmigg1fc结合的能力。
对通过facsarraytm分析显示出针对人lag-3migg2afcdyl650具有特异性染色的和/或通过biacoretm显示出结合人lag-3migg2afcdyl650的细胞，对其进行扩增以用于分选并将其提交用于测序，以复原能够结合人lag-3的特定的hc/lc组合。通过pcr来获取(rescue)编码所述细胞群中发现的抗体的hc和lc的开放阅读框(orf)。通常来说，通过测序发现多个hc/lc序列。在一些情况下，通过使用人lag-3migg2afcdyl650进行首轮facs分选来富集表达目标单克隆抗体的细胞，从而鉴定所需的hc/lc组合。将呈现出高抗体表达并与人lag-3migg2afcdyl650的结合呈阳性的细胞群分离出来，并进行随后的序列分析。总体来说，12个不同的hc/lc对被鉴定为潜在的适合进一步表征的特异性抗lag-3抗体。将这些配对策略(strategies)被标记为a1/a14、a2、a3/a17、a4/a19、a5/a16、a6、a8/a20、a9、a10/a15、a11、a12和a13。
还对抗体结合食蟹猴lag-3蛋白(cynolag-3)的能力进行了表征。由于从所述文库中鉴定出的这些种系抗体太弱以至于不能结合表达在细胞表面的抗原，因此用dyl650标记了与人抗原相似的可溶性抗原(cynolag-3migg2afcdyl650)，然后与hek293细胞孵育，所述hek293细胞在细胞表面陈列抗体配对策略。测试了从所述可进化文库中鉴定出的八种抗体配对策略，并且证明其具有结合cynolag-3ecdmigg1fc的能力。
本实施例的结果证实，可以使用可进化文库来鉴定针对人和非人lag-3的单克隆抗体。
实施例5
本实施例展示了使用可进化文库鉴定出的针对人lag-3的抗体的亲和力成熟。
用活化诱导的胞苷脱氨酶(aid)转染共表达从实施例4中所描述的可进化文库中鉴定出的每种抗体的hc和lc的稳定细胞系，以引发体外shm。还将aid直接转染入了从文库筛选扩增出来的原始混合细胞群中。在所有情况下，对细胞群体的igg表达和抗原结合进行了染色，通过流式细胞术将其收集成大细胞群，然后对其进行扩增以通过下一代测序法(ngs)进行序列分析。对于每种配对策略，迭代重复该过程，使得对于每种配对策略，积累重链和轻链可变区及其衍生物中源自shm的突变。通过(1)spr，(2)结合cho-shulag-3ecd细胞的能力和(3)在mlr测定法中的活性，来监测亲和力的改善。随着每种抗体亲和性的改善，提高了选择严格性，直到通过鉴定和重新组合新的突变来实现亲和性的目标。
使用如上所述的thermofluor测定法来评估所选抗体的热稳定性。该测定法证明，从所述配对策略a17选择出来的单克隆抗体具有适合于药物开发的可接受的tm。还使用了基于流式细胞术的测定法测试了抗体与hek293f细胞的结合。结果表明，所选的候选物a17的非特异性结合较低。
如上所述，测试了所选抗体阻断dyl650标记的人lag-3migg2afc(人lag-3migg2afcdyl650)与daudi细胞结合的能力。将一定剂量范围的中和性抗体与可溶性lag-3预孵育并用流式细胞术进行分析。某些亲和力成熟的抗lag-3抗体完全抑制了可溶性lag-3与mhcii的相互作用。
本实施例的结果证实了一种使得经可进化文库鉴定出的针对lag-3的单克隆抗体的亲和力成熟的方法。
实施例6
本实施例证明本发明所述抗lag-3的单克隆抗体可以在体内单独地以及以与抗pd-1抗体或抗tim-3抗体组合地抑制lag-3信号传导并且增强t细胞活化。
为了建立用于抗lag-3和抗pd-1组合研究的参数，在上述人cd4+t细胞mlr测定法中以剂量-应答的方式滴定了抗pd-1的抗体ape02058。在多次mlr测定中滴定所述抗pd-1抗体的结果的基础上，选择了133pm(近似ec50)和13pm(近似ec10)用于在拮抗剂研究中测试其与抗lag-3单克隆抗体的组合。当与133pm或13.3pm的抗pd-1组合时，抗lag-3单克隆抗体的ec50从690pm(仅存在抗lag-3)下降到40pm(+133pm抗pd-1)或200pm(+13.3pm抗pd-1)，效力分别升高了17倍和3倍。
为了建立用于抗lag-3和抗tim-3组合研究的参数，在上述人cd4+t细胞mlr测定法中以剂量-应答的方式滴定了抗lag-3的抗体ape05505。在多次mlr测定中滴定所述抗lag-3抗体的结果的基础上，选择了2nm(近似ec50)和0.2nm(近似ec10)用于在拮抗剂研究中测试其与抗tim-3单克隆抗体的组合。当与2nm或0.2nm抗lag-3组合时，抗lag-3mab的ec50从11nm(仅存在抗lag-3)下降到6nm(+0.2nm抗tim-3)或3nm(+2nm抗tim-3)，效力分别升高了1.8倍和3.6倍。
本实施例的结果证明，本发明的lag-3结合剂可以单独地以及与免疫系统其它负调节因子的拮抗剂组合来抑制lag-3的生物学活性。
实施例7
本实施例证明本发明的抗lag-3单克隆抗体可以在体内与抗pd-1抗体组合来抑制lag-3信号传导并且增强t细胞活化。
在mc38同系肿瘤模型中单独测试了抗小鼠lag-3替代型单克隆抗体(mabc9b7w，bioxcell，西黎巴嫩，美国新罕布什尔州)的活性，或者其与抗小鼠pd-1替代型单克隆抗体(mabrmp1-14，bioxcell，西黎巴嫩，美国新罕布什尔州)组合时的活性。对所有组(10只动物/组)皮下注射1x106个mc38细胞。接种后10天，将动物按肿瘤大小随机分组。在第1天、第4天、第8天和第11天，用5mg/kg的抗pd-1单克隆抗体和/或10mg/kg的抗lag-3单克隆抗体治疗小鼠，每种抗体或抗体组合共给药4次。每周测量两次肿瘤，以评估对治疗的应答。抗pd-1+抗lag-3的组合在降低肿瘤生长方面比单独使用单一药物更有效。在组合治疗组中观察到所有10只动物都有完全应答，相比之下，在仅给予pd-1的组中观察到7只动物具有完全应答以及在仅给于抗lag-3的组中没有动物具有完全应答。然后通过用4x106个mc38细胞进行皮下接种，对来自组合组的显示完全应答的9只动物进行了再接种(rechallenged)。在再接种组中，没有动物发展出可测量的肿瘤，但是注射有相同量细胞的所有对照初始小鼠都生长出了明显的肿瘤。
