用于检测生物污染物的组合物和方法与流程

相关申请的交叉引用本申请根据35usc§119(e)要求于2015年3月27日提交的美国临时专利申请no.62/139,321的优先权，该申请通过引用整体具体地并入本文。发明领域本发明一般涉及通过细胞培养制造生物分子的方法。本发明更具体地但非排他地涉及用于检测细胞培养物中的生物污染物的组合物和方法。发明背景生物药物，特别是治疗性抗体，通过哺乳动物细胞培养生产。中国仓鼠卵巢(cho)细胞是最常用的宿主细胞。这些生产系统易于发生外源性和内源性病毒感染，这为生物药物带来潜在的安全问题。因此，使用病毒清除程序和病毒载量测量来促进药物的安全性。用于减少病毒载量的步骤包括纳滤、通过热或ph保持的病毒灭活和色谱法。可以通过耗时的感染性测定或通过快速定量测定(如实时pcr或定量聚合酶链反应(q-pcr))来监测病毒载量和病毒去除的有效性。q-pcr需要适当的阴性和阳性对照使得其可靠。加入核酸提取对照以测试样品以控制适当的核酸提取。如果核酸提取对照在q-pcr过程中为阴性或超出预期的回收范围，则样品被拒绝。相反，如果核酸提取对照在q-pcr过程中为阳性或在预期的回收范围内，则将来自测试样品的核酸提取视为可靠的。通常在q-pcr测定中包括阴性对照，例如无样品的缓冲剂。在阴性对照中存在阳性信号可能意味着使用病毒材料的q-pcr或核酸提取试剂的污染。在q-pcr病毒载量测定中也可以包括阳性扩增对照。这种阳性对照可以包括使用扩增真正病毒污染物的引物扩增的保守的病毒核酸序列。q-pcr检测阳性对照的失败可能表明，如果测试样品中存在病毒污染物，扩增程序将无法检测到病毒污染物。使用模拟靶污染物的阳性扩增对照产生自身问题。如果测试样品被甚至轻微的阳性对照污染，鉴于q-pcr敏锐的灵敏度，测试样品可能显示假阳性。通过使用低水平的阳性扩增对照，使用隔离室进行阳性对照工作，使用ung/dutp系统选择性降解含有dutp的pcr产物，使用一次性容器和置换移液器，以及彻底清洁工作区和设备，可以在一定程度上减轻假阳性。不管使用哪种缓解剂，pcr检测过程中仍然会出现假阳性结果。在生物制药制造中，获得生物污染物的假阳性的风险是不可忽略的，并且可能导致昂贵的纠正措施。非常需要系统和方法来确定给定的阳性pcr结果是否是由阳性对照的交叉污染引起的真阳性或假阳性。申请人已经开发并且现在公开了允许实时确定假阳性q-pcr信号的阳性对照组合物、系统和方法。发明概述申请人已经解决了实时识别测试样品中靶污染物的阳性q-pcr信号是否为由于交叉污染而为真阳性或假阳性的问题。申请人已经创建了包括生物污染物靶序列(即阳性对照序列)和特有人工质粒特异性序列的阳性扩增对照(pac)质粒。这种特有人工质粒特异性序列使测定技术人员能够在样品中特异性鉴定质粒。因此，当检测到阳性污染物信号并且确定不存在人工质粒特异性序列时，技术人员可以确信结果是真阳性结果。相反，在假阳性的情况下，特有人工质粒序列的存在允许技术人员快速排除表面上的阳性结果为假阳性。在一些实施方案中，使用包含在q-pcr反应混合物中荧光标记的人工寡核苷酸检测探针(“特有检测探针”或“udp”)检测阳性对照特有人工质粒特异性序列(“特有序列”；亦称pacp或阳性扩增对照多核苷酸)。特有检测探针包含与荧光团和淬灭剂共价结合的核酸聚合物。“特有”核酸聚合物被设计为与特有序列特异性退火，并且在pcr过程中并入到特有序列的扩增子拷贝中。“特有”核酸聚合物被设计为在靶测定操作中使用的杂交条件下不识别或与任何天然存在的细小病毒退火。在一个实施方案中，“特有”核酸聚合物包含17至20个核苷酸，其中不超过七(7)至10个内部连续核苷酸和不超过六(6)个连续3’核苷酸与任何细小病毒序列相同。在一个实施方案中，“特有”核苷酸聚合物包含17至20个核苷酸，其中不超过7至10个连续核苷酸和不超过六(6)个连续的3’核苷酸与seqidno：9和12-37所示的任何细小病毒序列相同。当特有检测探针的核酸聚合物没有被并入扩增子拷贝中时，淬灭剂保持紧邻荧光团。如果荧光团被激发，则淬灭剂吸收发射的光并防止该光被检测到(通过fret或接触淬灭)。当核酸聚合物掺入扩增子拷贝(即当样品中存在特有序列时)，荧光团和淬灭剂从特有检测探针中释放并因此在空间上分开。在这种情况下，当荧光团被激发时，淬灭剂足够远，不能有效地淬灭发射的光。因此可以检测发射的光。因此，当样品中存在特有序列时，随着pcr的进行，可检测的发射波长的强度增加。当不存在特有序列时，随着pcr的进展，淬灭剂完成其工作并且检测不到发射波长。在一个实施方案中，荧光团连接在核酸聚合物的5’末端或其附近，并且淬灭剂连接在3’末端或附近。在替代实施方案中，荧光团连接在核酸聚合物的3’末端或其附近，并且淬灭剂连接在5’末端附近或附近。现在已知或稍后发现的任何荧光团-淬灭剂对可用于本发明的实践中。(参见例如s.a.marras,“selectionoffluorophoreandquencherpairsforfluorescentnucleicacidhybridizationprobes,”methodsmol.biol.2006；335:3-16.)。在一些实施方案中，荧光团的激发波长分别为495nm、538nm或646nm，发射波长分别为520nm、554nm或669nm。在一些实施方案中，淬灭剂是吸收峰为430nm至672nm的染料。在一些实施方案中，淬灭剂选自ddq-i，dabcyl，eclipse，iowablackfq，bhq-1，qsy-7，bhq-2，ddq-ii，iowablackrq，qsy-21和dhq-3。在一个实施方案中，荧光团的激发波长为495nm，发射波长为520nm，例如fam，淬灭剂为bhq-1。在一个实施方案中，核酸聚合物包含seqidno：3(5’-tgtcgatggcgaatggcta-3’)的核酸序列。本发明的一个方面是如上的含有核酸聚合物和连接的荧光团和淬灭剂的特有检测探针本身。本发明的其它方面包括含有生物污染物靶序列和特有人工质粒特异性序列的阳性扩增对照(pac)质粒本身，以及使用该质粒作为阳性对照来评估细胞培养物中的靶生物污染物的存在。pac质粒用于控制设计用于扩增靶生物污染物序列的成功的pcr扩增反应。例如，运行分开且平行的pcr反应，其包含与测试样品相同的组分并在相同的参数下运行，但含有代替测试样品的阳性对照质粒。如果含有阳性对照质粒的样品产生一个阳性“污染物”信号而测试样品没有，那么可以断定测试样品没有靶生物污染物。在一些实施方案中，测试样品获自哺乳动物细胞培养物，例如含有工程改造以产生感兴趣的治疗性蛋白质的cho细胞的生物反应器培养物。在一个实施方案中，pac质粒含有(a)靶扩增多核苷酸(tap)序列，例如细小病毒核酸序列或另一靶污染物的序列，和(b)质粒扩增对照多核苷酸(pacp)序列。pacp序列(有义链或克里克链)与特有序列探针(反义链或沃森链)的核酸聚合物互补。在一个实施方案中，将pac质粒与含有测试样品的q-pcr反应平行地部署在分开的q-pcr反应中。tap序列被设计为代表靶生物污染物。例如，如果测试样品q-pcr反应不能产生tap扩增子，并且阳性对照(即含有pac质粒的样品)q-pcr不能产生tap扩增子，则可以认为q-pcr反应失败。在一个实施方案中，靶生物污染物是啮齿动物细小病毒，tap序列包含啮齿动物细小病毒序列。在一个实施方案中，tap序列包括全部或部分细小病毒ns1序列，其跨越若干啮齿动物细小病毒株是保守的。参见cotmore,etal.,“replicationinitiatorproteinns1oftheparvovirusminutevirusofmicebindstomodulardivergentsitesdistributedthroughoutduplexviraldna,”j.virol.2007dec；81(23):13015-13027。在一些实施方案中，若干啮齿动物细小病毒株包括小鼠细小病毒原型株(mvmp)，小鼠细小病毒免疫抑制株(mvmi)，小鼠细小病毒cutter株(mvmc)，小鼠细小病毒1b(mpv-1b)，小鼠细小病毒1a(mpv-1a)，小鼠细小病毒1c(mvp-1c)，仓鼠细小病毒(hapv)，toolan's细小病毒(h-1)，kilham大鼠病毒(krv)，大鼠细小病毒1a(rpv-1a)，大鼠细小病毒(rmv)和大鼠病毒l的马萨诸塞大学株(rv-umass)。参见o.-w.merten,“viruscontaminationsofcellcultures–abiotechnologicalview,”cytotechnology.2002july；39(2):91-116。在一个实施方案中，tap序列包含seqidno：1、seqidno：2的核酸序列和seqidno：4的互补序列。在其他方面，本发明涉及pcr混合物组合物和使用pcr混合物来检测测试样品中的靶污染物并排除由于pac检测样品的污染引起的假阳性的方法。在一个实施方案中，pcr混合物特别包含靶污染物特异性正向寡核苷酸引物、靶污染物特异性寡核苷酸检测探针、人工寡核苷酸检测探针例如上述特有检测探针(udp)和靶污染物特异性反向寡核苷酸引物。在靶污染物是啮齿动物细小病毒的实施方案中，pcr混合物特别包含啮齿动物细小病毒特异性正向寡核苷酸引物、啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针、人工寡核苷酸检测探针例如上述特有检测探针(udp)和啮齿动物细小病毒特异性反向寡核苷酸引物。每个检测探针(即靶污染物特异性寡核苷酸检测探针，例如啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针和人工寡核苷酸检测探针)含有一端(5’或3’)连接至荧光团和另一端(分别为3’或5’)连接至淬灭剂的核酸序列。这里，啮齿动物细小病毒特异性正向寡核苷酸引物和啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针的核酸序列与细小病毒的反义链杂交。啮齿动物细小病毒特异性反向寡核苷酸引物与细小病毒的有义链杂交。在一个实施方案中，引物和细小病毒特异寡核苷酸探针杂交的细小病毒序列是保守的啮齿动物细小病毒序列。在一种情况下，保守的细小病毒序列是细小病毒ns1序列，例如seqidno：9中描述的核酸序列。通过使用保守序列，单一探针将有效地检测多种啮齿动物细小病毒株。在一个实施方案中，人工寡核苷酸检测探针不与细小病毒核酸或任何生物污染物序列杂交。