抗人类Notch4抗体的制作方法

本发明涉及与人类notch4结合的抗体。
背景技术：
：notch是有助于决定各种组织细胞的命运的分子，揭示于初期发生时期、胚胎期、出生后的各阶段参与分化、增殖、生存等。作为notch家族，报告有notch1、notch2、notch3、notch4的4种受体、及jagged1、jagged2、dll1、dll3、dll4的5种配体。借由在邻接的细胞上表达的notch受体与notch配体结合，将受体的细胞外区域下部所存在的nrr区域借由tace切断，借由由此所引起的细胞内区域的结构变化，将细胞内区域利用γ分泌酶(secretase)切断。该结果所形成的notch胞内结构(nic)域转移至核内，与转录因子csl形成异二聚物，诱导并表达hes家族或hey家族等靶分子。这些下游分子进而诱导并表达各种基因，结果notch信号有助于干细胞或祖细胞的维持、分化、细胞周期停滞、细胞命运决定等(非专利文献1)。已知有notch也参与肿瘤形成。最初报告有因t(7；9)染色体易位所引起的notch1突变与前t细胞急性淋巴细胞白血病(t-all)的发病有关。此外，报告有作为自然肿瘤发病模型的小鼠乳癌病毒(mmtv)的基因组插入部位为int3(notch4细胞内区域)，报告有于使int3强制表达的转基因小鼠中引起乳癌或唾液腺癌等上皮细胞癌(非专利文献2)。报告有notch4对于人类也参与乳癌(非专利文献3)、黑色素瘤(非专利文献4)、胃癌(非专利文献5)、b细胞性急性淋巴性白血病(b-all)(非专利文献6)、慢性淋巴性白血病(cll)(非专利文献7)、神经胶质瘤(非专利文献8)、肝细胞癌(非专利文献9)、肺癌(非专利文献10)、肾癌(非专利文献11)、卡波西氏肉瘤(非专利文献12)等的致癌、进展或转移。notch信号也有助于肿瘤内血管新生。于血管内皮细胞中，表达notch1、notch4作为notch受体，作为配体，确认dll4、jagged1的表达。位于新生血管的前端的尖端细胞(tipcell)因vegf刺激而高表达dll4，使信号进入邻接的柄细胞的notch受体，借此发生血管伸长。另一方面，jagged1与dll4争夺notch受体，而抑制dll4与notch受体的结合。由于来自jagged1的信号与dll4相比较弱，故而借由与jagged1的结合而抑制notch信号。借由该两种配体的空间上不同的表达模式而调整notch信号的强弱，从而控制血管新生(非专利文献13)。关于dll4抑制抗体，已有生产报告，若使用dll4抑制抗体而抑制来自dll4的信号，则于肿瘤内部无血流的未成熟的血管会更新，而诱导肿瘤增殖抑制。其与vegf抑制剂抑制血管内皮细胞的增殖而抑制血管形成的现象完全不同，notch信号作为新的血管新生抑制剂的标靶而备受关注(非专利文献14)。引用清单[非专利文献1]radtke等人(2004),natureimmunology5,247-53。[非专利文献2]jhappan等人(1992),genesdev.6,345-55[非专利文献3]nagamatsu等人(2014),anticancerres.34,69-80[非专利文献4]hardy等人(2010),cancerres.70,10340-50[非专利文献5]qian等人(2015),molcellbiochem.401,165-74[非专利文献6]nwabokamdje等人(2011),blood118,380-9[非专利文献7]nwabokamdje等人(2012),bloodcancerjournal2,e73[非专利文献8]dell'albani等人(2012),neuro-oncology16,204-16[非专利文献9]ahn等人(2013),hepatobiliarypancreatdisint.12,286-94[非专利文献10]justilien等人(2012),plosone7,e35040[非专利文献11]boo等人(2009),jpediatrsurg.44,2031-6[非专利文献12]curry等人(2005),oncogene24,6333-44[非专利文献13]benedito等人(2009),cell137,1124-35[非专利文献14]ridgway等人(2006),nature444,1083-7技术实现要素：发明欲解决的问题本发明的目标在于提供对于人类notch4可具有中和活性的抗人类notch4抗体或其notch4结合片段、及含有这些作为有效成分的药物组合物。解决问题的技术手段诸位发明人为了解决上述问题而反复进行努力研究，结果成功获得了对于人类notch4具有较高的中和活性及结合亲和性的小鼠抗人类notch4抗体。并且，诸位发明人借由确定出所述小鼠抗人类notch4抗体的互补决定区(complementaritydeterminingregions：cdr)的序列，而可生产包含重链及轻链的可变区连同所述小鼠抗人类notch4抗体的cdr序列的人源化抗体，从而完成本发明。换言之，本发明于一实施例中涉及以下的发明。(1)抗notch4抗体或其notch4结合片段，其包含：(a)包含seqidno.15或seqidno.16的氨基酸序列的重链cdr1；(b)包含seqidno.17或seqidno.18的氨基酸序列的重链cdr2；(c)包含seqidno.19的氨基酸序列的重链cdr3；(d)包含seqidno.20的氨基酸序列的轻链cdr1；(e)包含seqidno.21的氨基酸序列的轻链cdr2；及(f)包含seqidno.22的氨基酸序列的轻链cdr3。(2)如(1)中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，且选自以下的(i)-(vii)的任一者中：(i)所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列的抗体，(ii)所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列的抗体，(iii)所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.47的氨基酸序列的抗体，(iv)所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.49的氨基酸序列的抗体，(v)所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.51的氨基酸序列的抗体，(vi)所述重链的可变区包含seqidno.39的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列的抗体，及(vii)所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.47的氨基酸序列的抗体。(3)如(2)中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列。(4)如(2)中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列。(5)如(2)中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.47的氨基酸序列。(6)如(2)中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.49的氨基酸序列。(7)如(2)中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.51的氨基酸序列。(8)如(2)中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.39的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列。(9)如(2)中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.47的氨基酸序列。(10)如(1)至(9)中任一项所记载的抗体或其notch4结合片段，其中所述重链的恒定区、及所述轻链的恒定区包含源自人类抗体的序列。(11)如(10)中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中重链的恒定区包含人类igg的恒定区。(12)如(11)中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中所述人类igg的恒定区为人类igg2的恒定区。(13)如(12)中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中所述人类igg2的恒定区具有v234a和/或g237a的突变。(14)如(10)中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中将所述重链的恒定区的羧基末端的赖氨酸残基人工地去除。(15)如(10)中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中所述轻链的恒定区包含人类igκ的恒定区。(16)药物组合物，其包含如(1)至(15)中任一项所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段。