利用撞击法同时收集及检测细菌及病毒的方法与流程

本发明涉及一种利用撞击法同时收集及检测细菌及病毒的方法，涉及一种利用撞击法同时收集及检测细菌及病毒的方法，其能够利用一种培养基同时收集及检测空气中的细菌及病毒。

背景技术：

近来，随着大气污染变得严重，室内空气中含有各种如病毒、大肠杆菌或霉菌等一样的病原菌，并且成为气味根源的各种有机物含量也在变高。

通常，就病毒而言，根据寄生的宿主分为植物病毒、动物病毒以及细菌病毒(噬菌体)，并且在大气中移动的病毒为0.02～0.2μm，尺寸非常小，研究起来很困难，并且不仅成为以多种形态给人和动物造成伤害的疾病的原因，而且根据不同的情况也会在经济上造成巨大损害。

在现有技术中，为了收集如上所述的病毒而通过如下方法实现：使得病毒感染于细胞单层(cellmonolayer)并制造病毒溶液，将所述病毒溶液施加于经过灭菌处理的固体培养基上后，计算混合于宿主(host)液体培养基并晃动后生成的噬斑数量，从而病毒收集作业通过多次作业实现，所以在病毒收集方面具有需要大量时间以及作业变得复杂的问题。

此外，现在使用的微生物采样方法中有撞击法、清洗法以及过滤法等，就所述撞击法的情况而言，为如下方法：安德森采样器(andersonsievesampler)将含有3％明胶的胰蛋白胨磷酸盐培养液放入皮氏培养皿，然后收集存在于空气所含有的粒子内的病毒，但是，所收集到的病毒的数量受限制且不是一定的，从而具有无法用作定量分析方法的问题。

此外，就清洗法的情况而言，有如下方法：将如聚乙二醇一样的病毒浓缩物质放入撞击滤尘器(impinger)内，以一定的流速抽吸空气，从而收集大气中的气溶胶病毒，但是，所述方法将在病毒浓缩物质中收集到的病毒放入经过灭菌的管中，并用滤纸过滤后，放入福尔马林，然后对病毒进行固定并收集，所以具有直到收集为止执行多次作业的问题。

此外，就过滤法的情况而言，使得明胶过滤器在培养基上部立刻溶解，在培养后计算出所形成的菌落(colony)并收集细菌，并且就病毒而言，使得明胶过滤器熔解于生理盐水或者0.1％蛋白胨溶液，利用搅拌磁铁使其充分溶解后，将用膜滤器过滤的溶液与宿主一起涂抹于培养基上部，在培养后计算出形成的噬斑(plaque)数量并收集病毒，从而具有执行多次作业的问题。

此外，目前，就想要在一个室内收集病毒和细菌的情况而言，使用如下方法：首先，将一种细菌(或者病毒)喷射到室内，在收集喷射的细菌(或者病毒)后，对腔室进行清洗(杀菌)，再次将又另一种病毒(或者细菌)喷射到室内，并收集所述病毒(或者细菌)，从而具有如下问题：为了在一个室内收集病毒和细菌，应至少反复实验两次相同的作业，所以需要很长的收集时间，并且腔室的清洗作业应单独地进行，所以需要很长的整体作业时间。

此外，为了掌握根据微生物种类的危险程度和暴露极限，需要在室内环境下对通过空气采样器的细菌和病毒进行收集，但是同时收集病毒和细菌的方法到目前为止都没能找到。

先行技术文献

(专利文献1)公开专利公报公开号特2003-0085829(2003.110.07)

(专利文献2)公开专利公报公开号10-2010-00584442(2010.05.25)

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用撞击法同时收集及检测细菌及病毒的方法，其能够一下子快速且简单地收集及检测空气中的细菌和病毒。

本发明作为利用一个试验室同时收集并检测细菌和病毒的方法，包括：喷射步骤，将涂抹有宿主菌的tsa(trypticsoyagar：胰蛋白胨大豆琼脂)培养基安装在试验室内的空气采样器，将病毒和又另一种细菌同时喷射到试验室内，病毒将涂抹于所述tsa培养基的宿主菌作为宿主，又另一种细菌并非所述病毒的宿主，其在涂抹有病毒的宿主菌的tsa培养基中形成菌落并能够区分；微生物收集步骤，利用空气采样器收集被喷射的细菌和病毒，并生成样品；培养步骤，培养利用所述空气采样器生成的样品并使得菌落形成；计算步骤，在培养步骤后，计算在样品中通过病毒感染来抑制细菌增殖而形成的噬斑(plaque)的数量，并且计算在样品中通过所收集的细菌的增殖而形成的喷射细菌的菌落(colony)的数量，就从tsa培养基收集细菌及病毒而言，利用空气采样器在tsa培养基中收集细菌及病毒。

本发明利用涂抹有宿主(host)的培养基通过撞击法同时收集细菌和病毒，通过一个试验样品可以计算噬斑的数量和菌落数量，噬斑形成有与宿主的菌落相接触的病毒，菌落形成有与培养基相接触的细菌。

