适于保护微生物的组合物的制作方法

本发明涉及组合物，其包含至少一种包括多糖的载体、至少一种抗氧化剂以及至少一种选自半胱氨酸、赖氨酸、丙氨酸和精氨酸的氨基酸。本发明还涉及这种组合物用于在干燥、储存和/或重构期间保护微生物的用途、培养物粉末、制备所述培养物粉末的方法以及包含所述培养物粉末的产品。
背景技术：
：有益的培养物粉末，尤其是益生菌培养物粉末，被添加到各种各样货架稳定的产品中。大多数含益生菌培养物粉末的低含水量产品要求货架期为至少18个月。在此期间，必须保证产品中存在最低量的活微生物。因此，产品中培养物粉末的用量需要将储存期间微生物存活力的损失考虑在内。因此，重要的是寻找在加工期间和储存期间保护微生物以促进其存活的方法。细菌在温热条件下的干燥期间经受各种应力，例如干燥器中的热应力和剪切应力，或由于脱水(例如在喷雾干燥期间)引起的渗透应力。这些应力可能对细菌产生不利甚至致命的影响。通过添加保护剂，细菌可在一定程度上抵抗这些应力而保持稳定。储存期间，细菌会承受另外的应力。此外，当用液体重构粉末时，细菌暴露在渗透应力下。保护剂可在干燥、储存和/或重构期间使微生物稳定。干燥期间的保护效果主要与储存和重构期间的稳定效果有关，因为当微生物在干燥期间受到更好的保护时，它们的损伤更少，因此在储存和重构期间更加强健。文献中已推荐了许多用作保护剂的成分。例如，jp3504365描述了用于细菌冷冻干燥的保护剂，该保护剂包含至少三种选自天冬氨酸、精氨酸、谷氨酸、脯氨酸、赖氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸的成分的混合物。然而，冷冻干燥和使用温热气体的干燥工序(诸如喷雾干燥)在本质上截然不同，它们将生物质暴露在不同的应激因素下。因此，所公开的用于冷冻干燥工序的保护剂对于确定适合用于在使用温热气体的干燥工序(诸如喷雾干燥)以及随后的储存和重构期间保护微生物(诸如细菌)的保护剂没有帮助。一些文献具体涉及微生物的喷雾干燥。例如，ep1281752b1描述了对微生物细胞进行喷雾干燥的方法。重点在于所获得的粉末的颗粒大小和干燥工序使用的低温。该文献还指出，可使用本领域熟知的保护剂。其提供了许多潜在保护剂的示例，即：维生素，诸如抗坏血酸；氨基酸，诸如谷氨酰胺、谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸；糖或糖醇，诸如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖醇或麦芽糖醇；多糖，诸如低聚糖、环糊精或糊精；脂肪，诸如从油菜籽、大豆、花生等中获得的高级脂肪酸；蛋白质，诸如从牛奶、大豆等中获得的那些，以及降解的蛋白质，诸如肽；无机盐，诸如硫酸镁；以及其它物质，诸如蔗糖脂肪酸酯、苹果酸、核酸、酵母提取物、脱脂乳、蛋白胨、明胶、单宁等。这些成分可以单独使用或以它们的任意组合形式使用。该文献没有提供关于选择具有最佳活性的具体成分组合的任何指导。类似地，us6010725涉及微生物的喷雾干燥及其存活。其教导的重点在于喷雾干燥工序中应用的条件。该文献还指出，可使用文献中已知的各种保护剂，并例举了抗坏血酸、氨基酸及其盐(诸如赖氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和谷氨酸钠)、蛋白质或蛋白质水解产物、糖类(诸如乳糖、海藻糖、蔗糖、糊精和麦芽糖糊精)以及脂肪。尽管有许多文献公开了大量可能用作保护剂的成分列表，但需要进一步细化和鉴定在使用温热气体的干燥工序以及随后的储存和重构期间保护微生物的具有优化活性的成分组合。