(17)如(16)中所记载的药物组合物，其进而包含药学上可接受的载体。(18)如(17)中所记载的药物组合物，其用于治疗非小细胞肺癌。(19)如(17)中所记载的药物组合物，其用于治疗甲状腺癌。(20)如(17)中所记载的药物组合物，其用于治疗前列腺癌。(21)如(17)中所记载的药物组合物，其用于治疗肝细胞癌。在其他实施例中，本发明涉及以下的发明。(1')抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，且选自以下的(i)-(vii)的任一者中：(i)所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列的抗体，(ii)所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列的抗体，(iii)所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.47的氨基酸序列的抗体，(iv)所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.49的氨基酸序列的抗体，(v)所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.51的氨基酸序列的抗体，(vi)所述重链的可变区包含seqidno.39的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列的抗体，及(vii)所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.47的氨基酸序列的抗体。(2')如(1')中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列。(3')如(1')中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列。(4')如(1')中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.47的氨基酸序列。(5')如(1')中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.49的氨基酸序列。(6')如(1')中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.51的氨基酸序列。(7')如(1')中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.39的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列。(8')如(1')中所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.47的氨基酸序列。(9')如(1')至(8')中任一项所记载的抗体或其notch4结合片段，其中所述重链的恒定区、及所述轻链的恒定区包含源自人类抗体的序列。(10')如(9')中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中重链的恒定区包含人类igg的恒定区。(11')如(10')中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中所述人类igg的恒定区为人类igg2的恒定区。(12')如(11')中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中所述人类igg2的恒定区具有v234a和/或g237a的突变。(13')如(9')中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中将所述重链的恒定区的羧基末端的赖氨酸残基人工地去除。(14')如(9')中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中所述轻链的恒定区包含人类igκ的恒定区。(15')药物组合物，其包含如(1')至(14')中任一项所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段。(16')如(15')中所记载的药物组合物，其进而包含药学上可接受的载体。(17')如(16')中所记载的药物组合物，其用于治疗非小细胞肺癌。(18')如(16')中所记载的药物组合物，其用于治疗甲状腺癌。(19')如(16')中所记载的药物组合物，其用于治疗前列腺癌。(20')如(16')中所记载的药物组合物，其用于治疗肝细胞癌。在其他实施例中，本发明还涉及以下的发明。(1")抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列。(2")抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列。(3")抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.47的氨基酸序列。(4")抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.49的氨基酸序列。(5")抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.33的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.51的氨基酸序列。(6")抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.39的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.45的氨基酸序列。(7")抗notch4抗体或其notch4结合片段，其中所述抗体或其notch4结合片段包含重链及轻链，其中所述重链的可变区包含seqidno.35的氨基酸序列且所述轻链的可变区包含seqidno.47的氨基酸序列。(8")如(1")至(7")中任一项所记载的抗体或其notch4结合片段，其中所述重链的恒定区、及所述轻链的恒定区包含源自人类抗体的序列。(9")如(8")中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中重链的恒定区包含人类igg的恒定区。(10")如(9")中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中所述人类igg的恒定区为人类igg2的恒定区。(11")如(10")中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中所述人类igg2的恒定区具有v234a和/或g237a的突变。(12")如(10")中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中将所述重链的恒定区的羧基末端的赖氨酸残基人工地去除。(13")如(8")中所记载的抗体或其notch4结合片段，其中所述轻链的恒定区包含人类igκ的恒定区。(14")药物组合物，其包含如(1")至(13")中任一项所记载的抗notch4抗体或其notch4结合片段。(15")如(14")中所记载的药物组合物，其进而包含药学上可接受的载体。(16")如(15")中所记载的药物组合物，其用于治疗非小细胞肺癌。(17")如(15")中所记载的药物组合物，其用于治疗甲状腺癌。(18")如(15")中所记载的药物组合物，其用于治疗前列腺癌。(19")如(15")中所记载的药物组合物，其用于治疗肝细胞癌。上述所列举的本发明的特征的一种或多种的任意组合的发明也包含于本发明的范围中。附图说明图1表示抗体b的浓度与相对发光(％)的值的关系。图2表示calu6皮下移植模型中的抗体b的抗肿瘤效果及血液灌注抑制效果。图2a表示于calu6皮下移植模型中以10mg/kg尾静脉给予有对照igg、或以1、3或10mg/kg尾静脉给予有抗体b的各组中的相对肿瘤体积(rtv)的变化(n＝8，平均±标准误差)。图2b表示对给予试验结束时(第8天)所采样的肿瘤的hoechst的荧光面积进行定量的结果(n＝8平均±标准误差)(﹡p＜0.05对比对照igg给予组(dunnett检验))。图3表示calu6小鼠皮下移植模型中的借由抗体b与顺铂的联用所获得的抗肿瘤效果。对照(未处理)组、抗体b给予组(1周2次尾静脉给予)、顺铂给予组(尾静脉给予1次)、抗体b(1周2次尾静脉给予)+顺铂(尾静脉给予1次)联用组的相对肿瘤体积(rtv)变化(n＝4，平均±标准误差)(﹡：p＜0.05对比对照组(学生t检验，第8天，第24天)，#：p＜0.05顺铂10mg/kg给予组对比抗体b+顺铂联用组(学生t检验，第36天))。图4表示ftc238人类甲状腺癌细胞株皮下移植模型中的借由抗体b与甲磺酸乐伐替尼(lenvatinibmesilate)的联用所获得的抗肿瘤效果。