本发明能够用简单的方法同时收集存在于空气中的细菌及病毒，从而快速地掌握大气中的病原性微生物状况并且预测移动，进而能够制定出针对此的应对方案。

本发明利用撞击法收集细菌和病毒，所以与现有的利用清洗法及过滤法的微生物收集相比，收集过程简单。

本发明在基于实际居住或生活空间的试验室内进行，所以能够进行相对于实际生活环境的准确的微生物检测(收集)。

本发明在基于实际居住或生活空间的试验室内进行微生物收集，所以可以适用于空气净化器的性能评价试验。

附图说明

图1是表示根据本发明的细菌和病毒收集过程的框例示图

图2是示出根据本发明的空气采样器的概念的例示图

图3是示出根据本发明的实施例的结果的照片例示图

图4是图3的“a”放大照片例示图

具体实施方式

图1是示出根据本发明的病毒和细菌的收集过程的框例示图，图2是示出根据本发明的空气采样器的概念的例示图。

本发明包括：喷射步骤，将涂抹有细菌的tsa培养基安装在试验室内的空气采样器，并且将病毒和又另一种细菌同时喷射到试验室内，病毒将涂抹于所述tsa培养基的细菌作为宿主，又另一种细菌并非所述病毒的宿主，其在涂抹有病毒的宿主菌的tsa培养基中形成菌落并能够区分；

微生物收集步骤，利用空气采样器收集被喷射的细菌和病毒，并生成样品；

培养步骤，培养利用所述空气采样器生成的样品并使得菌落形成；

计算步骤，在培养步骤后，计算在样品中通过病毒感染来抑制细菌增殖而形成的噬斑(plaque)的数量，并且计算在样品中通过所收集的细菌的增殖形成的喷射细菌的菌落(colony)的数量，

就从tsa培养基收集细菌及病毒而言，利用空气采样器在tsa培养基中收集细菌及病毒。

所述喷射步骤作为将想要收集的病毒和细菌同时喷射于一个试验室内的步骤，将涂抹有宿主菌的tsa培养基安装于试验室内的空气采样器，利用喷雾器将病毒和细菌喷射到试验室内。

所述试验室设置有基于实际居住或生活空间的30m³至120m³的封闭空间，在喷射微生物前，利用空气净化装置来清洁试验室内空气，空气净化装置设置有利用紫外灯进行的杀菌以及hepa(highefficiencyparticleair：高效空气)过滤器等，并且运转吊扇，对试验室内空气进行搅动的同时喷射微生物。

此时，就所喷射的病毒、细菌而言，分别事先对每ml病毒(pfu,plaqueformingunit：噬斑形成单位)数量和每ml细菌数量(cfu,colonyformingunit：菌落形成单位)进行定量，然后喷射，此时的液体培养基为蒸馏水或pbs(phosphatebuffersaline：磷酸缓冲盐)溶液。此外，设定为在室的容积不同的情况下喷射的量也不同，但是以用空气采样器收集病毒/细菌而培养的噬斑/菌落数不超过每培养基300cfu(pfu)的形式喷射。这意味着，优选地，试验者事先规定收集浓度，并以与收集量相符合的形式喷射所计算的浓度。

并没有特别地限定使用于所述喷射步骤的涂抹有宿主菌的tsa培养基的制造，但是所述涂抹有宿主菌的tsa培养基可以通过如下方式制造：在事先将宿主菌培养于液体培养基后，取约1ml与5ml的0.7％琼脂(agar)相混合并涂布于25ml的tsa上部。所述宿主菌的涂抹在净化工作台进行，净化工作台利用空气幕功能隔绝外部污染的可能性。

此时，在所述涂抹有宿主菌的tsa培养基的量为20ml以上且利用撞击法收集的情况下，优选地，使tsa培养基的量具备25ml。所述培养基的量不到20ml时，根据微生物的尺寸而在惯性力上显示出差异，所以收集效率会相对变低，因此如病毒一样，尺寸小时，为了提高收集效率，应增加培养基的量。据此，最为优选地，所述培养基的量具备25ml。

所述病毒及宿主细菌是指细菌病毒和属于所述细菌病毒的宿主的细菌，并非对其种类进行特别地限定。例如，所述细菌可以使用金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等等，并且将所述细菌作为宿主的病毒可以使用sa11、t3、phi-x174等等。

与所述病毒一起喷射的细菌是指不属于细菌病毒的宿主的其他的细菌，并且并非对其种类进行特别地限定。例如，所述细菌可以使用表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)、粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)等等。

所述phi-x174作为以大肠杆菌(escherichiacoli)为宿主(host)并进行增殖的0.027μm大小的细菌病毒，是构成为围绕核酸周围的外壳蛋白(衣壳)的dna噬菌体。所述大肠杆菌作为属于杆菌的肠道细菌的一种，大致为非病原性菌，并且栖息于人体及各种动物的肠内，也通过排泄物而广泛分布于自然界中。在革兰氏染色中呈阴性，并且尺寸是2～4μm。

