CRISPR杂合DNA/RNA多核苷酸及使用方法与流程

相关申请的交叉引用本申请主张2015年1月28日提交的美国临时专利申请序列号62/108,931和2015年11月5日提交的美国临时专利申请序列号62/251548(其中所有都通过引用并入本文)的权益。序列表本申请含有已经以ascii形式电子提交且在此以其整体通过引用并入的序列表。所述ascii拷贝，在2016年1月26日创建，命名为0198470101ptwo_sl.txt，且大小为83,522字节。背景集群固定间隔短回文重复(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,crispr)和crispr相关的(cas)系统是ishino在大肠杆菌中首次发现的原核免疫系统。ishino等人.1987(journalofbacteriology169(12):5429–5433(1987))。该免疫系统通过以序列特异性方式靶向病毒和质粒的核酸来提供针对病毒和质粒的免疫。有两个主要阶段参与该免疫系统：第一是获得，第二是干扰。第一阶段涉及切割入侵病毒和质粒的基因组，并将其区段整合至生物体的crispr基因座中。整合至基因组中的区段被称为原间隔区，且有助于保护生物体免于相同病毒或质粒的后续攻击。第二阶段涉及攻击入侵病毒或质粒。该阶段依赖于原间隔区被转录成rna，该rna在一些加工之后，然后与入侵病毒或质粒的dna中的互补序列杂交，同时还与有效切割dna的蛋白或蛋白复合物缔合。有几种不同的crispr/cas系统，并且这些的命名和分类随着系统的进一步表征而变化。在ii型系统中，存在两条rna链，crisprrna(crrna)和反式活化crisprrna(tracrrna)，其作为crispr/cas系统的一部分。tracrrna与前crrna的互补区域杂交，导致前crrna成熟为crrna。由tracrrna和crrna形成的双链体被蛋白cas9识别，并且与蛋白cas9缔合，所述蛋白cas9被与靶核酸中的序列互补并与之杂交的crrna的序列引导至靶核酸。已经表明，基于rna的免疫系统的这些最小组分可以被重新编程为通过使用单一蛋白和两个rna引导序列或单一rna分子以位点特异性方式靶向dna。crispr/cas系统优于涉及内切核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录活化物样效应子核酸酶(talen)(其可能需要每个新靶基因座的重新蛋白工程改造)的其它基因组编辑方法。作为rna引导的系统，crispr/cas系统可容易出现rna-dna杂交结构的问题，诸如rna链的rnasea降解和rna-dna错配的更高可能性。此外，dna寡核苷酸的合成比rna寡核苷酸的合成更经济和稳健。与天然存在的rna引导的crispr系统相比，dna引导的crispr系统还可以将额外机制募集至特定靶标。需要克服与基于rna的crispr/cas系统相关的问题的改进系统，获得降低的成本和增加的dna合成的稳健性，并改进crispr/cas系统的特异性。发明概述在一些实施方案中，本公开提供用于与2类crispr系统一起使用的单一多核苷酸，其包含：包含脱氧核糖核酸(dna)的靶向区域；和包含核糖核酸(rna)的活化区域。在一些实施方案中，所述靶向区域包含dna和rna的混合物；且所述活化区域包含dna、rna或dna和rna的混合物。在一些实施方案中，本公开提供用于与2类crispr系统一起使用的单一多核苷酸，其包含：包含脱氧核糖核酸(dna)的靶向区域；和包含与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(rna)的多核苷酸区域的活化区域。在一些实施方案中，所述靶向区域包含dna和rna的混合物；且所述活化区域包含dna、rna或dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的下游。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的上游。在一些实施方案中，所述活化区域包含选自下部茎、凸起、上部茎、连结(nexus)和发夹的结构。在一些实施方案中，所述活化区域包含茎环结构。在一些实施方案中，所述活化区域与cas9蛋白相互作用。在一些实施方案中，所述活化区域与cpf1蛋白相互作用。在一些实施方案中，本公开提供2类crispr系统，其包含：单一多核苷酸，其含有包含脱氧核糖核酸(dna)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域；与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(rna)的活化区域；和位点定向多肽。在一些实施方案中，所述核酸是dna，在一些实施方案中，所述核酸是rna，在一些实施方案中，所述核酸是rna和dna的混合物。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的下游。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的上游。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cas9蛋白。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cpf1蛋白。在一些实施方案中，所述活化区域包含选自下部茎、凸起、上部茎、连结和发夹的结构。在一些实施方案中，所述活化区域包含茎环结构。在一些实施方案中，所述活化区域与所述位点定向多肽相互作用。在一些实施方案中，所述活化区域包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述靶向区域包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述2类crispr系统还包含供体多核苷酸。在一些实施方案中，本公开提供2类crispr系统，其包含：第一多核苷酸，其包含(i)包含脱氧核糖核酸(dna)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域，和(ii)与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(rna)的活化区域；第二多核苷酸，其包含与所述第一多核苷酸的所述活化区域中的序列互补的序列；和位点定向多肽。在一些实施方案中，所述活化区域和所述第二多核苷酸杂交以形成选自下部茎、凸起、上部茎、连结和双链体的一种或多种结构。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cas9蛋白。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cpf1蛋白。在一些实施方案中，所述位点定向多肽与所述活化区域相互作用。在一些实施方案中，所述活化区域包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述第二多核苷酸包含rna、dna或dna和rna的混合物。在一些实施方案中，本公开提供用于与2类crispr系统一起使用的两个多核苷酸，其包含：第一多核苷酸，其包含(i)包含脱氧核糖核酸(dna)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域；和(ii)与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(rna)的活化区域；和第二多核苷酸，其包含与所述第一多核苷酸的所述活化区域中的序列互补的序列。在一些实施方案中，所述活化区域和所述第二多核苷酸杂交以形成选自下部茎、凸起、上部茎、连结和双链体的一种或多种结构。在一些实施方案中，所述靶向区域包含dna和rna的混合物，所述活化区域包含dna和rna的混合物，且所述第二多核苷酸包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，本公开提供修饰靶核酸分子的方法，所述方法包括：使具有靶序列的靶核酸分子与以下接触：单一多核苷酸，其含有包含脱氧核糖核酸(dna)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域；与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(rna)的活化区域；和位点定向多肽，其中所述单一多核苷酸与所述位点定向多肽形成复合物，且其中切割所述靶核酸分子或调节由所述靶核酸分子编码的至少一个基因的转录。在一些实施方案中，所述靶核酸是dna，在一些实施方案中，所述靶核酸是rna，在一些实施方案中，所述靶核酸是rna和dna的混合物。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的下游。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的上游。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cas9蛋白。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cpf1蛋白。在一些实施方案中，所述活化区域包含选自下部茎、凸起、上部茎、连结和发夹的结构。在一些实施方案中，所述活化区域包含茎环结构。在一些实施方案中，所述活化区域与所述位点定向多肽相互作用。在一些实施方案中，所述活化区域包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述靶向区域包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述方法还包括提供供体多核苷酸。在一些实施方案中，本公开提供修饰靶核酸分子的方法，所述方法包括：使具有靶序列的靶核酸分子与以下接触：第一多核苷酸，其包含(i)包含脱氧核糖核酸(dna)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域，和(ii)与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(rna)的活化区域；提供第二多核苷酸，其包含与所述第一多核苷酸的所述活化区域中的序列互补的序列，和位点定向多肽，其中所述第一和第二多核苷酸与所述位点定向多肽形成复合物，且其中切割所述靶核酸分子或调节由所述靶核酸分子编码的至少一个基因的转录。在一些实施方案中，所述活化区域和所述第二多核苷酸杂交以形成选自下部茎、凸起、上部茎、连结和双链体的一种或多种结构。在一些实施方案中，所述靶向区域包含dna和rna的混合物，所述活化区域包含dna和rna的混合物，且所述第二多核苷酸包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述方法还包括提供供体多核苷酸。在一些实施方案中，本公开提供用于降低使用2类crispr系统的脱靶修饰的方法，其包括：使具有靶序列的靶核酸分子与以下接触：单一多核苷酸，其含有包含脱氧核糖核酸(dna)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域；与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(rna)的活化区域；和位点定向多肽，其中所述单一多核苷酸与所述位点定向多肽形成复合物，且其中所述靶核酸分子在靶序列处比在靶核酸中的其它序列处更优先被切割或编辑，由此降低脱靶修饰。在一些实施方案中，所述靶核酸是dna，在一些实施方案中，所述靶核酸是rna，在一些实施方案中，所述靶核酸是rna和dna的混合物。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的下游。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的上游。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cas9蛋白。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cpf1蛋白。在一些实施方案中，所述活化区域包含选自下部茎、凸起、上部茎、连结和发夹的结构。在一些实施方案中，所述活化区域包含茎环结构。在一些实施方案中，所述活化区域与所述位点定向多肽相互作用。在一些实施方案中，所述活化区域包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述靶向区域包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述靶向区域不含尿嘧啶。在一些实施方案中，所述方法还包括提供供体多核苷酸。在一些实施方案中，本公开提供用于降低使用2类crispr系统的脱靶修饰的方法，其包括：使具有靶序列的靶核酸分子与以下接触：第一多核苷酸，其包含(i)包含脱氧核糖核酸(dna)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域，和(ii)与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(rna)的活化区域；提供第二多核苷酸，其包含与所述第一多核苷酸的所述活化区域中的序列互补的序列，和位点定向多肽，其中所述第一和第二多核苷酸与所述位点定向多肽形成复合物，且其中所述靶核酸分子在靶序列处比在靶核酸中的其它序列处更优先被切割或编辑，由此降低脱靶修饰。在一些实施方案中，所述靶核酸是dna，在一些实施方案中，所述靶核酸是rna，在一些实施方案中，所述靶核酸是rna和dna的混合物。在一些实施方案中，所述活化区域和所述第二多核苷酸杂交以形成选自下部茎、凸起、上部茎、连结和双链体的一种或多种结构。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cas9蛋白。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cpf1蛋白。在一些实施方案中，所述靶向区域包含dna和rna的混合物，所述活化区域包含dna和rna的混合物，且所述第二多核苷酸包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述靶向区域不含尿嘧啶。在一些实施方案中，所述方法还包括提供供体多核苷酸。在一些实施方案中，本公开提供用于增加使用2类crispr系统的靶标特异性修饰的方法，其包括：使具有靶序列的靶核酸分子与以下接触：单一多核苷酸，其含有包含脱氧核糖核酸(dna)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域；与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(rna)的活化区域；和位点定向多肽，其中所述单一多核苷酸与所述位点定向多肽形成复合物，且其中所述靶核酸分子在靶序列处比在靶核酸中的其它序列处更优先被切割或编辑，由此增加靶标特异性修饰。在一些实施方案中，所述靶核酸是dna，在一些实施方案中，所述靶核酸是rna，在一些实施方案中，所述靶核酸是rna和dna的混合物。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的下游。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的上游。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cas9蛋白。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cpf1蛋白。在一些实施方案中，所述活化区域包含选自下部茎、凸起、上部茎、连结和发夹的结构。在一些实施方案中，所述活化区域包含茎环结构。在一些实施方案中，所述活化区域与所述位点定向多肽相互作用。在一些实施方案中，所述活化区域包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述靶向区域包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述方法还包括提供供体多核苷酸。在一些实施方案中，本公开提供用于增加使用2类crispr系统的靶标特异性修饰的方法，其包括：使具有靶序列的靶核酸分子与以下接触：第一多核苷酸，其包含(i)包含脱氧核糖核酸(dna)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域，和(ii)与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(rna)的活化区域；提供第二多核苷酸，其包含与所述第一多核苷酸的所述活化区域中的序列互补的序列，和位点定向多肽，其中所述第一和第二多核苷酸与所述位点定向多肽形成复合物，且其中所述靶核酸分子在靶序列处比在靶核酸中的其它序列处更优先被切割或编辑，由此增加靶标特异性修饰。在一些实施方案中，所述靶核酸是dna，在一些实施方案中，所述靶核酸是rna，在一些实施方案中，所述靶核酸是rna和dna的混合物。在一些实施方案中，所述活化区域和所述第二多核苷酸杂交以形成选自下部茎、凸起、上部茎、连结和双链体的一种或多种结构。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cas9蛋白。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cpf1蛋白。在一些实施方案中，所述靶向区域包含dna和rna的混合物，所述活化区域包含dna和rna的混合物，且所述第二多核苷酸包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述靶向区域不含尿嘧啶。在一些实施方案中，所述方法还包括提供供体多核苷酸。在一些实施方案中，本公开提供使用2类crispr系统将供体多核苷酸引入细胞或生物体的基因组中的方法，其包括：使具有靶序列的靶核酸分子与以下接触：单一多核苷酸，其含有包含脱氧核糖核酸(dna)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域；与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(rna)的活化区域；和位点定向多肽，其中所述单一多核苷酸与所述位点定向多肽形成复合物，且其中所述靶核酸分子在靶序列处或其附近被切割，且提供在切割位点处引入细胞或生物体的基因组的供体多核苷酸。在一些实施方案中，所述靶核酸是dna，在一些实施方案中，所述靶核酸是rna，在一些实施方案中，所述靶核酸是rna和dna的混合物。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的下游。在一些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的上游。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cas9蛋白。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cpf1蛋白。在一些实施方案中，所述活化区域包含选自下部茎、凸起、上部茎、连结和发夹的结构。在一些实施方案中，所述活化区域包含茎环结构。在一些实施方案中，所述活化区域与所述位点定向多肽相互作用。在一些实施方案中，所述活化区域包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述靶向区域包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述供体多核苷酸通过同源重组引入核酸。在一些实施方案中，所述供体多核苷酸通过非同源末端连接引入核酸。在一些实施方案中，本公开提供使用2类crispr系统将供体多核苷酸引入细胞或生物体的基因组中的方法，其包括：使具有靶序列的靶核酸分子与以下接触：第一多核苷酸，其包含(i)包含脱氧核糖核酸(dna)且被配置为与核酸中的靶序列杂交的靶向区域，和(ii)与所述靶向区域相邻的包含核糖核酸(rna)的活化区域；提供第二多核苷酸，其包含与所述第一多核苷酸的所述活化区域中的序列互补的序列，和位点定向多肽，其中所述第一和第二多核苷酸与所述位点定向多肽形成复合物，且其中所述靶核酸分子在靶序列处或其附近被切割，且提供在切割位点处引入细胞或生物体的基因组的供体多核苷酸。在一些实施方案中，所述靶核酸是dna，在一些实施方案中，所述靶核酸是rna，在一些实施方案中，所述靶核酸是rna和dna的混合物。在一些实施方案中，所述活化区域和所述第二多核苷酸杂交以形成选自下部茎、凸起、上部茎、连结和双链体的一种或多种结构。