对照(未处理)组、抗体b给予组(1周2次尾静脉给予)、甲磺酸乐伐替尼给予组(1天1次经口给予)、抗体b(1周2次尾静脉给予)+甲磺酸乐伐替尼(1天1次经口给予)联用组的相对肿瘤体积(rtv)变化(n＝5，平均±标准误差)(﹡：p＜0.05对比对照组(学生t检验，第13天)，#：p＜0.05单剂给予组对比抗体b+甲磺酸乐伐替尼联用组(学生t检验，第13天))。图5表示du145人类前列腺癌细胞株皮下移植模型中的借由抗体b与紫杉醇的联用所获得的抗肿瘤效果。对照(未处理)组、抗体b给予组(1周2次尾静脉给予)、紫杉醇给予组(1天1次尾静脉给予5天)、抗体b(1周2次尾静脉给予)+紫杉醇(1天1次尾静脉给予5天)联用组的肿瘤体积(tv)变化(n＝4，平均±标准误差)(﹡：p＜0.05对比对照组(学生t检验，第57天)，#：p＜0.05单剂给予组对比抗体b+紫杉醇联用组(学生t检验，第57天)。图6表示源自人类患者的肝细胞癌皮下移植模型中的借由抗体b与甲磺酸乐伐替尼的联用所获得的抗肿瘤效果。对照(3mmhcl给予)组、甲磺酸乐伐替尼(10mg/kg)给予组、甲苯磺酸索拉非尼(30mg/kg)给予组、抗体b(0.5mg/个体)+甲磺酸乐伐替尼(10mg/kg)联用组的肿瘤体积(tv)变化(n＝10，平均±标准误差)(﹡：p＜0.05对比对照组。非配对t检验，第13天)。图7表示抗体b的浓度与相对发光(％)的值的关系。图表是表示独立的3次试验的结果的平均值，误差条表示其标准偏差)。图8表示覆盖显示(overlaydisplay)的抗体b与人类notch的nrr区域的相互作用的感测图(sensorgram)。(a)人类notch1-nrr-seap-his，(b)人类notch2-nrr-seap-his，(c)人类notch3-nrr-seap-his，(d)人类notch4-nrr-seap-his。具体实施方式于本说明书中，抗体可指可经由位于免疫球蛋白分子的可变区的至少1个抗原识别部位与糖质、多核苷酸、脂质、多肽、蛋白质等标靶特异性地结合的免疫球蛋白分子。抗体可指完整体的多克隆抗体或单克隆抗体。抗体可为igg、iga或igm(或这些的亚型)等任意类别，并不限定于特定的类别。根据重链(有时也称为h链)的恒定区的抗体氨基酸序列，将免疫球蛋白分成不同类别。5种主要的免疫球蛋白的类别有iga、igd、ige、igg及igm，这些中的若干例如可进而细分化为igg1、igg2、igg3、igg4、iga1及iga2的亚型(同种型)。不同类别的免疫球蛋白所对应的重链的恒定区分别称为α、δ、ε、γ及μ。此外，抗体的轻链(有时也称为l链)的种类中存在λ链及κ链。一方面，本发明的抗人类notch4抗体可为igg抗体，例如可为igg1抗体或igg2抗体等。此外，本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段可视情形为单体、二聚物或多聚物的形态。于本说明书中，抗体的抗原结合片段只要为该抗体的功能性、结构性片段且保持该抗体对于可结合的抗原的结合性者，则无特别限定。作为抗体的抗原结合片段的实例，并无限定，可列举：fab、fab'、f(ab')2、fv、单链(scfv)、其变异体、包含抗体部分的融合蛋白、及包含抗原识别部位的免疫球蛋白分子的其他修饰结构体等。抗体的抗原结合片段例如可经由完整的抗体的蛋白质消化而获得，或者也可利用重组宿主细胞(例如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞等真核生物、或大肠杆菌等原核生物)而直接产生。例如可借由自大肠杆菌直接回收fab'-sh片段并以化学方式使其结合而形成f(ab')2片段。此外，f(ab')2也可使用促进f(ab')2分子的组装的亮氨酸拉链gcn4而使之形成。此外，于利用化学合成技术生产scfv的情形时，可使用自动合成机。于利用基因重组技术生产scfv的情形时，可将包含编码scfv的多核苷酸的适当的质粒导入至适当的宿主细胞(例如酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞等真核生物、或大肠杆菌等原核生物)中。编码目标scfv的多核苷酸可借由多核苷酸的连接等众所周知的操作而生产。结果所产生的scfv可使用该
技术领域：
中公知的标准的蛋白质纯化技术进行分离。抗体的可变区可意指抗体轻链的可变区和/或抗体重链的可变区，抗体的恒定区可意指抗体轻链的恒定区和/或抗体重链的恒定区。重链及轻链的可变区分别包含利用也作为超可变区而已知的3个cdr进行连结的4个构架区(fr)。各链中的cdr是利用fr而保持于附近，与另一链中的cdr一并有助于抗体的抗原结合部位的形成。作为用以决定cdr的技术并无限定，例如可列举：(1)基于异种间序列可变性的方法(例如kabat等人，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,1991,nationalinstitutesofhealth,bethesdamd)；及(2)基于抗原-抗体复合体的结晶结构学研究的方法(al-lazikani等人，1997j.molec.biol.273:927-948)。也可将这些方法、或其他方法组合而使用。“特异性地结合”的术语是该
技术领域：
中本领域的普通技术人员众所周知的术语，用以确定抗体等与抗原或抗原决定基的特异性结合的方法也众所周知。例如理解为与notch4的抗原决定基特异性地结合的抗体或其抗原结合片段可以大于与其他抗原决定基或非抗原决定基部分结合的亲和性、结合活性更迅速和/或更长时间持续地与该notch4抗原决定基结合。然而，并不排除与第一标靶特异性地结合的抗体或其抗原结合片段会与第二标靶特异性地结合的情况。单克隆抗体可意指由实质上均一的抗体群体所获得的抗体。换言之，该群体中所包含的各个抗体除了若干有可能存在的天然突变体以外均相同。单克隆抗体是针对单一抗原部位者，极具特异性。进而，与以不同抗原或不同抗原决定基作为标靶的典型的多克隆抗体相对照，各单克隆抗体是以抗原的单一抗原决定基作为标靶者。修饰语“单克隆”表示由实质上均一的抗体群体所获得的抗体的特性，不应限定性地理解为必须借由特定方法而生产抗体。本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段可为嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、非人类哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、牛、马、山羊等)的抗体、或其抗原结合片段。嵌合抗体例如为将非人类(例如小鼠或大鼠)抗体的可变区导入至人类抗体的恒定区而成的抗体，例如可指可变区源自非人类抗体且恒定区源自人类抗体的抗体。人源化抗体例如为将非人类抗体的超可变区(也称为互补决定区(complementarity-determiningregion：cdr))导入至人类抗体中而成的抗体，例如可指cdr源自非人类抗体且除此以外的抗体区源自人类抗体的抗体。但是，于本发明中，嵌合抗体与人源化抗体的界限并非必须明确，也可为称为嵌合抗体或人源化抗体的状态。当然，对上述所例示的嵌合抗体或人源化抗体于保持该抗体的功能的状态下(或者为了附加、提高该抗体的功能)进行适当改变(例如抗体的修饰、或抗体的氨基酸序列的部分的置换、加成、缺失)而成的抗体也包含于本发明的抗体中。更具体而言，为了提高与标靶结合的抗体的抗体依赖性细胞毒杀活性((antibody-dependentcellularcytotoxity：adcc)活性))而利用potelligenttm技术进行改变的抗体、或为了提高抗体的补体依赖性细胞毒杀活性((complement-dependentcytotoxicity：cdc)活性)而利用complegenttm技术进行改变的抗体、或联用这些技术进行改变的抗体也包含于本发明的范围中。此外，为了减少由抗体产生细胞所产生的抗体的不均一性，而借由基因改变等人工方法使位于重链的羧基末端(c末端)的赖氨酸(lys)缺失的抗体也包含于本发明的范围中。进而，同时兼具具有本发明的抗体的cdr序列的抗体结合部位及与不同抗原结合的抗原结合部位的双特异性抗体(kontermann(2012),mabs4,182-97)也包含于本发明的范围中。本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段可视需要进行修饰。本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段的修饰可为对(a)例如折叠或螺旋构象等在修饰区的氨基酸序列的三维结构；(b)于标靶部位的分子的电荷或疏水性状态；或(c)对于维持侧链体积的修饰效果进行改变的修饰，或者也可为不会明显观察到这些变化的修饰。本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段的修饰例如可借由构成其的氨基酸残基的置换、缺失、加成等而达成。于本说明书中，所谓氨基酸是以其最广泛的含义使用，不仅包括天然氨基酸、例如丝氨酸(ser)、天冬酰胺(asn)、缬氨酸(val)、亮氨酸(leu)、异亮氨酸(ile)、丙氨酸(ala)、酪氨酸(tyr)、甘氨酸(gly)、赖氨酸(lys)、精氨酸(arg)、组氨酸(his)、天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、谷氨酰胺(gln)、苏氨酸(thr)、半胱氨酸(cys)、甲硫氨酸(met)、苯丙氨酸(phe)、色氨酸(trp)、脯氨酸(pro)，也包括氨基酸变异体及衍生物等非天然氨基酸。