人工寡核苷酸检测探针的核酸是合成的，并且不会与任何生物污染物核酸序列进行任何严格性杂交。在一个实施方案中，将人工寡核苷酸检测探针的核酸(亦称“特有”核酸聚合物或特有序列)设计为在本研究测定的操作中使用的杂交条件下不识别或与任何天然存在的细小病毒退火。在一个实施方案中，“特有”核酸聚合物包含17至20个核苷酸，其中不超过七(7)至10个内部连续核苷酸和不超过六(6)个连续3’核苷酸与任何细小病毒序列相同。在一个实施方案中，“特有”核苷酸聚合物包含17至20个核苷酸，其中不超过7至10个连续核苷酸和不超过六(6)个连续的3’核苷酸与seqidno：9和12-37所示的任何细小病毒序列相同。然而，人工寡核苷酸检测探针的核酸(即特有序列)与pac质粒的pacp序列杂交。因此，人工寡核苷酸检测探针检测pac质粒，但不检测细小病毒或其他生物污染物序列。在一个实施方案中，pcr混合物可用于确定pac质粒是否存在于测试生物样品中，产生假阳性结果。这里，如果测试样品针对细小病毒特异性寡核苷酸探针显示阳性q-pcr信号和针对人工寡核苷酸检测探针显示阴性q-pcr信号，则测试样品被认为没有pac污染(即，真阳性)。在一个实施方案中，靶污染物特异性正向寡核苷酸引物包含seqidno：1的序列；靶污染物特异性寡核苷酸检测探针核酸包含seqidno：2的序列；人工寡核苷酸检测探针核酸(即udp)包含seqidno：3的序列；靶污染物特异性反向寡核苷酸引物包含seqidno：4的序列。在其他方面，本发明提供了用于检测测试样品中生物污染物的系统和方法。这里，测试样品是细胞培养物，例如用于生产治疗性蛋白质的工业规模的哺乳动物细胞培养物。可用于本发明实践的哺乳动物细胞包括但不限于cho细胞、cho-k1细胞和eesyr细胞(参见美国专利号7,771,997)。除了如上所述使用的引物、探针、混合物和pac质粒之外，系统和方法还包括使用核酸提取对照(nec)。在一个实施方案中，nec是m13k07噬菌体，其在核酸提取之前被包括在测试样品中。如果核酸提取足以检测污染物dna或rna，则在“加标”测试样品中通过q-pcr检测nec核酸(例如，m13k07核酸)。在具体实施方案中，q-pcr反应混合物含有靶污染物特异性正向寡核苷酸引物、靶污染物特异性寡核苷酸检测探针、人工寡核苷酸检测探针例如上述特有检测探针(udp)、靶污染物特异性反向寡核苷酸引物、nec特异性正向寡核苷酸引物、nec特异性寡核苷酸检测探针和nec特异性反向寡核苷酸引物。在一个实施方案中，测试样品取自在核酸提取和随后的q-pcr分析之前加入nec(例如，m13k07噬菌体)的治疗性蛋白质生产细胞培养物。在一个具体实施方案中，靶污染物是啮齿动物细小病毒，在这种情况下(1)靶污染物特异性正向寡核苷酸引物是啮齿动物细小病毒特异性正向寡核苷酸引物，更具体地包含seqidno：1的序列；(2)靶污染物特异性寡核苷酸检测探针是啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针，更具体地包含seqidno：2的核酸序列；(3)人工寡核苷酸检测探针是特有检测探针(udp)，更具体地包含seqidno：3的核酸序列；(4)靶污染物特异性反向寡核苷酸引物是啮齿动物细小病毒特异性反向寡核苷酸引物，更具体地包含seqidno：4的核酸序列；(5)nec特异性正向寡核苷酸引物是m13正向寡核苷酸引物，更具体地包含seqidno：5的核酸序列；(6)nec特异性寡核苷酸检测探针是m13检测探针，更具体地包含seqidno：6的核酸序列；和(7)nec特异性反向寡核苷酸引物是m13反向寡核苷酸引物，更具体地包含seqidno：8的核酸。在该方法的一个实施方案中，如果检测到necq-pcr信号(即，信号在预期的回收范围内)，则可以认为测试样品的核酸提取是成功的。另一方面，如果没有检测到nec信号(即，信号在预期的回收范围之外)，则可以认为测试样品的核酸提取失败，并且任何阴性q-pcr靶污染物信号被认为是无效的(即假阴性)。发明详述在描述本发明之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为这些方法和条件可以变化。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的本领域技术人员通常理解的相同的含义。如本文所使用的，术语“约”当用于参考特定列举的数值时，意味着该值可以从所列举的值改变不超过1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101以及之间的所有值(例如，99.1、99.2、99.3、94.4等)。尽管与本文类似或等同的任何方法和材料可用于本发明的实践中，但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用整体并入本文。通过查阅随后的详述，其它实施方案将变得显而易见。为了完全理解本文所描述的发明，给出以下详述。本发明涉及用于检测产生治疗性蛋白质的任何细胞培养物中的任何生物污染物的改进的材料和方法。具体地，本发明涉及定量聚合酶链反应(q-pcr)材料和方法，其包含易于检测以消除假阳性的阳性扩增对照元件或步骤。pcr和定量pcr如本文所用，短语“聚合酶链反应”(“pcr”)是指通过使用多个变性(模板dna链的分开)、退火(单链寡核苷酸与单链模板dna链的杂交)和dna合成(dna聚合酶使用模板dna链作为模板催化从杂交寡核苷酸的3’末端引发的新dna链的合成)的循环来制备核酸(例如dna)的拷贝的方法。为了进行扩增，在pcr反应中使用至少两种不同的寡核苷酸引物(简称为“引物”)。通常称为正向引物的一个引物与模板dna的反义链杂交并形成新合成的有义链的5’末端。通常称为反向引物的另一个引物与模板dna的有义链杂交，并形成新合成的反义链的5’末端。在每个循环中，每个模板链被复制以形成新的双链dna分子，其也称为“扩增子”。因此，使用非限制量的寡核苷酸引物、dna聚合酶(即taq聚合酶或其他热稳定dna聚合酶；参见innisetal.,dnasequencingwiththermusaquaticusdnapolymeraseanddirectsequencingofpolymerasechainreaction-amplifieddna,85(24)procnatlacadsciusa.9436-40(1988))和三磷酸核苷酸，dna分子(模板和扩增子)的数量在每个循环加倍。pcr描述于美国专利号4,683,202(1987年7月28日授权)中。也可以参见pcrprimer:alaboratorymanual(carlw.dieffenbach&gabrielas.dvekslereds.,1995)。如本文所用，术语“循环”是指单轮的(1)称为“变性”的dna链解链，随后(2)通过碱基配对的规则将寡核苷酸引物与所得单链dna杂交，称为“退火”的过程，以及(3)从寡核苷酸引物的3’末端开始新的dna链并以5’向3’方向移动的聚合，称为“扩增”或“延伸”的过程。通常，聚合使用dna聚合酶如taq聚合酶来催化相邻的脱氧核苷酸三磷酸(“dntp”)之间的磷酸二酯键的形成，根据碱基配对的规则通过氢键将dntp沿着暴露的单链模板dna放置。部分基于dna模板和寡核苷酸引物的gc含量以及待复制的dna链的长度，在某些温度下进行变性、退火和扩增。变性和退火的温度以及反应缓冲剂的离子强度控制了杂交的严格性和dna复制的保真度。“定量pcr”或“qpcr”或“q-pcr”(也称为“实时pcr”)是一种能够在pcr循环过程期间监测扩增子形成的pcr。q-pcr可用于量化样品中特定模板dna的量。除了正向寡核苷酸引物和反向寡核苷酸引物之外，q-pcr还在反应混合物中引入至少一种寡核苷酸检测探针。检测探针是在正向引物结合位点和反向引物结合位点之间某处与靶模板dna的正义或反义链杂交的单链寡核苷酸。在退火步骤期间，寡核苷酸检测探针与单链模板退火。当聚合发生时，探针被dna聚合酶的5’核酸酶活性切割并降解。因此，随着特定模板序列的扩增，检测探针以指数速率降解。q-pcr寡核苷酸检测探针通常用连接的荧光团(也称为报告荧光染料，或简称“报告物”)和连接的淬灭剂构建。在大多数情况下，荧光团连接在寡核苷酸的5’末端或其附近，并且淬灭剂连接在寡核苷酸的3’末端或其附近。然而，在本发明的实践中可以使用任何可行的构造。当寡核苷酸检测探针完整时，荧光团和淬灭剂接近，使得淬灭剂吸收由激发的荧光团发射的光，从而显著降低可检测的荧光团发射。当寡核苷酸检测探针被切割或降解时，荧光团和淬灭剂被释放并因此在空间上分开。淬灭剂不再接近足以淬灭荧光团发射。当形成更特异的扩增子时，更多的寡核苷酸检测探针被切割，更多的荧光团和淬灭剂被释放，使得更多的荧光团/淬灭剂对被分开，并且荧光发射幅度增加。换句话说，增加的荧光团发射信号与样品中特异性靶dna的量相关。对于q-pcr的综述，参见ianm.mackayetal.,surveyandsummary:real-timepcrinvirology,30(6)nucleicacidsresearch1292-1305(2002)。荧光淬灭可以通过报告物和淬灭剂之间的直接接触(也称为静态淬灭)或当报告物和淬灭剂都在彼此的半径内时通过报告物和淬灭剂之间的荧光共振能量转移(fret)而发生。特定荧光团可以被一个或多个特定波长或者具有最大波长的波长范围的光激发。这被称为激发波长。在荧光团被激发后，它返回到基态并发射比激发波长更长波长的光。这被称为发射波长。在fret期间，具有与荧光团的发射光谱匹配或重叠的吸收光谱的第二荧光团、染料、镧系分子等吸收半径内激发的荧光团发射的光，从而淬灭或减少荧光团发射波长。当报告物和淬灭剂在荧光团的基态形成三元复合物时，产生接触或静态淬灭。该三元复合物是非荧光的，即基本上不可激发的，因此在预期的发射波长下不发光。关于静态淬灭和fret的综述，参见salvatorea.e.marrasetal.,efficienciesoffluorescenceresonanceenergytransferandcontact-mediatedquenchinginoligonucleotideprobes,30(21)nucleicacidsresearche122,pp.1-8(2002).marrasetal.也讨论了选择用于q-pcr的应用的报告物/淬灭剂对。核酸本文根据它们对分子生物学领域的本领域技术人员的普通意义使用术语“多核苷酸”，“寡核苷酸”，“探针”，“引物”或“核苷酸引物”或“寡核苷酸引物”，“模板”或“模板核酸”或“模板dna”。