还在colon26同系肿瘤模型中单独地或以组合的形式测试了上文描述的替代型单克隆抗体的活性。所有组(12只动物/组)皮下注射5x105个colon26细胞。在第4天、第7天、第11天和第14天，用10mg/kg抗pd-1抗体和/或10mg/kg抗lag-3抗体治疗小鼠，每种抗体或抗体组合共给药4次。每周测量两次肿瘤以评估对治疗的应答。抗pd-1+抗lag-3的组合在肿瘤生长方面比单独的每种单一药物更有效。在组合治疗组中观察到12只动物中有10只具有完全应答，相比之下，在仅给予pd-1的组中观察到三只动物具有完全应答以及在仅给予抗lag-3的组中有一只动物具有完全应答。然后用5x105个colon26细胞对来自组合组的显示完全应答的九只动物进行了再接种(rechallenged)。在再接种组中没有动物发展出可测量的肿瘤，但是注射有相同量细胞的所有对照初始小鼠都生长出了明显的肿瘤。
本实施例的结果证明，本发明的lag-3结合剂在与免疫系统的其他负调节因子的拮抗剂组合时，能够在体内抑制lag-3的生物学活性。
实施例8
本实施例证明，抗体同种型在单独的抗lag-3抗体的抗肿瘤活性或者在抗lag-3抗体与抗pd-1抗体组合时在同系小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性的效应。
从大鼠杂交瘤细胞系中测序和克隆抗小鼠lag-3中和性抗体(mabc9b7w,bioxcell，西黎巴嫩，美国新罕布什尔州)的可变区之后，将其克隆进小鼠igg1或小鼠igg2a表达载体，产生识别小鼠lag-3的igg1(d265a)和igg2a同种型替代抗体。然后测试这些抗体在单独存在时以及与识别小鼠pd-1的小鼠igg1(d265a)替代抗体组合时的功效，所述小鼠igg1(d265a)替代抗体以类似的方式从购自bioxcel(mabrmp1-14,西黎巴嫩，美国新罕布什尔州)的大鼠抗体产生。具体地，将colon26结肠腺癌细胞(5x105s.c.)植入balb/c小鼠中并使其生长3天。将小鼠随机分为7组(12只动物/组)，并如表1所示在第4天、第7天、第11天和第14天施予每种抗体或抗体组合。注射了匹配的同种型抗体的小鼠被用作对照。每周两次测量肿瘤体积，直到研究结束。
表1
该实验的结果示于图1a和1b中，其显示与具有效应子功能的抗小鼠lag-3抗体(即，igg2a)(其对肿瘤生长没有明显的效应)相比，具有最低效应子功能的单一试剂的抗小鼠lag-3抗体(即，igg1(d265a))具有抗肿瘤功效。
另外，图1a显示了与单独的抗小鼠pd-1igg1(d265a)抗体相比，具有最低效应子功能的抗小鼠lag-3抗体(即，igg1(d265a))与抗小鼠pd-1igg1(d265a)抗体的治疗方案的组合显示出升高的抗肿瘤活性。然而，具有完整效应子功能(igg2a)的抗小鼠lag-3抗体与抗小鼠pd-1抗体的组合不如单独的抗小鼠pd-1igg1(d265a)有效，表明抗体的效应子功能可能干扰了抗小鼠pd-1介导的功效。
图1b提供了来自第3治疗组(用抗小鼠pd-1igg1(d265a)抗体治疗的动物组)、第7组(用抗小鼠pd-1igg1(d265a)抗体与抗小鼠lag-3igg1(d265a)抗体的组合治疗的动物组)和第6组(用抗小鼠pd-1igg1(d265a)抗体与抗小鼠lag-3igg2抗体的组合治疗的动物组)的动物个体的肿瘤体积随时间的变化图。在第7组(抗小鼠pd-1igg1(d265a)抗体与抗小鼠lag-3igg1(d265a)的组合组)中，12只动物中的8只在研究结束时未见肿瘤生长。相比之下，在第6组(抗小鼠pd-1igg1(d265a)抗体与抗小鼠lag-3igg2抗体的组合组)中/12只动物中仅有3只在研究结束时未见肿瘤。在第3组(单独使用抗小鼠pd-1igg1(d265a)的组)中，12只动物中的6只在研究结束时无肿瘤，表明当与抗小鼠pd-1igg1(d265a)抗体组合施予时，抗小鼠lag-3igg2抗体的效应子功能可能造成干扰。
本实施例的结果证明，没有效应子功能的抗小鼠lag-3和抗小鼠pd-1抗体在单独和以组合的形式下都可以在小鼠同系肿瘤模型中抑制肿瘤生长。当使用具有效应子功能的抗小鼠lag-3抗体时未观察到功效，并且还可能干扰抗pd-1介导的功效。
实施例9
本实施例证明，在混合淋巴细胞反应中，可以基于收获时间将本发明所述抗lag-3单克隆抗体的抑制活性与抗pd-1单克隆抗体的抑制活性区分开来，并且与pd-1和lag-3的表达相关。
在人cd4+t细胞的混合淋巴细胞反应(mlr)测定法中测试了功能性lag-3拮抗剂抗体，其中在所述测定法中通过测量il-2的分泌评估了在抗lag-3抗体存在的条件下cd4+t细胞的活化。抗lag-3抗体与拮抗性抗pd-1抗体被一起测试，其中在不同时间点添加和/或收获所述抗体。具体地，从人供体分离得到的外周血单核细胞被分化成树突状细胞(dc)，然后与从第二供体分离得到的cd4+t细胞混合。在共培养开始时或者在共培养开始后24小时时加入抑制性抗体。在抗体加入后24和48小时测量il-2的水平。
预期对lag-3和pd-1的拮抗作用可以导致t细胞活化升高，其中t细胞活化升高可以通过il-2产量的升高而测得。当在检测开始时加入，抗pd-1抗体在抗体加入后24和48小时提升了il-2的分泌量，而抗lag-3抗体在48小时时的mlr测定中提升了il-2的分泌量，但在24小时没有提升il-2的分泌量。当在共培养开始后24小时加入抑制性抗lag-3或抗pd-1抗体并在72小时收获时，两种抗体都有活性并且ec50似乎相当(图2a)。这与表达相关，因为在24-72小时观察到了升高的pd-1的表达，而lag-3似乎在48和72小时的测定中更晚表达(图2b)。
本实施例的结果证明，lag-3抑制的效果与靶点表达相关，并且lag-3的表达在时间上比pd-1更晚发生。
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，在此通过引用并入本文，其程度如同每个参考文献被单独和具体地指明通过引用并入并且全部在此列出。
除非本文另有说明或者与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)使用的术语“一”和“一个”以及“所述”和“至少一个”及相似的指示词应被解释成涵盖单数和复数。除非本文另有说明或者与上下文明显矛盾，否则使用的术语“至少一个”后跟一个或多个项目列表(例如，“a和b”中的至少一个)应被解释成表示从列出的项目中选出的一个项目(a或b)或者所列项目中的两个或多个的任意组合(a和b)。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”将被解释成开放式术语(即表示“包括，但不限于，”)。除非本文另有说明，否则本文中关于值的范围的描述仅旨在用作单独提及落在所述范围内的每个单独值的简便方法，并且将每个单独值并入本说明书中，如同在本文中单独列举一样。除非本文另有说明或者与上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。对本文提供的任何及所有的实施例或示例性语言(例如，“例如”)的使用，仅旨在更好地说明本发明，并且除非另有说明，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的语言不应被解释成表示任何未被要求保护的元件对于本发明的实践是必需的。