只要为本领域的普通技术人员，则当然会考虑到该广泛的定义而理解为，作为本说明书中的氨基酸，例如可列举：l-氨基酸；d-氨基酸；氨基酸变异体、氨基酸衍生物等经化学修饰的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等在生物体内不会成为蛋白质的构成材料的氨基酸；及具有本领域的普通技术人员所公知的氨基酸的特性的化学合成的化合物等。作为非天然氨基酸的实例，可列举：α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、d-氨基酸(d-天冬氨酸、d-谷氨酸等)、组氨酸样的氨基酸(2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸、α-甲基-组氨酸等)、于侧链具有多余的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)及侧链中的羧酸官能基氨基酸被取代为磺酸基的氨基酸(氧化半胱氨酸等)等。天然存在的氨基酸残基例如可根据一般的侧链特性而分为以下组：(1)疏水性：met、ala、val、leu、ile；(2)中性亲水性：cys、ser、thr；(3)酸性：asp、glu；(4)碱性：asn、gln、his、lys、arg；(5)对链取向产生影响的残基：gly、pro；及(6)芳香族：trp、tyr、phe。构成抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列的非保存性置换可借由将属于这些组的一的氨基酸与属于其他组的氨基酸交换而进行。更保存性的置换可借由将属于这些组的一的氨基酸与同一组的其他氨基酸交换而进行。同样地，也可适当进行氨基酸序列的缺失或置换。作为构成抗体或其抗原结合片段的氨基酸的修饰，例如可为利用糖的糖基化、乙酰化或磷酸化等翻译后修饰。抗体可于其恒定区中的保存位置进行糖基化。抗体的糖基化通常为n-连接或o-连接的任一者。n-连接意指对于天冬酰胺残基的侧链的糖质部分的连接。作为三肽序列的天冬酰胺-x-丝氨酸、天冬酰胺-x-苏氨酸、及天冬酰胺-x-半胱氨酸(式中，x为除脯氨酸以外的任意氨基酸)为用于以酶方式加成对于天冬酰胺侧链的糖质部分的识别序列。借由这些三肽序列的任一者存在于抗体或其抗原结合片段中，而存在潜在性的糖基化部位。o-连接糖基化可为n-乙酰基半乳胺糖、半乳糖、或木糖的任一者与羟基氨基酸(例如丝氨酸或苏氨酸)的连接，视情形也可为与5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸的连接。本领域的普通技术人员可根据目的而适当选择糖基化的条件(于使用生物学方法进行糖基化的情形时，例如为宿主细胞或细胞培养基的种类、ph值等)。本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段可进而基于本领域的普通技术人员所公知的技术常识，借由其他修饰方法单独或组合进行修饰。本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段可借由本领域的普通技术人员众所周知的方法而产生。例如可使用产生本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段的杂交瘤而产生抗体，或者，也可借由将编码本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段的基因组入至表达载体中并将该表达载体导入至大肠杆菌细胞、猴cos细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞等中而产生抗体。本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段可为依据本领域的普通技术人员所公知的方法进行分离或纯化的那些。此处，“分离”或“纯化”意指从自然的状态人工地进行分离或纯化。于分子或组合物为自然产生者的情形时，其发生变化或自原本的环境中被去除、或为该两者时为“分离”或“纯化”。作为分离或纯化的方法的实例，可列举：电泳、分子生物学、免疫学或层析的方法等，具体而言，可列举：离子交换层析、疏水性层析、或反相hplc层析、或等电点电泳等，但并不限定于这些。测定抗体或其抗原结合片段与抗原的结合特性(例如结合亲和性及种交叉反应性)的方法可使用该
技术领域：
中本领域的普通技术人员所公知的方法。例如结合亲和性可使用biacoretm生物传感器、kinexa生物传感器、闪烁接近分析法、elisa、origen免疫测定法(igen公司)、流式细胞仪、荧光消光、荧光转移、酵母显示和/或免疫染色进行测定，但并不限定于这些。抗体或其抗原结合片段对于notch4与其配体的结合的中和活性可使用biacoretm生物传感器、elisa和/或流式细胞仪进行测定，但并不限定于这些。抗体或其抗原结合片段对于notch4借由其配体的结合而于人类生物体内诱导的信号传递、或细胞的分子表达应答或功能性变化的中和活性例如可借由如下所述的方法进行测定，但并不限定于这些：(i)借由报道分析所进行的notch信号下游分子的表达变动的检测；(ii)借由西方墨点法所进行的利用tnf-α转化酶(tace)或γ分泌酶的notch4的切断的检测；(iii)借由免疫细胞染色所进行的notch细胞内区域(nic)的核内转移的检测；(iv)使用表达notch4的血管内皮细胞等正常细胞或癌细胞的细胞功能性评价。一方面，本发明可为药物组合物，其包含本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段。包含本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段的药物组合物可以水性或干燥制剂的形式进而包含药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。于所容许的载体、赋形剂、或稳定剂中，例如包含生理盐水；如磷酸、柠檬酸、及其他有机酸的缓冲液；包含抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量多肽；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶、或免疫球蛋白)；如聚乙烯吡咯啶酮的亲水性聚合物；氨基酸；包含葡萄糖、甘露糖、或糊精类的单糖类、二糖类、及其他碳水化合物；如edta的螯合剂；如甘露糖醇或山梨糖醇的糖醇类；如钠般的形成盐的抗衡离子；或如tweentm、pluronicstm、或peg的非离子性表面活性剂。包含本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段的药物组合物例如可封入至微胶囊内、胶体性药物传递体系(例如脂质粒、白蛋白微球体、微乳液、纳米粒子、或纳米胶囊)内、或巨乳液内。于对于具有适于需要给予抗体的任一疾病的释放性的制剂期待抗体的持续释放给予的情形时，可实现抗体的微胶囊化。持续释放基质的实例包括：聚酯、水凝胶(例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸类、l-谷氨酸与γ乙基-l-谷氨酸盐的共聚物、非分解性乙烯-乙酸乙烯酯、如luprondepottm的分解性乳酸-乙醇酸共聚物(包含乳酸-乙醇酸共聚物及乙酸亮丙瑞林的注射用微球体)、及聚-d-(-)-3-羟基丁酸。用于活体内(invivo)给予的制剂必须为无菌。其是借由通过无菌过滤膜的过滤而容易地达成。包含本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段的药物组合物有对非小细胞肺癌、甲状腺癌、前列腺癌或肝细胞癌的治疗有用的可能性。换言之，另一方面，本发明可为非小细胞肺癌、甲状腺癌、前列腺癌或肝细胞癌的治疗方法，其包括将治疗上有效量的本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段给予受试者的步骤。此外，另一方面，本发明还可为本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段的用途，其用于制造非小细胞肺癌、甲状腺癌、前列腺癌或肝细胞癌的治疗药。用于治疗非小细胞肺癌、甲状腺癌、前列腺癌或肝细胞癌的本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段优选为识别notch4的细胞外区域的抗体。例如本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段可为与seqidno.1所表示的人类notch4的氨基酸序列中的24-1447位的任一部位特异性地结合的抗体或其抗原结合片段。再者，于seqidno.1所表示的人类notch4的氨基酸序列中，1-23位为信号序列，1448-2003位为跨膜区域及细胞内区域。本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段可于治疗法中单独使用，或与其他药剂或组合物联用。例如本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段可与其他抗癌剂同时或异时给予。