有关其中每一个的详细说明，参见例如pcrprimer:alaboratorymanual(carlw.dieffenbach&gabrielas.dvekslereds.,1995)。如本文所用，“扩增子”是指通过pcr扩增模板核酸序列产生的dna产物。随着pcr的进行和模板的扩增，新形成的dna扩增子作为后续的dna合成轮的模板。细胞培养本发明涉及用于检测细胞培养物中的生物污染物的改进的q-pcr方法。细胞培养物通常用于产生用于治疗用途的复杂生物分子，例如抗体、陷阱分子和fc融合蛋白。这些培养物应保持没有生物污染物。污染物的检测对于确定特定批次是否被丢弃或进行修复是重要的。细胞培养物包括通常衍生自单细胞系的培养基和细胞。这里，细胞系包括能够产生生物治疗性蛋白质的细胞。常规用于生产蛋白质生物治疗剂的细胞系的实例特别包括原代细胞，bsc细胞，hela细胞，hepg2细胞，llc-mk细胞，cv-1细胞，cos细胞，vero细胞，mdbk细胞，mdck细胞，crfk细胞，raf细胞，rk细胞，tcmk-1细胞，llcpk细胞，pk15细胞，llc-rk细胞，mdok细胞，bhk细胞，bhk-21细胞，cho细胞，cho-k1细胞，ns-1细胞，mrc-5细胞，wi-38细胞，3t3细胞，293细胞，per.c6细胞和鸡胚细胞。中国仓鼠卵巢(cho)细胞系或若干特定cho细胞变体中的一种或多种如cho-k1细胞系被优化用于大规模蛋白质生产。细胞系是优化用于增强感兴趣的蛋白质生产的专门cho细胞系。有关细胞的详细说明，请参见美国专利号7,771,997(于2010年8月10日授权)。“细胞培养物”或“培养物”是指多细胞生物体或组织外生长和繁殖的细胞。哺乳动物细胞的合适培养条件是本领域已知的。参见例如animalcellculture:apracticalapproach(d.rickwood,ed.,1992)。哺乳动物细胞可以悬浮培养或附着到固体基质上。具有或不具有微载体的流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶、摇瓶或搅拌罐生物反应器并且以分批、补料分批、连续、半连续或灌注模式操作可用于哺乳动物细胞培养。细胞培养基或浓缩进料培养基可以在培养期间连续地或间隔地加入到培养物中(即分批补料)。例如，可以对培养物每天、每隔一天、每三天补料一次，或者当直接或间接监测的特定培养基成分的浓度落在所需范围之外时可以进行补料。动物细胞如cho细胞或细胞可以在小规模培养物中培养，例如在具有约25ml培养基的125ml容器中，具有约50至100ml培养基的250ml容器，具有约100至200ml培养基的500ml容器。或者，培养物可以是大规模的，例如具有约300至1000ml培养基的1000ml容器，具有约500ml至3000ml培养基的3000ml容器，具有约2000ml至8000ml培养基的8000ml容器，以及具有约4000毫升至15000毫升培养基的15000毫升的容器。用于制造的培养物可以含有10,000l或更多的培养基。大规模细胞培养物，例如用于蛋白质治疗剂的临床制造，通常保持数天或数周，同时细胞产生所需的蛋白质。在此期间，可以取出培养物样品并测试生物污染物的存在。生产治疗性蛋白质监测生物污染的细胞培养物可用于产生感兴趣的蛋白质或其它生物分子，例如治疗有效的抗体或其它生物药物物质。蛋白质产物(靶蛋白质)可以特别是抗体，人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，单克隆抗体，多特异性抗体，双特异性抗体，抗原结合抗体片段，单链抗体，双抗体，三抗体或四抗体，fab片段或f(ab’)2片段，iga抗体，igd抗体，ige抗体，igm抗体，igg抗体，igg1抗体，igg2抗体，igg3抗体或igg4抗体。在一个实施方案中，抗体是igg1抗体。在一个实施方案中，抗体是igg2抗体。在一个实施方案中，抗体是igg4抗体。感兴趣的蛋白质可以是含有fc部分和另一结构域的重组蛋白质(例如fc-融合蛋白)。fc融合蛋白可以是受体fc-融合蛋白，其含有一个或多个与fc部分偶联的受体的一个或多个细胞外结构域。在一些情况下，fc部分包含铰链区，随后是igg的ch2和ch3结构域。在一些情况下，受体fc-融合蛋白含有两个或更多个不同的受体链，其结合单个配体或多个配体。例如，fc融合蛋白是陷阱，例如il-1陷阱(例如，rilonacept，其含有与融合到higg1的fc结构域il-1r1胞外区融合的il-1racp配体结合区；参见美国专利号6,927,004)或vegf陷阱(例如，aflibercept，其含有与融合到higg1的fc结构域的vegf受体flk1的ig结构域3融合的vegf受体flt1的ig结构域2；参见美国专利号7,087,411和7,279,159)。本发明不限于用于蛋白质生产的任何特定类型的细胞或细胞系。适用于蛋白质生产的细胞类型的实例包括哺乳动物细胞，例如cho衍生细胞如昆虫细胞，禽细胞，细菌细胞和酵母细胞。细胞可以是干细胞或采用用于重组基因表达的载体转化的重组细胞，或采用用于产生病毒产物的病毒转染的细胞。细胞可以含有编码感兴趣的蛋白质的重组异源多核苷酸构建体。该构建体可以是附加型(例如染色体外的质粒或片段)，或者其可以物理整合到细胞的基因组中。细胞还可以产生感兴趣的蛋白质，而不需要在异源多肽构建体上编码该蛋白质。换句话说，细胞可以天然地编码感兴趣的蛋白质，例如产生抗体的b细胞。遗传工程改造细胞或细胞系以表达目的蛋白质的方法和载体是本领域本领域技术人员所熟知的。例如，各种技术被描述于currentprotocolsinmolecularbiology,ausubeletal.,eds.(wiley&sons,newyork,1988,andquarterlyupdates)；sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual(coldspringlaboratorypress,1989)；kaufman,r.j.,largescalemammaliancellculture,1990,pp.15-69。适用于培养生长的各种细胞系可从americantypeculturecollection(manassas,va.)和商业供应商获得。细胞还可以是原代细胞，例如鸡胚细胞或原代细胞系。有用细胞的实例包括bsc细胞，llc-mk细胞，cv-1细胞，cos细胞，vero细胞，mdbk细胞，mdck细胞，crfk细胞，raf细胞，rk细胞，tcmk-1细胞，llcpk细胞，pk15细胞，llc-rk细胞，mdok细胞，bhk-21细胞，鸡胚细胞，ns-1细胞，mrc-5细胞，wi-38细胞，bhk细胞，293细胞，per.c6细胞和cho细胞。在各种实施方案中，细胞系是cho细胞衍生物，例如cho-k1，choduxb-11，chodg-44，veggie-cho，gs-cho，s-cho，cholec突变系或细胞系。在一种特定情况下，细胞是异位(异源)表达蛋白质的cho细胞衍生物，例如细胞。该蛋白质包含免疫球蛋白重链区域，例如ch1、ch2或ch3区域。在一个实施方案中，蛋白质包含人或啮齿动物免疫球蛋白ch2和ch3区。在一个实施方案中，蛋白质包含人或啮齿动物免疫球蛋白ch1、ch2和ch3区。在一个实施方案中，蛋白质包含铰链区和ch1、ch2和ch3区。在具体实施方案中，蛋白质包含免疫球蛋白重链可变结构域。在具体实施方案中，蛋白质包含免疫球蛋白轻链可变结构域。在具体实施方案中，蛋白质包含免疫球蛋白重链可变结构域和免疫球蛋白轻链可变结构域。在具体实施方案中，蛋白质是抗体，例如人抗体，啮齿动物抗体或嵌合人/啮齿动物抗体(例如人/小鼠、人/大鼠或人/仓鼠)。细胞培养物的蛋白质生产阶段可以在任何培养规模下进行，从单个培养瓶和摇瓶或摇袋到一升生物反应器和到大规模工业生物反应器。可以以约100升至20,000升或更大的体积进行大规模的过程。可以使用若干方法中的一种或多种来控制蛋白质生产，例如温度变换或化学诱导。细胞的生长阶段可以在比蛋白质表达和/或分泌的生产阶段更高的温度下进行。例如，生长阶段可以在约35℃至38℃的第一温度下进行，并且生产阶段可以在约29℃至37℃、任选地约30℃至36℃或约30℃至34℃的第二温度进行。此外，可以在温度变换之前或之后同时加入蛋白质生产的化学诱导剂，例如咖啡因，丁酸酯，他莫昔芬，雌激素，四环素，多西环素和六亚甲基双乙酰胺(hmba)。如果在温度变换后添加诱导剂，则可以在温度变换后1小时至5天加入，例如温度变换后1至2天。生产细胞培养物可以作为连续进料培养系统进行，如在恒化器中(参见c.altamiranoetal.,biotechnolprog.2001nov-dec；17(6):1032-41)，或根据补料分批(分批补料)过程(huang，2010)。治疗性蛋白质产品如本文所用，“肽”、“多肽”和“蛋白质”在全文中可互换使用，并且是指包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸残基的分子。肽、多肽和蛋白质还可以包括修饰，例如糖基化，脂质附着，硫酸化，谷氨酸残基的γ-羧化，烷基化，羟基化和adp-核糖基化。肽、多肽和蛋白质可以具有科学或商业利益，包括基于蛋白质的药物。肽、多肽和蛋白质尤其包括抗体和嵌合或融合蛋白。使用细胞培养方法由重组动物细胞系产生肽、多肽和蛋白质。“抗体”是指由四条多肽链(两条重(h)链和两条通过二硫键相互连接的轻(l)链)组成的免疫球蛋白分子。每条重链具有重链可变区(hcvr或vh)和重链恒定区。重链恒定区含有三个结构域ch1、ch2和ch3。每条轻链具有轻链可变区和轻链恒定区。轻链恒定区由一个结构域(cl)组成。vh和vl区域可以进一步细分为高变区域，称为互补决定区(cdr)，散布于更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl由以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个cdr和四个fr组成：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。术语“抗体”包括任何同种型或亚类的糖基化和非糖基化免疫球蛋白。