本文描述了本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读了前面的描述之后，对于本领域普通技术人员来说，这些优选实施方案的变化形式会变得显而易见。发明人可以预期本领域技术人员可适当地应用这些变化形式，并且发明人预期到以不同于本文具体描述的方式来实施本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中列举主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或者与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖了上述元件的所有可能的变化形式的任何组合。
序列表
<110>安奈普泰斯生物有限公司
<120>针对淋巴细胞活化基因3（lag-3）的抗体
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<400>34
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151015
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<213>人工序列
<220>
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<220>
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<222>(10)..(10)
<223>xaa1是精氨酸(arg)或甘氨酸(gly)
<220>
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<222>(21)..(21)
<223>xaa2是苏氨酸(thr)或异亮氨酸(ile)
<220>
<221>misc_feature
<222>(23)..(23)
<223>xaa3是苏氨酸(thr)或丙氨酸(ala)
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(28)
<223>xaa4是丝氨酸(ser)或丙氨酸(phe)
<220>
<221>misc_feature
<222>(30)..(30)
<223>xaa5是丝氨酸(ser)或苯丙氨酸(phe)
<220>
<221>misc_feature
<222>(35)..(35)
<223>xaa6是丝氨酸(ser)或异亮氨酸(ile)
<220>
<221>misc_feature
<222>(42)..(42)
<223>xaa7是甘氨酸(gly)或精氨酸(arg)
<220>
<221>misc_feature
<222>(56)..(56)
<223>xaa8是丝氨酸(ser)或天冬酰胺(asn)
<220>
<221>misc_feature
<222>(78)..(78)
<223>xaa9是苯丙氨酸(phe)或亮氨酸(leu)
<220>
<221>misc_feature
<222>(83)..(83)
<223>xaa10是天冬酰胺(asn)或丝氨酸(ser)
<220>
<221>misc_feature
<222>(84)..(84)
<223>xaa11是丝氨酸(ser)或苯丙氨酸(phe)
<220>
<221>misc_feature
<222>(96)..(96)
<223>xaa12是丙氨酸(ala)或缬氨酸(val)
<220>
<221>misc_feature
<222>(100)..(100)
<223>xaa13是天冬氨酸(asp)或天冬酰胺(asn)
<400>35
glnvalglnleuglnglntrpglyalaxaaleuleulysproserglu
151015
thrleuserleuxaacysxaavaltyrglyglyxaaphexaaglytyr
202530
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354045
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505560
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<220>
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<400>36
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151015
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202530
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354045
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505560
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65707580
lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysala
859095
arggluglyasptyrglyasptyrasptyrtrpglyglnglythrleu
100105110
valthrvalserser
115
<210>37
<211>117
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>37
glnvalglnleuglnglntrpglyalaglyleuleulysproserglu
151015
thrleuserleuthrcysalavaltyrglyglyserpheserglytyr
202530
tyrtrpsertrpileargglnproproglylysglyleuglutrpile