于此种联合治疗中，包含联用给予(于相同或不同的制剂中包含两种或更多种的药剂)及分离给予(例如同时或连续地)。在分别给予两种或更多种的药剂的情形时，本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段的给予可于附随的治疗法之前进行，或之后进行。可与本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段联用的抗癌剂例如可为对非小细胞肺癌、甲状腺癌、前列腺癌或肝细胞癌的治疗有效的抗癌剂。作为此种抗癌剂，例如可列举：顺铂、乐伐替尼、紫杉醇，但并不限定于这些。作为用于联合治疗的药物组合物的实例，可列举：含有本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段及顺铂的药物组合物、含有本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段及乐伐替尼的药物组合物、以及含有本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段及紫杉醇的药物组合物，但并不限定于这些。给予包含本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段的药物组合物的受试者并无限定，例如可对哺乳动物(人类、猪、牛、猴、狒狒、狗、猫、大鼠、小鼠等)使用本发明。但是，于人类不宜作为受试者的情形时，也可将其自受试者中去除。将包含本发明的抗notch4抗体或其抗原结合片段的药物组合物给予受试者的方法(给予途径、给予量、1天的给予次数、给予的时序等)并无限定，本领域的普通技术人员(例如医生)可根据受试者的健康状态、疾病的程度、所联用的药剂的种类等而适当决定。本领域的普通技术人员理解，只要于技术上不矛盾，则可将本说明书中所记载的任意和所有方面的任意一个或多个适当组合而实施本发明。进而，本领域的普通技术人员理解，只要于技术上不矛盾，则优选为将本说明书中所记载的优选或有利的所有方面适当组合而实施本发明。本说明书中所引用的文献应视为借由参照而将其全部披露内容明确地援用于本说明书中，可理解本领域的普通技术人员可依据本说明书的上下文，于不脱离本发明的精神及范围的情况下将其等文献中的相关披露内容作为本说明书的一部分加以援用。本说明书中所引用的文献仅是为了揭示本申请的申请日前的相关技术而提供，不得解释为诸位发明人根据先前发明或任意其他理由而自认不具有先行于该揭示的权利。这些文献的全部描述是基于本申请人可获取的信息，丝毫不构成本申请人认为这些描述内容正确。本说明书中所使用的术语是用于说明特定的实施方面，并非意在限定发明。本说明书中所使用的“包含(comprise)”的术语除上下文上应作明显不同的理解的情形以外，意指存在所记载的事项(构件、步骤、要素或数字等)，不排除存在其以外的事项(构件、步骤、要素或数字等)。“包含(consistof)”的术语包括以“包含(consistof)”和/或“实质上包含(consistessentiallyof)”的术语所记载的方面。本说明书中所使用的“中和活性”的术语意指抑制notch4与其配体的结合的活性和/或抑制notch4借由其配体的结合而于人类生物体内诱导的信号传递、或细胞的分子表达应答或功能性变化的活性。只要无不同的定义，则本文中所使用的全部术语(包括技术术语及科学术语)具有与本发明所属的技术的本领域的普通技术人员广泛理解的含义相同的含义。本文中所使用的术语只要未明示不同的定义，则应解释为具有与本说明书及相关
技术领域：
中的含义一致的含义，不应理想化，或过度地以形式含义加以解释。如第一、第二等术语是用以表述各种要素，可理解这些要素不应受这些术语本身所限定。这些术语仅用于将要素与其他要素区分，例如可于不脱离本发明的范围的情况下将第一要素记为第二要素，同样地，将第二要素记为第一要素。于本说明书中，用以表示成分含量或数值范围等的数值只要未特别明示，则应理解为以术语“约”修饰。例如所谓“4℃”，只要未特别明示，则理解为意指“约4℃”，当然本领域的普通技术人员可根据技术常识及本说明书的文意而合理地理解其程度。除上下文明确地表示其他含义的情形以外，于在本说明书及权利要求书中使用的情形时，可理解以单数形式表示的各方面只要于技术上不矛盾，则也可以复数形式表示，反之亦然。以下，参照实例更详细地说明本发明。但是，本发明可借由各种方面而具体化，不得解释为限定于本文中所记载的实例。相关
技术领域：
的本领域的普通技术人员可于不变更本发明的精神或范围的情况下伴随各种改变、附加、缺失、置换等而实施本发明。实例实例1：抗人类notch4单克隆抗体的生产小鼠抗人类notch4单克隆抗体的生产为了生产针对人类notch4(genbankaccessionno.np_004548.3)(seqidno.1)的单克隆抗体，将使分泌型碱性磷酸酶(seap)及组氨酸标签融合而成的人类notch4的3个egf重复序列及阴性控制区(negativeregulatoryregion：nrr)(seqidno.1的1046-1445位)(以下称为“人类notch43egf-nrr-seap-his”)免疫balb/c小鼠。人类notch43egf-nrr-seap-his蛋白质是借由以下步骤而制备：首先，构建pcdna3.1-人类notch43egf-nrr-seap-his表达载体。人类notch4的3个egf重复序列及nrr是借由pcr而扩增，亚克隆至具有igκ信号序列、编码seap及组氨酸标签的dna序列的pcdna3.1(invitrogen/lifetechnologies)的sfii/noti部位。其次，将pcdna3.1-人类notch43egf-nrr-seap-his表达载体借由transit-lt1(takara)转染至hek293ebna细胞(invitrogen/lifetechnologies)。培养(5％co2，37℃)6天后，回收培养上清液。使用protino管柱(macherey-nagel)将人类notch43egf-nrr-seap-his蛋白质进行纯化。将20μg的上述人类notch43egf-nrr-seap-his蛋白质与同量的gerbu佐剂(gerbubiotechnikgmbh)混合，皮下注射至balb/c小鼠的足垫。于第3天、第7天、及第10天追加3次注射给予。次日，将小鼠处死(sacrificed)，并回收末梢淋巴结。然后，将各末梢淋巴结的一半移植至scid小鼠。淋巴结细胞是由各淋巴结的剩余一半所制备，于genomeone-cf(ishiharasangyokaisha,ltd.)的存在下以5:1的比率与p3u1骨髓瘤细胞融合。上述融合细胞是于96孔塑料板上进行培养。培养(5％co2，37℃)7天后，回收培养上清液。于移植当天及移植6天后将10μg的人类notch43egf-nrr-seap-his蛋白质静脉内给予至被移植上述淋巴结的scid小鼠。于最终免疫的3天后，回收末梢淋巴结细胞，如上所述般融合并培养。借由上述步骤而获得8个克隆的小鼠单克隆抗体。自这些中，以notch4特异性信号抑制活性、与小鼠notch4及人类notch4的结合活性为基准，选择最佳的前导抗体(6-3-a6)。小鼠抗人类notch4单克隆抗体(6-3-a6)的序列分析借由5'-race(5'-rapidamplificationofcdnaends)法使编码克隆6-3-a6的重链及轻链的dna序列扩增。使用trizol(invitrogen/lifetechnologies)由上述杂交瘤制备总rna，并利用dnase(qiagen，rnasefreednaseset)进行处理。使用cdna合成试剂盒(takara)，由上述总rna制备双链cdna。对上述cdna加成借由ad29s(acatcactccgt(seqidno.2))及ad29as(acggagtgatgtccgtcgacgtatctctgcgttgatacttcagcgtagct(seqidno.3))的退火所获得的5'衔接子(adaptor)。借由5'正向引物(5'-pcr4primer，agctacgctgaagtatcaacgcagag(seqidno.4))及3'反向引物(小鼠igg1重链的扩增是使用gccagtggatagactgatgg(seqidno.5)，小鼠igκ轻链的扩增是使用gatggatacagttggtgcagc(seqidno.6))使所获得的cdna扩增。将上述扩增后的cdna插入至pcr2.1载体(invitrogen/lifetechnologies)中。使用abi3130xl对基因序列进行分析。将借由该分析而鉴定的基因序列所编码的氨基酸序列示于下表。表1小鼠抗人类notch4抗体的氨基酸序列(6-3-a6)表2小鼠抗人类notch4抗体的核酸序列(6-3-a6)嵌合抗人类notch4抗体及人源化抗人类notch4抗体的制备借由重叠延伸pcr(overlappingextensionpcr)，作为重链，使6-3-a6的重链可变区的基因序列及具有v234a及g237a突变的人类igg2的恒定区的基因序列结合，作为轻链，使6-3-a6的轻链可变区的基因序列及人类igκ的恒定区的基因序列结合，而制备编码嵌合抗体的dna序列。此处所谓“v234a”表示将234位的缬氨酸置换为丙氨酸的突变，所谓“g237a”表示将237位的甘氨酸置换为丙氨酸的突变。将结果所获得的序列插入至表达载体(重链为pee6.4，轻链为pee12.4，lonza)中。