术语“抗体”包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的抗体分子，例如从转染以表达抗体的宿主细胞分离的抗体。术语抗体还包括双特异性抗体，其包括可结合多于一个表位的异四聚体化免疫球蛋白。双特异性抗体一般性描述在美国专利申请公开号2010/0331527中，其通过引用并入本文。术语抗体的“抗原结合部分”(或“抗体片段”)是指保留特异性结合抗原的能力的抗体的一个或多个片段。包含在术语抗体的“抗原结合部分”的结合片段的实例包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab’)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个fab片段的二价片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段，(v)dab片段(wardetal.(1989)nature241:544-546)，其由vh结构域，(vi)分离的cdr，和(vii)scfv，其由通过合成接头连接以形成单个蛋白质链的fv片段的两个结构域vl和vh组成，其中vl和vh区域配对形成单价分子。其他形式的单链抗体，例如双抗体也包括在术语“抗体”下(参见例如holligeretal.(1993)pnasusa90:6444-6448；poljaketal.(1994)structure2:1121-1123)。抗体或其抗原结合部分可以是通过抗体或抗体部分与一种或多种其它蛋白质或肽的共价或非共价缔合形成的较大免疫粘附分子的一部分。这种免疫粘附分子的实例包括使用链霉抗生物素蛋白核心区域制备四聚体化scfv分子(kipriyanovetal.(1995)humanantibodiesandhybridomas6:93-101)以及使用半胱氨酸残基、标记肽和c-末端多组氨酸标签以制备二价和生物素化的scfv分子(kipriyanovetal.(1994)mol.immunol.31:1047-1058)。使用常规技术例如通过木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化整个抗体，可以从全抗体制备抗体部分，例如fab和f(ab’)2片段。此外，可以使用标准重组dna技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子(参见sambrooketal.,1989)。术语“人抗体”旨在包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以例如在cdr中，特别是cdr3中包括未被人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用的术语“人抗体”不包括其中衍生自另一种哺乳动物物种如小鼠的种系的cdr序列已经被移植到人框架序列上的抗体。如本文所用的术语“重组人抗体”旨在包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，从重组的组合人抗体文库中分离的抗体，从用于人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如tayloretal.(1992)nucl.acidsres.20:6287-6295)或通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其它dna序列的任何其它方式制备、表达、产生或分离的抗体。这种重组人抗体具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，这种重组人抗体进行体外诱变(或者当使用用于人ig序列的转基因动物时，体内体细胞诱变)并因此重组体抗体的vh和vl区的氨基酸序列是当从人种系vh和vl序列衍生并与之相关的序列时在体内可能不会天然存在于人类抗体种系库(repertoire)中的序列。“fc融合蛋白”包含两种或更多种蛋白质的部分或全部，其中之一是免疫球蛋白分子的fc部分，其在自然界中并不一起发现。包含融合到抗体衍生多肽的各个部分(包括fc结构域)的某些异源多肽的融合蛋白的制备已经描述于例如ashkenazietal.,proc.natl.acad.sclusa88:10535,1991；byrnetal.,nature344:677,1990；和hollenbaughetal.,“constructionofimmunoglobulinfusionproteins”,于currentprotocolsinimmunology,suppl.4,pages10.19.1-10.19.11,1992。“受体fc融合蛋白”包含与fc部分偶联的受体的一个或多个细胞外结构域，其在一些实施方案中包括铰链区，其后是免疫球蛋白的ch2和ch3结构域。在一些实施方案中，fc融合蛋白含有结合一种或多种配体的两个或更多个不同的受体链。例如，fc融合蛋白是陷阱，例如il-1陷阱(例如，rilonacept，其含有与融合到higg1的fc的il-1r1胞外区融合的il-1racp配体结合区；参见美国专利号6,927,004)或vegf陷阱(例如，aflibercept，其含有与融合到higg1的fc的vegf受体flk1的ig结构域3融合的vegf受体flt1的ig结构域2；参见美国专利号7,087,411和7,279,159)。生物污染物如本文所用，术语“生物污染物”是指任何不需要的、不期望的、有害的或潜在有害的生物实体。这些实体特别包括朊病毒(牛/传染性海绵状脑病的病原学原因)，病毒粒子，病毒，支原体，其他细菌，污染性后生动物细胞，dna，rna，转座子，其他转座因子，酵母，其他真菌，藻类，原生生物，和其他外源性和内源性剂。使用啮齿动物细胞(如cho细胞和cho细胞的衍生物)的生物治疗剂生产过程特别关注的是与细胞或培养基或制造原料相关的外源性病毒。细胞培养大量处理材料和所得药物产品的污染构成对患者的直接风险以及中断药物供应的间接风险。可以感染cho细胞培养物的外源性和/或内源性剂的非穷举列表包括：单链(-)rna病毒如卡奇谷病毒(cachevalleyvirus)，甲型/乙型流感病毒，副流感1/2/3，猿猴病毒5，腮腺炎病毒，牛呼吸道合胞病毒和水泡性口炎病毒；单链(+)rna病毒如牛冠状病毒，疱疹病毒2117，脑心肌炎病毒，柯萨奇病毒b-3，赛姆利基森林病毒和辛德比斯病毒；双链rna病毒如蓝舌病毒，动物流行性出血病病毒和呼肠弧病毒1/2/3；单链dna病毒如猪圆环病毒1，以及特别有问题的细小病毒，其包括小鼠细小病毒(也称为小鼠的细小病毒)；和双链dna病毒如腺病毒和伪狂犬病病毒。在这些潜在的外源性剂中，四种病毒主要来自各种制造商的cho细胞培养物的大量收获样品。这些病毒是呼肠病毒2型、卡奇谷病毒、动物流行性出血病病毒和啮齿动物细小病毒小鼠细小病毒。cho细胞培养物的外源性病毒污染的详细综述，参见andreasbertingetal.,virussusceptibilityofchinesehamsterovary(cho)cellsanddetectionofviralcontaminationsbyadventitiousagenttesting,106(4)biotechnologyandbioengineering598-607(2010),和andrewkerr&raymondnims,adventitiousvirusesdetectedinbiopharmaceuticalbulkharvestsamplesovera10yearperiod,64(5)pdajournalofpharmaceuticalscience&technology481-485(2010)。外源性剂测试分为两大类。第一类是使用体外病毒测定的经典病毒学方法。这里，将测试样品应用于指示细胞系，将细胞孵育并传代14至28天，然后测量终点，例如致细胞病变效应或血凝反应(berting，2010)。第二类是基于pcr的测定，其实时测量与外源性或内源性剂相关的核酸的存在。例如，参见zhanetal.,detectionofminutevirusofmiceusingrealtimequantitativepcrinassessmentofvirusclearanceduringthepurificationofmammaliancellsubstratederivedbiotherapeutics,30(4)biologicals259-270(2002)。小鼠细小病毒(亦称mmv、小鼠的细小病毒或mvm)对生物治疗剂制造构成特殊问题。美国食品和药物管理局(fda)和欧洲药品都要求专门测试mvm。这种病毒是细小病毒科(细小病毒)的成员，在小鼠中是常见的。它在尿液和粪便中排泄并且在环境中稳健、持续存在。它可以很容易地被引入到生物治疗剂制造过程中。参见moodyetal.,mouseminutevirus(mmv)contamination–acasestudy:detection,rootcausedetermination,andcorrectiveactions,65(6)pdajournalofpharmaceuticalscienceandtechnology580-288(2011)。其他啮齿动物细小病毒可能会对基于细胞培养的生物药物生产产生负面影响。除了mvm原型株之外，这些啮齿动物细小病毒特别包括mvm免疫抑制株和cutter株，小鼠细小病毒1a(mpv-1a)，mpv-1b，mpv-1c，仓鼠细小病毒，toolan's细小病毒(细小病毒h-1)，kilham大鼠病毒，大鼠细小病毒1a，大鼠细小病毒和大鼠病毒l的umass株。参见s.f.cotmore&p.tattersal,theautonomouslyreplicatingparvovirusesofvertebrates,33advancesinvirusresearch91-174(1987),和jacobyetal.,rodentparvovirusinfections,46(4)labanimsci.370-80(1996)。这些细小病毒共有称为ns-1(ns1)的保守核酸序列，其编码参与病毒基因组扩增的大的非结构蛋白。来自mvm的保守的ns1核苷酸序列示于seqidno：9中。该序列的核苷酸875-956在广泛的啮齿动物细小病毒ns1序列中至少97％保守，因此用作基于pcr的外源性和内源性剂测试的良好靶序列。