354045
glygluileasnhisserglyserthrasntyrasnproserleulys
505560
serargvalthrileservalaspthrserlysasnglnpheserleu
65707580
lysleuserservalthralaalaaspthralavaltyrtyrcysval
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<222>(2)..(2)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(25)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(34)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(35)..(35)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(55)..(55)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(56)..(56)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(94)..(94)
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<220>
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<222>(98)..(98)
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proglnleuleuiletyrlysvalserasnargpheserglyvalpro
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argthr
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>88
aspilevalmetthrglnthrproleuserleuservalthrprogly
151015
glnproalaserilesercysargserserglnserleuvalhisser
202530
aspserasnthrtyrleuhistrptyrleuglnlysproglyglnser
354045
proglnleuleuiletyrleuvalserasnargpheserglyvalpro
505560
aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile
65707580
serargvalglualagluaspvalglyvaltyrphecysglyglnser
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thrhisvalprotyralapheglyglyglythrlysvalgluilelys
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argthr
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<212>prt
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<220>
<223>合成序列
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<222>(49)..(53)
<223>子序列xaa1xaa2xaa3xaa4xaa5缺失或是tyr-asp-ala-ser-asn
<220>
<221>misc_feature
<222>(94)..(94)
<223>xaa6是苏氨酸(thr)或异亮氨酸(ile)
<400>89
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505560
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proserval
115
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<211>115
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>90
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysglnalaserglnaspileserasntyr
202530
leuasntrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile
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tyraspalaserasnleugluthrglyvalproserargphesergly
505560
serglyserglythraspphethrphethrileserserleuglnpro
65707580
gluaspilealavaltyrtyrcysglnglnsertyrserthrleuile
859095
thrpheglyglnglythrargleugluilelysargthrvalalaala
100105110
proserval
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<211>110
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>91
aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysglnalaserglnaspileserasntyr
202530
leuasntrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile
354045
leugluthrglyvalproserargpheserglyserglyserglythr
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65707580