在一些实施方案中，所述靶向区域包含dna和rna的混合物，所述活化区域包含dna和rna的混合物，且所述第二多核苷酸包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述活化区域与所述位点定向多肽相互作用。在一些实施方案中，所述活化区域包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述靶向区域包含dna和rna的混合物。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cas9蛋白。在一些实施方案中，所述位点定向多肽是cpf1蛋白。在一些实施方案中，所述供体多核苷酸通过同源重组引入核酸。在一些实施方案中，所述供体多核苷酸通过非同源末端连接引入核酸。在一些实施方案中，所述供体多核苷酸通过微同源性介导的末端连接引入。在一些实施方案中，所述供体多核苷酸通过单链退火引入。附图简述图1a显示ii型crispr系统的crd(r)na和tracrrna。图1b显示本公开的彼此杂交的两个多核苷酸(crd(r)na和tracrrna或tracrd(r)na)(也称为“双引导”系统)。图2显示本公开的包含与活化区域连接的靶向区域的单一多核苷酸(也称为“单一引导”系统或“单一引导d(r)na”或“sgd(r)na”)。图3显示使用本公开的核酸靶向多核苷酸用ii型crispr/cas系统切割靶dna序列。图4a和b显示测定使用本公开的核酸靶向多核苷酸通过ii型crispr/cas系统的各种靶序列的切割量的体外生物化学测定的结果。图5显示测定使用本公开的核酸靶向多核苷酸通过ii型crispr/cas系统的靶序列的切割量的体外测定的结果。图6显示测定使用本公开的核酸靶向多核苷酸通过ii型crispr/cas系统的靶序列的脱靶切割量的体外生物化学测定的结果。图7显示测定使用本公开的核酸靶向多核苷酸通过ii型crispr/cas系统的靶序列的切割量的体外测定的结果。图8显示crd(r)na或sgd(r)na与cas9-d10a蛋白针对质粒靶标的体外切口活性的结果。图9显示来自v型crispr系统的crrna的典型结构。图10a-c显示用于与v型crispr系统一起使用的本公开的单一引导d(r)na的可能结构。图11a-e显示用于与v型crispr系统一起使用的本公开的单一引导d(r)na的可能结构。图12a-i显示用于与v型crispr系统一起使用的本公开的包含crrna和/或crd(r)na的双引导的可能组分。图13a-h显示用于与v型crispr系统一起使用的本公开的包含crrna和/或crd(r)na的双引导的可能构型。图14a-b显示测定使用本公开的核酸靶向多核苷酸通过ii型crispr/cas系统的靶序列的切割量的原位(inplanta)测定的测序结果。详述crispr/cas系统最近被重新分为两类，包含五种类型和十六种亚型。makarova等人(naturereviewsmicrobiology13:1-15(2015))。该分类基于鉴定crispr/cas基因座中的所有cas基因，然后确定每个crispr/cas基因座中的特征基因，最终确定crispr/cas系统可以基于编码效应子模块(即参与干扰阶段的蛋白)的基因置于1类或2类中。1类系统具有多亚基crrna-效应子复合物，而2类系统具有单一蛋白，诸如cas9、cpf1、c2c1、c2c2、c2c3或crrna-效应子复合物。1类系统包含i型、iii型和iv型系统。2类系统包含ii型和v型系统。i型系统都具有cas3蛋白，其具有解旋酶活性和切割活性。i型系统进一步分为七种亚型(i-a至i-f和i-u)。每种i型亚型具有特征基因和操纵子组织的不同特征的定义组合。例如，亚型i-a和i-b似乎具有组织在两个或更多个操纵子中的cas基因，而亚型i-c至i-f似乎具有由单一操纵子编码的cas基因。i型系统具有参与crispr/cas免疫系统的加工和干扰阶段的多蛋白crrna-效应子复合物。该多蛋白复合物被称为抗病毒防御的crispr-相关复合物(cascade)。亚型i-a包含编码小亚基蛋白的csa5和被分成两个编码降解的大和小亚基且还具有分开的cas3基因的cas8基因。具有亚型i-acrispr/cas系统的生物体的实例是闪烁古生球菌(archaeoglobusfulgidus)。亚型i-b具有cas1–cas2–cas3–cas4–cas5–cas6–cas7–cas8基因排列，且缺乏csa5基因。具有亚型i-b的生物体的实例是克氏梭状芽胞杆菌(clostridiumkluyveri)。亚型i-c不具有cas6基因。具有亚型i-c的生物体的实例是耐盐芽孢杆菌(bacillushalodurans)。亚型i-d具有cas10d，而非cas8。具有亚型i-d的生物体的实例是蓝丝菌属(cyanothecesp.)。亚型i-e不具有cas4。具有亚型i-e的生物体的实例是大肠杆菌。亚型i-f不具有cas4且具有与cas3融合的cas2。具有亚型i-f的生物体的实例是假结核耶尔森菌(yersiniapseudotuberculosis)。具有亚型i-u的生物体的实例是金属还原地杆菌(geobactersulfurreducens)。所有iii型系统都具有cas10基因，其编码含有palm结构域(rna识别基序(rrm)的变体)的多结构域蛋白，所述palm结构域与许多核酸聚合酶和环化酶的核心结构域同源并且是iii型crrna-效应子复合物的最大亚基。所有iii型基因座也编码小亚基蛋白，一种cas5蛋白和通常几种cas7蛋白。iii型可以进一步分为四种亚型iii-a至iii-d。亚型iii-a具有编码小亚基的csm2基因，并且还具有cas1、cas2和cas6基因。具有亚型iii-a的生物体的实例是表皮葡萄球菌(staphylococcusepidermidis)。亚型iii-b具有编码小亚基的cmr5基因，并且通常还缺乏cas1、cas2和cas6基因。具有亚型iii-b的生物体的实例是激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)。亚型iii-c具有具有无活性环化酶样结构域的cas10蛋白，且缺乏cas1和cas2基因。具有亚型iii-c的生物体的实例是热自养甲烷热杆菌(methanothermobacterthermautotrophicus)。亚型iii-d具有缺乏hd结构域的cas10蛋白，其缺乏cas1和cas2基因，并且具有称为csx10的cas5样基因。具有亚型iii-d的生物体的实例是玫瑰弯菌属(roseiflexussp.)。iv型系统编码最小多亚基crrna-效应子复合物，其包含部分降解的大亚基csf1、cas5、cas7，且在一些情况下，推定的小亚基。iv型系统缺乏cas1和cas2基因。iv型系统不具有亚型，但存在两种不同的变体。一种iv型变体具有ding家族解旋酶，而第二种iv型变体缺乏ding家族解旋酶，但具有编码小α螺旋蛋白的基因。具有iv型系统的生物体的实例是氧化亚铁硫杆菌(acidithiobacillusferrooxidans)。ii型系统具有cas1、cas2和cas9基因。cas9编码组合crrna-效应子复合物的功能与靶dna切割的多结构域蛋白。ii型系统也编码tracrrna。ii型系统进一步分为三种亚型，亚型ii-a、ii-b和ii-c。亚型ii-a含有额外基因csn2。具有亚型ii-a系统的生物体的实例是嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)。亚型ii-b缺乏csn2，但具有cas4。具有亚型ii-b系统的生物体的实例是嗜肺军团杆菌(legionellapneumophila)。亚型ii-c是细菌中发现的最常见的ii型系统，且只有三种蛋白cas1、cas2和cas9。具有亚型ii-c系统的生物体的实例是乳糖奈瑟氏菌(neisserialactamica)。v型系统具有cpf1基因和cas1和cas2基因。cpf1基因编码蛋白cpf1，其具有与cas9的相应结构域同源的ruvc样核酸酶结构域，但缺乏存在于cas9蛋白中的hnh核酸酶结构域。已经在几种细菌中鉴定了v型系统，所述细菌包括parcubacteria细菌gwc2011_gwc2_44_17(pbcpf1)、毛螺菌科细菌mc2017(lb3cpf1)、proteoclasticus丁酸弧菌(butyrivibrioproteoclasticus)(bpcpf1)、peregrinibacteria细菌gw2011_gwa_33_10(pecpf1)、氨基酸球菌属(acidaminococcussp.)bv3l6(ascpf1)、猕猴卟啉单胞菌(porphyromonasmacacae)(pmcpf1)、毛螺菌科细菌nd2006(lbcpf1)、狗口腔卟啉单胞菌(porphyromonascrevioricanis)(pccpf1)、解糖胨普雷沃氏菌(prevotelladisiens)(pdcpf1)、bovoculi莫拉氏菌237(mbcpf1)、密斯氏菌属sc_k08d17(sscpf1)、稻田钩端螺旋体(leptospirainadai)(licpf1)、毛螺菌科细菌ma2020(lb2cpf1)、新凶手弗朗西斯氏菌(franciscellanovicida)u112(fncpf1)、candidatusmethanoplasmatermitum(cmtcpf1)和挑剔真杆菌(eubacteriumeligens)(eecpf1)。在1类系统中，表达和干扰阶段涉及多亚基crisprrna(crrna)–效应子复合物。在2类系统中，表达和干扰阶段涉及单个大蛋白，例如cas9、cpf1、c2c1、c2c2或c2c3。在1类系统中，前crrna与多亚基crrna-效应子复合物结合并加工成成熟的crrna。在i型和iii型系统中，这涉及rna内切核酸酶，例如，cas6。在2类ii型系统中，前crrna与cas9结合，并在涉及rnaseiii和tracrrna的步骤中加工成成熟的crrna。然而，在至少一种ii型crispr-cas系统(脑膜炎奈瑟氏菌的系统)中，具有成熟的5'末端的crrna从内部启动子直接转录，并且不发生crrna加工。在1类系统中，crrna与crrna-效应子复合物缔合，并通过组合核酸酶活性与rna-结合结构域和crrna与靶核酸之间的碱基对形成来实现干扰。在i型系统中，crrna-效应子复合物的crrna和靶标结合涉及与小亚基蛋白融合的cas7、cas5和cas8。i型系统的靶核酸切割涉及hd核酸酶结构域，其与超家族2解旋酶cas3'融合或由单独的基因cas3''编码。在iii型系统中，crrna-效应子复合物的crrna和靶标结合涉及cas7、cas5、cas10和小亚基蛋白。iii型系统的靶核酸切割涉及cas7和cas10蛋白的组合作用，其具有与cas10融合的独特的hd核酸酶结构域，所述cas10被认为在干扰期间切割单链dna。在2类系统中，crrna与单一蛋白缔合，并通过组合核酸酶活性与rna-结合结构域和crrna与靶核酸之间的碱基对形成来实现干扰。在ii型系统中，crrna和靶标结合涉及cas9，如同靶核酸切割一样。在ii型系统中，cas9的ruvc样核酸酶(rnaseh折叠)结构域和hnh(mcra样)核酸酶结构域各自切割靶核酸的一条链。ii型系统的cas9切割活性还需要crrna与tracrrna杂交以形成便于cas9的crrna和靶标结合的双链体。在v型系统中，crrna和靶标结合涉及cpf1，如同靶核酸切割一样。在v型系统中，cpf1的ruvc样核酸酶结构域以交错构型切割靶核酸的两条链，产生5'突出端，其与由cas9切割产生的平末端相反。这些5'突出端可以便于通过非同源末端连接方法插入dna。v型系统的cpf1切割活性也不需要crrna与tracrrna的杂交以形成双链体，反而v型系统的crrna使用具有形成内部双链体的茎环结构的单一crrna。cpf1以序列和结构特异性方式结合crrna，其识别茎环和与茎环邻近的序列，最显著地，与靶核酸杂交的间隔区序列的核苷酸5'。该茎环结构通常长度为15至19个核苷酸的范围。破坏该茎环双链体的取代废除切割活性，而不破坏茎环双链体的其它取代不会废除切割活性。在v型系统中，crrna在5'末端形成茎环结构，且3'末端的序列与靶核酸中的序列互补。与v型crrna和靶标结合和切割相关的其它蛋白包括2类候选1(c2c1)和2类候选3(c2c3)。c2c1和c2c3蛋白的长度与cas9和cpf1蛋白相似，范围为约1,100个氨基酸至约1,500个氨基酸。c2c1和c2c3蛋白也含有ruvc-样核酸酶结构域，且具有类似于cpf1的结构。c2c1蛋白在需要crrna和tracrrna用于靶标结合和切割的方面与cas9蛋白相似，但具有50℃的最佳切割温度。c2c1蛋白靶向富含at的pam，其与cpf1相似，是靶序列的5'，参见例如，shmakov等人(molecularcell;60(3):385–397(2015))。2类候选2(c2c2)不与其它crispr效应子蛋白共享序列相似性，因此可能在推定的vi型系统中。c2c2蛋白具有两个hepn结构域，并且被预测为具有rnase活性，因此可靶向和切割mrna。c2c2蛋白似乎在需要crrna用于靶标结合和切割、而不需要tracrrna的方面与cpf1蛋白相似。也像cpf1一样，c2c2蛋白的crrna形成稳定的发夹或茎环结构，其可有助于与c2c2蛋白缔合。如本文所用，“位点定向多肽”是指在具有本文公开的多核苷酸的crispr系统中使用的单一蛋白或蛋白复合物。位点定向多肽可以包含一个或多个核酸酶结构域。本公开的位点定向多肽可以包含hnh或hnh样核酸酶结构域、ruvc或ruvc样核酸酶结构域和/或hepn-超家族样核酸酶。hnh或hnh样结构域可以包含mcra样折叠。hnh或hnh样结构域可以包含两个反向平行的β-链和α-螺旋。hnh或hnh样结构域可以包含金属结合位点(例如，二价阳离子结合位点)。hnh或hnh样结构域可以切割靶核酸的一条链(例如，crrna靶向链的互补链)。包含hnh或hnh样结构域的蛋白可以包括内切核酸酶、大肠杆菌素、限制性内切核酸酶、转座酶和dna包装因子。位点定向多肽可以是cas9蛋白、cpf1蛋白、c2c1蛋白、c2c2蛋白、c2c3蛋白、cas3、cas5、cas7、cas8、cas10或这些的复合物，其取决于所使用的具体crispr系统。在一些实施方案中，所述位点定向多肽可以是cas9或cpf1蛋白。在一些实施方案中，具有降低的核酸酶活性的位点定向多肽可以是切口酶，即其可以被修饰以切割靶核酸双链体的一条链。在一些实施方案中，位点定向多肽可以被修饰为不具有核酸酶活性，即其不切割靶核酸双链体的任何链或靶核酸的任何单链。具有降低的或没有核酸酶活性的位点定向多肽的实例可以包括具有对hnh和/或ruvc核酸酶结构域的修饰的cas9和对ruvc核酸酶结构域的修饰的cpf1。此类修饰的非限制性实例可以包括对新凶手弗朗西斯氏菌cpf1的ruvc核酸酶结构域的d917a、e1006a和d1225a，和化脓性链球菌cas9的残基d10、g12、g17、e762、h840、n854、n863、h982、h983、a984、d986和/或a987的改变，以及它们在其它cpf1和cas9蛋白中的相应氨基酸残基。在一些实施方案中，可以修饰位点定向多肽。此类修饰可以包括将结构域从另一多肽引入或融合至位点定向多肽，或用另一多肽的结构域替代位点定向多肽的结构域。例如，修饰的位点定向多肽可以含有来自cas9或cpf1蛋白的第一结构域和来自除cas9或cpf1之外的蛋白的第二结构域。在修饰的位点定向多肽中包括此类结构域的修饰可以对修饰的位点定向多肽赋予额外活性。此类活性可以包括核酸酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、dna修复活性、dna损伤活性、脱氨基活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性、糖基化酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、去泛素化活性、腺苷酸化活性、脱腺苷化活性、sumo化活性、去sumo化活性、核糖基化活性、脱核糖基化活性、肉豆蔻酰化活性或脱肉豆蔻酰化活性)，其修饰与靶核酸相关的多肽(例如组蛋白)。在一些实施方案中，位点定向多肽可以在核酸序列(例如基因组dna)中引入双链断裂或单链断裂。在某些实施方案中，核酸序列可以是靶核酸。本公开的某些位点定向多肽可以引入平端切割位点，而某些实施方案产生具有粘性末端(即5'或3'突出端)的切割位点。例如，cpf1可以引入具有约4或5个核苷酸(nt)5'突出端的交错的dna双链断裂。双链断裂可以刺激细胞的内源性dna修复途径(例如，同源重组和非同源末端连接(nhej)或替代的非同源末端连接(a-nhej))。nhej可以修复切割的靶核酸而不需要同源模板。这可以导致靶核酸的缺失。同源重组(hr)可以与同源模板一起发生。同源模板可以包含与侧接靶核酸切割位点的序列同源的序列。在通过位点定向多肽切割靶核酸之后，可以破坏切割位点(例如，用核酸靶向多核苷酸和位点定向多肽的另一轮切割不能接近该位点)。在一些情况下，同源重组可以将外源多核苷酸序列插入靶核酸切割位点。外源多核苷酸序列可被称为供体多核苷酸或供体序列。在一些实施方案中，可以将供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分、供体多核苷酸的拷贝或供体多核苷酸的拷贝的一部分插入靶核酸切割位点。供体多核苷酸可以是外源多核苷酸序列。供体多核苷酸可以是单链dna。供体多核苷酸可以是双链dna。供体多核苷酸可以是rna。供体多核苷酸可以是rna和dna的双链体。供体多核苷酸可以是在靶核酸切割位点处不天然存在的序列。在一些实施方案中，由于nhej和/或hr导致的靶核酸的修饰可以导致例如突变、缺失、改变、整合、基因校正、基因替换、基因标记、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏和/或基因突变。将非天然核酸整合至基因组dna中的过程可以被称为“基因组工程改造”。本公开的crispr系统可以被称为“dna引导的crispr系统”。本公开的crispr系统可以被编程为使用两个核酸靶向多核苷酸(“双引导”)切割靶核酸。在一些实施方案中，双引导crispr系统可以包括crispr-d(r)na(crd(r)na)和反式活化crisprrna(tracrrna)，例如包含dna和rna两者的一种多核苷酸和包含rna的第二多核苷酸。在一些实施方案中，双引导系统可以包括crd(r)na和tracrd(r)na，例如包含dna和rna两者的一种多核苷酸和包含dna和rna两者的第二多核苷酸。crd(r)na和tracrd(r)na或tracrrna元件可以通过融合区域(例如，接头)连接并合成为单一元件(例如，sgd(r)na)，如图2中所示(“单一引导”)。如本文所用，术语“crd(r)na”是指包含靶向区域和活化区域的多核苷酸，其中所述靶向区域包含dna或dna和rna，并且其中所述活化区域包含rna或dna，或dna和rna的混合物。在某些实施方案中，靶向区域在活化区域的上游。在某些实施方案中，活化区域在靶向区域的上游。在一些实施方案中，tracrrna包含与crd(r)na的活化区域中的序列互补的序列。如本文所用，术语“tracrd(r)na”是指具有与crd(r)na的活化区域中的序列互补的序列的多核苷酸，且其中所述多核苷酸包含dna或dna和rna的混合物。如本文所用，术语“靶向区域”是指包含dna或dna和rna的混合物的多核苷酸的区域，其与靶核酸中的序列互补。在某些实施方案中，靶向区域还可以包含其它核酸或核酸类似物或其组合。在某些实施方案中，靶向区域可以仅由dna构成，因为该构型可能不太可能在宿主细胞内分解。在一些实施方案中，该构型可以增加靶序列识别的特异性和/或减少脱靶结合/杂交的发生率。如本文所用，术语“活化区域”是指包含rna或dna或dna和rna的混合物的多核苷酸的一部分，其与位点定向多肽相互作用或能够与之缔合或结合。在某些实施方案中，活化区域还可以包含其它核酸或核酸类似物或其组合。在某些实施方案中，活化区域与靶向区域相邻。在某些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的下游。在某些实施方案中，所述活化区域在所述靶向区域的上游。如本文所用，术语“sgd(r)na”或“单一引导d(r)na”是指包含靶向区域和活化区域的多核苷酸，其中所述靶向区域包含dna、rna或dna和rna的混合物，其与靶核酸中的序列互补，其中所述活化区域包含rna或dna或dna和rna的混合物，其中所述靶向区域或活化区域或两者都包含至少一个dna核苷酸，且其中所述活化区域具有自身互补的序列，其杂交以形成双链体，其可含有二级结构。单一引导d(r)na的实例可以由crd(r)na和tracrd(r)na或tracrrna构建，其中crd(r)na和tracrd(r)na或crd(r)na和tracrrna通过核苷酸序列连接，所述核苷酸序列可以是dna、rna或dna和rna的混合物。如本文所用，术语“下游”是指远离核苷酸序列的3'方向的参考点的点。