针对啮齿动物细小病毒(以及其他外源性和内源性试剂)的基于pcr测试可以在原料、预收获培养基、沿生物治疗分子的整体方法纯化的各个点以及制剂和包装阶段进行。污染物的检测可能需要修复步骤，例如处理受污染的材料，更换原材料以及对设施进行去污。除了在制造期间测试外源性剂、内源性剂和其它生物污染物，其使得能够进行纠正和预防作用(capa)，可以采用特殊制造和批量处理步骤(即，单元操作)来消除、减少或灭活病毒污染物。已经显示化学灭活、病毒保持性过滤和色谱法在收获或部分纯化的细胞培养液中有效减少疱疹病毒、逆转录病毒和细小病毒。最常使用的化学灭活步骤是低ph处理，本领域本领域技术人员认为是由于病毒包膜蛋白的变性。蛋白a、羟基磷灰石、阳离子交换和阴离子交换色谱步骤已被证明可以在一定程度上去除病毒。参见例如miesegaesetal.,analysisofviralclearanceunitoperationsformonoclonalantibodies,106(2)biotechnologyandbioengineering238-246(2010),和liuetal.,recoveryandpurificationprocessdevelopmentformonoclonalantibodyproduction,2(5)mabs480-499(2010)。q-pcr测试：阳性和阴性对照对生物污染物的测试应适当控制，以确保准确性、可靠性和可信度。如本文所用，“阴性对照”包含大多数或所有实验试剂和条件，但不含测试样品。测试样品可以用已知不包含感兴趣的生物污染物的缓冲剂或假培养基来代替。此外，如本文所用，“阴性对照”应该对生物污染物产生阴性结果。如果阴性对照产生阳性生物污染物结果，则本领域技术人员或科学家可以认为，平行测试样品的阳性结果可能不能准确反映测试样品是否含有生物污染物。如本文所用，使用一个或多个“阳性对照”来评估实验条件是否足以可操作地检测生物污染物。可以在沿着实验过程的任何步骤中使用阳性对照，以确保每个步骤都在运行，并确定过程的哪个步骤发生故障。在一些实施方案中，在核酸提取步骤中使用阳性对照以评估任何生物污染物核酸的预期提取是否足够有效地检测生物污染物。这种阳性对照被称为“核酸提取对照”或“nec”。在某些情况下，选择nec以蛋白质-核酸结构的形式模拟靶生物污染物。如果以足以被检测的方式提取nec，则技术人员可以认为靶生物核酸也以足以被检测的方式提取。在一个实施方案中，nec是单链dna噬菌体，不完全不像细小病毒。在具体实施方案中，nec是m13噬菌体，其由约6407个核苷酸的环形单链dna组成。在更具体的实施方案中，nec是m13k07株，其是用于克隆和其他实验室目的的通常可用的分子生物学试剂。参见vanwezenbeeketal.,nucleotidesequenceofthefilamentousbacteriophagem13dnagenome:comparisonwithphagefd,11(1-2)gene129-148(1980)。m13k07噬菌体的核苷酸序列示于seqidno：8中。虽然m13噬菌体或m13k07噬菌体株可以在具体实施方案中用作nec，但是本发明绝不限于使用该特定剂作为nec。本领域本领域技术人员可以在本发明的实践中替代另一种剂作为nec，而不脱离本发明的范围(例如，用于逆转录酶-pcr测定的ms2噬菌体；参见kothapallietal.,problemsassociatedwithproductenhancementreversetranscriptaseassayusingbacteriophagems2rnaasatemplate,109(2)j.virol.methods203-207(2003))。在本发明的一些实施方案中，在pcr扩增步骤中使用阳性对照来评估pcr试剂(包括引物)和pcr步骤是否足以检测生物污染物模板核酸。这种阳性对照被称为“质粒扩增对照”或“pac”。在某些情况下，选择或设计pac以匹配靶生物污染物核酸序列，并完全匹配测试样品正向和反向寡核苷酸引物。在具体实施方案中，pac另外含有在靶生物污染物核酸中未发现的“特有序列”。在更具体的实施方案中，在自然界中不存在特有序列。设计“特有”核酸聚合物以与该特有序列特异性退火，并且在pcr过程中并入到特有序列的扩增子拷贝中。“特有”核酸聚合物被设计为在靶测定操作中使用的杂交条件下不识别或与任何天然存在的细小病毒退火。在一个实施方案中，“特有”核酸聚合物包含17至20个核苷酸，其中不超过七(7)至10个内部连续核苷酸和不超过六(6)个连续3’核苷酸与任何细小病毒序列相同。在一个实施方案中，“特有”核苷酸聚合物包含17至20个核苷酸，其中不超过7至10个连续核苷酸和不超过六(6)个连续的3’核苷酸与seqidno：9和12-37所示的任何细小病毒序列相同。这种特有序列使得本领域技术人员能够区分真正的靶生物污染物序列和测试q-pcr反应的与pac质粒的交叉污染。在一个实施方案中，将pac(作为质粒，亦称pac质粒)包含在相同但分开的q-pcr反应中以控制pcr扩增。pac反应使用与测试样品q-pcr反应中使用的完全相同的寡核苷酸引物和探针，以准确反映实际靶生物污染物核酸的扩增。测试样品q-pcr反应和分开的pac质粒q-pcr反应包括靶检测探针和特有序列探针。pac反应如果功能正常，预计会产生阳性靶信号和阳性特有序列信号。在含有pac质粒的反应中获得阳性靶信号和阳性特有序列信号表明，每当存在靶生物污染物核酸，测试样品q-pcr试剂和条件就能充分地在测试样品中产生阳性靶信号。因此，pac用作适当pcr扩增的对照。如果在测试样品中获得阴性靶信号，但是pac显示出阳性靶信号，则本领域技术人员可以认为在测试样品中不存在可检测的靶污染物dna。相反，如果在测试样品中获得阳性靶序列信号和阳性特有序列信号，则本领域技术人员可以假定pac质粒交叉污染测试样品，因此阳性靶序列信号可能是假阳性。若干实施方案的详述在一些实施方案中，提供改进的阳性对照系统(即，组合物和方法)用于通过使用聚合酶链反应、更具体地q-pcr来检测生物污染物。在一个方面，本发明提供了用于检测阳性扩增对照质粒(pac质粒)的特有序列探针(usp)。usp含有能够与特有人工质粒特异性序列(亦称特有序列或pacp特有序列，或uaps)杂交的人工核苷酸序列、荧光团和淬灭剂。在具体实施方案中，能够与uaps杂交的人工核苷酸序列包含seqidno：3(5’-tgtcgatggcgaatggcta-3’)的核酸序列，其与uaps有义链序列(例如，即seqidno：10——5’-tagccattcgccatcgaca-3’)反义。如上所述，q-pcr检测探针含有荧光团和淬灭剂。根据荧光团/淬灭剂对，可以通过接触淬灭或fret进行淬灭。这里，荧光团和淬灭剂共价连接usp寡核苷酸。在一个实施方案中，荧光团具有495nm至680nm的激发波长和515nm至710nm的发射波长。在一些实施方案中，荧光团的激发波长分别为495nm、538nm或646nm，发射波长分别为520nm、554nm或669nm。在一些实施方案中，淬灭剂是吸收峰为430nm至672nm的染料。有用的淬灭剂的实例包括-i，dabcyl，iowablack-1，-7，-2，-ii，iowablack-21和-3。在具体实施方案中，荧光团是荧光素亚酰胺(fluoresceinamidite)(fam；描述于美国专利号5,583,236(1996年12月10日授权))，其吸光度最大值约为495nm，发射最大值约为520nm，淬灭剂是blackhole-1(-1，biosearchtechnologies，inc.，petaluma，ca)，其在480nm至580nm处吸收。-1通过fret淬灭并接触淬灭。通常而不总是，淬灭剂通过醚键连接到寡核苷酸的3’羟基基团，而荧光团通过酯键连接到寡核苷酸的5’磷酸基团。另一方面，本发明提供了包含多个寡核苷酸和探针的q-pcr试剂的混合物，其可用于检测细胞培养物、原料、部分纯化和纯化的生物分子等中的生物污染物。在一个实施方案中，生物污染物是dna病毒，更具体地是细小病毒，更具体地，是啮齿动物细小病毒，例如mvm。细小病毒含有具有与表1中列出的任何序列至少88％相同的核酸序列的ns1基因。在另一实施方案中，细小病毒含有与seqidno：9所示的序列(即小鼠分子病毒(mvm)ns1基因))具有至少97％同一性的核酸序列的ns1基因。在另一实施方案中，细小病毒含有包含seqidno：37的共有序列的ns1基因。表1：细小病毒科ns1序列在具体实施方案中，混合物含有(1)啮齿动物细小病毒特异性正向寡核苷酸引物；(2)啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针；(3)人工寡核苷酸检测探针，如usp；和(4)啮齿动物细小病毒特异性反向寡核苷酸引物。这种混合物可以用于测试样品和阳性对照样品中。在更具体的实施方案中，寡核苷酸引物和细小病毒特异性寡核苷酸检测探针与ns1序列杂交，例如seqidno：9所示的ns1序列。在更具体的实施方案中，(1)正向引物包含seqidno：1的序列；(2)细小病毒特异性寡核苷酸检测探针包含seqidno：2的序列；(3)人工探针是usp并且包含seqidno：3的序列；和(4)反向引物包含seqidno：4的序列。如上所述，usp包含荧光团和淬灭剂，使得含有该序列(即pacdna)的扩增子可以随着q-pcr的进行而实时检测。以类似的方式，细小病毒特异性检测探针含有具有共价连接的荧光团和淬灭剂的寡核苷酸。在实践中，细小病毒检测探针的荧光团发射波长应该不同于usp的发射波长，以区分真正的细小病毒阳性信号和由pac质粒或其他pacp污染测试样品(例如，pacp污染扩增子)的假阳性。因此，在usp荧光团为fam的实施方案中，连接至细小病毒检测探针寡核苷酸的荧光团应具有除了约520nm之外的发射波长。在具体实施方案中，连接至啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针的荧光团是染料(lifetechnologies，inc.，carlsbad，ca)，其具有538nm的吸光度最大值和约554nm的发射最大值。这里，淬灭剂可以是fret淬灭剂或接触淬灭剂。在一个实施方案中，淬灭剂是小沟结合非荧光淬灭剂(mgbnfq)(参见sylvainetal.,rapidscreeningforhla-b27byataqman-pcrassayusingsequence-specificprimersandaminorgroovebinderprobe,anoveltypeoftaqmantmprobe,287(1-2)journalofimmunologicalmethods179-186(2004))。