tyrtyrcysglnglnsertyrserthrleuilethrpheglyglngly
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<212>prt
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505560
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65707580
tyrtyrcysglnglnsertyrserileleuilethrpheglyglngly
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100105110
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<212>dna
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tcctgcaaggcttctggatttaacattaaagacgactatatacactgggtgaaacaggcc120
cctggaaaagggcttgagtggattggatggattgatcctgagaatggtgatagtgaatat180
gcctcgaagttccagggcagagtcaccataaccgtggacacgtctacaaacacagcctac240
atggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtacgtacgctttc300
gggggctactgggggcaagggaccacggtcaccgtctcctcagc344
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<211>344
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>94
gaggtccagctggtacagtctggggctgaggtgaagaagcctggggctacagtgaaaatc60
tcctgcaaggcttctggattttccattaaagacgactatatacactgggtgaaacaggcc120
cctggaaaagggcttgagtggattggatggattgatcctgagaatggtgatagtgaatat180
gcctcgaagttccagggcagagtcaccataaccgtggacacgtctacaaacacagcctac240
atggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtacgtacgctttc300
gggggctactgggggcaagggaccacggtcaccgtctcctcagc344
<210>95
<211>344
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>95
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argthrvalalaalaproserval
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<220>
<221>misc_feature
<222>(76)..(76)
<223>xaa17是a、t
<220>
<221>misc_feature
<222>(77)..(77)
<223>xaa18是n、d
<220>
<221>misc_feature
<222>(78)..(78)
<223>xaa19是i、t
<220>
<221>misc_feature
<222>(79)..(79)
<223>xaa20是v、a
<220>
<221>misc_feature
<222>(81)..(81)
<223>xaa21是l、m
<220>
<221>misc_feature
<222>(82)..(82)
<223>xaa22是h、e
<220>
<221>misc_feature
<222>(83)..(83)
<223>xaa23是f、l
<220>
<221>misc_feature
<222>(87)..(87)
<223>xaa24是t、r
<220>
<221>misc_feature
<222>(97)..(97)
<223>xaa25是t、a
<220>
<221>misc_feature
<222>(98)..(98)
<223>xaa26是l或没有
<220>
<221>misc_feature
<222>(99)..(99)
<223>xaa27是f或没有
<220>
<221>misc_feature
<222>(100)..(100)
<223>xaa28是a或没有
<220>
<221>misc_feature
<222>(101)..(101)
<223>xaa29是y或没有
<220>
<221>misc_feature
<222>(102)..(102)
<223>xaa30是w或没有
<220>
<221>misc_feature
<222>(103)..(103)
<223>xaa31是g或没有
<220>
<221>misc_feature
<222>(104)..(104)
<223>xaa32是t、l
<220>
<221>misc_feature
<222>(113)..(113)
<223>xaa33是s、t
<220>
<221>misc_feature
<222>(114)..(114)
<223>xaa34是l、v
<220>
<221>misc_feature
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<223>xaa35是i、t
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115
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<211>119
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<220>
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<220>
<221>misc_feature