如本文所用，术语“上游”是指远离核苷酸序列的5'方向的参考点的点。本公开的多核苷酸，例如，crd(r)na、tracrd(r)na或单一引导d(r)na还可以包含dna和其它核酸(例如肽核酸(pna)，或其它核酸类似物)的混合物。本公开提供使用如本文公开的任何长度的单一引导d(r)na、crd(r)na、tracrd(r)na和/或tracrrna以及多核苷酸的组合，其支持位点定向多肽对靶核酸的可编程的切割和/或修饰。图1a显示用于ii型crispr系统中的多核苷酸。在该实施方案中，101可以是crd(r)na，且102可以是tracrd(r)na或tracrrna。图1b显示图1a的沿着互补区域彼此杂交的多核苷酸。杂交可以生成二级结构，诸如凸起105、靶向区域103、连结107和发夹108和109。图1b还显示包含上部双链体区域106和下部双链体区域104的实施方案。上部双链体区域可以包含上部茎。下部双链体区域可以包含下部茎。在某些实施方案中，杂交以形成区域104的多核苷酸可以包含在靶向区域103的下游区域中相同多核苷酸链(例如102)上的dna和rna的混合物。在某些实施方案中，如图1b中所示的区域104可以包含相同多核苷酸链(例如102)上的dna和rna的混合物。靶向区域的紧邻下游的核苷酸序列可以包含不同比例的dna和rna。在某些实施方案中，该比例可以是5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100％rna或其之间的范围。如本文所述，靶向区域103的下游核苷酸序列(例如，如图1b中所示的靶向区域103和凸起105之间的区域)可以包含dna和rna的混合物，如seqidno.19-26中所示。图2显示用于与ii型crispr系统一起使用的单一引导d(r)na的实例。参考图2，该实施方案包含靶向区域201、下部双链体区域202、上部双链体区域203、融合体区域204、二级结构(例如，凸起)205、连结206和发夹207和208。上部双链体区域可以包含上部茎。下部双链体区域可以包含下部茎。一些实施方案可以包含活化区域，其包含上部双链体区域和下部双链体区域。在一些实施方案中，区域202可以包含dna和rna的混合物，其在靶向区域201的紧邻下游。靶向区域的紧邻下游的核苷酸序列可以包含不同比例的dna和rna。在某些实施方案中，该比例可以是5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100％rna或其之间的范围。如本文所述，靶向区域201的下游核苷酸区域(例如，如图2中所示的靶向区域201和凸起205之间的区域)可以包含dna和rna的混合物，如seqidno.127-132中所示。在一些实施方案中，区域203可以包含dna和rna的混合物，其在靶向区域201的下游。靶向区域的下游的核苷酸序列可以包含不同比例的dna和rna。在某些实施方案中，该比例可以是5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100％rna或其之间的范围。如本文所述，靶向区域201下游的核苷酸区域可以包含dna和rna的混合物，如seqidno.44-47和129中所示。在某些实施方案中，活化区域可以包含至少一个二级结构。二级结构可以是下部茎、上部茎、凸起、连结、发夹、这些中的一个或多个及其组合。在某些实施方案中，活化区域包含凸起。图1b显示由双引导系统产生的二级结构，即与tracrd(r)na杂交的crd(r)na或与tracrrna杂交的crd(r)na，包括下部茎104、凸起105、上部茎106、连结107和发夹，例如108。二级结构还可以包括额外类型的结构。二级结构的定位和数量没有特别限制，并且可以根据在crispr系统中使用何种位点定向多肽来改变。在某些实施方案中，活化区域可以包含核苷酸区域，其包含下部茎、上部茎和凸起。在某些实施方案中，仅可存在凸起。在某些实施方案中，凸起可以在下部茎和上部茎之间。某些实施方案可以省略上部茎。术语“上部茎”和“下部茎”可以在本文中仅用于参考活化区域的所示位置，并且不一定意图将这些区域限于任何特定结构、二级结构或定位。例如，图1b显示定位在凸起和间隔区之间的下部茎104。在某些实施方案中，靶向区域可以包含间隔区。在一些实施方案中，下部茎中的靶向区域下游的核苷酸序列可以具有作为5'gyyyur的序列，其中y是c或u/t，且r是a或g。在一些实施方案中，下部茎中的靶向区域下游的核苷酸序列可以具有作为5'guuuuugu的序列。在一些实施方案中，下部茎中的靶向区域下游的核苷酸序列可以具有作为5'guuuua的序列。在一些实施方案中，下部茎中的核苷酸可以是rna或dna或dna和rna的混合物。在某些实施方案中，二级结构可以包含凸起。凸起可以是指双链体中核苷酸的未配对区域。在某些实施方案中，单一引导d(r)na可以包含凸起。用于crispr系统中使用的多核苷酸的某些实施方案可以包含二级结构，且所述二级结构是四环(tetraloop)。包含凸起的单一引导d(r)na可以包含双链体的5'侧和3'侧。参考图2，例如，双链体的5'侧可以是指204的上游(即，在5'方向上)的区域，且双链体的3'侧可以是指204的下游(即，在3'方向上)的区域。在某些实施方案中，活化区域包含凸起。在一些实施方案中，凸起可以参与与位点定向多肽的结合或与其相互作用。凸起可以在双链体的一侧上包含未配对的5'-rrrz-3'，其中r是任何嘌呤，且z可以是可以与双链体的相反链上的核苷酸以及双链体的另一侧上的未配对的核苷酸区域形成摆动对的核苷酸。凸起可以包含dna、rna及其混合物。凸起可以在凸起双链体的5'侧上包含dna、rna或其混合物，并且可以在凸起的3'侧包含dna、rna或其混合物。在某些实施方案中，用于crispr系统中使用的多核苷酸可以包含靶向区域和活化区域，且凸起双链体的靶向区域侧可以包含dna、rna及其混合物，且凸起双链体的活化区域侧可以含有dna、rna及其混合物。例如，在一个实施方案中，更接近于多核苷酸的5'末端的凸起侧可以包含rna，且更接近于多核苷酸的3'末端的凸起侧可以包含rna。在某些实施方案中，凸起侧可以包含比凸起的另一侧更少的核苷酸。在某些实施方案中，用于与crispr系统一起使用的多核苷酸包含具有5'方向和3'方向的多核苷酸，并且包含具有5'侧和3'侧的凸起，且5'侧可以包含dna和/或rna，且3'侧可以包含rna。在某些实施方案中，用于与crispr系统一起使用的多核苷酸包含具有5'方向和3'方向的多核苷酸，并且包含具有5'侧和3'侧的凸起，且5'侧可以包含dna和/或rna，且3'侧可以包含rna，且3'侧可以具有比所述凸起的5'侧更多的核苷酸。在一些实施方案中，用于crispr系统中使用的多核苷酸可以包含crd(r)na和tracrd(r)na，且凸起双链体的crd(r)na侧可以包含dna、rna及其混合物，其包含两个核苷酸；且凸起双链体的tracrd(r)na侧可以含有dna、rna及其混合物。在一些实施方案中，用于crispr系统中使用的多核苷酸可以包含crd(r)na和tracrrna，且凸起双链体的crd(r)na侧可以包含dna、rna及其混合物，其包含两个核苷酸；且凸起双链体的tracrrna侧可以含有多于两个核苷酸。例如，凸起可以在凸起侧上包含未配对的嘌呤(例如，腺嘌呤)。在一些实施方案中，凸起可以在凸起侧上包含未配对的5'-aagz-3'，其中z可以是可以与凸起的另一侧上的核苷酸形成摆动配对的核苷酸。在双链体的第一侧(例如朝向用于crispr系统中使用的多核苷酸的5'末端的一侧)上的凸起可以包含至少1、2、3、4或5个或更多个未配对的核苷酸。在双链体的第一侧(例如朝向用于crispr系统中使用的多核苷酸的5'末端的一侧)上的凸起可以包含至多1、2、3、4或5个或更多个未配对的核苷酸。在双链体的第一侧(例如朝向用于crispr系统中使用的多核苷酸的5'末端的一侧)上的凸起可以包含1个未配对的核苷酸。在双链体的第二侧(例如，双链体的tracrrna或tracrd(r)na侧)上的凸起可以包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配对的核苷酸。在双链体的第二侧(例如，双链体的tracrrna或tracrd(r)na侧)上的凸起可以包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个未配对的核苷酸。在双链体的第二侧(例如，双链体的tracrrna或tracrd(r)na侧)上的凸起可以包含4个未配对的核苷酸。双链体的每条链上的不同数量的未配对的核苷酸的区域可以配对在一起。某些实施方案可以包含二级结构，其包含凸起，其中所述凸起不形成双链体。凸起可以包含来自第一链的5个未配对的核苷酸和来自第二链的1个未配对的核苷酸。凸起可以包含来自第一链的4个未配对的核苷酸和来自第二链的1个未配对的核苷酸。凸起可以包含来自第一链的3个未配对的核苷酸和来自第二链的1个未配对的核苷酸。凸起可以包含来自第一链的2个未配对的核苷酸和来自第二链的1个未配对的核苷酸。凸起可以包含来自第一链的1个未配对的核苷酸和来自第二链的1个未配对的核苷酸。凸起可以包含来自第一链的1个未配对的核苷酸和来自第二链的2个未配对的核苷酸。凸起可以包含来自第一链的1个未配对的核苷酸和来自第二链的3个未配对的核苷酸。凸起可以包含来自第一链的1个未配对的核苷酸和来自第二链的4个未配对的核苷酸。凸起可以包含来自第一链的1个未配对的核苷酸和来自第二链的5个未配对的核苷酸。在某些实施方案中，未配对的二级结构可以在多核苷酸的crd(r)na侧上形成。在某些实施方案中，未配对的二级结构可以在多核苷酸的crd(r)na侧上形成，并且还可以包含在tracrrna或tracrd(r)na侧上的未配对的二级结构。在此实施方案中，这些二级结构可以是凸起。在某些实施方案中，当指二级结构时，术语“未配对”可以意味着二级结构不是双链体的形式。在一些情况下，凸起可以包含至少一个摆动配对。在一些情况下，凸起可以包含至多一个摆动配对。凸起序列可以包含至少一个嘌呤核苷酸。凸起序列可以包含至少3个嘌呤核苷酸。凸起序列可以包含至少5个嘌呤核苷酸。凸起序列可以包含至少一个鸟嘌呤核苷酸。凸起序列可以包含至少一个腺嘌呤核苷酸。凸起序列可以包含尿嘧啶。二级结构可以包含dna、rna及其组合。在某些实施方案中，二级结构可以形成双链体结构，且所述双链体结构可以包含凸起，其包含dna和rna。tracrd(r)na序列可以具有约6个核苷酸至约150个核苷酸的长度。例如，tracrd(r)na序列可以具有约6个核苷酸(nt)至约50nt、约6nt至约40nt、约6nt至约30nt、约6nt至约25nt、约6nt至约20nt、约6nt至约15nt、约8nt至约40nt、约8nt至约30nt、约8nt至约25nt、约8nt至约20nt或约8nt至约15nt、约15nt至约150nt、约15nt至约130nt、约15nt至约100nt、约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt的长度。在一些实施方案中，tracrd(r)na序列具有大约14个核苷酸的长度。在某些实施方案中，tracrd(r)na仅由dna构成。tracrd(r)na序列可以在至少6、7或8个连续核苷酸的区段与参考tracrrna序列(例如，来自化脓性链球菌的野生型tracrrna序列)具有至少约60％同一性。例如，tracrd(r)na序列可以在至少6、7或8个连续核苷酸的区段与参考tracrrna序列(例如，来自化脓性链球菌的野生型tracrrna序列)具有至少约60％同一性、至少约65％同一性、至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性或100％同一性。tracrd(r)na序列可以包含多于一个双链体区域(例如，发夹、杂交区域)。tracrd(r)na序列可以包含两个双链体区域。tracrd(r)na可以包含二级结构。tracrd(r)na可以含有多于一个二级结构。在某些实施方案中，tracrd(r)na序列可以包含第一二级结构和第二二级结构，且第一二级结构包含比第二二级结构更多的核苷酸。在某些实施方案中，tracrd(r)na可以包含第一二级结构、第二二级结构和第三二级结构，且所述第一二级结构包含比所述第二二级结构更少的核苷酸，且所述第二二级结构包含比所述第三二级结构更多的核苷酸。二级结构和相应核苷酸长度的数量没有特别限制。tracrrna序列可以具有约6个核苷酸至约150个核苷酸的长度。例如，tracrrna序列可以具有约6nt至约50nt、约6nt至约40nt、约6nt至约30nt、约6nt至约25nt、约6nt至约20nt、约6nt至约15nt、约8nt至约40nt、约8nt至约30nt、约8nt至约25nt、约8nt至约20nt或约8nt至约15nt、约15nt至约150nt、约15nt至约130nt、约15nt至约100nt、约15nt至约80nt、约15nt至约50nt、约15nt至约40nt、约15nt至约30nt或约15nt至约25nt的长度。在一些实施方案中，tracrrna序列具有大约14个核苷酸的长度。tracrrna序列可以在至少6、7或8个连续核苷酸的区段与参考tracrrna序列(例如，来自化脓性链球菌的野生型tracrrna序列)具有至少约60％同一性。例如，tracrrna序列可以在至少6、7或8个连续核苷酸的区段与参考tracrrna序列(例如，来自化脓性链球菌的野生型tracrrna序列)具有至少约60％同一性、至少约65％同一性、至少约70％同一性、至少约75％同一性、至少约80％同一性、至少约85％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约98％同一性、至少约99％同一性或100％同一性。tracrrna序列可以包含多于一个双链体区域(例如，发夹、杂交区域)。tracrrna序列可以包含两个双链体区域。tracrrna可以包含二级结构。tracrrna可以含有多于一个二级结构。在某些实施方案中，tracrrna序列可以包含第一二级结构和第二二级结构，且第一二级结构包含比第二二级结构更多的核苷酸。在某些实施方案中，tracrrna可以包含第一二级结构、第二二级结构和第三二级结构，且所述第一二级结构包含比所述第二二级结构更少的核苷酸，且所述第二二级结构包含比所述第三二级结构更多的核苷酸。二级结构和相应核苷酸长度的数量没有特别限制。天然存在的v型crispr系统，不像ii型crispr系统，不需要tracrrna用于靶核酸的crrna成熟和切割。图9显示来自v型crispr系统的crrna的典型结构，其中dna靶标-结合序列在与cpf1蛋白相互作用的茎环结构的下游。环区域中核苷酸的改变不影响cpf1切割活性。图10a-c显示用于与v型crispr系统一起使用的本公开的单一引导d(r)na的可能结构。在这些构型中，实心黑色区域代表rna，而方格区域代表dna。图10a显示单一引导d(r)na，其中靶向区域包含rna，3'茎包含dna，且环和5'茎包含rna。图10b显示单一引导d(r)na，其中靶向区域包含rna，5'茎包含dna，且环和3'茎包含rna。图10c显示单一引导d(r)na，其中靶向区域和环包含rna，且5'和3'茎包含dna。图10a-c中的3'茎和5'茎可以在一起或单独地称为用于与v型系统一起使用的多核苷酸的“活化区域”。图11a-e显示用于与v型crispr系统一起使用的本公开的单一引导d(r)na的可能结构。在这些构型中，实心黑色区域代表dna，而方格区域代表rna。图11a显示单一引导d(r)na，其中靶向区域包含dna，3'茎包含dna，且环和5'茎包含rna。图11b显示单一引导d(r)na，其中靶向区域包含dna，5'茎包含dna，且环和3'茎包含rna。图11c显示单一引导d(r)na，其中靶向区域、5'茎和3'茎包含dna，且环包含rna。图11d显示单一引导d(r)na，其中靶向区域包含dna，且5'茎、3'茎和环包含dna。图11e显示单一引导d(r)na，其中所述靶向区域包含dna和rna的混合物，且5'茎、3'茎和环包含dna。图11a-e中的3'茎和5'茎可以在本文中一起或单独地称为用于与v型系统一起使用的多核苷酸的“活化区域”。图12a-i显示用于与v型crispr系统一起使用的本公开的crrna和crd(r)na的可能构型，其中3'元件和5'元件在分开的多核苷酸上并且通过氢碱基对相互作用缔合而形成双链体或茎结构。图12a显示用于v型crispr系统中使用的双引导系统，其中靶向区域与3'元件连接。第二多核苷酸在图12a中也显示为5'元件。5'元件被配置为与连接至靶向区域的3'元件杂交以形成双链体或茎。在图12a中，靶向区域、3'元件和5'元件包含rna。图12b显示包含rna的5'元件。图12c显示包含dna的5'元件。图12d显示包含rna的靶向区域和包含rna的3'元件。图12e显示包含rna的靶向区域和包含dna的3'元件。图12f显示包含dna的靶向区域和包含rna的3'元件。图12g显示包含dna的靶向区域和包含dna的3'元件。图12h显示包含rna和dna的靶向区域和包含dna的3'元件。图12i显示包含rna和dna的替代混合物的靶向区域和包含dna的3'元件。图12a-i中的3'元件可以在本文被称为用于与v型系统一起使用的多核苷酸的“活化区域”。图13a-h显示用于与v型crispr系统一起使用的本公开的crrna和crd(r)na的可能构型，其中3'元件和5'元件在分开的多核苷酸上并且通过氢碱基对相互作用缔合而形成双链体或茎结构。在图10a-13h中所示的多核苷酸的一些实施方案中，dna的区域也可以包含rna。在一些实施方案中，rna的区域也可以包含dna。在一些实施方案中，dna的区域也可以包含rna，且rna的区域也可以包含dna。图13a-h中的3'元件可以在本文被称为用于与v型系统一起使用的多核苷酸的“活化区域”。图10a-13h中显示的多核苷酸的各个区域中的dna和rna的比例可以变化。在某些实施方案中，该比例可以是5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100％rna或其之间的范围。可以与v型crispr系统一起使用的多核苷酸的实例提供于seqidno:168-203中。核酸-靶向多核苷酸的活化区域可以与位点定向多肽的区域相互作用。活化区域可以与位点定向多肽的多个区域相互作用。活化区域可以与位点定向多肽的多个区域相互作用，其中至少一个区域与靶核酸的pam相互作用。这些区域的实例可以包括化脓性链球菌中的cas9的氨基酸1096-1225和1105-1138。与未配对的核苷酸相邻的核苷酸可以是形成摆动碱基配对相互作用的核苷酸。摆动碱基配对相互作用可以包括鸟嘌呤-尿嘧啶、次黄嘌呤-尿嘧啶、次黄嘌呤-腺嘌呤和次黄嘌呤-胞嘧啶。摆动碱基配对相互作用可以导致降低的靶标和/或切割特异性。与未配对的核苷酸相邻的至少1、2、3、4或5个或更多个核苷酸可以形成摆动配对。与未配对的核苷酸相邻的至多1、2、3、4或5个或更多个核苷酸可以形成摆动配对。在某些实施方案中，靶向区域可以包含脱氧核糖核苷酸胸腺嘧啶(“dt”)作为核糖核苷酸尿嘧啶的替代物。使用dt来代替u降低摆动配对且降低脱靶碱基配对，因此在某些实施方案中导致增加的靶标特异性。靶核酸可以由dna、rna或其组合构成，并且可以是双链核酸或单链核酸。根据待使用的特定位点定向多肽，靶向区域序列可以与位于原间隔区邻近基序(pam)的5'或3'的靶核酸杂交。根据待使用的位点定向多肽，pam可以变化。例如，当使用来自化脓性链球菌的cas9时，pam可以是包含序列5'-nrr-3'的靶核酸中的序列，其中r可以是a或g，其中n是任何核苷酸，且n是靶向区域序列靶向的靶核酸序列的紧邻3'。可以修饰位点定向多肽，使得pam可以与未修饰的位点定向多肽的pam相比不同。例如，当使用来自化脓性链球菌的cas9时，可以修饰cas9，使得pam不再包含序列5'-nrr-3'，而是包含序列5'-nnr-3'，其中r可以是a或g，其中n是任何核苷酸，且n是靶向区域序列靶向的靶核酸序列的紧邻3'。其它位点定向多肽可以识别其它pam，且本领域技术人员能够确定任何特定位点定向多肽的pam。例如，来自新凶手弗朗西斯氏菌(francisellanovicida)的cpf1被鉴定为具有5'-ttn-3'pam(zetsche等人(cell;163(3):759-71(2015)))，但这不能支持靶核酸的体内位点特异性切割。鉴于新凶手弗朗西斯氏菌(francisellanovicida)和其它cpf1蛋白(诸如来自氨基酸球菌属bv3l6的cpf1)(其利用5'-tttn-3'pam)之间的引导序列的相似性，更可能的是，新凶手弗朗西斯氏菌cpf1蛋白识别和切割接近于5'-tttn-3'pam的靶核酸上的位点，其特异性和活性高于zetsche等人错误鉴定的接近于截短的5'-ttn-3'pam的靶核酸上的位点。本申请中描述的多核苷酸和crispr系统可以与针对接近于5'-tttn-3'pam的靶核酸上的位点的cpf1蛋白(例如，来自新凶手弗朗西斯氏菌)一起使用。靶核酸序列可以是20个核苷酸。靶核酸可以小于20个核苷酸。靶核酸可以是至少5、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30或更多个核苷酸。