使用上述引物和探针的混合物来测试和区分阳性扩增对照构建体与真正的细小病毒污染物。在一些实施方案中，引物的混合物还包括用于检测核酸提取对照(nec)的一组引物和探针。在具体实施方案中，nec是m13噬菌体，例如m13k07株(seqidno：8)。因此，在一些实施方案中，除了细小病毒引物和探针和ups探针之外，引物和探针的混合物含有(5)m13特异性正向寡核苷酸引物；(6)m13特异性寡核苷酸检测探针；和(7)m13特异性反向寡核苷酸引物。在一些实施方案中，m13引物和探针与seqidno：8的序列杂交。在具体实施方案中，m13特异性正向寡核苷酸引物包含seqidno：5的核酸序列；m13特异性寡核苷酸检测探针包含seqidno：6的核酸序列；m13特异性反向寡核苷酸引物包含seqidno：7的核酸序列。如在细小病毒探针和usp的非重叠荧光团发射光谱的情况下，nec探针含有以非重叠光谱发射光的荧光团。在具体的实施方案中，连接至m13特异性寡核苷酸检测探针的荧光团是cy5，其为具有吸光度最大值约650nm和最大发射最大值为670nm的花青染料(参见southwicketal.,cyaninedyelabelingreagents:carboxymethylindocyaninesuccinimidylesters,11cytometry,418–430(1990))。这里，淬灭剂可以通过fret或接触淬灭进行操作。在一个实施方案中，淬灭剂是最大吸收约579nm的blackhole-2(-2，biosearchtechnologies，inc.，petaluma，ca)，并且在约550nm至约650nm的范围内淬灭。另一方面，本发明提供了一种检测生物分子生产过程中生物污染物的方法。生物污染物更具体地包括细小病毒，更特别地是啮齿动物细小病毒，最特别地包括与mvmns1基因具有至少97％同一性的那些细小病毒。在一些实施方案中，ns1基因包含seqidno：9的序列。在一个实施方案中，生物分子生产方法是用于制备抗体、陷阱分子或其它治疗性抗体的哺乳动物细胞培养方法。从细胞培养物(或大量成分)中取出测试样品并提取核酸。在一些情况下，将测试样品加入nec，例如m13(例如，seqidno：8)，以用作在q-pcr之前适当提取核酸的对照。该方法包括以下步骤：(1)混合(a)从测试样品中提取的核酸样品，(b)寡核苷酸引物和探针(如上所述)，和(c)dna聚合酶，优选具有5’核酸外切酶活性的热稳定dna聚合酶如taq聚合酶；(2)使混合物进行聚合酶链反应(pcr)；和(3)通过荧光发射幅度监测各种扩增子的产生。特异性扩增子的形成与测试样品中各种模板核酸的存在和量相关。特异性扩增子包括(1)靶扩增多核苷酸(tap)，例如啮齿动物细小病毒序列(例如含有ns1序列的那些生物污染物)，(2)核酸提取对照(nec)，例如m13(例如m13k07)多核苷酸(necp)，和(3)质粒扩增对照多核苷酸(pacps)，例如特有人工质粒特异性序列(uaps)。如果产生tap和necp，并且不产生pacp，则可以得出结论：测试样品含有生物污染物并且不含有交叉污染的阳性扩增对照质粒。然而，如果在测试样品q-pcr反应中产生tap和pacp(即uap)，则可以得出结论：测试样品与pac质粒交叉污染，并且tap结果可能是假阳性。在具体实施方案(其中引物和探针包含(1)包含seqidno：1的序列的啮齿动物细小病毒特异性正向寡核苷酸引物，(2)包含seqidno：2的序列的啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针、vic荧光团和mgbnfq淬灭剂，(3)人工寡核苷酸检测探针，例如包含seqidno：3的序列并用6-fam和-1标记的usp，(4)包含seqidno：4的序列的啮齿动物细小病毒特异性反向寡核苷酸引物，(5)包含seqidno：5的序列的m13特异性正向寡核苷酸引物，(6)m13特异性寡核苷酸检测探针，其包含seqidno：6并用cy5和-2标记，和(7)包含seqidno：7的序列的m13特异性反向寡核苷酸引物中，在约533nm至约580nm监测tap的产生，在约465nm至约510nm监测pacp的产生，并且在约618nm至约660nm监测necp的产生。在一个实施方案中，在收获培养物前96至72小时，测试样品取自生产cho细胞培养物，例如，用编码感兴趣的蛋白质的核酸转化的细胞的生产培养物。如果在测试样品中检测到tap和necp，但是在测试样品中没有检测到pacp，则可以在收获前48小时从相同生产细胞培养物获得的第二测试样品进行确认测试。如果在第二测试样品中再次检测到tap和necp，但是在测试样品中没有检测到pacp，则认为细胞培养物被污染并且可能不被进一步处理。或者，可能不进行第二次测试，但细胞培养物可被认为被污染并且培养物不被进一步处理。在一个实施方案中，从获自生产细胞培养物的测试样品中提取核酸。这里，将1毫升测试样品进行细胞裂解、蛋白水解和热变性，然后将样品与核酸提取对照(nec)样品组合，然后从样品中提取核酸。在一个实施方案中，使用自动化核酸提取系统(例如instrument)(qiagen,inc.,valencia,ca)从测试样品(或nec加标测试样品)中提取核酸(参见leeetal.,comparativeevaluationoftheqiagenspsystemandbiomérieuxnuclisenseasymagautomatedextractionplatformsinaclinicalvirologylaboratory,52(4)j.clin.virol.339-43(2011))。在一个实施方案中，在进行pcr之前将尿嘧啶-n-糖基化酶(ung)加入到q-pcr反应混合物中，以选择性降解污染性扩增子(参见taggartetal.,useofheatlabileunginanrt-pcrassayforenterovirusdetection,105(1)j.virol.methods.57-65(2002))。将反应混合物在50℃下孵育至少2分钟，更具体地在一些情况下孵育2分钟或5分钟。在具体实施方案中，在任选的ung处理后，将反应混合物在95℃下孵育2分钟，然后进行8个循环：(1)在95℃变性10秒，然后(2)退火和延伸30秒，使得第一个退火温度为70℃，然后每个循环退火温度降低1℃，第八个退火为62℃。在最初的8个循环后，进行40个循环的dna扩增，其包括以下步骤：(1)在95℃变性10秒，然后(2)在62℃退火和延伸30秒。在具体实施方案中，从变性温度到退火温度的温度变化速率为约4.4℃/秒，并且从退火温度至变性温度为约2.2℃/秒。在一些实施方案中，检测生产细胞培养基或其产物中的生物污染物的方法包括进行与测试样品测定分开运行的外部阳性扩增对照(pac)测定，并进行与测试样品测定和pac测定分开运行的外部阴性对照测定。如果阴性对照或阳性对照失败，则从测试样品测定获得的结果被拒绝。在一个实施方案中，外部阳性对照包括以下步骤：(1)在没有测试样品的情况下特别混合(a)阳性扩增对照(pac)质粒，其在具体实施方案中包含seqidno：11，(b)包含seqidno：1的序列的啮齿动物细小病毒特异性正向寡核苷酸引物，(c)包含用vic和mgbnfq标记的seqidno：2的序列的啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针，(d)人工寡核苷酸检测探针，例如包含用6-fam和-1标记的seqidno：3的序列的usp，(e)包含seqidno：4的序列的啮齿动物细小病毒特异性反向寡核苷酸引物，和(f)dna聚合酶，优选具有5’核酸外切酶活性的热稳定dna聚合酶，如taq聚合酶；(2)使阳性对照混合物进行阳性对照聚合酶链反应(pcr)；(3)在pcr过程中监测(a)靶扩增多核苷酸(tap)，(b)核酸提取对照扩增多核苷酸(necp)和(c)质粒扩增对照多核苷酸(pacp)的产生。在约533nm至约580nm监测tap的产生，在约465nm至约510nm监测pacp的产生，并且在约618nm至约660nm监测necp的产生。阳性扩增对照pcr反应与测试样品pcr反应(如上所述)相同地进行。如果在阳性对照反应中产生tap和pacp，则可以得出结论：pcr扩增程序正常运行。如果在阳性扩增对照反应中没有产生tap，则测试样品中的任何阴性tap可以作为pcr反应失败而大打折扣。在一个实施方案中，nec(即，例如，m13k07)包括在阳性扩增对照中。正常发挥功能的对照也应显示阳性necp信号(见表1)。在一个实施方案中，外部阴性对照包括以下步骤：(1)在没有测试样品并且没有pac质粒的情况下特别混合(a)空白，其可以是模拟测试样品缓冲系统的缓冲剂，或简单地是水，(b)包含seqidno：1的序列的啮齿动物细小病毒特异性正向寡核苷酸引物，(c)包含用vic和mgbnfq标记的seqidno：2的序列的啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针，(d)人工寡核苷酸检测探针，例如包含用6-fam和-1标记的seqidno：3的序列的usp，(e)包含seqidno：4的序列的啮齿动物细小病毒特异性反向寡核苷酸引物，和(f)dna聚合酶，优选具有5’核酸外切酶活性的热稳定dna聚合酶，例如taq聚合酶；(2)使阳性对照混合物进行阳性对照聚合酶链反应(pcr)；(3)在pcr过程中监测(a)靶扩增多核苷酸(tap)，(b)核酸提取对照扩增多核苷酸(necp)和(c)质粒扩增对照多核苷酸(pacp)的产生。在约533nm至约580nm监测tap的产生，并且在约465nm至约510nm监测pacp的产生。阴性对照pcr反应与测试样品pcr反应(如上所述)相同地进行。如果在阴性对照反应中产生tap和pacp，则可以得出结论：pcr试剂被pac质粒污染。如果在阴性对照反应中产生tap，但没有产生pacp，则可以得出结论：pcr试剂被细小病毒污染。在这两种情况下，都丢弃测试样品结果。然而，如果阴性对照反应中tap和pacp的产生均为阴性，则在阳性扩增对照中tap和pacp的产生为阳性，在测试样品反应中tap(或任选的necp)的产生为阳性，pacp的产生为阴性，那么技术人员可以断定测试样品被污染(见表2和表3)。