<222>(77)..(77)
<223>xaa2是n、d
<220>
<221>misc_feature
<222>(97)..(97)
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<220>
<221>misc_feature
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<220>
<221>misc_feature
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<220>
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<222>(100)..(100)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(101)..(101)
<223>xaa7是y或没有
<220>
<221>misc_feature
<222>(102)..(102)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(103)..(103)
<223>xaa9是g或没有
<220>
<221>misc_feature
<222>(104)..(104)
<223>xaa10是t、l
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thrvalthrvalserserala
115
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<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
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tyrmetphetrpvallysglnargprogluglnglyleuglutrpile
354045
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505560
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65707580
leuhispheserserleuthrsergluaspthralavaltyrtyrcys
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ala
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202530
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glytrpileaspprogluasnglyaspthrglutyralaserlysphe
505560
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65707580
metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys
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alathrphealatyrtrpglyglnglythrthrvalthrvalserser
100105110
ala
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<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
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gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala
151015
thrvallysilesercyslysvalserglypheasnilelysaspasp
202530
tyrmetphetrpvalglnglnalaproglylysglyleuglutrpmet
354045
glytrpileaspprogluasnglyaspthrglutyralaserlysphe
505560
glnaspargvalthrilethralaaspthrserthrasnthralatyr
65707580
metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys
859095
thrleuphealatyrtrpglyglnglythrthrvalthrvalserser
100105110
ala
<210>195
<211>119
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>195
gluvalglnleuvalglnserglyalagluvallyslysproglyala
151015
thrvallysilesercyslysvalserglypheasnilelysaspasp
202530
tyrmetphetrpvalglnglnalaproglylysglyleuglutrpmet
354045
glytrpileaspprogluglnglyaspthrglutyralaserlysphe
505560
glnaspargvalthrilethralaaspthrserthrasnthralatyr
65707580
metgluleuserserleuargsergluaspthralavaltyrtyrcys
859095
thrleuphealatyrtrpglyleuphealatyrtrpglyglnglythr
100105110
thrvalthrvalserserala
115
<210>196
<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<220>
<221>misc_feature
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<220>
<221>misc_feature
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<223>xaa2是t、s