靶核苷酸可以包含约5-30之间范围的核苷酸，和其之间的范围。例如，在包含5'-nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnxrr-3'的序列中，靶核酸可以是对应于n的序列，其中n是任何核苷酸，且其中x是化脓性链球菌识别的pam的第一个核苷酸。基于待在给定情况下使用的特定位点定向多肽，特定pam的选择在本领域技术人员的知识内。本公开的在相同链上包含dna和rna的多核苷酸不能使用表达载体在体内制备，但可以在体外化学合成。多核苷酸的化学合成是本领域普通技术人员完全理解的。本公开的多核苷酸的化学合成可以在溶液中或在固体支持物上进行。溶剂中的合成对于大量和对于较高纯度多核苷酸是优选的，因为在每个步骤后纯化中间体。对于较小量(其中序列纯度不是至关重要的)，固相合成是优选的方法。本公开的多核苷酸还可以从提供多核苷酸的自动化学合成的商业来源获得。dna的化学合成可以比rna的化学合成更容易、更快速和更便宜。包含dna的多核苷酸的生成和测试可以与包含rna的序列相比更快速且成本有效。含有dna的序列可以提供靶向靶核酸诸如dna的特异性增加的优点。包含本文所讨论的特定区域中的dna的多核苷酸还可以呈现减少脱靶结合的优点，这是因为与脱氧核糖核酸碱基(与核糖核酸碱基相比)相关的摆动碱基配对的倾向性降低(例如，dna中的胸苷碱基与rna中的尿嘧啶碱基相比)。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸还可以包含例如增加多核苷酸的稳定性的修饰。此类修饰可以包括硫代磷酸酯，手性硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，膦酸甲酯和其它膦酸烷酯诸如3'-亚烷基膦酸酯，5'-亚烷基膦酸酯，手性膦酸酯，次膦酸酯，氨基磷酸酯，包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯，二氨基磷酸酯，硫羰基氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)，硫羰基氨基磷酸酯(thionoalkylphosphonates)，硫羰基烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)，硒代磷酸酯和硼代磷酸酯，其具有正常3'-5'键，2-5'连接的类似物，以及具有相反极性的那些，其中一个或多个核苷酸间键是3'至3'、5'至5'或2'至2'键。具有反向极性的合适的核酸-靶向多核苷酸可以包含在3'-最多核苷酸间键的单个3'至3'键(即其中核碱基缺失或以羟基替代其的单一倒置核苷残基)。还可以包括各种盐(例如，氯化钾或氯化钠)、混合盐和游离酸形式。在一些实施方案中，本公开的多核苷酸还可以含有其它核酸或核酸类似物。核酸类似物的实例是肽核酸(pna)。可以通过本领域技术人员已知的许多方法在体外或体内实现本公开的多核苷酸递送至细胞。这些方法包括脂质转染、电穿孔、核转染、显微注射、生物弹射、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸缀合物。脂质转染是众所周知的，并且描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787；和4,897,355；且脂质转染试剂是商售的。适用于多核苷酸的有效受体-识别脂质转染的阳离子和中性脂质描述于国际公开号wo91/17424和wo91/16024中。脂质:核酸复合物，包括靶向脂质体诸如免疫脂质复合物，且此类复合物的制备是本领域技术人员众所周知的(参见例如，crystal,science270:404-410(1995);blaese等人,cancergenether.2:291-297(1995):behr等人,bioconjugatechem.5:382-389(1994);remy等人,bioconjugatechem.5:647-654(1994);gao等人,genetherapy2:710-722(1995);ahmad等人,cancerres.52:4817-4820(1992);美国专利号4,186,183;4,217,344;4,235,871;4,261,975;4,485,054;4,501,728;4,774,085;4,837,028;和4,946,787)。电穿孔可用于递送本公开的多核苷酸。电穿孔也可用于递送本公开的位点定向多肽和多核苷酸的复合物。在这些方法中，将多核苷酸或位点定向多肽和多核苷酸的复合物在电穿孔缓冲液中与靶细胞混合以形成悬浮液。然后将该悬浮液以优化的电压进行电脉冲，其在细胞膜的磷脂双层中产生临时孔，其允许带电分子如dna和蛋白被驱动通过孔并进入细胞。进行电穿孔的试剂和设备是市售的。生物弹射或微粒子递送可用于递送本公开的多核苷酸。在这些方法中，通过用氯化钙、亚精胺或聚乙二醇沉淀来用多核苷酸包被微粒子诸如金或钨。使用装置诸如biolistic®pds-1000/he粒子递送系统(bio-rad;hercules,california)将微粒子颗粒以高速加速至细胞中。在一些实施方案中，本公开提供修饰细胞中的靶基因的方法。细胞可以来自任何生物体(例如，细菌细胞、古细菌细胞、单细胞真核生物的细胞、植物细胞、藻类细胞、真菌细胞(例如，酵母细胞)、来自无脊椎动物的细胞、来自脊椎动物的细胞或来自哺乳动物的细胞，包括来自人的细胞。在一些实施方案中，本公开提供修饰植物中的靶基因的方法。如本文所用，术语“植物”是指整个植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞、种子及其后代。植物细胞包括但不限于来自种子、悬浮培养物、胚胎、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子的细胞。植物部分包括分化和未分化组织，包括但不限于根、茎、芽、叶、花粉、种子、肿瘤组织和各种形式的细胞和培养物(例如单细胞、原生质体、胚胎和愈伤组织)。以下实施例不旨在限制本发明人认为是本发明的各个方面的范围。实施例1引导rna组分的产生通过从双链dna模板的体外转录(例如，t7quickhighyieldrna合成试剂盒,newenglandbiolabs,ipswich,ma)来产生引导rna(例如，sgrna和tracrrna)，所述双链dna模板在dna序列的5'末端并入t7启动子。通过使用含有与rna组分对应的dna序列的3'重叠引物的pcr组装rna组分的双链dna模板。组装中使用的寡核苷酸呈现于表1中。表1用于生成引导rna模板的重叠引物引导rna的类型dna-结合序列的靶标seqidnosgrna-aavsaavs-1(腺相关病毒整合位点1-人基因组)seqidno:63,64,65,66,67tracrrnan/aseqidno:63,71,72,73,74向商业合成制造商(integrateddnatechnologies,coralville,ia;或eurofins,luxembourg)提供寡核苷酸序列(例如，seqidno63-122中所示的引物序列)。dna引物各自以2nm的浓度存在。对应于t7启动子(正向引物：seqidno.63，表1)和rna序列的3'末端(反向引物：seqidno67和74，表1)的两个外部dna引物以640nm使用以驱动扩增反应。遵循制造商的说明，使用q5hotstarthigh-fidelity2xmastermix(newenglandbiolabs,ipswich,ma)进行pcr反应。使用以下热循环条件进行pcr组装反应：98℃持续2分钟，35个循环的在98℃15秒、在62℃15秒、在72℃15秒，在72℃最终延伸2分钟。通过琼脂糖凝胶电泳(1.5%,sybr®safe,lifetechnologies,grandisland,ny)评估dna质量。在37℃下，使用t7高产量rna合成试剂盒(newenglandbiolabs,ipswich,ma)将0.25-0.5μg的用于引导rna组分的dna模板转录约16小时。转录反应用dnasei(newenglandbiolabs,ipswich,ma)处理，并使用genejetrna清除和浓缩试剂盒(lifetechnologies,grandisland,ny)进行纯化。使用nanodroptm2000系统(thermoscientific,wilmington,de)定量rna产量。通过琼脂糖凝胶电泳(2%,sybr®safe,lifetechnologies,grandisland,ny)检查转录的rna的质量。引导rna组分序列显示于表2中。表2引导rna序列。上述用于产生引导rna组分的方法可以应用于如本文所述的其它rna组分的产生。实施例2用于cas9切割测定中的双链dna靶区域的产生使用来自基因组dna的靶区域的pcr扩增产生用于体外cas切割测定中的靶双链dna。通过pcr从苯酚-氯仿制备的人细胞系k562(atcc,manassas,va)基因组dna(gdna)扩增用于生物化学测定的双链dna靶区域(例如，aavs-1)。遵循制造商的说明，用q5hotstarthigh-fidelity2xmastermix(newenglandbiolabs,ipswich,ma)实施pcr反应。使用25μl的最终体积中的20ng/μlgdna来在以下条件下扩增所选靶区域：98℃持续2分钟，35个循环的在98℃20秒、在60℃20秒、在72℃20秒，在72℃最终延伸2分钟。pcr产物使用spinsmarttmpcr纯化管(denvillescientific,southplainfield,nj)纯化，并使用nanodroptm2000uv-vis分光光度计(thermoscientific,wilmington,de)进行定量。用于从gdna扩增选择的靶向的序列的正向和反向引物如下。引物、扩增子大小和从cas9介导的切割产生的片段大小显示于表3中。表3双链dna靶标双链靶标扩增子大小切割片段大小seqidno:aavs-1靶标1495bp316bp/179bpseqidno:75,76emx1靶标1282bp153bp/129bpseqidno:77,78vegfa靶标1276bp112bp/164bpseqidno:79,80cd34靶标1282bp111bp/171bpseqidno:81,82cd34靶标2268bp108bp/160bpseqidno:83,84stat5a靶标1288bp152bp/136bpseqidno:85,86stat5a靶标2242bp103bp/139bpseqidno:87,88jak1靶标1310bp179bp/131bpseqidno:89,90jak1靶标2310bp178bp/132bpseqidno:91,92使用基本上相同的方法获得其它合适的双链dna靶区域。对于非人靶区域，使用来自所选生物体(例如，植物、细菌、酵母、藻类)的基因组dna代替源自人细胞的dna。此外，可以使用除基因组dna之外的多核苷酸来源(例如，载体和凝胶分离的dna片段)。实施例3cas9切割测定本实施例说明本公开的crd(r)na在体外cas9切割测定中用于评估和比较所选crd(r)na/tracrrna/cas9蛋白复合物相对于所选双链dna靶序列的切割百分率的用途。测定针对双链dna靶标(aavs-1；实施例2，表3)的crd(r)na变体(seqidno:38-62)的集合的切割活性。将每种sgrna、crdna或crd(r)na在退火缓冲液(1.25mmhepes,0.625mmmgcl2,9.375mmkcl，ph7.5)中与等摩尔量的tracrrna(如果适当)混合，在95℃下孵育2分钟，从热循环仪中取出并使其平衡至室温。将sgrna、crdna/tracrrna和crd(r)na/tracrrna添加至cas9反应混合物中。cas9反应混合物包含在反应缓冲液(20mmhepes,100mmkcl,5mmmgcl2,1mmdtt和5%甘油，ph7.4)中稀释至200μm的最终浓度的cas9蛋白。在反应混合物中，每种反应混合物中的每种crd(r)na/tracrrna的最终浓度为500nm。将每种反应混合物在37℃下孵育10分钟。通过添加靶dna至15nm的最终浓度来开始切割反应。将样品混合并短暂离心，然后在37℃下孵育15分钟。通过添加0.2μg/μl的最终浓度的蛋白酶k(denvillescientific,southplainfield,nj)和0.44mg/µlrnasea溶液(sigmaaldrich,st.louis,mo)来终止切割反应。将样品在37℃下孵育25分钟且在55℃下孵育25分钟。通过琼脂糖凝胶电泳(2%,sybr®gold,lifetechnologies,grandisland,ny)来评估12μl的总反应的切割活性。对于aavs-1双链dna靶标，在约316bp和约179bp处的dna条带的出现表明已经发生靶dna的切割。使用如通过每个切割片段和靶dna的fiji(imagej;开源java图像处理程序)计算的曲线下面积值，并将切割片段的总和除以切割片段和靶dna的总和来计算切割百分比。图3呈现使用sgrna、crdna/tracrrna和crd(r)na/tracrrna的aavs-1靶双链dna的cas9切割测定的结果。在每个小图的顶部是对应于使用的引导rna组分的泳道编号，对应于各组分的seqidno显示于表4中。表4aavs-1crd(r)na泳道seqidno:1dna标记物2无引导对照3seqidno:374seqidno:385seqidno:396seqidno:407seqidno:418seqidno:429dna标记物10dna标记物11无引导对照12seqidno:113seqidno:4314seqidno:4415seqidno:4516seqidno:4617seqidno:4718seqidno:4819seqidno:4920dna标记物21dna标记物22无引导对照23seqidno:124seqidno:5025seqidno:5126seqidno:5227seqidno:5328seqidno:5429seqidno:5530seqidno:5631seqidno:5732seqidno:5833seqidno:5934seqidno:6035seqidno:6136seqidno:6237dna标记物切割百分比显示在每个泳道的底部。对于没有观察到切割活性的crdna或crd(r)na(例如，图3，3；图3，5；图3，15；图3，33；图3，34；图3，35)，切割活性表示为n/d(表示未检测到切割活性)。图3中呈现的数据表明本公开的crd(r)na促进cas9介导的靶双链dna的位点特异性切割。实施例4针对多种靶标的crd(r)na活性本实施例表明包含编程为靶向特定序列的不同空间的crd(r)na的体外生物化学活性。向商业合成制造商提供crdna、crrna和crd(r)na的序列(显示于表5)。表5crdna、crrna和crd(r)na序列。如实施例1中所述构建tracrrna。如实施例2中所述使用对应于适当靶序列的表3中所示的寡核苷酸生成双链dna靶标。将crdna/tracrrna、crrna/tracrrna和crd(r)na/tracrrna杂交，且如实施例3中所述实施生物化学切割。图4a和图4b显示各种间隔区的生物化学切割的结果。图4a显示生物化学切割百分比。emx靶标1的活性显示于组1中：其中‘a’为仅cas9对照，‘b’为crdna/tracrrna/cas9，‘c’为crrna/tracrrna/cas9，且‘d’为crd(r)na/tracrrna/cas9。vegfa靶标1的活性显示于组2中：其中‘a’为仅cas9对照，‘b’为crdna/tracrrna/cas9，‘c’为crrna/tracrrna/cas9，且‘d’为crd(r)na/tracrrna/cas9。cd34靶标1的活性显示于组3中：其中‘a’为仅cas9对照，‘b’为crdna/tracrrna/cas9，‘c’为crrna/tracrrna/cas9，且‘d’为crd(r)na/tracrrna/cas9。cd34靶标2的活性显示于组4中：其中‘a’为仅cas9对照，‘b’为crdna/tracrrna/cas9，‘c’为crrna/tracrrna/cas9，且‘d’为crd(r)na/tracrrna/cas9。stat5a靶标1的活性显示于组5中：其中‘a’为仅cas9对照，‘b’为crdna/tracrrna/cas9，‘c’为crrna/tracrrna/cas9，且‘d’为crd(r)na/tracrrna/cas9。stat5a靶标2的活性显示于组6中：其中‘a’为仅cas9对照，‘b’为crdna/tracrrna/cas9，‘c’为crrna/tracrrna/cas9，且‘d’为crd(r)na/tracrrna/cas9。jak1靶标1的活性显示于组7中；其中‘a’为仅cas9对照，‘b’为crdna/tracrrna/cas9，‘c’为crrna/tracrrna/cas9，且‘d’为crd(r)na/tracrrna/cas9。jak1靶标2的活性显示于组8中；其中‘a’为仅cas9对照，‘b’为crdna/tracrrna/cas9，‘c’为crrna/tracrrna/cas9，且‘d’为crd(r)na/tracrrna/cas9。对于所有仅cas9样品(图4a，‘a’)和crdna/tracrrna/cas9样品(图4b，‘b’)，没有检测到切割活性(图4a，‘n/d’)。在图4b中，切割百分比显示于图的y轴上，且靶标显示于x轴上。emx靶标1的活性显示于组1的条中。vegfa靶标1的活性显示于组2的条中。cd34靶标1的活性显示于组3的条中。cd34靶标2的活性显示于组4的条中。stat5a靶标1的活性显示于组5的条中。stat5a靶标2的活性显示于组6的条中。jak1靶标1的活性显示于组7的条中。jak1靶标2的活性显示于组8的条中。'c'和'd'是指与图4a中相同的反应。图4表明使用本公开的crd(r)na的双链dna靶标的cas9介导的生物化学切割可跨越不同的靶序列转移。实施例5用于检测真核细胞中的靶标修饰的t7e1测定法本实施例说明t7e1测定法评估crd(r)na相对于所选双链dna靶序列的体内切割百分比的用途。a.使用cas多核苷酸组分的细胞转染使用nucleofector®96-孔穿梭系统(lonza,allendale,nj)和以下方案将包含aavs-1靶向序列的sgrna和crd(r)na/tracrrna转染入组成型表达spycas9-gfp融合物的hek293细胞(hek293-cas9-gfp)中。将等摩尔量的引导rna组分制备于退火缓冲液(1.25mmhepes,0.625mmmgcl2,9.375mmkcl，ph7.5)中，在95℃下孵育2分钟，从热循环仪中取出，使其平衡至室温，并在10μl最终体积中一式三份分配于96孔板中。将培养基从hek293-cas9-gfp细胞吸出，并将细胞用无钙且无镁的pbs洗涤一次，然后通过添加tryple(lifetechnologies,grandisland,ny)、随后在37℃下孵育3-5分钟来进行胰蛋白酶消化。将胰蛋白酶消化的细胞轻轻上下移液以形成单细胞悬浮液，并添加至由含有10%fbs(fisherscientific,pittsburgh,pa)的dmem培养基(lifetechnologies,grandisland,ny)组成且补充青霉素和链霉素(lifetechnologies,grandisland,ny)的dmem完全培养基中。然后通过以200xg离心3分钟使细胞沉淀，吸出培养基，并将细胞重悬浮于pbs中。使用countess®ii自动细胞计数器(lifetechnologies,grandisland,ny)计数细胞。将2.2x107个细胞转移至50ml管中并沉淀。吸出pbs并将细胞重悬浮于nucleofector™sf(lonza,allendale,nj)溶液中至1x107个细胞/ml的密度。然后将20μl细胞悬浮液添加至含有10ulcas多核苷酸组分的各个孔中，并将整个体积转移至96孔nucleocuvette™板(lonza,allendale,nj)的孔中。将该板装载至nucleofector™96-孔shuttle™(lonza,allendale,nj)上，并使用96-cm-130nucleofector™程序(lonza,allendale,nj)将细胞核转染。核转染后，向各孔中添加70μldmem完全培养基，并将50μl细胞悬浮液转移到含有150μl预温热的dmem完全培养基的胶原包被的96孔细胞培养板中。然后将板转移至组织培养箱中，并在37℃、5%co2中保持48小时。b.t7e1测定的靶双链dna生成在使用每孔50μlquickextractdna提取溶液(epicentre,madison,wi)的cas多核苷酸组分转染后48小时从hek-293-spycas9细胞分离gdna，随后在37℃下孵育10分钟，在65℃下孵育6分钟，并在95℃下孵育3分钟以停止反应，。然后用150μl水稀释gdna，并将样品储存在-80℃。