在其它方面，本发明提供了阳性扩增对照质粒(pac质粒)和包含阳性对照质粒的阳性对照试剂的混合物。在一个实施方案中，pac质粒包含(1)细小病毒核酸序列，(2)m13k07核酸序列，和(3)该质粒特有的人工核酸序列(亦称“uaps”或“特有”序列))。在具体实施方案中，细小病毒核酸序列包含seqidno：1、seqidno：2和seqidno：4的序列；m13k07核酸序列包含seqidno：5、seqidno：6和seqidno：7的序列，特有序列包含seqidno：3的反义序列。在更具体的实施方案中，pac质粒的核苷酸序列由seqidno：11所示的序列组成。在一些实施方案中，阳性对照试剂的混合物特别包括上述pac质粒，啮齿动物细小病毒特异性正向寡核苷酸引物，啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针，人工寡核苷酸检测探针(即usp)，啮齿动物细小病毒特异性反向寡核苷酸引物，m13特异性正向寡核苷酸引物，m13特异性寡核苷酸检测探针和m13特异性反向寡核苷酸引物和缓冲剂。混合物任选地含有dntp和taq聚合酶。表2：测定对照和测试会话状态表3：测试会话状态样品描述细小病毒uap信号m13k07测试样品是否合适？阴性测试样品00+是假阴性测试样品000否阳性测试样品+0+是假阳性测试样品+++是在具体实施方案中，啮齿动物细小病毒特异性正向寡核苷酸引物包含seqidno：1的核酸序列，啮齿动物细小病毒特异性寡核苷酸检测探针包含vic荧光团、小沟结合淬灭剂(mgbnfq)和seqidno：2的核酸序列，usp包含vic荧光团、非荧光淬灭剂bhq和seqidno：3的核酸序列，啮齿动物细小病毒特异性反向寡核苷酸引物包含seqidno：4的核酸序列，m13特异性正向寡核苷酸引物包含seqidno：5的核酸序列，m13特异性寡核苷酸检测探针包含cy5荧光团、bhq-2淬灭剂和seqidno：6的核酸序列，m13特异性反向寡核苷酸引物包含seqidno：7的核酸序列。实施例1：寡核苷酸和核酸试剂从不同规模各种供应商处和以各种形式获得啮齿动物细小病毒、m13k07和人工特有寡核苷酸(oligos)，其在表4中描述。所有寡核苷酸在从供应商接收时被分配为三年的有效期。寡核苷酸在水中重构至浓度为100μm以产生主储液。在设置qpcr反应之前，将主储液进一步稀释以产生10x储液。表5描述了10x和1x浓度的qpcr寡核苷酸(引物和探针)。表4：细小病毒、m13和特有人工序列引物和探针表5：寡核苷酸浓度实施例2：阳性扩增对照质粒在puc57-kan质粒(genewiz，inc.，southplainfield，nj)中制备细小病毒-m13阳性扩增对照(pac)质粒。该pac质粒由seqidno：11所示的序列组成。细小病毒-m13pac质粒含有2.1×108拷贝/ng，使用以下公式计算：[数量＝(量*数/摩尔)/(bp*ng/g*g/bp的摩尔)]；其中，量＝ng，数/摩尔＝6.022×1023，bp＝4372，ng/g＝1×109，g/bp的摩尔＝650。计算质粒的浓度并以ng/μl表示，并连续稀释至102拷贝/μl的10x浓度。从102拷贝/μl稀释液中制备50μl等分试样并储存在2ml无菌螺帽管中。所有等分试样储存在≤-60℃。实施例3：制备m13k07噬菌体使用mem作为稀释剂十倍连续稀释m13k07噬菌体，以100pfu/μl的滴度获得m13k07。制备200μl等分试样并储存在≤-60℃，并分配三年的有效期。实施例4：q-pcr反应试剂制备啮齿动物细小病毒实时pcr检测测定是全自动化pcr方法，其由使用(qiagen)的自动化dna纯化，随后在480仪器(rochediagnostic)上进行核酸扩增和实时pcr产物检测组成。为了评估pcr抑制剂的存在，每个测试物品被自动掺入噬菌体m13k07作为内部对照(ic)。设计啮齿动物细小病毒引物寡核苷酸以在啮齿动物细小病毒基因组(ns-1区域)的高度保守区域内杂交，以确保宽范围检测。测定以双工(即两个靶)形式进行，啮齿动物细小病毒和m13k07引物分别产生约110和97bp的pcr产物。通过用不同的报告染料标记的两个探针的切割实时检测pcr产物：用于啮齿动物细小病毒的vic荧光团和用于m13k07噬菌体的cy5荧光团。使用浓度为100拷贝/ul的阳性扩增对照(pac)质粒。该质粒含有使用由荧光团fam标记的特异性探针将其与野生型细小病毒区分开的特有(flag)序列(usp)。根据表6将mastermix以足以为包括对照的测试制品的数量的至少三倍的量分装在2ml管中。将管储存在2-8℃。通过向2ml管中加入50ul水制备阴性扩增对照(nac)小瓶。表6：反应混合物实施例5：测试的样品制备由于所有样品都具有容纳或被外源性剂污染的可能性，因此对于所有样品预处理步骤都遵守无菌实践。以下步骤在干净的生物安全柜内进行。从产生抗体或捕获分子的细胞培养物获得测试制品(样品)，并冷冻或直接使用。将1000μlpbs等分分装到合适的2ml管中以用作阴性提取对照(nec)。当pcr用作细胞培养步骤的终点时，细胞培养物的阳性和阴性对照分别用作阳性提取对照和阴性提取对照。每个测试制品在室温下解冻。将60ml袋中的样品转移到50ml-falcon管中，然后等分分装。将1000μl的每个样品移液到2ml管中进行预处理。将400μl裂解缓冲剂(lysisbufferl13，invitrogen，cat#cs11202或等价物，carlsbad，ca)加入每个管中并涡旋至少10秒。然后将20μl蛋白酶k(≥10mg/ml，在含有10mmtris-hcl，ph7.5的含有1mm乙酸钙的40％甘油(v/v)中≥800单位/ml；safc，cat#p4850-5ml，sigmaaldrich，st.louis，mo)加入在每个样品中涡旋至少10秒。然后将样品在65℃下孵育30分钟。孵育后将样品涡旋并以17,000×g离心10分钟。同时，将阳性扩增对照(pac；2ml管中的最小50μl的102拷贝/μl质粒)和m13k07(102pfu/ml)内部对照(ic；最小150μl/12个样品)解冻。实施例6：核酸提取在仪器(qiagen，valencia，ca)上编程的提取操作方案要求内部对照(ic)。仪器自动向每个样品添加120μl重组ic。对于每12个样品，仪器需要1.8ml的ic(即1小瓶)。通过向150μl的m13k07ic中加入1650μlave缓冲剂(含有0.04％叠氮化钠的无rna酶的水)制备ic小瓶。将每个制备的样品加载到生物安全柜(bsc)内的仪器的samplecarrier中。将ic小瓶以每12个样品一个ic小瓶的比例装载到bsc内的分开(专用)samplecarrier中。所有抽屉都关闭，仪器根据制造商的推荐操作方案运行(参见qiasymphonydnahandbook，09/2010，可从http://www.algimed.by/download/en-qiasymphony-dna-handbool.pdf获得)。使用含有进行提取所需的所有试剂的dsp病毒/病原体试剂盒制备试剂制备盒(reagentprepcartridge)(参见dsp病毒/病原体试剂盒使用说明书(handbook，2013年4月，可从https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx？id＝f8bc0b3c-0aff-46ee-8807-5ed145f9e969&lang＝en获得)。试剂制备盒中含有蛋白酶k，保质期约为2周。在96孔式的反应板中进行核酸提取以促进与q-pcr的整合。自动核酸提取程序完成并通过状态检查后，将反应板冷却并用480密封箔(roche，branchburg，nj)密封。将96孔板置于用合适的配重(例如另一个96孔板)平衡的板旋转器中并旋转30至60秒。检查孔中的气泡，必要时重复旋转。实施例7：q-pcr使用taqmantriplex和/或veriquesttriplex两种程序中的任一种，在480仪器(roche，branchburg，nj)上进行q-pcr。taqmantriplex操作方案使用无参考染料(rox)的taqmanfastadvancecustommastermix。选择三个荧光通道(fam、vic和cy5)，并且ung步骤时间为2分钟。使用的反应参数概述在表7中。当使用也没有rox的mastermix时，使用5分钟的ung步骤时间。使用的反应参数概述在表8中。表7：啮齿动物细小病毒pcrtaqmantriplex程序步骤通过两种算法中的一种或两种来确定m13内部对照、啮齿动物细小病毒和阳性扩增对照质粒中的每一个的交叉点(cp)荧光信号。第一种算法是自动二阶导数法(automatedsecondderivativemethod)。该方法不需要用户输入，通常导致更高的一致性，因此被认为是首选方法。第二种算法是拟合点方法(fitpointsmethod)。这种方法允许用户在离散背景的情况下设置阈值线。对数线性曲线越过该阈值线的点成为交叉点。以下滤光梳被用于监测荧光信号：用于啮齿动物细小病毒(子集“sample-parvo”)的533-580nm(vic信号)；用于内部对照m13k07(子集“sample-m13”)的618-660nm(cy5信号)；和用于阳性扩增对照质粒(子集“sample-fam”)的465-510nm(fam信号)。在不明确的荧光信号的情况下，使用拟合点分析来确定荧光背景水平。可接受的背景荧光信号被认为是在扩增曲线标度上≤1个单位。任何荧光信号≤1单位被认为在可接受的背景内，因此是阴性。表8：啮齿动物细小病毒pcrveriquesttriplex程序步骤实施例8：有效测试会话的条件为了使测试会话被认为是有效的，必须满足以下条件。阴性扩增对照(nac，即水)在所有三个通道中的荧光信号必须为阴性。阴性提取对照(nec，即pbs)或细胞培养物阴性对照瓶在[533-580]通道(即啮齿动物细小病毒探针vic信号)中的荧光信号必须为阴性，在[465-510]通道(即阳性扩增对照[pac]反义flag探针-fam信号)中的荧光信号必须为阴性，在[618-660]通道(即m13k07探针-cy5信号)中的荧光信号必须为阳性。pac在所有三个通道的荧光信号应为阳性。nec中的m13k07cp值用作评估样品中抑制物质存在的参考。