二醇生成用重组微生物的制作方法

文档序号：13950480阅读：274来源：国知局

本发明涉及二醇生成用重组微生物。

背景技术：

具有4个碳和2个羟基(-oh)的2,3-丁二醇为可作为合成橡胶(syntheticrubber)的主要原料物质的1,3-丁二烯(1,3-butadiene)和作为溶剂的甲基乙基酮(methylethylketone，mek)的前体(precursor)使用的产业上的潜在性非常高的化学物质。并且，2,3-丁二醇的冰点非常低，因此可直接使用成防冻剂(antifreezingagent)，并且辛烷值(octanenumber)高，因此可通过与现有汽油(gasoline)混合来用作辛烷值增进剂(octanebooster)。

具有3个碳和2个羟基(-oh)的1,3-丙二醇可用作聚酯或聚氨酯等高分子的单体，并且，可用作对化妆品及个人卫生用品等的性质改善用途的添加剂。尤其，在借助1,3-丙二醇和苯二甲酸(terephthalicacid)的聚合反应而生成的作为线性的芳香族聚酯的聚对苯二甲酸丙二醇酯(ptt，polytrimethyleneterephthalate)中，在半晶体(semi-crystal)分子结构上产生的被称为纽结(kink)的独特的扭曲存在于高分子链上，因此防弹性及形态稳定性优秀，根据这些结构上的特性，可适用于纤维、包装和薄膜、非织造结构物、工程塑料等多种领域。

上述多种二醇可通过化学合成工序或微生物发酵工序生成。但是，化学合成工序存在在进行工序的过程中产生环境污染物质或者合成费用高的问题。并且，在通过微生物发酵工序生成二醇(2,3-丁二醇、1,3-丙二醇)的过程中，在发酵培养液不仅存在二醇，还一同产生琥珀酸(succinate，丁二酸)、乙酸(acetate)等，因此存在使分离及回收费用增加的问题。

为此，本发明人在研究产业上可利用的二醇的生成能力高的重组微生物的过程中，制备出了二醇的生成能力高且琥珀酸及乙酸的生成能力低的重组微生物，由此完成了本发明。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题

本发明的目的在于，提供二醇的生成能力高且副产品的生成能力低的二醇生成用重组微生物。

技术方案

为了实现上述目的，本发明提供如下的二醇生成用重组微生物，即，具有二醇生物合成途径，上述微生物的特征在于，抑制使丙酮酸(pyruvate)转换成乳酸(lactate)的途径及使草酰乙酸(oxaloacetate)转换成琥珀酸(succinate)的途径。