通过从分离的gdnapcr扩增靶双链dna序列(例如，aavs-1)来生成t7e1的dna。使用8μlgdna作为模板，用kapahifihotstart聚合酶设置pcr反应，其在25ul的总体积中含有0.5u聚合酶，1x反应缓冲液，0.4mmdntp和300nm针对靶双链dna的正向和反向引物(例如，aavs-1，seqidno:75、76(表3))。使用以下条件扩增靶dna：95℃持续5分钟，4个循环的在98℃20秒，在70℃20秒，-2℃/循环，在72℃30秒，随后30个循环的在98℃15秒，在62℃20秒，在72℃20秒，在72℃最后延伸1分钟。c.t7e1测定法在热循环仪中，将用于t7e1测定法的pcr扩增的靶双链dna在95℃下变性10分钟，然后使其通过以-0.5℃/s冷却至-25℃来再退火。将再退火的dna与0.5mlt7内切核酸酶i在1xnebuffer2缓冲液(newenglandbiolabs,ipswich,ma)中在15ml的总体积中在37℃下孵育25分钟。使用fragmentanalyzer™系统(advancedanalyticaltechnologies,inc.,ames,ia)和dnf-910双链dna试剂盒(advancedanalyticaltechnologies,inc.,ames,ia)分析t7e1反应。fragmentanalyzer™系统提供每个切割片段和切割后保留的靶双链dna的浓度。使用以下方程从每个切割片段和切割已发生后保留的靶双链dna的浓度计算靶双链dna的切割百分比。方程1在方程1中，“片段1”和“片段2”浓度对应于双链dna靶标的cas切割片段的浓度，且“亲本”对应于切割已经发生后保留的靶双链dna。图5显示从以各种浓度的crd(r)na转染的细胞制备的gdna的t7e1测定法的结果。检测到的平均百分比indel频率显示在每个条形图上方(使用方程1计算)。百分比是三个样品的平均值，除了图5，第4条(其中仅在两个样品中检测到活性)和图5，第5条(其中仅在一个样品中检测到活性)。核转染至细胞中的crd(r)na/tracrrna或sgrna的浓度显示于表6中。表6转染的引导rna组分浓度。用于检测真核细胞中的靶标修饰的t7e1测定法提供数据以表明如本文所述的crd(r)na/tracrrna/cas9系统便于cas介导的靶双链dna的体内特异性切割。遵循本文所述的指导，本实施例中描述的t7e1测定可以由本领域普通技术人员实施，以测量来自用其它crispr-cas系统(包括但不限于cas9、cas9-样、cas1、csn2、cas4、cpf1、c2c1、c2c2、c2c3，由cas9直向同源物编码的蛋白，cas9-样合成蛋白，cas9融合体及其变体和修饰)组合如本文所述修饰以包含crd(r)na的其同源多核苷酸组分修饰的细胞的活性。实施例6中靶/脱靶crd(r)na切割活性本实施例说明crd(r)na评估在预期靶位点(“中靶”)和预测的最近邻(“脱靶”)位点的靶标的切割活性的用途。中靶/脱靶位点的靶序列显示于表7中：表7中靶/脱靶位点序列。向商业合成制造商提供crrna和crd(r)na序列。如实施例1中所述构建tracrrna。如实施例2中所述使用对应于适当靶序列的表8中所示的寡核苷酸生成双链dna靶标。表8中靶/脱靶dna。将crrna/tracrrna和crd(r)na/tracrrna杂交，且如实施例3中所述实施生物化学切割。图6显示crrna/tracrrna和crd(r)na/tracrrna在预期中靶位点和四个计算预测的脱靶位点的生物化学活性的比较。切割百分比显示在y轴上，且样品显示在x轴上。表9列出样品：表9crrna和tracrrna中靶/脱靶活性。图7中呈现的数据显示当与crrna相比时，crd(r)na保持高中靶活性。crd(n)na不支持脱靶活性，而crrna具有不期望的脱靶活性。实施例7用于检测真核细胞中的靶标修饰的深度测序分析本实施例说明深度测序分析评估和比较所选sgd(r)na/cas9蛋白复合物相对于所选双链dna靶序列的体内切割百分比的用途。a.sgd(r)na的合成向商业合成制造商提供靶向人aavs-1基因座且包含不同dna/rna组合物和硫代磷酸酯保护的键的六个sgd(na)序列。这些序列显示于表10中。表10sgd(r)na序列。b.sgd(r)na/cas9蛋白的rnp复合物的形成cas9蛋白从大肠杆菌(bl21(de3))中的细菌表达载体表达，并使用根据jinek等人(science;337(6096):816-21(2012))中描述的方法的亲和离子交换和大小排阻色谱法进行纯化。化脓性链球菌cas9的编码序列在c末端包括两个核定位序列(nls)。将核糖核蛋白(rnp)复合物以以下两种浓度一式三份组装：20pmolcas9:60pmolsgd(r)na和200pmolcas9:600pmolssgd(r)na。将sgd(r)na组分以等摩尔量在5μl的最终体积中在退火缓冲液(1.25mmhepes,0.625mmmgcl2,9.375mmkcl，ph7.5)中混合至所需浓度(60pmol或600pmol)，在95℃下孵育2分钟，从热循环仪中取出并使其平衡至室温。将cas9蛋白在结合缓冲液(20mmhepes,100mmkcl,5mmmgcl2,1mmdtt和5%甘油，ph7.4)中稀释至适当浓度至5μl的最终体积，并与5μl热变性crd(r)na混合，然后在37℃下孵育30分钟。c.使用sgd(r)na/cas9蛋白rnp的细胞转染使用nucleofector®96孔穿梭系统(lonza,allendale,nj)和以下方案将rnp复合物转染至k562细胞(atcc,manassas,va)中。将rnp复合物以10μl最终体积分配至96孔板的各个孔中。将悬浮于培养基中的k562细胞从培养瓶转移至50ml锥形管。通过以200xg离心3分钟使细胞沉淀，吸出培养基，并将细胞用无钙且无镁的pbs洗涤一次。然后通过以200xg离心3分钟使k562细胞沉淀，吸出pbs，并将细胞沉淀重悬浮于10ml的无钙且无镁的pbs中。使用countess®ii自动细胞计数器(lifetechnologies,grandisland,ny)计数细胞。将2.2x107个细胞转移至50ml管中并沉淀。吸出pbs并将细胞重悬浮于nucleofector™sf(lonza,allendale,nj)溶液中至1x107个细胞/ml的密度。将20μl细胞悬浮液添加至含有10μlrnp复合物的各个孔中，并将整个体积转移至96孔nucleocuvette™板(lonza,allendale,nj)的孔中。将该板装载至nucleofector™96-孔shuttle™(lonza,allendale,nj)上，并使用96-ff-120nucleofector™程序(lonza,allendale,nj)将细胞核转染。核转染后，将70μl补充有10%fbs(fisherscientific,pittsburgh,pa)、青霉素和链霉素(lifetechnologies,grandisland,ny)的iscove氏改良的dulbecco氏培养基(imdm;lifetechnologies,grandisland,ny)添加至每孔，并将50μl细胞悬浮液转移至含有150μl预热的imdm完全培养基的96孔细胞培养板中。然后将板转移至组织培养箱中，并在37℃、5%co2中保持48小时。d.生成靶双链dna用于深度测序在使用每孔50μlquickextractdna提取溶液(epicentre,madison,wi)的rnp转染后48小时从k562细胞分离gdna，随后在37℃下孵育10分钟，在65℃下孵育6分钟，并在95℃下孵育3分钟以停止反应。将分离的gdna用50μl水稀释，并将样品储存在-80℃。使用分离的gdna，使用1x浓度的q5hotstarthigh-fidelity2xmastermix(newenglandbiolabs,ipswich,ma)，各0.5μm的引物(seqidno:93、94)，3.75μl的gdna在10ul的最终体积中进行第一次pcr，如下扩增：98℃持续1分钟，35个循环的在98℃10秒，在60℃20秒，在72℃30秒，且在72℃最终延伸2分钟。将pcr反应物在水中1:100稀释。对于每个样品使用独特引物设置“条形码化”pcr，以便于多重测序。样品和相应的引物对显示于表11中。表11条形码化引物。使用1x浓度的q5hotstarthigh-fidelity2xmastermix(newenglandbiolabs,ipswich,ma)，各0.5μm的引物，1μl1:100稀释的第一pcr在10ul的最终体积中进行条形码化pcr，且如下扩增：98℃持续1分钟，12个循环的在98℃10秒，在60℃20秒，在72℃30秒，且在72℃最终延伸2分钟。e.spriselect清洁将pcr反应物合并至单个微量离心管中，用于扩增子的spriselect(beckmancoulter,pasadena,ca)基于珠粒的清洁，用于测序。向合并的扩增子中添加0.9倍体积的spriselect珠粒，并混合并在室温(rt)下孵育10分钟。将微量离心管置于磁性管架(beckmancoulter,pasadena,ca)上，直到溶液已清洁。除去上清液并弃去，并用1个体积的85％乙醇洗涤剩余的珠粒，并在室温下孵育30秒。孵育后，吸取乙醇，将珠粒在室温下风干10分钟。然后从磁性支架取出微量离心管，并将0.25x体积的qiageneb缓冲液(qiagen,venlo,limburg)添加至珠粒，剧烈混合，并在室温下孵育2分钟。将微量离心管返回至磁体，孵育，直到溶液已清洗，并将含有纯化的扩增子的上清液分配至干净的微量离心管中。使用nanodroptm2000系统(thermoscientific,wilmington,de)定量纯化的扩增子文库，并使用fragmentanalyzer™系统(advancedanalyticaltechnologies,inc.,ames,ia)和dnf-910双链dna试剂盒(advancedanalyticaltechnologies,inc.ames,ia)分析文库质量。f.深度测序设置将扩增子文库针对4nmol浓度均一化，如从扩增子的nanodrop值和大小计算。用miseq试剂盒v2(illumina,sandiego,ca)在miseq测序仪(illumina,sandiego,ca)上分析文库300个循环，其中两个151个循环配对末端运行加上两个八循环指数读数。g.深度测序数据分析基于在pcr的条形码化轮次中适应至扩增子上的指数条形码序列，确定测序数据中的产物的身份。通过执行以下任务来使用计算脚本来处理miseq数据：·使用bowtie(http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml)软件将读数与人类基因组(构建grch38/38)进行比对。·将比对的读数与预期的野生型aavs-1基因座序列进行比较，弃去不与aavs-1基因座的任何部分比对的读数。·记录匹配野生型aavs-1序列的读数。·通过indel类型将具有indel(碱基的插入或缺失)的读数并记录。·将总indel读数除以野生型读数的总和，且indel读数给出检测到的indel百分比。图7显示来自用靶向aavs-1基因座中的区域的sgd(r)na/cas9核转染的人k562细胞的aavs-1靶位点的分析结果。x轴显示seqidno。对于使用的sgd(r)na，y轴显示从miseq数据检测到的indel百分比。系列a显示以20pmolcas9:120pmolsgd(r)na的给定sgd(r)na的三次独立重复检测到的indel平均百分比，且系列b显示以100pmolcas9:600pmolsgd(r)na的给定sgd(r)na的三次独立重复检测到的indel平均百分比。三个重复的平均百分比的标准偏差由垂直黑线表示。条之下的数字对应于转染中使用的sgd(na)na的seqidno，sgd(r)na的序列提供于表10中。该数据显示各种类型的sgd(na)在人细胞中的靶区域以序列特异性和剂量依赖性方式诱导修饰的能力。本文描述的方法由本领域普通技术人员通过深度测序的分析来证明sgd(r)na/cas9的体内活性。实施例8包含dna靶标-结合序列的多个crd(r)na的筛选本实施例说明本公开的crd(r)na用于修饰人基因组dna中存在的靶标且测量那些位点处的切割活性水平的用途。可以首先从基因组dna选择靶位点，然后可以设计crd(r)na，以靶向那些选择的序列。然后可以实施测量以确定已经发生的靶标切割的水平。不是每次筛选都需要所有以下步骤，步骤的顺序也不一定如所呈现，并且筛选可以与其它实验偶联，或者形成较大实验的一部分。a.从基因组dna选择dna靶区域鉴定所选基因组区域内的所有pam序列(例如，“ngg”)。鉴定和选择与pam序列5'相邻的一个或多个20个核苷酸序列长序列(靶dna序列)。选择标准可以包括但不限于：与基因组中的其它区域的同源性；g-c含量百分比；熔融温度；间隔区内均聚物的存在；以及本领域技术人员已知的其它标准。将适当的crd(r)na序列附加至鉴定的靶dna序列的3'末端。通常由商业制造商合成crd(r)na构建体，并且通过体外转录如实施例1中所述产生同源tracrrna。如本文所述的crd(r)na可以与同源tracrrna一起使用以完成用于与同源cas蛋白一起使用的crd(r)na/tracrrna系统。b.确定切割百分比和特异性例如使用实施例3的cas切割测定法比较与crd(r)na/tracrrna系统相关的体外切割百分比和特异性，如下：(a)如果仅鉴定或选择单一靶dna序列，则可以确定dna靶区域的切割百分比和特异性。如果如此需要，可以在使用本公开的方法的进一步实验中改变切割百分比和/或特异性，所述方法包括但不限于修饰crd(r)na，引入效应子蛋白/效应子蛋白-结合序列或配体/配体结合部分。(b)可以在包含靶结合序列的不同dna之间比较从切割测定获得的切割百分比数据和位点特异性数据，以鉴定具有最佳切割百分比和最高特异性的靶dna序列。切割百分比数据和特异性数据提供了为各种应用选择碱基的标准。例如，在一些情况下，crd(r)na的活性可以是最重要的因素。在其它情况下，切割位点的特异性可以比切割百分比相对更重要。如果如此需要，在使用本公开的方法的进一步实验中改变切割百分比和/或特异性，所述方法包括但不限于修饰crd(r)na，引入效应子蛋白/效应子蛋白-结合序列或配体/配体结合部分。任选地或代替体外分析，例如使用实施例5中描述的t7e1测定法比较与crd(r)na系统相关的体内切割百分比和特异性，如下：(a)如果仅鉴定靶dna序列，则可以确定dna靶区域的切割百分比和特异性。如果如此需要，在使用本公开的方法的进一步实验中改变切割百分比和/或特异性，所述方法包括但不限于修饰crd(r)na，引入效应子蛋白/效应子蛋白-结合序列或配体/配体结合部分。(b)可以在不同靶dna之间比较从切割测定获得的切割百分比数据和位点特异性数据，以鉴定导致靶dna的最高切割百分比和靶dna的最高特异性的crd(r)na序列。切割百分比数据和特异性数据提供了为各种应用选择碱基的标准。例如，某些实施方案可以依赖于crd(r)na的活性，并且可能是最重要的因素。在某些实施方案中，切割位点的特异性可以比切割百分比相对更重要。在某些实施方案中，可以使用本公开的方法改变切割百分比和/或特异性，所述方法包括但不限于修饰rna，引入效应子蛋白/效应子蛋白-结合序列或配体/配体结合部分。遵循本说明书和实施例的指导，本实施例中描述的筛选可以由本领域普通技术人员用其它ii类crisprcas蛋白(包括但不限于cas9、cas9-样、cas、cas3、csn2、cas4、由cas9直向同源物编码的蛋白、cas9-样合成蛋白、cas9融合体、cpf1、cpf1-样、c2c1、c2c2、c2c3及其变体和修饰)以及如本文所述修饰以包含crd(r)na的其同源多核苷酸组分实施。实施例9crd(r)na:tracrrna和sgd(r)na介导的切口本实施例说明这样的方法，通过所述方法，本公开的crd(r)na:tracrrna复合物或sgd(r)na可以用于在双链dna(dsdna)质粒靶标中结合含有使ruvc核酸酶叶无活性的d10a突变的化脓性链球菌cas9(cas9-d10a)诱导缺口。不是所有的以下步骤都是必需的，步骤的顺序也不一定如所呈现。化脓性链球菌cas9具有两个活性核酸酶结构域，即ruvc和hnh结构域。化脓性链球菌cas9的第十个氨基酸位置的天冬氨酸的突变(将其转化为丙氨酸)，降低ruvc结构域的核酸酶能力。hnh结构域保持活性，但cas9-d10a位点定向多肽仅可在与间隔区序列互补的dna靶链的磷酸二酯骨架中引起切口。描述了合适的载体、培养基、培养条件等的实例。鉴于本说明书的教导，本领域普通技术人员将理解这些组分和条件的修改。根据本说明书的实施例1生成引导试剂。如实施例2中所述，使用seqidno133和134生成dsdna靶标。然后将扩增的片段克隆至合适的lic相容载体中。一种这样合适的载体是市售的pethis6lic克隆载体(addgene,cambridge,ma)。使用市售的xl1-blu细菌细胞(agilent,santaclara,ca)将质粒转化至用于质粒表达的细菌菌株中。含有lic载体的细菌细胞在补充有100μg/ml氨苄青霉素(sigma-aldrich,st.louis,mo)的lb培养基中在37℃下生长18小时。将细胞以5,000rpm离心15分钟，之后使用qiagen质粒试剂盒(qiagen,venlo,netherlands)提取质粒。如本说明书的实施例3中详述进行纯化质粒的生物化学切割，修改在于在反应中用1nm的最终浓度的纯化质粒替换dna靶标。将crd(r)na以实施例3所述的方式与tracrrna(seqidno:2)杂交。通过在用sybr金(lifetechnologies,grandisland,ny)染色的1％琼脂糖凝胶上运行来分析生物化学反应。基于超螺旋质粒形式的消失和质粒的切口开环形式(切口质粒)的出现(其可通过凝胶上质粒迁移速率的变化来区分)来计算切口效率。从含有切口质粒和超螺旋质粒的凝胶上的染色条带的强度来计算切口质粒的百分数。使用曲线下面积值测量强度，如通过fiji(imagej;开源java图像处理程序)计算。通过将切口质粒的染色强度除以切口质粒物质和超螺旋质粒物质的染色强度的总和来计算切口百分比。本实验中使用的crd(r)na和sgd(r)na的seqidno显示于表12中。表12切口crd(r)na和sgd(r)na样品id描述seqidno:acrd(r)naseqidno:38bcrd(r)naw/18nt间隔区seqidno:135ccrd(r)naseqidno:41dcrd(r)naw/17nt间隔区seqidno:136ecrd(r)naseqidno:43fcrd(r)naw/18nt间隔区seqidno:137hsgd(r)naseqidno:127isgrna对照seqidno:1h仅靶质粒-图8显示crd(r)na或sgd(r)na与cas9-d10a蛋白针对质粒靶标的生物化学切口活性的结果。切口百分比显示在y轴上。crd(r)na和sgd(r)na样品显示在x轴上，且对应于表12中所示的样品id。数据显示crd(r)na和sgd(r)na支持cas9-d10a蛋白针对靶质粒的切口能力的活性。数据还显示间隔区序列从间隔区(seqidno:135、136和137)的5'末端的截短能够具有切口活性。遵循本说明书和本文实施例的指导，本领域普通技术人员可以实施crd(r)na:tracrrna和sgd(r)na的切口活性的设计和验证。实施例10crisprrna和反式活化crisprrna的鉴定和筛选本实施例说明这样的方法，通过所述方法，可以鉴定crispr-casii型系统的crisprrnas(crrnas)和反式活化crisprrnas(tracrrnas)。本文呈现的方法从chylinski,等人,(rnabiol;10(5):726-37(2013))调整。不是所有的以下步骤都是筛选必需的，步骤的顺序也不一定如所呈现。a.鉴定含有crispr-cas9ii型系统的细菌物种使用基本局部比对搜索工具(blast,blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)，进行各种物种的基因组的检索，以鉴定cas9或cas9-样蛋白。ii型crispr-cas9系统在细菌物种间表现出序列的高度多样性，然而cas9直向同源物表现出中心hnh内切核酸酶结构域和分离的ruvc/rnaseh结构域的保守结构域结构。针对鉴定的结构域过滤主要blast结果；弃去不完整或截短的序列，并鉴定cas9直向同源物。当在物种中鉴定cas9直向同源物时，针对其它cas蛋白和相关的重复-间隔区阵列探测与cas9直向同源物的编码序列相邻的序列，以鉴定属于crispr-cas基因座的所有序列。已知密切相关的物种表现出相似的crispr-cas9基因座结构(即，cas蛋白组成、大小、取向、阵列位置、tracrrna的位置等)，这可以通过与公共领域中已知的其它crispr-casii型基因座的比对来完成。b.推定的crrna和tracrrna的鉴定在基因座内，crrna通过由外来dna片段间隔的其重复序列的性质而容易地鉴定，并且构成重复-间隔区阵列。