如果使用pcr作为来自具有啮齿动物细小病毒阳性对照的细胞培养步骤的测试制品的终点，则阳性病毒对照在[533-580]通道(即啮齿动物细小病毒探针vic信号)中的荧光信号必须为阳性，在[618-660]通道(即m13k07探针-cy5信号)中的荧光信号必须为阳性，在[465-510]通道(即pac反义flag探针-fam信号)中的荧光信号必须为阴性。细胞培养阳性对照样品中m13k07cp值预计在nec-m13cp值的±4个循环范围内。对于所有含有pac质粒的对照反应，荧光信号在所有三个通道中必须为阳性。实施例9：无效测试会话的条件当满足以下条件中的一个或多个条件时，测定被认为是无效的：(1)pac的非常低的扩增曲线(在荧光标度上为<1单位)，(2)决定因子错误(机器、软件或人为错误)得到确认，(3)nac对于三个通道中的任一个均为阳性，(4)nec在[533-580]vic通道中的扩增阳性，在[465-510]fam通道中的扩增阳性，或[618-660]cy5通道中的扩增阴性，(5)pac对于三个通道中的任一个的扩增信号为阴性。每当测定确定为无效时，进行测试样品的调查和重新测试。实施例10：有效测试中阴性样品结果的条件对于有效的阴性细小病毒测试结果，必须满足以下所有条件。在nec-m13cp±4循环的预期cp值范围内，在m13[618-660]通道中，样品的m13k07dna扩增信号必须为阳性，表明不存在pcr抑制剂。在细小病毒[533-580]通道中，样品的细小病毒dna扩增信号必须为阴性。不考虑cp值、在荧光标度上低于1单位的荧光信号被认为在可接受的荧光背景水平内，并且被报告为细小病毒dna扩增阴性。在反义flag[465-510]通道中，样品的pac扩增信号必须为阴性。请注意，不考虑cp值、在荧光标度上低于1单位的荧光信号(由仪器自动产生)被认为在可接受的荧光背景水平内，并且被报告为pac-质粒dna扩增阴性。实施例11：有效测试会话中“无样品”的条件当满足以下条件中的一个或多个时，产生“无样品”的结果。每当样品在cy5通道[618-660]中的m13k07dna扩增信号为阴性，在细小病毒通道[533-580]中的细小病毒dna扩增信号为阴性，在反义flagfam通道[465-510]中的pac扩增为阴性时，根据标准操作程序调查样品或pcr试剂。该条件表明pcr抑制剂的存在或适当的核酸提取失败。样品可以稀释(1:2、1:5、1:10)以克服抑制。在超出范围(necm13cp±4个循环)的m13通道[618660]中的荧光信号的cp值表示pcr的部分抑制或噬菌体加标的错误，并且需要重复测试。可以考虑样品稀释(1:2、1:5、1:10)来克服pcr的任何抑制。在m13通道[618-660]中观察到的决定因子错误或意外的非常低的荧光信号(在荧光标度上为<1单位)的任何证据(其不允许样品适合性的结论性评估)都被认为是“无样品的结果”，并表示在扩增或dna提取过程中失败。这需要重复测试。实施例12：有效测试会话中初始输出规范(ioos)样品结果的条件当样品在(i)细小病毒通道[533-580](即啮齿动物细小病毒探针vic信号)中的细小病毒dna扩增信号为阳性，其在荧光标度上的荧光信号高于1单位(对于两个重复孔中的至少一个)和(ii)在反义flagfam通道[465-510]中的pac扩增为阴性(表明没有来自pac的交叉污染)时，样品被认为是ioos。因此，技术人员必须(i)启动glif(通用实验室调查表)，(ii)通知将提交样品给qc病毒学进行测试的部门，(iii)启动noe，(iv)保存扩增管(-20℃冷冻)用于进一步研究(如flag序列筛选或测序)，(v)重复测定并重新测试样品。实施例13：重复和重新测试计划每当测定无效或样品结果被认为为“无结果”时，启动重复测试。进行重新测试以确认ioos事件(即第一次样品结果在细小病毒通道[533-580]中的dna扩增信号为阳性)。重新测试或重复测试必须使用新鲜的试剂等分试样(即mastermix试剂，提取试剂盒)进行。如果nac在任何通道中的荧光为阳性；采用新鲜制备mastermix使用已经纯化的dna样品，从扩增(pcr)步骤开始重复整个测试会话。如果nec在m13通道[618-660]中的荧光为阴性，则整个测试会话将从dna提取步骤开始重复。如果nec在细小病毒通道[533-580]或反义flag通道[465-510]中的荧光为阳性，则整个测试会话将从dna提取步骤开始重复。如果pac在任何通道中的荧光为阴性，则采用新鲜制备mastermix使用同样已经纯化的dna样品从扩增(pcr步骤)重复测试会话。对于具有“无样品”结果的那些样品，从dna提取步骤开始对受影响的样品重复测试会话。作为调查和问题解决过程的一部分，在dna提取之前，样品可以稀释(1:2、1:5或1:10)(除了未稀释的样品外)，以证明抑制剂的存在。使用以下四个分开的等分试样进行确认初始阳性结果(ioos)的重新测试如下：来自原始取样事件的两个等分试样(例如，最终进料后一天)和来自不同取样事件(例如如果可能的话，最终进料后两天)或不同的样品袋的两个等分试样。如果4等分试样的任何另外的测试导致阳性信号而没有确定性错误证据(通过调查证明)，则认为该批次不符合不存在啮齿动物细小病毒病毒基因组材料的要求。对于这种阳性q-pcr结果，必须进行感染性测定以进行最终处置。cho-k1细胞用作指示细胞系以确定检测到的核酸的感染状态。每当重新测试结果为阴性时，在不同的取样事件(例如最终进料后三天)需要验证性测试以确认啮齿动物细小病毒基因组材料的不存在。实施例14：对具有ioos的其它样品类型的重新测试计划其中包括例如未经处理的散装材料，生产结束的细胞，体外寿命极限的细胞和具有初始阳性结果(ioos)的大豆材料的其他样品类型使用四个分开的等分试样重新测试如下：根据标准操作程序重新测试来自原始样品容器(即，例如袋)的两个等分试样和来自不同样品容器的两个等分试样。将cho-k1指示剂细胞接种来自原始样品容器中的测试制品的一个样品等分试样。在按照标准操作程序培养1-3天后收获接种的指示细胞cho-k1，以确定检测到的核酸的感染状态。可以使用用于定量重新提取的核酸的标准曲线。每当四个等分试样的任何另外的pcr检测为阳性而没有确定性错误证据(通过调查证明)时，感染性测定确定了制品的最终处置。在确认初始oos后，可以考虑核酸的测序和透射电子显微镜(tem)，以鉴定微生物并排除任何实验室错误。需要使用cho-k1作为可疑污染材料的指示细胞的感染性测定来确定检测到的核酸的感染状态。每当调查未能支持细小病毒病毒污染的可能性，并且测试制品和chok1培养物的四个等分试样的另外的pcr检测均为阴性时，则该批次被认为符合不存在感染性啮齿动物细小病毒的要求。实施例15：重组蛋白生产过程中的细小病毒检测上述的q-pcr程序作为细胞培养液(即来自含有包含异源抗体重链和轻链构建体的cho细胞衍生物的生产生物反应器的未经处理的散装材料)测试的关键过程中(in-process)对照进行。每个异源单克隆抗体(mab)结合不同的靶或表位。qc病毒学科学家在大型生物工艺生产设施中进行了良好制造工艺(gmp)测试。这些测试中的十六(16)个列在表9中。在每种情况下，测试会话都是有效的，测定系统适用性标准已经被满足，并且没有观察到假阳性检测。在#13和#14的测试中，确实发生了假阴性检测，这表明存在pcr抑制剂或核酸提取失败。表9：啮齿动物细小病毒pcr测试upb＝未加工的散装材料；ea＝早期警报；rodentparvopcr＝上述q-pcr程序。序列表<110>瑞泽恩制药公司<120>用于检测生物污染物的组合物和方法<130>10107us01<140>pct/us16/24216<141>2016-03-25<150>us62/139,321<151>2015-03-15<160>37<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>dna<213>parvovirus<400>1tgcataaaagagtaacctcaccag24<210>2<211>18<212>dna<213>parvovirus<400>2actggatgatgatgcagc18<210>3<211>19<212>dna<213>parvovirus<400>3tgtcgatggcgaatggcta19<210>4<211>18<212>dna<213>parvovirus<400>4ccacctggttgagccatc18<210>5<211>20<212>dna<213>bacteriophagem13<400>5aagcctcagcgaccgaatat20<210>6<211>24<212>dna<213>bacteriophagem13<400>6tatgcgtgggcgatggttgttgtc24<210>7<211>22<212>dna<213>bacteriophagem13<400>7tcagcttgctttcgaggtgaat22<210>8<211>6407<212>dna<213>bacteriophagem13<400>8aacgctactactattagtagaattgatgccaccttttcagctcgcgccccaaatgaaaat60atagctaaacaggttattgaccatttgcgaaatgtatctaatggtcaaactaaatctact120cgttcgcagaattgggaatcaactgttacatggaatgaaacttccagacaccgtacttta180gttgcatatttaaaacatgttgagctacagcaccagattcagcaattaagctctaagcca240tccgcaaaaatgacctcttatcaaaaggagcaattaaaggtactctctaatcctgacctg300ttggagtttgcttccggtctggttcgctttgaagctcgaattaaaacgcgatatttgaag360tctttcgggcttcctcttaatctttttgatgcaatccgctttgcttctgactataatagt420cagggtaaagacctgatttttgatttatggtcattctcgttttctgaactgtttaaagca480tttgagggggattcaatgaatatttatgacgattccgcagtattggacgctatccagtct540aaacattttactattaccccctctggcaaaac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