所述粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)作为杆状的革兰氏阴性肠道细菌，通常对成人的呼吸器官、泌尿道及儿童的胃肠具有病原性，并丰富地存在于环境中，并且在湿气重的浴室增殖，形成粉红或朱黄色的薄膜。粘质沙雷氏菌是被分类为bl1(biosafetylevel：生物安全等级)等级的直径为0.4μm的细菌。

此时，所述喷雾器的喷射粒子尺寸及性能示出于下面的[表1]，phi-x174、大肠杆菌(escherichiacoli)、粘质沙雷氏菌(serratiamarcescens)如[表2]所示。

[表1]

[表2]

所述微生物收集步骤作为在涂抹有细菌的tsa培养基中同时收集将所述细菌作为宿主的病毒和一起被喷射的其他细菌的步骤，通过喷射步骤喷射微生物(病毒及细菌)后，使得吊扇停止，为了实现室内空气及喷射微生物的均质化，经过10～30分钟后，利用空气采样器进行的撞击法，即，使得喷射到试验室内的病毒和细菌撞击在涂抹有宿主菌的tsa培养基，从而生成样品。

在所述喷射步骤及病毒收集步骤中，试验室内的温湿度条件执行为温度23±3℃以及相对湿度50±5％。(但，相对湿度建议是不会使得噬菌体失活的湿度。)

所述培养步骤作为使得通过病毒和细菌的收集步骤收集的试验样品得到培养的步骤，在35℃好气性条件的恒温器中进行培养，在所述培养以后，被培养的样品内病毒和细菌的噬斑及菌落数量实现为落入每培养基50～200pfu(cfu)的范围，并且以在皮氏培养皿同时生成由病毒形成的噬斑和由细菌形成的菌落的形式进行培养。

就所述计算步骤而言，在通过培养而存在于皮氏培养皿的噬斑和菌落中，区分噬斑和细菌的菌落数量并计算，噬斑通过病毒来抑制宿主菌的增殖而生成，细菌的菌落进入撞击器的孔(hole)并且在tsa培养基上被收集并进行增殖。

换句话说，在涂抹有细菌的tsa培养基中收集将所述细菌作为宿主的病毒时，根据病毒的增殖与否来妨碍作为宿主的细菌的增殖，并在细菌的菌落生成孔，所以计算如上所述形成的噬斑(plaque)的数量。

此外，计算与病毒同时被喷射的细菌(不属于病毒的宿主的细菌)通过培养得到增殖而形成的菌落数量。

就如上所述构成的本发明的同时收集及检测细菌及病毒的方法而言，在涂抹有宿主菌的tsa中，利用撞击法同时收集将所述细菌作为宿主的病毒和其他细菌，所以能够简单且快速地执行在现有技术中分别独立地执行的两种微生物的收集。

以下，对本发明进行如下更为具体的说明。

实施例1

-试验宿主菌：大肠杆菌(escherichiacoli)

-涂抹有宿主菌的tsa培养基：25ml

-试验病毒：phi-x174

-试验细菌：粘质沙雷氏菌(sarratiamarcescens)

空气采样器：mas-100nt(merck公司产品，公称流量100l/min,采样容积:50l,头直径:10cm)

试验室：容积60m³，温度23±3℃，相对湿度50±5％

条件：为了用于收集的培养基的制造，将电源运转10分钟以上，从而从充分地隔绝外部污染的条件的净化工作台内取出事先准备好的1ml大肠杆菌培养液，并与5ml的0.7％琼脂相混合，并且涂布于25ml的tsa培养基上部，然后使其干燥到充分坚硬为止，准备好。将准备好的培养基安装于试验室内的空气采样器后退出试验室。在喷射细菌及病毒前，运转紫外灯进行杀菌，并使用空气净化装置(利用hepa过滤器单元进行过滤，利用空气调节设备进行温湿度调节)实现清洁。之后，使得吊扇运转约10分钟，同时利用喷雾器喷射phi-x174和粘质沙雷氏菌(sarratiamarcescens)，并进行均质化，然后，关掉吊扇，在使其停滞30分钟后，利用空气采样器进行收集。

将如上所述收集到的试验样品在35℃温度下以好气性条件在恒温器中进行24小时培养，并且观察根据phi-x174的增殖与否是否妨碍大肠杆菌的增殖从而形成噬斑、是否通过粘质沙雷氏菌(sarratiamarcescens)的增殖形成粉红色的菌落。

图3是表示针对本发明实施例1的结果的照片例示图，图4是图3的“a”放大照片例示图，随着噬菌体感染于宿主而抑制宿主的增殖，可以观察到，在被涂抹的黄色的大肠杆菌层生成噬斑。此外，可以观察到，利用撞击法在培养基上部收集到的细菌进行增殖，并根据孔(hole)形状生成圆形的粉红色的菌落。

本发明并非限定于所述特定的优选的实施例，当然，在没有脱离权利要求书中所要求的本发明的要旨的状态下，若是在该发明所属的技术领域具有一般知识的技术人员，则任何人都能够进行多种变形实施，与此相同的变更属于权利要求书所记载的范围内。