将嵌合抗体的氨基酸序列及核苷酸序列示于下表。表3嵌合抗人类notch4抗体的氨基酸序列表4嵌合抗人类notch4抗体的核酸序列借由将小鼠抗体6-3-a6的cdr移植至人类抗体的可变区，而将抗体人源化。对于上述cdr，首先依据kabat的编号系统(kabatnumberingsystem)，使用abysis软件(来自ucl的许可)对小鼠抗体6-3-a6的氨基酸序列进行编号，根据该编号，依据用以鉴定cdr的kabat的定义(kabatdefinition)、或abm的定义法(abmdefinitionmethod)而确定。将6-3-a6的cdr的氨基酸序列及核苷酸序列示于下表。表56-3-a6的cdr的氨基酸序列表66-3-a6的cdr的核酸序列根据对于6-3-a6的构架区(frameworkregion：fr)的较高的同源性，关于人类抗体的fr，对轻链选择igkv1-27﹡1或igkv3-15﹡1、及jk1且对重链选择ighv3-64﹡01及jh4作为人源化抗体的fr。其后，使用小鼠6-3-a6的3d结构预测模型，预测与cdr的氨基酸相互作用的fr中的氨基酸，与cdr一并进行移植。分别使用具有v234a及g237a突变且具有c末端赖氨酸残基或不具有c末端赖氨酸残基的人类igg2的恒定区、及人类igκ作为重链及轻链的恒定区。hk1、hk2、及hk3是作为移植由借由kabat的定义方法所决定的cdr的人源化抗体的重链而设计，ha1及ha2是作为移植由借由abm的定义方法所决定的cdr的人源化抗体的重链而设计，l1、l2、及l5是作为使用igkv1-27﹡1及jk1的人源化抗体的轻链而设计，l3、l4、及l6是作为使用igkv3-15﹡1及jk1的人源化抗体的轻链而设计。下表是表示人源化抗体的可变区、具有v234a及g237a突变且具有c末端赖氨酸残基或不具有c末端赖氨酸残基的人类igg2的恒定区、及人类igκ的氨基酸序列及核苷酸序列。表7人源化抗人类notch4抗体重链(hk1)的可变区的氨基酸序列及核酸序列表8人源化抗人类notch4抗体重链(hk2)的可变区的氨基酸序列及核酸序列表9人源化抗人类notch4抗体重链(hk3)的可变区的氨基酸序列及核酸序列表10人源化抗人类notch4抗体重链(ha1)的可变区的氨基酸序列及核酸序列表11人源化抗人类notch4抗体重链(ha2)的可变区的氨基酸序列及核酸序列表12人源化抗人类notch4抗体轻链(l1)的可变区的氨基酸序列及核酸序列表13人源化抗人类notch4抗体轻链(l2)的可变区的氨基酸序列及核酸序列表14人源化抗人类notch4抗体轻链(l3)的可变区的氨基酸序列及核酸序列表15人源化抗人类notch4抗体轻链(l4)的可变区的氨基酸序列及核酸序列表16人源化抗人类notch4抗体轻链(l5)的可变区的氨基酸序列及核酸序列表17人源化抗人类notch4抗体轻链(l6)的可变区的氨基酸序列及核酸序列表18具有v234a及g237a突变且具有c末端赖氨酸的人类igg2的恒定区的氨基酸序列及核酸序列表19具有v234a及g237a突变且不具有c末端赖氨酸的人类igg2的恒定区的氨基酸序列及核酸序列表20人类igκ的恒定区的氨基酸序列及核酸序列利用genscriptusainc.而合成这些人源化抗体的可变区的基因序列，并插入至包含编码具有c末端赖氨酸或不具有c末端赖氨酸的人类igg2的恒定区、或人类igκ的恒定区的dna序列的pcdna3.3(invitrogen)中。为了产生抗体，使用freestyle293表达系统(invitrogen)，将上述表达载体转染至freestyle293-f细胞(invitrogen)。回收上清液，并使用proteina(gehealthcare)进行纯化。将人源化抗体的全长(可变区+恒定区)的基因序列同样地优化，利用genscriptusainc.而完全地合成，将重链插入至pee6.4，将轻链插入至pee12.4(lonza)。为了产生抗体，借由上述方式使用这些表达载体。将人源化抗体的优化的核苷酸序列示于下表。表21人源化抗人类notch4抗体重链的优化的核酸序列(hk2可变区、及具有v234a及g237a突变且不具有c末端赖氨酸的人类igg2恒定区)表22人源化抗人类notch4抗体重链的优化的核酸序列(hk3可变区、及具有v234a及g237a突变且不具有c末端赖氨酸的人类igg2恒定区)表23人源化抗人类notch4抗体重链的优化的核酸序列(ha2可变区、及具有v234a及g237a突变且不具有c末端赖氨酸的人类igg2恒定区)表24人源化抗人类notch4抗体轻链的优化的核酸序列(l3可变区、及人类igκ恒定区)表25人源化抗人类notch4抗体轻链的优化的核酸序列(l4可变区、及人类igκ恒定区)表26人源化抗人类notch4抗体轻链的优化的核酸序列(l5可变区、及人类igκ恒定区)表27人源化抗人类notch4抗体轻链的优化的核酸序列(l6可变区+人类igκ恒定区)于以下的实例中，于实例1中使用包含特定的抗体6-3-a6的cdr的氨基酸序列的抗体进行实验。为方便起见，将以下的实例中所使用的特定的抗体称为“抗体a(antibodya)”、“抗体b(antibodyb)”、“抗体c(antibodyc)”、“抗体d(antibodyd)”、“抗体e(antibodye)”、“抗体f(antibodyf)”及“抗体g(antibodyg)”。关于抗体a，重链可变区包含实例1中所记载的hk2的重链可变区，且轻链可变区包含实例1中所记载的l3的轻链可变区。关于抗体b，重链可变区包含实例1中所记载的hk3的重链可变区，且轻链可变区包含实例1中所记载的l3的轻链可变区。关于抗体c，重链可变区包含实例1中所记载的hk2的重链可变区，且轻链可变区包含实例1中所记载的l4的轻链可变区。关于抗体d，重链可变区包含实例1中所记载的hk3的重链可变区，且轻链可变区包含实例1中所记载的l5的轻链可变区。关于抗体e，重链可变区包含实例1中所记载的hk2的重链可变区，且轻链可变区包含实例1中所记载的l6的轻链可变区。关于抗体f，重链可变区包含实例1中所记载的ha2的重链可变区，且轻链可变区包含实例1中所记载的l3的轻链可变区。关于抗体g，重链可变区包含实例1中所记载的hk3的重链可变区，且轻链可变区包含实例1中所记载的l4的轻链可变区。再者，于抗体a-g中，位于一般的人类抗体的重链的c末端的赖氨酸(lys)缺失。实例2：抗人类notch4抗体的中和活性使用notch4-gal4荧光素酶报道分析对抗人类notch4抗体(抗体b)的中和活性进行评价。本实验是如下实验系统：对于导入有将notch4的细胞内区域的一部分置换为gal4dna结合区域的改变基因及gal4uas与luciferase2cp的融合基因表达载体的b.end3细胞株(以下称为“报道细胞”)，利用作为notch配体的dll4施加刺激，对此时的荧光素酶活性进行评价，借此评价notch4特异性的信号传递。利用pbs溶解重组人类dll4(r&dsystems，1506-d4-050/cf)，而制备10μg/ml的溶液(以下为dll4溶液)。对平底96孔白板(greiner，655083)以50μl/孔(500ng/孔)分注dll4溶液，对无刺激孔以50μl/孔分注pbs，并于4℃下静置一晚，借此将dll4固相化于96孔白板上。使报道细胞悬浮于含有10％胎牛血清(fbs)、青霉素/链霉素的d-mem培养液中，而制备1×10^5/ml的细胞悬浮液。将固相化有dll4的各孔利用pbs清洗3次，以50μl/孔(5,000个/孔)接种细胞悬浮液。分别添加抗人类notch4抗体稀释液(最终浓度：0、0.00064、0.0032、0.016、0.08、0.4、2、10μg/ml)或人类igg2κ(sigma，i5404，最终浓度：10μg/ml)各50μl，并于37℃下培养22小时。使用steady-glo分析系统(promega，e2510)如下所述般评价报道细胞的荧光素酶活性。向培养后的各孔中添加steady-glo溶液各100μl并搅拌后，于室温下静置30分钟，使用多功能酶标仪(envision2102-0020，perkinelmer)测定发光。根据以下式，由所测得的发光值算出相对发光(％)。相对发光(％)＝(标本孔的发光强度－无刺激孔的发光强度平均值)/(对照孔的发光强度平均值－无刺激孔的发光强度平均值)将抗体b的浓度与相对发光(％)的值的关系示于图1。图1的图表是表示独立的3次试验的结果的平均值，误差条表示其标准偏差)。ic50为0.011μg/ml(95％ci；0.0036-0.034)。其次，对于包含抗体b的复数个抗人类notch4抗体(抗体a、抗体b、抗体c、抗体d、抗体e、抗体f及抗体g)进行相同的实验，测定抗体的中和活性。利用pbs溶解重组人类dll4(r&dsystems，1506-d4-050/cf)，而制备10μg/ml的溶液(以下为dll4溶液)。对平底96孔白板(greiner，655083)以50μl/孔(500ng/孔)分注dll4溶液，对无刺激孔以50μl/孔分注pbs，并于4℃下静置一晚，借此将dll4固相化于96孔白板上。使报道细胞悬浮于含有10％胎牛血清(fbs)、青霉素/链霉素的d-mem培养液中，而制备1×10^5/ml的细胞悬浮液。将固相化有dll4的各孔利用pbs清洗3次，以50μl/孔(5,000个/孔)接种细胞悬浮液。