并且，本发明提供利用上述重组微生物的二醇生成方法。

有益效果

本发明的重组微生物的二醇的生成能力高，并且副产品的生成能力低，因此具有二醇的生成及回收简单的优点。

附图说明

图1为示出在本发明的重组微生物中通过基因缺失的代谢途径的变化的图。

图2为示出kpwt的二醇的生成能力及细胞浓度(od600值)的图。

图3为示出kpwt的发酵液内的副产品的生成能力的图。

图4为示出kpδldha的二醇的生成能力及细胞浓度(od600值)的图。

图5为示出kpδldha的发酵液内的副产品的生成能力的图。

图6为示出kpδldhaδmdh的二醇的生成能力及细胞浓度(od600值)的图。

图7为示出kpδldhaδmdh的发酵液内的副产品的生成性的图。

图8为示出kpδldhaδfuma的二醇的生成能力及细胞浓度(od600值)的图。

图9为示出kpδldhaδfuma的发酵液内的副产品的生成能力的图。

图10为示出菌株的时间别二醇的生成能力的图。

图11为示出菌株的时间别琥珀酸的生成能力的图。

具体实施方式

本发明涉及如下的二醇生成用重组微生物，即，具有二醇生物合成途径，上述微生物的特征在于，抑制使丙酮酸转换成乳酸的途径及使草酰乙酸转换成琥珀酸的途径。

并且，本发明涉及如下的二醇生成方法，即，包括：培养本发明的二醇生成用重组微生物的步骤；以及从上述培养物回收二醇的步骤。

最优选的实施方式

并且，本发明涉及如下的二醇生成方法，即，包括：培养本发明的二醇生成用重组微生物的步骤；以及从上述培养物回收二醇的步骤。

以下，对本发明进行详细的说明。

具有二醇生物合成途径的微生物

本发明的微生物具有二醇生物合成途径。上述微生物只要是具有前述的二醇生物合成途径的微生物即可，并不进行特别的限定。上述二醇生物合成途径是指从微生物内的特定代谢产物合成出二醇的途径。本发明的二醇生物合成途径可以为从丙酮酸合成出2,3丁二醇的途径和/或从甘油合成出1,3丙二醇的途径等。优选地，本发明的微生物具有从甘油等的碳源合成出二醇的途径。

并且，本发明的微生物可以为以野生型的方式具有二醇生物合成途径的微生物或者借助基因重组而成的重组微生物。优选地，上述微生物为具有1,3-丙二醇和/或2,3丁二醇的生成能力的微生物。上述微生物可选自由克雷白氏杆菌(klebsiella)属、肠杆菌(enterobacter)属、乳酸菌(lactobacillus)属组成的组，优选为克雷白氏杆菌属，更优选为肺炎克雷伯氏菌。

使丙酮酸转换成乳酸的途径

乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase)调节丙酮酸转换成乳酸。可通过抑制上述乳酸脱氢酶来抑制使丙酮酸转换成乳酸的途径。上述乳酸脱氢酶的抑制可根据乳酸脱氢酶的表达抑制、乳酸脱氢酶的活性抑制等来实现。例如，使作为编码对乳酸脱氢酶的基因的ldha缺失或者在上述基因产生突变(使部分碱基产生变异、取代或去除或者导入部分碱基来抑制正常基因的表达等的突变)或者调节转录过程或翻译过程中的基因表达等，本发明所属技术领域的普通技术人员可选择适当的方法来抑制乳酸脱氢酶。

使草酰乙酸转换成琥珀酸的途径

具有本发明的丙酮酸生物合成途径的微生物具有使草酰乙酸转换成琥珀酸的途径。上述使草酰乙酸转换成琥珀酸的途径优选为使草酰乙酸通过苹果酸及富马酸转换成琥珀酸的途径。

优选地，上述使草酰乙酸转换成琥珀酸的途径的抑制通过抑制使草酰乙酸转换成苹果酸的途径或使苹果酸转换成富马酸的途径来进行，更优选地，通过抑制苹果酸脱氢酶或延胡索酸来抑制上述使草酰乙酸转换成琥珀酸的途径。最优选地，使mdh或fuma(或fumabc)基因缺失或者灶上述基因产生突变(使部分碱基产生变异、取代或去除或者导入部分碱基来抑制正常基因的表达等的突变)或者调节转录过程或翻译过程中的基因表达等，由此抑制上述使草酰乙酸转换成琥珀酸的途径。上述mdh基因为具有seqidno：9和80％以上的同源性的碱基序列，优选为具有85％以上的同源性的碱基序列，更优选为具有90％以上的同源性的碱基序列，最优选为具有95％以上的同源性的碱基序列。上述fuma基因为具有seqidno：17和80％以上的同源性的碱基序列，优选为具有85％以上的同源性的碱基序列，更优选为具有90％以上的同源性的碱基序列，最优选为具有95％以上的同源性的碱基序列。

二醇

本发明的重组微生物为二醇生成用重组微生物。上述二醇优选为碳数为5以下的二醇，更优选为1,3-丙二醇或2,3-丁二醇。最优选地，本发明的重组微生物在发酵产物中以高比率生成1,3-丙二醇和2,3-丁二醇。

二醇生成用重组微生物

本发明的重组微生物的二醇的生成性(单位时间、单位体积生成的二醇的量)、生成能力(单位体积生成的二醇的量，即，发酵液内的二醇的浓度)、收率(相对碳源量的二醇的生成量)高，尤其，上述重组微生物的特征在于，在发酵过程中，与野生型微生物相比，发酵液内的二醇的浓度高。并且，本发明的重组微生物的特征在于，抑制乳酸、琥珀酸、乙酸等的氧化副产品的生成。