如果重复序列来自已知物种，则将其在crisprdb数据库(crispr.u-psud.fr/crispr/)中鉴定且从其中检索。如果不知道重复序列与物种相关联，则使用crisprfinder软件(crispr.u-psud.fr/server/)使用鉴定为如上所述的物种的crispr-casii型基因座的序列来预测重复序列。一旦对于物种鉴定重复序列的序列，则tracrrna通过其与重复-间隔区阵列中的重复序列互补的其序列(tracr反重复序列)来鉴定。使用计算机芯片上预测筛选来提取反重复序列以鉴定相关的tracrrna。筛选假定的反重复，例如，如下。使用给定物种的鉴定的重复序列来探测反重复序列的crispr-cas9基因座(例如，使用blastp算法等)。搜索通常仅限于crispr-cas9基因座的内含子区域。针对与鉴定的重复序列的互补性验证鉴定的反重复区域。在rho非依赖性转录终止子的推定的反重复的5'和3'探测推定的反重复序列(transtermhp,transterm.cbcb.umd.edu/)。因此，确定包含反重复元件和rho非依赖性转录终止子的鉴定序列是给定物种的假定tracrrna。c.rna-seq文库的制备使用rna测序(rnaseq)进一步验证在计算机芯片上鉴定的推定的crrna和tracrrna。来自鉴定推定的crrna和tracrrna的物种的细胞购自商业储存库(例如，atcc,manassas,va;dsmz,braunschweig,germany)。细胞生长至对数中期，并且总rna使用trizol试剂(sigma-aldrich,st.louis,mo)制备并用dnasei(fermentas,vilnius,lithuania)处理。使用ribo-zerorrna移取试剂盒(illumina,sandiego,ca)处理10ug总rna，并使用rna清洁和浓缩器(zymoresearch,irvine,ca)纯化剩余的rna。然后遵循制造商的说明使用truseqsmallrna文库制备试剂盒(illumina,sandiego,ca)制备文库，其导致存在与cdna相关的适体序列。使用miseq测序仪(illumina,sandiego,ca)将所得cdna文库测序。d.测序数据的处理可以使用以下方法处理cdna文库的测序读数。使用cutadapt1.1(pypi.python.org/pypi/cutadapt/1.1)去除适体序列，并从读数的3'末端修剪15nt，以提高读数质量。读数与每个相应物种的基因组(从其中鉴定推定的tracrrna)反向对齐，容许2个核苷酸的错配。使用bedtools(bedtools.readthedocs.org/en/latest/)计算读数覆盖率。使用integrativegenomicsviewer(igv,www.broadinstitute.org/igv/)来定位读数的起始(5')和结束(3')位置。从比对的sam文件计算对于推定的tracrrna检索的总读数。使用rna-seq数据来验证在体内主动转录推定的crrna和tracrrna元件。使用本文概述的方法，针对鉴定的crrna和tracrrna序列支持cas9介导的双链dna靶标的切割的功能性能力来验证来自计算机芯片上和rna-seq筛选的复合物的确认的命中(参见实施例1、2和3)。遵循本说明书和本文实施例的指导，本领域普通技术人员可以实施新型crrna和tracrrna序列的鉴定。实施例11crd(r)na和sgd(r)na的设计本实施例说明这样的方法，通过所述方法，分别从crrna和tracrrna设计crd(r)na和sgd(r)na。不是所有的以下步骤都是筛选必需的，步骤的顺序也不一定如所呈现。如实施例10中所述进行给定物种的crrna和tracrrna引导序列的鉴定。鉴定的crrna和tracrrna序列在计算机芯片上反转录为dna。从crrna和tracrrna的序列鉴定上部茎、下部茎和凸起元件。将rna碱基引入分别产生crd(r)na和sgd(r)na的crdna和tracrdna序列的dna序列中。可以使用计算或实验筛选方法选择crdna和tracrrna内的rna碱基的位置、数量和分布。设计crd(r)nas的集合，其中核糖核苷酸置于分子内的许多不同位置。优选地，在一些crd(r)na序列中，用下部茎内的脱氧核糖核苷酸取代核糖核苷酸。在一些crd(r)na序列中，在间隔区序列的3'末端取代核糖核苷酸。设计额外crd(r)na和sgd(r)na序列，例如，如下。搜索公共领域中的3维蛋白结构(例如，rcsbpdb;rcsb.org)的库以鉴定cas内切核酸酶结构。针对与其同源crrna和tracrrna结合的cas内切核酸酶的高分辨率坐标文件搜索库。如果没有目标cas内切核酸酶的解析的结构，则使用通过与目标cas内切核酸酶的序列或三级结构相似性定义的结构相邻性。下载存储的坐标文件。使用可视化软件，诸如pymol(pymolmoleculargraphicssystem,版本1.7.4schrödinger,llc)，分析坐标以鉴定cas内切核酸酶蛋白和crrna和tracrrna的核苷酸之间的核糖特异性相互作用。使用蛋白与crrna和tracrrna的核苷酸直接或间接接触(即通过水或金属中间体)的位置来鉴定引导序列内用于用核糖核苷酸或其它核苷酸变体替代脱氧核糖核苷酸的有利位置。当与相关物种的cas9蛋白相比时，crrna和tracrrna序列是保守的。引导序列与来自相似物种的其它已知引导序列的比对提供关于对核糖核苷酸赋予优先性的保守碱基的额外信息。使用基于web的软件muscle(ebi.ac.uk/tools/mas/muscle/)进行crrna或tracrrna的多重序列比对。然后针对沿着骨架的保守核苷酸序列位置评价比对。使用核酸二级结构预测软件(例如rnafold;rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/rnafold.cgi)来分析引导骨架的折叠。使用其中rna特异性扭转角度有利的区域来通知在crdna和/或tracrdna中核糖核苷酸位置的放置。使用二级结构、蛋白-核酸相互作用和序列保守性的组合来通知核苷酸在crd(r)na、tracrd(r)na和sgd(r)na序列中的定位。理解不同配置可以支持不同的期望特性(即活性、特异性、稳定性等)，测试crd(r)na和tracrd(r)na的多种设计。可以通过接头将crd(r)na和tracrd(r)na连接至单个分子中以形成sgd(r)na。crd(r)na和tracrd(r)na的组合可以伴随一起形成上部茎的crd(r)na的3'末端和tracrd(r)na的5'末端的核苷酸的总数的减少。seqidno138-142、147-150、154-157和161-164显示crd(r)na和tracrd(r)na的设计。seqidno143-146、151-153、158-160和165-167显示sgd(r)na的设计。表13给出序列的同一性。表13crd(r)na、tracrd(r)na和sgd(r)naid属/物种引导描述seqidno:138金黄色葡萄球菌crd(r)naseqidno:139金黄色葡萄球菌crd(r)naseqidno:140金黄色葡萄球菌crd(r)naseqidno:141金黄色葡萄球菌crd(r)naseqidno:142金黄色葡萄球菌tracrrnaseqidno:143金黄色葡萄球菌sgd(r)naseqidno:144金黄色葡萄球菌sgd(r)naseqidno:145金黄色葡萄球菌sgd(r)naseqidno:146金黄色葡萄球菌sgd(r)naseqidno:147嗜热链球菌crispr-icrd(r)naseqidno:148嗜热链球菌crispr-icrd(r)naseqidno:149嗜热链球菌crispr-icrd(r)naseqidno:150嗜热链球菌crispr-itracrrnaseqidno:151嗜热链球菌crispr-isgd(r)naseqidno:152嗜热链球菌crispr-isgd(r)naseqidno:153嗜热链球菌crispr-isgd(r)naseqidno:154脑膜炎奈瑟氏菌crd(r)naseqidno:155脑膜炎奈瑟氏菌crd(r)naseqidno:156脑膜炎奈瑟氏菌crd(r)naseqidno:157脑膜炎奈瑟氏菌tracrrnaseqidno:158脑膜炎奈瑟氏菌sgd(r)naseqidno:159脑膜炎奈瑟氏菌sgd(r)naseqidno:160脑膜炎奈瑟氏菌sgd(r)naseqidno:161巴斯德氏链球菌crd(r)naseqidno:162巴斯德氏链球菌crd(r)naseqidno:163巴斯德氏链球菌crd(r)naseqidno:164巴斯德氏链球菌tracrrnaseqidno:165巴斯德氏链球菌sgd(r)naseqidno:166巴斯德氏链球菌sgd(r)naseqidno:167巴斯德氏链球菌sgd(r)na向商业合成制造商(例如，integrateddnatechnologies,coralville,ia)提供序列。使用本文所述的方法实验测试crd(r)na、tracrd(r)na和sgd(r)na，以测定不同序列支持cas9介导的双链dna靶标的切割的活性(参见实施例1、2和3)。遵循本说明书和本文实施例的指导，本领域普通技术人员可以实施新型crd(r)na、tracrd(r)na和sgd(r)na序列的设计和验证。实施例12v型cpf1crd(r)na和sgd(r)na元件的设计和与cpf1一起使用以修饰dna下表14和15提供了用于与v型crispr系统一起使用的示例性双引导crd(r)na和sgd(r)na。对示例性图和seqidno的引用并不意图以任何方式是限制性的，并且本领域技术人员理解的是，基于表14、15中的公开内容以及相关的seqidno和示例性图，用于与v型crispr系统一起使用的双引导crd(r)na和sgd(r)na可以设计成靶向靶核酸内的任何所需序列。表14用于形成双引导crd(r)na和引导cpf1活性至目标dna序列的v型crd(r)na5’和3’元件和组合的描述序列的描述示例性图seqidno:v型cpf1crrna5’元件12b,13d,13e,13hseqidno:168v型cpf1crd(r)na5’元件12c,13b,13c,13f,13gseqidno:169硫代磷酸酯保护的v型cpf1crrna5’元件12b,13d,13e,13hseqidno:170硫代磷酸酯保护的v型cpf1crd(r)na5’元件12c,13b,13c,13f,13gseqidno:171具有25核苷酸rna靶向区域的v型cpf1crrna3’元件12dseqidno:172具有20核苷酸rna靶向区域的v型cpf1crrna3’元件12dseqidno:173硫代磷酸酯保护的具有25核苷酸rna靶向区域的v型cpf1crrna3’元件12dseqidno:174硫代磷酸酯保护的具有20核苷酸rna靶向区域的v型cpf1crrna3’元件12dseqidno:175具有25核苷酸dna靶向区域的v型cpf1crd(r)na3’元件12f,13e,13fseqidno:176具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1crd(r)na3’元件12h,12iseqidno:177具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1crd(r)na3’元件12h,12iseqidno:178具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1crd(r)na3’元件12h,12iseqidno:179具有25核苷酸rna靶向区域的v型cpf1crd(r)na3’元件12e,13c,13dseqidno:180硫代磷酸酯保护的具有25核苷酸rna靶向区域的v型cpf1crd(r)na3’元件12e,13c,13dseqidno:181具有20核苷酸rna靶向区域的v型cpf1crd(r)na3’元件12e,13c,13dseqidno:182硫代磷酸酯保护的具有20核苷酸rna靶向区域的v型cpf1crd(r)na3’元件12e,13c,13dseqidno:183具有25核苷酸dna靶向区域的v型cpf1crd(r)na3’元件12g,13g,13hseqidno:184具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1crd(r)na3’元件12h,12iseqidno:185具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1crd(r)na3’元件12h,12iseqidno:186具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1crd(r)na3’元件12h,12iseqidno:187含有3’和5’元件的双引导v型cpf1crrna13aseqidno:168;seqidno:172含有硫代磷酸酯保护的3’和5’元件的双引导v型cpf1crrna13aseqidno:170;seqidno:173含有3’和5’元件的双引导v型cpf1cr(d)rna13bseqidno:169;seqidno:172含有3’和5’元件的双引导v型cpf1cr(d)rna13cseqidno:169;seqidno:180含有3’和5’元件的双引导v型cpf1cr(d)rna13dseqidno:168;seqidno:180含有3’和5’元件的双引导v型cpf1cr(d)rna13eseqidno:168;seqidno:176含有3’和5’元件的双引导v型cpf1cr(d)rna13fseqidno:169;seqidno:176含有3’和5’元件的双引导v型cpf1cr(d)rna13gseqidno:169;seqidno:184含有3’和5’元件的双引导v型cpf1cr(d)rna13hseqidno:168;seqidno:184表15v型sgd(r)na设计的描述序列的描述示例性图seqidno:具有25核苷酸rna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na10aseqidno:188具有25核苷酸rna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na10bseqidno:189具有25核苷酸rna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na10cseqidno:190具有25核苷酸dna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na11dseqidno:191具有25核苷酸dna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na11bseqidno:192具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na11eseqidno:193具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na11eseqidno:194具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na11eseqidno:195具有25核苷酸dna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na11aseqidno:196具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na11eseqidno:197具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na11eseqidno:198具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na11eseqidno:199具有25核苷酸dna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na11cseqidno:200具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na11eseqidno:201具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na11eseqidno:202具有25核苷酸dna/rna靶向区域的v型cpf1sgd(r)na11eseqidno:203a.v型cpf1crd(r)na和sgd(r)na元件的设计使用序列分析程序(诸如psi-blast、phi-blast和hmmer)鉴定cpf1直向同源物。一旦鉴定cpf1直向同源物，搜索附近的序列来鉴定相关的crispr阵列。crrna序列被鉴定为位于crispr阵列内的重复序列，如zetsche等人(cell;163(3):759-71(2015))中所述。v型crrna序列在重复序列内含有茎环，其位于靶向区序列的5'。茎环包含5'元件和3'元件。鉴定了crrna的5'元件、3'元件和环的序列。这些crrna元件的序列在计算机芯片上反转录成dna。设计5'元件，其含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。5'元件的实例显示于图12、图13和表14中。设计3'元件，其含有核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。3'元件的实例显示于图12、图13和表14中。靶向区域序列被选择为与目标dna中的pam序列相邻，并且附加至3’crrna元件的3'末端。设计靶向区序列，其含有dna、dna和rna或rna核苷酸。通过将crd(r)na3’元件和crd(r)na5’元件组合在一起(表14、图12、图13)以形成双引导v型crd(r)na，将cpf1引导至切割在目标靶核酸中的靶核酸序列。设计crd(r)nas的集合用于测试，其中核糖核苷酸置于crd(r)na序列内的许多不同位置。优选地，在一些crd(r)na序列中，用3’茎和5’茎内的脱氧核糖核苷酸取代核糖核苷酸。在一些crd(r)na序列中，在靶向区域序列的5'末端取代核苷酸。使用由环序列连接的靶向区域、3'元件和5'元件的组合，设计sgd(r)na的不同版本。可以使用计算或实验筛选方法选择sgd(r)na内的rna碱基的位置、数量和分布。设计sgd(r)na的集合，其中核糖核苷酸置于sgd(r)na内的许多不同位置。优选地，在一些sgd(r)na序列中，用3’茎和5’茎内的脱氧核糖核苷酸取代核糖核苷酸。在一些sgd(r)na序列中，在靶向区域序列的5'末端取代核苷酸。设计的sgd(r)na的实例列于表15中，并且显示于图10a-c和图11a-e中。在下文中，使用sgd(r)na序列，但应当理解，可以使用3’和5’crd(r)na元件的配对(其实例显示于表14中)代替sgd(r)na。b.用cpf1和sgd(r)na消化核酸序列cpf1sgd(r)na可与cpf1一起使用以靶向和切割核酸序列。靶核酸是rna、基因组dna、质粒dna或扩增的dna。扩增的靶dna可以如实施例2中所述制备。合成含有靶向靶dna中的目标序列的间隔区序列的sgd(r)na序列。切割测定如zetsche等人(2015)中所述实施，并使用实施例3中所述的方法进行分析。总之，将靶核酸与一种或多种cpf1和sgd(r)na序列在选择用于支持cpf1活性的适当缓冲液中一起孵育。分析核酸以确定是否如实施例3中所述进行消化。可以使用两种或更多种cpf1/sgd(r)na复合物来从靶dna切割dna片段。dna片段具有突出末端，并且可以在其已经与亲本dna分离后连接至互补序列适体或载体。c.用cpf1sgd(r)na核糖核蛋白复合物的基因组编辑通过合成编码cpf1的密码子优化的开放阅读框和将开放阅读框克隆至表达质粒(例如pet27b)中来构建大肠杆菌表达载体。编码序列可以包括用于纯化蛋白的亲和标签，以及驱动真核细胞中的核定位的c-末端的nls序列。cpf1蛋白可以在大肠杆菌中从表达载体表达，并使用亲和力、离子交换和大小排阻色谱的组合进行纯化。将纯化的蛋白浓缩至10mg/ml并与sgd(r)na组合以制备核糖核蛋白复合物。将200pmol的cpf1在分开的反应管中与50pmol、100pmol、200pmol、400pmol、600pmol、800pmol、1000pmol的sgd(r)na和反应缓冲液组合。根据实施例7中所述的方法，将cpf1-sgd(r)na复合物重复电穿孔至hek293细胞中。细胞在37℃下生长，并在4、8、16、24、48和72小时之后从每个反应收获基因组dna。使用pcr和illumina测序分析基因组dna，以确定基因组已经根据实施例7中所述的方法进行编辑。d.