分别添加各抗人类notch4抗体稀释液(最终浓度：0、10μg/ml)或人类igg2κ(sigma，i5404，最终浓度：10μg/ml)各50μl，并于37℃下培养22小时。使用dualluc-glo分析系统(promega，e2940)如下所述般评价报道细胞的荧光素酶活性。向培养后的各孔中添加dual-glo荧光酵素底物溶液各100μl并搅拌后，于室温下静置20分钟，使用多功能酶标仪(envision2102-0020，perkinelmer)测定萤火虫荧光素酶的发光。此外，其次向各孔中添加dual-glostop&glo底物溶液各100μl并搅拌后，于室温下静置20分钟，使用多功能酶标仪(envision2102-0020，perkinelmer)测定海紫罗兰科荧光素酶发光。由发光值的比算出各孔的相对发光(萤火虫荧光素酶/海紫罗兰科荧光素酶)。进而，使用下式，由各算出值算出相对发光(％)，对各抗体的notch4信号抑制活性进行评价。相对发光(％)＝(标本孔的相对发光的平均值－无刺激孔的相对发光的平均值)/(对照孔的相对发光的平均值－无刺激孔的相对发光的平均值)将各抗体的notch4信号抑制活性(以10μg/ml浓度实施试验)记载于下表28中。于下述表中，例如“hk2l3(lys-)”的记载意指用于实验的人源化抗人类notch4抗体的重链可变区为实例1中的人源化抗人类notch4抗体重链hk2的重链可变区，轻链可变区为实例1中的人源化抗人类notch4抗体轻链l3的轻链可变区，且位于一般的人类抗体的重链的c末端的赖氨酸(lys)于本抗体中缺失。表28样品h/l链对照％s.d.p值抗体ahk2l3(lys-)0.13.25.9e-11抗体bhk3l3(lys-)10.811.48.3e-07抗体chk2l4(lys-)-9.914.08.0e-07抗体dhk3l5(lys-)2181.8e-07抗体ehk2l6(lys-)531.7e-11抗体fha2l3(lys-)1753.5e-09抗体ghk3l4(lys-)1392.4e-07实例3：人源化抗notch4抗体与重组notch4-nrr区域蛋白质的结合的动态分析使用biacore实施人类、食蟹猴、小鼠及大鼠的notch4-nrr区域与抗体b的相互作用的动态分析。抗体b是使用蛋白质a亲和层析法自转染有抗体b的稳定cho细胞株的培养上清液进行纯化。人类、猴、小鼠及大鼠的notch4-nrr区域是作为分泌型碱性磷酸酶(seap)与10x组氨酸标签的融合蛋白而制备。这些蛋白质的基因是于opti-mem(invitrogen)中使用expifectamine293而转染至expi293f细胞。这些细胞是于expi293表达培养基(invitrogen)中进行培养。简言的，将细胞稀释为7.5×107细胞/25.5ml，于第0天利用expifectamine293试剂进行转染。转染约16小时后，将150μl的expifectamine293转染增强剂1及1.5ml的expifectamine293转染增强剂2添加至各烧瓶中。于第4天回收上清液。这些抗原是使用ni-ntasuperflow管柱(qiagen)进行纯化。相互作用是如下所述般进行分析。所纯化的抗体b是利用固定于cm5感测片(gehealthcare)上的抗人类iggfc抗体进行捕捉。将所纯化的notch4-nrr融合蛋白以8种不同浓度注入至感测片，依据制造商的说明书而观察其相互作用及解离。表29所算出的抗体b的动态参数蛋白质ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)人类notch4-nrr3.17e+051.18e-033.74e-09食蟹猴notch4-nrr2.95e+051.06e-033.62e-09小鼠notch4-nrr6.01e+057.27e-031.12e-08大鼠notch4-nrrndndnd如下所述般实施进一步的抗notch4抑制人源化抗体的动态分析。使用cho细胞株使人类notch4-nrr区域fc融合蛋白表达。利用固定于cm5感测片上的识别人类notch4的不同的抗原决定基的抗人类notch4抗体而捕捉培养上清液中的抗原。然后，将人源化抗人类notch4抗体以各种浓度注入至感测片。依据制造商的说明书而算出其相互作用及解离常数。将其结果示于表30。于下述表中，例如“hk2l3(lys-)”的记载意指用于实验的人源化抗人类notch4抗体的重链可变区为实例1中的人源化抗人类notch4抗体重链hk2的重链可变区，轻链可变区为实例1中的人源化抗人类notch4抗体轻链l3的轻链可变区，且位于一般的人类抗体的重链的c末端的赖氨酸(lys)于本抗体中缺失。无“(lys-)”的记载意指位于人类抗体的重链的c末端的lys未缺失。表30所算出的人源化抗notch4抑制抗体对于人类notch4-nrr融合蛋白的动态参数利用更多的抗体进行与上述表30相同的实验，将所获得的实验结果示于表31中。表31实例4：使用抗人类notch4抗体的活体内药理试验(calu6皮下移植模型中的抗体b的抗肿瘤效果及血液灌注抑制效果)将利用含有10％fbs、mem非必需氨基酸、丙酮酸钠、青霉素/链霉素的emem培养液培养的人类非小细胞肺癌细胞株calu6(atccnumberhtb-56)利用emem培养液制备为1.6×108个细胞/ml浓度，以1:1与matrigeltm(corningcat#354234)混合而制备8.0×107个细胞/ml的细胞悬浮液。以0.1ml的用量移植至6周龄的裸小鼠(cann.cg-foxn1nu/crlcrlj，雌，japancharlesriver)的右后背部皮下。自移植起28天后使用电子数字光标卡尺(digimatictmcaliper，mitutoyo股份有限公司)测量肿瘤的短径、长径，并根据以下的计算式算出肿瘤体积tv(tumorvolume)。tv(mm3)＝长径(mm)x短径(mm)x短径(mm)/2根据给予初日的肿瘤体积以肿瘤体积的平均值变得大致相等的方式进行随机分组。抗体b是于即将给予前以载体液(25mm组氨酸，250mm蔗糖，0.05％tween80(ph值5.3))与生理盐水成为1:9的方式进行稀释，而获得0.1、0.3、1.0mg/ml的评价标本(分别为1、3、10mg/kg给予组)。评价标本是以0.2ml/20g小鼠体重的给予量1周2次(将分组的日设为第1天，于第1天、第4天)借由尾静脉注射进行给予。对照组是利用pbs将对照igg(chrompure人类igg，完整分子，jacksonimmunoresearchlaboratories，cat#009-000-003)11.6mg/ml稀释为1.0mg/ml，并以0.2ml/20g小鼠体重借由尾静脉注射进行给予(给予体积10mg/kg)。实验是以1组8只进行。对于对照igg组、抗体b给予组各者，根据以下式算出相对肿瘤体积rtv(relativetumorvolume)，并示于图2a。rtv＝测定日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积于calu6皮下移植模型中，抗体b于所有用量下显示出显著的抗肿瘤效果。肿瘤的血液灌注是借由对利用尾静脉注射的荧光色素(hoechst)的血管周边的细胞的核染色所产生的荧光进行定量而评价(funahashi等人(2014)，cancersci.,105(10),1334-42.)。测定试验最终日的肿瘤直径后，利用pbs将hoechst3334210mg/ml(lifetechnologiescat#h3570)稀释2倍，以0.1ml/只尾静脉注射稀释后的hoechst333425.0mg/ml。注射hoechst5分钟后，借由颈椎脱臼使小鼠安乐死，将所采取的肿瘤包埋于oct复合物(sakurafinetekjapancat#4583)中，而生产冷冻块。将冷冻切片的肿瘤血管利用抗cd31抗体(fitcconjugated，bdpharmingencat#553372)进行免疫荧光染色，并利用biorevo荧光显微镜(keyence，bz-9000)对每1肿瘤片拍摄5处肿瘤血管的热点的hoechst荧光。利用图像分析软件(luminavisionver2.2.2，三谷商事)对hoechst阳性面积进行定量，算出各肿瘤片的平均值，并示于图2b。于calu6皮下移植模型中，抗体b于所有用量下显示出显著的血液灌注抑制作用。实例5：calu6皮下移植模型中的抗体b与顺铂的联用将利用含有10％fbs、青霉素/链霉素的emem培养液培养的人类非小细胞肺癌细胞株calu6(atccnumberhtb-56)利用emem培养液制备为1.2×108个细胞/ml浓度，以1:1与matrigeltm(corningcat#354234)混合而制备6.0×107个细胞/ml的细胞悬浮液。以0.1ml的用量移植至7周龄的裸小鼠(cann.cg-foxn1nu/crlcrlj，雌，japancharlesriver)的右后背部皮下。自移植起27天后使用电子数字光标卡尺(digimatictmcaliper，mitutoyo股份有限公司)测量肿瘤的短径、长径，并根据以下的计算式算出肿瘤体积tv(tumorvolume)。肿瘤体积tv(mm3)＝长径(mm)x短径(mm)x短径(mm)/2根据给予初日的肿瘤体积以肿瘤体积的平均值成为大致相等的方式进行随机分组。抗体b是于即将给予前利用pbs将10.34mg/ml溶液(载体：25mm磷酸盐，200mm海藻糖，0.05％tween80(ph值5.5))进行稀释而制备2.5mg/ml溶液，并以0.2ml(500μg)/只的给予量1周2次借由静脉注射而给予5周。