<220>
<221>misc_feature
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<220>
<221>misc_feature
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<220>
<221>misc_feature
<222>(42)..(42)
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<220>
<221>misc_feature
<222>(50)..(50)
<223>xaa6是r、k
<220>
<221>misc_feature
<222>(68)..(68)
<223>xaa7是a、s
<220>
<221>misc_feature
<222>(88)..(88)
<223>xaa8是v、l
<220>
<221>misc_feature
<222>(109)..(109)
<223>xaa9是l、v
<400>196
aspvalvalmetthrglnxaaproleuxaaleuxaavalthrleugly
151015
glnproalaserilesercyslysserserglnserleuleuaspser
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aspglylysthrtyrleuasntrpxaaxaaglnargproglyglnser
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proxaaargleuiletyrleuvalserlysleuaspserglyvalpro
505560
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65707580
serargvalglualagluaspxaaglyvaltyrtyrcystrpglngly
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alahispheproglnthrpheglyglyglythrlysxaagluilelys
100105110
arg
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<212>prt
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aspileglnmetthrglnserproserserleuseralaservalgly
151015
aspargvalthrilethrcysargalaserglnserilesersertyr
202530
leuasntrptyrglnglnlysproglylysalaprolysleuleuile
354045
tyralaalaserserleuglnserglyvalproserargphesergly
505560
serglyserglythraspphethrleuthrileserserleuglnpro
65707580
gluaspphealavaltyrtyrcysglnglnsertyrserthrproleu
859095
thrpheglyglyglythrlysvalgluilelysarg
100105
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<211>113
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serargvalglualagluaspleuglyvaltyrtyrcystrpglngly
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100105110
arg
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<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>199
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151015
glnproalaserilesercyslysserserglnserleuleuaspser
202530
aspglylysthrtyrleuasntrppheglnglnargproglyglnser
354045
proargargleuiletyrleuvalserlysleuaspserglyvalpro
505560
aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile
65707580
serargvalglualagluaspvalglyvaltyrtyrcystrpglngly
859095
alahispheproglnthrpheglyglyglythrlysvalgluilelys
100105110
arg
<210>200
<211>113
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<223>合成序列
<400>200
aspvalvalmetthrglnserproleuserleuprovalthrleugly
151015
glnproalaserilesercyslysserserglnserleuleuaspser
202530
aspglylysthrtyrleuasntrpleuglnglnargproglyglnser
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prolysargleuiletyrleuvalserlysleuaspserglyvalpro
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65707580
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alahispheproglnthrpheglyglyglythrlysvalgluilelys
100105110
arg
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