优选地，与野生型微生物相比，本发明的重组微生物增加二醇生成性，并且抑制琥珀酸(即，丁二酸)生成能力或乙酸(即，醋酸)生成性。更优选地，本发明的重组微生物的二醇生成性为琥珀酸生成性的15倍以上，更优选地，二醇生成性为琥珀酸生成性的18倍以上。尤其，在本发明的重组微生物为抑制使草酰乙酸转换成苹果酸的途径的重组微生物的情况下，二醇生成性为琥珀酸生成性的80倍以上，优选为90倍以上，更优选为100倍以上。

更优选地，本发明的重组微生物抑制使丙酮酸转换成乳酸的途径，与不抑制使草酰乙酸转换成琥珀酸的途径的重组微生物相比，抑制乙醇生成能力或琥珀酸的生成能力。

二醇生成方法

本发明涉及如下的二醇生成方法，即，包括：培养本发明的二醇生成用重组微生物的步骤；以及从上述培养物回收二醇的步骤。上述培养在好氧条件下进行，优选地，在微好氧条件(microaerobiccondition)下进行。例如，上述培养在培养的过程中以供给氧的方式执行，即，以供给空气的方式执行，作为具体例，上述培养可通过搅拌来实现，但并不限定于此。

以下参照后述的实施例会让本发明的优点、特征及实现这些优点和特征的方法更加明确。但是，本发明并不局限于以下所公开的实施例，能够以互不相同的各种方式实施，本实施例用于使本发明所属技术领域的普通技术人员完整地理解本发明的范畴，本发明仅由发明要求保护范围定义。

<材料及方法>

使用肺炎克雷伯氏菌gsc123(kctc12133bp)。

在本发明中，微生物的代谢产物生成能力的计算如下。

-产物的浓度(g/l)：按单位体积生成的特定产物的量

-产物的收率(g/g)：特定产物的生成量(g)/碳源(g)

-产物的生成性(g/l/h)：按单位时间、单位体积生成的特定产物的量

<实验例1>重组微生物的制备

肺炎克雷伯氏菌gsc123△ldha(kp△ldha)菌株

由以下述方法制备乳酸脱氢酶(ldha)缺失的肺炎克雷伯氏菌gsc123△ldha(kp△ldha)菌株。首先，为了克隆肺炎克雷伯氏菌的乳酸脱氢酶，利用seqidno：3及4的引物并通过聚合酶链反应(pcr)来扩增作为靶基因的ldha(seqidno：1)的同源区1(seqidno：2)。并且，利用seqidno：6及7的引物并通过聚合酶链反应来扩增同源区2(seqidno：5)。然后，同时将同源区1和同源区2为模板并通过聚合酶链反应进行扩增，由此完成了接合有同源区1和同源区2的脱氧核糖核酸(dna)片段(seqidno：8)(表1)。

为了提高靶基因的重组概率，上述所完成的脱氧核糖核酸片段可包含抗生素耐药性基因等，为了去除在染色体内重组的抗生素耐药性基因，可包含对果聚糖蔗糖酶进行编码的sacb基因。

在所制备的上述脱氧核糖核酸片段中，利用电穿孔法(electroporation，25uf，200ω，18kv/cm)来向肺炎克雷伯氏菌野生型(即，肺炎克雷伯氏菌gsc123(kctc12133bp))传递，并且利用微生物本身具有的同源重组机制来去除靶基因。

表1

肺炎克雷伯氏菌gsc123△ldha△mdh(kp△ldha△mdh)菌株

由以下述方法制备使苹果酸脱氢酶(mdh)进一步缺失的肺炎克雷伯氏菌gsc123△ldha△mdh(kp△ldha△mdh)菌株。首先，为了克隆肺炎克雷伯氏菌的苹果酸脱氢酶，利用seqidno：11及12的引物并通过聚合酶链反应来扩增使作为靶基因的mdh(seqidno：9)的同源区1(seqidno：10)。并且，利用seqidno：14及15的引物并通过聚合酶链反应来扩增使同源区2(seqidno：13)。然后，同时将同源区1和同源区2为模板，并通过聚合酶链反应进行扩增，由此完成接合有同源区1和同源区2的脱氧核糖核酸片段(seqidno：16)(表2)。