顺铂是以10mg/kg的用量于给予初日尾静脉给予1次。实验是以1组4只进行。对于对照(未处理)组、抗体b给予组、顺铂给予组、抗体b+顺铂联用组各者，根据以下式算出相对肿瘤体积rtv(relativetumorvolume)，并示于图3。rtv＝测定日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积于calu6皮下移植模型中，抗体b与顺铂的联用与顺铂单剂相比，显示出显著优异的抗肿瘤效果。实例6：ftc238皮下移植模型中的抗体b与甲磺酸乐伐替尼的联用将利用含有10％fbs、青霉素/链霉素的dmem/ham'sf12(1:1)培养液培养的人类甲状腺癌细胞株ftc238(自大日本住友制药购买)利用dmem/ham'sf12(1:1)培养液制备为1.2×108个细胞/ml浓度，以1:1与matrigeltm(corningcat#354234)混合而制备6.0×107个细胞/ml的细胞悬浮液。以0.1ml的用量移植至7周龄的裸小鼠(cann.cg-foxn1nu/crlcrlj，雌，japancharlesriver)的右侧腹皮下。自移植起8天后使用电子数字光标卡尺(digimatictmcaliper，mitutoyo股份有限公司)测量肿瘤的短径、长径，并根据以下的计算式算出肿瘤体积tv(tumorvolume)。肿瘤体积tv(mm3)＝长径(mm)x短径(mm)x短径(mm)/2根据给予初日的肿瘤体积以肿瘤体积的平均值成为大致相等的方式进行随机分组。抗体b是于即将给予前利用载体液将10.8mg/ml抗体b(载体：25mm组氨酸，250mm蔗糖(ph值5.3))进行稀释而制备2.5mg/ml抗体b，并以0.2ml(500μg)/只的给予量1周2次借由尾静脉注射而给予2周。甲磺酸乐伐替尼是以10mg/kg的用量1天1次经口给予12天。实验是以1组5只进行。对于对照(未处理)组、抗体b给予组、甲磺酸乐伐替尼给予组、抗体b+甲磺酸乐伐替尼联用组各者，根据以下式算出相对肿瘤体积rtv(relativetumorvolume)，并示于图4。rtv＝测定日的肿瘤体积/给予开始日的肿瘤体积于ftc238皮下移植模型中，抗体b与甲磺酸乐伐替尼的联用与给予抗体b单剂、或甲磺酸乐伐替尼单剂相比，显示出显著优异的抗肿瘤效果。实例7：du145皮下移植模型中的小鼠抗体6-3-a6与紫杉醇的联用将利用含有10％fbs、丙酮酸钠、2-巯基乙醇、青霉素/链霉素的rpmi1640培养液培养的人类前列腺癌细胞株du145(atccnumberhtb-81)利用rpmi1640培养液制备为6.0×107个细胞/ml浓度。以0.1ml的用量移植至6周龄的裸小鼠(cann.cg-foxn1nu/crlcrlj，雌，japancharlesriver)的右侧腹皮下。自移植起24天后使用电子数字光标卡尺(digimatictmcaliper，mitutoyo股份有限公司)测量肿瘤的短径、长径，并根据以下的计算式算出肿瘤体积tv(tumorvolume)。肿瘤体积tv(mm3)＝长径(mm)x短径(mm)x短径(mm)/2根据给予初日的肿瘤体积以肿瘤体积的平均值成为大致相等的方式进行随机分组。6-3-a6是于即将给予前利用pbs将5.11mg/ml6-3-a6(载体：pbs)进行稀释而制备2.5mg/ml6-3-a6，并以0.2ml(500μg)/只的给予量1周2次借由尾静脉注射而给予4周。紫杉醇是以20mg/kg的用量1天1次尾静脉给予5天。实验是以1组4只进行。将对照(未处理)组、6-3-a6给予组、紫杉醇给予组、6-3-a6+紫杉醇联用组各者的肿瘤体积tv示于图5。于du145皮下移植模型中，6-3-a6与紫杉醇的联用与6-3-a6单剂或紫杉醇单剂相比，显示出显著优异的抗肿瘤效果。实例8：源自人类患者的肝细胞癌皮下移植模型中的抗体b与甲磺酸乐伐替尼的联用为了调查抗体b对于肝细胞癌(hcc)的抗肿瘤效果，使用作为(crownbioscienceinc.)源自患者之皮下移植模型的li0050。li0050是移植有女性hcc患者的癌组织的模型小鼠，报告有索拉非尼耐性(国际公开公报wo2015/031604)。自li0050储备小鼠采取肿瘤片段，将直径2-4mm的片段移植至balb/c裸小鼠的右侧腹部的皮下，使肿瘤成长。使用光标卡尺测量肿瘤的短径、长径，并根据以下的计算式算出肿瘤体积tv(tumorvolume)。肿瘤体积tv(mm3)＝长径(mm)x短径(mm)x短径(mm)/2于平均肿瘤体积达到约192mm3之时点开始治疗。根据给予初日的肿瘤体积以肿瘤体积的平均值成为大致相等的方式进行随机分组。各组包含10只小鼠，将分群之日设为第0天。自第0天至第13天，以下各组的小鼠1天1次接受治疗：(i)对照(3mmhcl给予)组、(ii)甲磺酸乐伐替尼(10mg/kg)给予组、(iii)甲苯磺酸索拉非尼(30mg/kg)给予组、及(iv)甲磺酸乐伐替尼(10mg/kg)+抗体b(0.5mg/个体)。对于组间比较，使用独立样本t检验。抗体b与甲磺酸乐伐替尼的联用与对照组相比，显示出显著优异的抗肿瘤效果。实例9：抗人类notch4多克隆抗体与抗体b的信号抑制活性的比较其次，使用notch4-gal4荧光素酶报道分析系统，比较多克隆抗人类notch4抗体(santacruz，sc8643，以下为n-17)与抗体b的信号抑制活性。为了去除n-17中所含有的叠氮化钠，使用slide-a-lyzer(thermoscientific，66333)，于4℃下利用pbs透析8小时。使用amiconultra(millipore，ufc503096)将透析后的n-17溶液浓缩后，使用微量分光亮度计(nanodrop，thermo)测定浓度。利用pbs溶解重组人类dll4(r&dsystems，1506-d4-050/cf)，而制备10μg/ml的溶液(以下为dll4溶液)。对平底96孔白板(greiner，655083)以50μl/孔(500ng/孔)分注dll4溶液，对无刺激孔以50μl/孔注pbs，并于4℃下静置一晚，借此将dll4固相化于96孔白板上。使报道细胞悬浮于含有10％胎牛血清(fbs)、青霉素/链霉素的d-mem培养液中，而制备1×10^5/ml的细胞悬浮液。将固相化有dll4的各孔利用pbs清洗3次，以50μl/孔(5,000个/孔)接种细胞悬浮液。分别添加于透析、浓缩后利用培养液稀释而成的n-17稀释液、或抗体b的稀释液(最终浓度：0、0.01、0.1、1、10μg/ml)各50μl，并于37℃下培养22小时。使用steady-glo分析系统(promega，e2510)如下所述般评价报道细胞的荧光素酶活性。向培养后的各孔中添加steady-glo溶液各100μl并搅拌后，于室温下静置30分钟，使用多功能酶标仪(envision2102-0020，perkinelmer)测定发光。根据以下式，由所测得的发光值算出相对发光。相对发光(％)＝(标本孔的发光强度－无刺激孔的发光强度平均值)/(对照孔的发光强度平均值－无刺激孔的发光强度平均值)将抗体b的浓度与相对发光(％)的值的关系示于图7。图7的图表是表示独立的3次试验的结果的平均值，误差条表示其标准偏差)。对于抗体b，确认信号抑制活性，对于n-17，未见所研究的浓度范围内的n-17的notch4信号抑制活性。实例10：抗体b与重组可溶型人类notchnrr区域的结合的动力学分析关于人类notch的同种型(notch1、notch2、notch3及notch4)的nrr区域与抗体b的相互作用，进行使用biacoret100的动力学分析。抗体b依序使用蛋白质a亲和层析法、captoq阴离子交换层析法及unospheres阳离子交换层析法自抗体b的cho稳定表达细胞株的培养上清液进行纯化。对于人类notch1nrr区域(genbankaccessionno.017617；序列1307-1733位)、人类notch2nrr区域(genbankaccessionno.024408；序列1239-1650位)、人类notch3nrr区域(genbankaccessionno.000435；序列1246-1641位)及人类notch4nrr区域(genbankaccessionno.np_004548.3；序列1046-1445位)，生产分泌型碱性磷酸酶(seap)与血凝素(ha)标签及组氨酸标签(x10)的融合蛋白后，使用histraptm快速管柱(gehealthcare)进行纯化。借由以下方法测定抗体b与人类notch的各同种型的nrr区域的相互作用。利用固定于cm5感测片(gehealthcare)上的抗人类iggfc抗体而捕捉所纯化的抗体b，将所纯化的人类notch的各同种型的nrr区域分别以6种不同浓度注入至感测片，依据操作说明书的指示而测定与抗体的相互作用及解离。将覆盖显示的相互作用感测图及所算出的动态参数分别示于图8及表32。表32所算出的抗体b与人类notch4-nrr融合蛋白的相互作用的动态参数样品ka(1/ms)kd(1/s)kd(m)人类notch1-nrr-seap-ha-hisndndnd人类notch2-nrr-seap-ha-hisndndnd人类notch3-nrr-seap-ha-hisndndnd人类notch4-nrr-seap-ha-his2.72e+048.31e-043.05e-08当前第1页12