在真核细胞中使用cpf1表达载体和sgd(r)na的基因组编辑通过合成编码cpf1的密码子优化的开放阅读框和将开放阅读框克隆至合适的哺乳动物表达质粒(例如，pcdna3.1)中来构建哺乳动物表达载体。编码序列可以包括用于纯化或检测蛋白的ha亲和标签，以及驱动真核细胞中的核定位的c-末端的nls序列。编码序列可以与质粒中的cmv启动子可操作连接。将cpf1表达质粒在分开的反应管中与50pmol、100pmol、200pmol、400pmol、600pmol、800pmol、1000pmol的sgd(r)na和反应缓冲液组合。根据实施例7中所述的方法，将反应混合物重复电穿孔至hek293细胞中。细胞在37℃下生长，并在4、8、16、24、48和72小时之后从每个反应收获基因组dna。使用pcr和illumina测序分析基因组dna，以确定基因组已经根据实施例7中所述的方法进行编辑。实施例13玉米胚胎的原位修饰本实施例说明这样的方法，通过所述方法，可以使用单一引导d(r)na来修饰玉米胚胎。本文呈现的方法从svitashev,等人(plantphysiol;169(2):931–945(2015))调整。不是所有的以下步骤都是筛选必需的，步骤的顺序也不一定如所呈现。本实施例说明单一引导d(r)na引导cas内切核酸酶来切割玉米胚胎中的染色体dna的用途。设计了6个单一引导d(r)na(sgd(r)na)，其靶向liguleless1基因和能育基因ms45附近的区域(表16)，并且被递送至含有预整合的组成型表达的化脓性链球菌cas9基因的玉米系。通过针对由sgd(r)nas/cas9介导的切割诱导的突变的存在的深度测序来检查玉米liguleless1和ms45基因组基因座。表16靶向玉米liguleless1和ms45的sgd(r)na。如svitashev等人(2015)中所述生成预整合的组成型表达的化脓性链球菌cas9玉米系。向商业合成制造商(eurofinsscientific,huntsville,al)提供sgd(r)na设计。如实施例1中所述构建sgrna(seqidno:207和227)。如svitashev等人(2015)中所述，实施用sgd(r)na源自组成型表达的化脓性链球菌cas9系的未成熟玉米胚胎(ime)的生物弹射法介导的转化。简言之，在细胞分裂刺激基因zmodp2(美国公开号20050257289)和zmwus2(美国专利号7,256,322)存在的情况下，将100ng的每种sgd(na)递送至60-90ime，如ananiev等人(chromosoma;118(2):157-77(2009))中所述。由于粒子枪转化可以是高度可变的，所以视觉可选择的标记dna表达盒mopat-dsred也与细胞分裂促进基因共同递送，如svitashev等人(2015)中所述。用100ngt7转录的靶向相同的切割区域的单一引导rna(sgrna)(seqidno:207和227)转化的胚胎充当阳性对照，并且仅用zmodp2、zmwus2和mo-pat-dsred表达盒转化的胚胎充当阴性对照。3天后，基于dsred荧光从每次处理选择20-30个最均匀转化的胚胎，将其合并并提取总基因组dna。用phusion®highfidelitypcrmastermix(m0531l,newenglandbiolabs,ipswich,ma)(其在扩增子特异性条形码所必需的序列上添加)和使用“加尾”引物通过两轮pcr的illumnia测序将预期靶位点周围的区域进行pcr扩增。一级pcr反应中使用的引物显示于表17中，且二级pcr反应中使用的引物是seqidno:214和215。表17pcr引物序列id样品引物条形码化引物集合-37seqidno.204seqidno:208,209条形码化引物集合-38seqidno.205seqidno:208,210条形码化引物集合-39seqidno.206seqidno:208,211条形码化引物集合-40seqidno.207seqidno:208,212条形码化引物集合-41无引导rna(阴性对照)seqidno:208,213条形码化引物集合-42seqidno.224seqidno:228,229条形码化引物集合-43seqidno.225seqidno:228,230条形码化引物集合-44seqidno.226seqidno:228,231条形码化引物集合-45seqidno.227seqidno:228,232条形码化引物集合-46无引导rna(阴性对照)seqidno:228,233所得pcr扩增用qiagenpcr纯化旋转柱纯化，用基于hoechst染料的荧光测定法测定浓度，以等摩尔比组合，并在illuminamiseq个人测序仪上进行单次读取的100个核苷酸长度深度测序，其中基于集合外序列掺入25%(v/v)的phix对照v3(illumina,fc-110-3001)。只有以预期切割位点为中心且在阴性对照中没有以类似水平发现的在10个核苷酸窗口内出现的具有≥1个核苷酸indel的那些读数被分类为突变体。将具有相同突变的突变体读数计数并收缩成单次读数，并在视觉上确认为具有在预期切割位点内产生的突变。然后使用视觉上确认的突变的总数来计算基于含有与条形码和正向引物的完美匹配的适当长度的读数的总数的突变体读数百分比。如表18中所示，在所有处理中都恢复突变，表明sgd(r)na可用于引导cas内切核酸酶以切割玉米细胞染色体dna。此外，某些sgd(r)na设计(seqidno.205和226)表现出接近t7转录的sgrna(seqidno:207和227)的突变频率。用sgd(r)na恢复的突变的实例显示于图14a(对应于seqidno:217-223，其中seqidno:216是包含liguleless1靶基因座的参考玉米序列)和图14b(对应于seqidno:235-254，其中seqidno:234是包含ms45靶基因座的参考玉米序列)。表18与sgrna/cas内切核酸酶系统相比，sgd(r)na/cas内切核酸酶系统产生的玉米liguleless1和ms45靶基因座处的突变体读数处理读数的总数突变体读数的数目ligueless1无引导rna(阴性对照)2,849,1450seqidno.2073,155,695552seqidno.2042,816,7055seqidno.2053,053,967192seqidno.2062,979,2829ms45无引导rna(阴性对照)1,248,14216seqidno.xx41,194,0508,784seqidno.xx11,192,758190seqidno.xx21,206,632114seqidno.xx31,192,110878尽管上述公开内容提供了本发明的具体实施方案的描述和实例，但其并不意图以任何方式进行限制，并且在本领域技术人员的知识范围内的是，修改公开的示例以调整特定的方法、组成或步骤以便在本发明的范围内实现期望的结果。所有这种修改意在本发明的范围内。序列表<110>pioneerhi-bredinternational,inc.<120>crispr杂合dna/rna多核苷酸及使用方法<130>019847.0101ptwo<140><141><150>62/108,931<151>2015-01-28<160>254<170>patentinversion3.5<210>1<211>121<212>rna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<400>1ggggccacuagggacaggaugucucagagcuaugcuguccuggaaacaggacagcauagc60aaguugagauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu120u121<210>2<211>73<212>rna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>2gcaggacagcauagcaaguugagauaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcac60cgagucggugcuu73<210>3<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>3gagtccgagcagaagaagaagtctcagagctatgctgtcctg42<210>4<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>4gggtggggggagtttgctccgtctcagagctatgctgtcctg42<210>5<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>5gtttgtgtttccataaactggtctcagagctatgctgtcctg42<210>6<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>6tctgtgataacctcagtttagtctcagagctatgctgtcctg42<210>7<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>7ggccactgtagtcctccagggtctcagagctatgctgtcctg42<210>8<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>8gtcccccagccggtcagccagtctcagagctatgctgtcctg42<210>9<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>9ggcagccagcatgatgagacgtctcagagctatgctgtcctg42<210>10<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>10gaggagctccaagaagactggtctcagagctatgctgtcctg42<210>11<211>42<212>rna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>11gaguccgagcagaagaagaagucucagagcuaugcuguccug42<210>12<211>42<212>rna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>12ggguggggggaguuugcuccgucucagagcuaugcuguccug42<210>13<211>42<212>rna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>13guuuguguuuccauaaacuggucucagagcuaugcuguccug42<210>14<211>42<212>rna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>14ucugugauaaccucaguuuagucucagagcuaugcuguccug42<210>15<211>42<212>rna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>15ggccacuguaguccuccagggucucagagcuaugcuguccug42<210>16<211>42<212>rna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>16gucccccagccggucagccagucucagagcuaugcuguccug42<210>17<211>42<212>rna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>17ggcagccagcaugaugagacgucucagagcuaugcuguccug42<210>18<211>42<212>rna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>18gaggagcuccaagaagacuggucucagagcuaugcuguccug42<210>19<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<400>19gagtccgagcagaagaagaagucucagagctatgctgtcctg42<210>20<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<400>20gggtggggggagttugcuccgucucagagctatgctgtcctg42<210>21<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<400>21gtttgtgtttccataaacuggucucagagctatgctgtcctg42<210>22<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<400>22tctgtgataacctcaguuuagucucagagctatgctgtcctg42<210>23<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<400>23ggccactgtagtccuccagggucucagagctatgctgtcctg42<210>24<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<400>24gtcccccagccggtcagccagucucagagctatgctgtcctg42<210>25<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<400>25ggcagccagcatgaugagacgucucagagctatgctgtcctg42<210>26<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<400>26gaggagctccaagaagacuggucucagagctatgctgtcctg42<210>27<211>20<212>dna<213>智人<400>27gagtccgagcagaagaagaa20<210>28<211>20<212>dna<213>智人<400>28gagttagagcagaagaagaa20<210>29<211>20<212>dna<213>智人<400>29aggtactagcagaagaagaa20<210>30<211>20<212>dna<213>智人<400>30acgtctgagcagaagaagaa20<210>31<211>20<212>dna<213>智人<400>31aggtgctagcagaagaagaa20<210>32<211>20<212>dna<213>智人<400>32gggtggggggagtttgctcc20<210>33<211>20<212>dna<213>智人<400>33ggatggagggagtttgctcc20<210>34<211>20<212>dna<213>智人<400>34ggggaggggaagtttgctcc20<210>35<211>20<212>dna<213>智人<400>35gggagggtggagtttgctcc20<210>36<211>20<212>dna<213>智人<400>36cgggggagggagtttgctcc20<210>37<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>37ggggccactagggacaggatgtctcagagctatgctgtcctg42<210>38<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<400>38ggggccactagggacaggatgucucagagctatgctgtcctg42<210>39<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<400>39ggggccactagggacaggatgtctcagagctatgctgtcctg42<210>40<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<400>40ggggccactagggacaggaugtctcagagctatgctgtcctg42<210>41<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<400>41ggggccactagggacaggaugucucagagctatgctgtcctg42<210>42<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<400>42ggggccacuagggacaggaugtctcagagctatgctgtcctg42<210>43<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<400>43ggggccactagggacaggatgucucagagctatgctgtcctg42<210>44<211>42<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡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223>a,c,t,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(15)..(17)<223>a,c,u,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(18)..(18)<223>a,c,t,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(19)..(19)<223>a,c,u,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(20)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>146nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuagtactctggaaacagaaucuacuaaaaacaaggc60caaaaugccgguguuuaucuucgucaacuuuguuggcgaggauuuu106<210>147<211>56<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(15)<223>a,c,t,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(16)..(20)<223>a,c,u,g,未知或其他<400>147nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuuguactctcaagatttaagtaactgtacaac56<210>148<211>56<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(20)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>148nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuugtactctcaagatttaagtaactgtacaac56<210>149<211>56<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(20)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>149nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuuguacuctcaagatttaagtaactgtacaac56<210>150<211>89<212>rna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>150cuuacacaguuacuuaaaucuugcagaagcuacaaagauaaggcuucaugccgaaaucaa60cacccugucauuuuauggcaggguguuuu89<210>151<211>106<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成多核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(15)<223>a,c,t,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(16)..