在所制备的上述脱氧核糖核酸片段中，可利用电穿孔法(electroporation，25uf，200ω，18kv/cm)来向使乳酸脱氢酶(ldha)缺失的肺炎克雷伯氏菌gsc123△ldha(kp△ldha)菌株传递，并且利用微生物

表2

肺炎克雷伯氏菌gsc123△ldha△fuma(kp△ldha△fuma)菌株

由以下述方法制备使延胡索酸(fuma)进一步缺失的肺炎克雷伯氏菌gsc123△ldha△fuma(kp△ldha△fuma)菌株。首先，为了克隆肺炎克雷伯氏菌的延胡索酸，利用seqidno：19及20的引物并通过聚合酶链反应来扩增使作为靶基因的fuma(seqidno：17)的同源区1(seqidno：18)。并且，利用seqidno：22及23的引物并通过聚合酶链反应来扩增使同源区2(seqidno：21)。然后，同时将同源区1和同源区2为模板，并通过聚合酶链反应进行扩增，由此完成接合有同源区1和同源区2的脱氧核糖核酸片段(seqidno：24)(表3)。

在所制备的上述脱氧核糖核酸片段中，利用电穿孔法(electroporation，25uf，200ω，18kv/cm)来向使乳酸脱氢酶(ldha)缺失的肺炎克雷伯氏菌gsc123△ldha(kp△ldha)菌株传递，并且利用微生物本身具有的同源重组机制来去除靶基因。

表3

<实验例2>二醇的生成

培养在上述实验例1制备的重组菌株来生成二醇。此时，作为比较例使用野生型肺炎克雷伯氏菌gsc123(kpwt)。

将各重组菌株接种于300ml的复合培养基，在37℃的温度下培养16小时后，将上述培养液接种于3l的复合培养基，并进行发酵。此时，发酵条件如下：微好氧条件(micro-aerobiccondition；好氧速度为0.5vvm，搅拌速度为300rpm)，开始时为20g/l的甘油，培养(feeding)时为30g/l的甘油，ph为6.0，培养温度为37℃。为了调节发酵中的ph而使用氨水(nh4oh)。相对上述重组克雷白氏杆菌而使用发酵中的样品，通过检测所使用的试料的od600(光密度(opticaldensity))来检测生长速度，在13000rpm的条件下对所使用的试料进行10分钟左右的离心分离后，通过液色谱法(hplc)分析上清液的代谢产物浓度。

其结果，使ldha缺失的重组菌株(kp△ldha)大幅度减少作为野生型肺炎克雷伯氏菌(kpwt)的最大副产品的乳酸。但是，增加了除了上述副产品之外的乙醇、琥珀酸等，尤其，与二醇相比，琥珀酸增加了约10％。

另一方面，可知，与野生型菌株及时ldha缺失的重组菌株(kp△ldha)相比，使ldha及mdh缺失的重组菌株(kp△ldha△mdh)及使ldha及fuma缺失的重组菌株(kpδldhaδfuma)增加了二醇的生成，并且显著减少了乙酸及琥珀酸的生成。尤其，与使ldha缺失的重组菌株(kp△ldha)相比，使ldha及mdh缺失的重组菌株(kp△ldha△mdh)及使ldha及fuma缺失的重组菌株(kpδldhaδfuma)的二醇生成分别增加了约10％、5％，琥珀酸的生成减少了约85％、31％。并且，使ldha及mdh缺失的重组菌株(kp△ldha△mdh)及使ldha及fuma缺失的重组菌株(kpδldhaδfuma)的乙酸及乙醇的生成也被减少(表4及表5，图2至图11。图2示出kpwt的二醇的生成能力及细胞浓度(od600值)，图3示出发酵液内的副产品的生成能力。上述细胞浓度是指发酵液内的细胞的量。图4示出kpδldha的二醇的生成能力及细胞浓度(od600值)，图5示出发酵液内的副产品的生成能力。图6示出kpδldhaδmdh的二醇的生成能力及细胞浓度(od600值)，图7示出发酵液内的副产品的生成能力。图8示出kpδldhaδfuma的二醇的生成能力及细胞浓度(od600值)，图9示出发酵液内的副产品的生成能力。图10示出菌株的时间别二醇的生成能力，图11示出时间别琥珀酸的生成能力)。