(20)<223>a,c,u,g,未知或其他<400>151nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuuguactcgaaagaagcuacaaagauuaaggcuuca60augccgaaauucaacacccuugucauuuuaauggcaggguuguuuu106<210>152<211>106<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成多核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(20)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>152nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuuguactcgaaagaagcuacaaagauuaaggcuuca60augccgaaauucaacacccuugucauuuuaauggcaggguuguuuu106<210>153<211>106<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成多核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(20)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>153nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuuguacucgaaagaagcuacaaagauuaaggcuuca60augccgaaauucaacacccuugucauuuuaauggcaggguuguuuu106<210>154<211>56<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(15)<223>a,c,t,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(16)..(20)<223>a,c,u,g,未知或其他<400>154nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuguagcucccattctcatttcgcagtgctacaat56<210>155<211>56<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(20)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>155nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuguagctcccattctcatttcgcagtgctacaat56<210>156<211>56<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(20)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>156nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuguagcucccattctcatttcgcagtgctacaat56<210>157<211>119<212>rna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<400>157auugucgcacugcgaaaugagaaccguugcuacaauaaggccgucugaaaagaugugccg60caacgcucugccccuuaaagcuucugcuuuaaggggcaucguuuauuucgguuaaaaau119<210>158<211>110<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成多核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(15)<223>a,c,t,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(16)..(20)<223>a,c,u,g,未知或其他<400>158nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuguagcucccattctcgaaagagaaccgguugcuacaa60auaaggccguucugaaaagaaugugccgcaaacgcucugcccccuuaaag110<210>159<211>110<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成多核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(20)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>159nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuguagcucccattctcgaaagagaaccgguugcuacaa60auaaggccguucugaaaagaaugugccgcaaacgcucugcccccuuaaag110<210>160<211>110<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成多核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(20)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>160nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuguagcucccattctcgaaagagaaccgguugcuacaa60auaaggccguucugaaaagaaugugccgcaaacgcucugcccccuuaaag110<210>161<211>56<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(14)<223>a,c,t,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(15)..(20)<223>a,c,u,g,未知或其他<400>161nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuuguactctcaagatttaagtaaccgtaaaac56<210>162<211>56<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(20)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>162nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuugtactctcaagatttaagtaaccgtaaaac56<210>163<211>56<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(20)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>163nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnguuuuuguacucucaagatttaagtaaccgtaaaac56<210>164<211>90<212>rna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>164cuugcacgguuacuuaaaucuugcugagccuacaaagauaaggcuuuaugccgaauucaa60gcaccccauguuuugacaugaggugcuuuu90<210>165<211>106<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成多核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(1)..(15)<223>a,c,t,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(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子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(44)<223>a,c,u,g,未知或其他<400>190aauutctacuguugtagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn44<210>191<211>44<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(44)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>191aauuucuacuguuguagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn44<210>192<211>44<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(44)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>192aauutctacuguuguagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn44<210>193<211>44<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(21)<223>a,c,u,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(22)..(44)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>193aauutctacuguuguagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn44<210>194<211>44<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(24)<223>a,c,u,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(25)..(44)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>194aauutctacuguuguagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn44<210>195<211>44<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(29)<223>a,c,u,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(30)..(44)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>195aauutctacuguuguagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn44<210>196<211>44<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(44)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>196aauuucuacuguugtagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn44<210>197<211>44<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(21)<223>a,c,u,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(22)..(44)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>197aauuucuacuguugtagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn44<210>198<211>44<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(24)<223>a,c,u,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(25)..(44)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>198aauuucuacuguugtagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn44<210>199<211>44<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(29)<223>a,c,u,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(30)..(44)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>199aauuucuacuguugtagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn44<210>200<211>44<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(44)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>200aauutctacuguugtagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn44<210>201<211>44<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(21)<223>a,c,u,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(22)..(44)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>201aauutctacuguugtagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn44<210>202<211>44<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(24)<223>a,c,u,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(25)..(44)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>202aauutctacuguugtagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn44<210>203<211>44<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成寡核苷酸"<220><221>修饰的碱基<222>(20)..(29)<223>a,c,u,g,未知或其他<220><221>修饰的碱基<222>(30)..(44)<223>a,c,t,g,未知或其他<400>203aauutctacuguugtagaunnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnn44<210>204<211>97<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成多核苷酸"<400>204tacgcgtacgcgtacgugugguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguc60cguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu97<210>205<211>105<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成多核苷酸"<400>205tacgcgtacgcgtacgugugguuuuagagctatgctgaaaagcatagcaaguuaaaauaa60ggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcu105<210>206<211>105<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成多核苷酸"<220><221>来源<223>/注="组合的dna/rna分子的描述：合成多核苷酸"<400>206tacgcgtacgcgtacgugugguuuuagagctatgctgaaaagcatagcaaguuaaaauaa60ggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggtgcu105<210>207<211>98<212>rna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>207ggcguacgcguacgugugguuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaggcuaguccg60uuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuu98<210>208<211>60<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>208ctacactctttccctacacgacgctcttccgatctaaggcgcaaatgagtagcagcgcac60<210>209<211>57<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>209caagcagaagacggcatacgagctcttccgatctcacctgctgggaattgtaccgta57<210>210<211>60<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>210ctacactctttccctacacgacgctcttccgatctggaacgcaaatgagtagcagcgcac60<210>211<211>60<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>211ctacactctttccctacacgacgctcttccgatctccttcgcaaatgagtagcagcgcac60<210>212<211>60<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>212ctacactctttccctacacgacgctcttccgatctgaagcgcaaatgagtagcagcgcac60<210>213<211>60<212>dna<213>人工序列<220><221>来源<223>/注="人工序列的描述：合成寡核苷酸"<400>213ctacactctttccctacacgacgctcttccgatctaggacgcaaatga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