表4

表5

<保藏号>

保藏单位名：韩国生命工程研究院

保藏号：kctc12133bp

保藏日：2012年2月8日

产业上的可利用性

本发明涉及产业上可利用的二醇的生成能力高的重组微生物。

序列表自由文本

seqidno说明

seqidno1：作为乳酸脱氢酶的基因的ldha的碱基序列。

seqidno2：ldha的同源区1的碱基序列。

seqidno3：用于ldha的同源区1的聚合酶链反应扩增的引物。

seqidno4：用于ldha的同源区1的聚合酶链反应扩增的引物。

seqidno5：ldha的同源区2的碱基序列。

seqidno6：用于ldha的同源区2的聚合酶链反应扩增的引物。

seqidno7：用于ldha的同源区2的聚合酶链反应扩增的引物。

seqidno8：同时将ldha的同源区1和同源区2为模板，并通过聚合酶链反应进行扩增而制备的接合有同源区1和同源区2的脱氧核糖核酸片段。

seqidno9：作为苹果酸脱氢酶的基因的mdh的碱基序列。

seqidno10：mdh的同源区1的碱基序列。

seqidno11：用于mdh的同源区1的聚合酶链反应扩增的引物。

seqidno12：用于mdh的同源区1的聚合酶链反应扩增的引物。

seqidno13：mdh的同源区2的碱基序列。

seqidno14：用于mdh的同源区2的聚合酶链反应扩增的引物。

seqidno15：用于mdh的同源区2的聚合酶链反应扩增的引物。

seqidno16：同时将mdh的同源区1和同源区2为模板，并通过聚合酶链反应进行扩增而制备的接合有同源区1和同源区2的脱氧核糖核酸片段。

seqidno17：作为延胡索酸的基因的fuma的碱基序列。

seqidno18：fuma的同源区1的碱基序列。

seqidno19：用于fuma的同源区1的聚合酶链反应扩增的引物。

seqidno20：用于fuma的同源区1的聚合酶链反应扩增的引物。

seqidno21：fuma的同源区2的碱基序列。

seqidno22：用于fuma的同源区2的聚合酶链反应扩增的引物。

seqidno23：用于fuma的同源区2的聚合酶链反应扩增的引物。

seqidno24：同时将fuma的同源区1和同源区2为模板，并通过聚合酶链反应进行扩增而制备的接合有同源区1和同源区2的脱氧核糖核酸片段。

<110>gs加德士

<120>二醇生成用重组微生物

recombinantmicroorganismforproducingdiols

<130>dnp150068

<160>24

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<212>dna

<213>肺炎克雷伯氏菌

<400>1

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ctggaagagctgaaggcccacggggtgaaatatatcgccctgcgctgcgccgggtttaac240

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gatcagatgaaagacggggtgatggtgatcaacaccagccgcggcgccctgatcgactct720

caggcggccatcgacgccctgaagcaccagaaaattggcgcgctggggctggacgtttat780

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ggcgaaacctgtccgaacgccatcgtctaa990

<210>2

<211>1200

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列

<400>2

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tgttgatctccagctggccaatatgcagccgccagcggctgggacgcgagagacgggcat120

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ccgaccgcgtcaggcgcgggctctcctgcaaagagatacgcgtgcccacgggcagccaga240

tgcccgccagcgtcggcacccagtgggttagcgtcaacagcagggttagcggcaataaca300

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taattgtacgattattttaaatatgctaccgtgacggtataatcactggagaaaagtctt1200

1200

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列

<400>3

tagaggatcccaagcgtgcgcggtgaaccg30

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列

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<210>5

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<212>dna

<213>人工序列

<220>

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ggtcagcggtttgctaaactaccccttatataattacagggcgcgtcgcggtttcacgc1199

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<220>

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