本发明有利地解决了上述问题。技术实现要素：在第一方面，本发明提供了组合物，其包含包括多糖的载体材料、至少一种抗氧化剂以及至少一种选自赖氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和精氨酸的氨基酸。在第二方面，本发明提供了根据本发明的组合物用于在使用温热气体的干燥工序中、在储存期间和/或在重构期间保护微生物的用途。在第三方面，本发明提供了包含活微生物和基质的培养物粉末，该基质包含根据本发明的组合物，该基质：活微生物的干重比为至少1。在第四方面，本发明提供了用于制备培养物粉末的方法，该方法包括：a.通过用微生物发酵产生生物质；b.浓缩步骤a)中获得的生物质；c.用根据本发明的组合物的水性溶液调理该浓缩的生物质；以及d.将经调理的生物质用温热气体干燥以形成粉末。在第五方面，本发明提供了包含根据本发明的培养物粉末的产品。附图说明图1：用glucidexmdde47、乳糖、海藻糖、麦芽糖或蔗糖作为保护剂，长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)bl999在喷雾干燥后和储存2、4、6、8和12周后的对数存活力损失，如在实施例1的预筛选试验中所测量。图2：用木糖醇、山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖醇、肌肉肌醇或甘油作为保护剂，长双歧杆菌bl999在喷雾干燥后和储存2、4、6和8周后的对数存活力损失，如在实施例1的预筛选试验中所测量。图3：用谷氨酸钠、谷氨酰胺、精氨酸、丙氨酸、赖氨酸或半胱氨酸作为保护剂，长双歧杆菌bl999在喷雾干燥后和储存2、4、6和8周后的对数存活力损失，如在实施例1的预筛选试验中所测量。图4：用酪朊酸钠、乳清分离蛋白、热变性乳清分离蛋白或明胶作为保护剂，长双歧杆菌bl999在喷雾干燥后和储存2、4、6和8周后的对数存活力损失，如在实施例1的预筛选试验中所测量。图5：用阿拉伯树胶、λ-角叉菜胶、果胶、瓜尔胶或藻酸盐作为保护剂，长双歧杆菌bl999在喷雾干燥后和储存2、4、6、8和12周后的对数存活力损失，如在实施例1的预筛选试验中所测量。图6：用抗性淀粉、小麦纤维、raftilose或raftiline作为保护剂，长双歧杆菌bl999在喷雾干燥后和储存2、4、6、8和12周后的对数存活力损失，如在实施例1的预筛选试验中所测量。图7：用盐酸甜菜碱、肉碱或脯氨酸作为保护剂，长双歧杆菌bl999在喷雾干燥后和储存2、4、6、8和12周后的对数存活力损失，如在实施例1的预筛选试验中所测量。图8：用卵磷脂、卵磷脂和玉米油的混合物、卵磷脂和葵花油的混合物或卵磷脂和大豆油的混合物作为保护剂，长双歧杆菌bl999在喷雾干燥后和储存2周和3周后的对数存活力损失，如在实施例1的预筛选试验中所测量。图9：用变型a至d和参照物作为保护剂，长双歧杆菌bl999在喷雾干燥后和储存2、4、6、8和12周后的对数存活力损失，如在实施例1的成分组合试验中所测量。图10：用变型e至h和参照物作为保护剂，长双歧杆菌bl999在喷雾干燥后和储存2、4、6、8和12周后的对数存活力损失，如在实施例1的成分组合试验中所测量。图11：在空气对流干燥后储存8周后，样本1、5、6和7(全部包含l-赖氨酸，单独地或与选自l-半胱氨酸、l-丙氨酸和l-精氨酸的另一种氨基酸成对地包含)中长双歧杆菌bl999的对数存活力损失，如实施例2中所测量。图12：在空气对流干燥后储存8周后，样本2、5、8和9(全部包含l-精氨酸，单独地或与选自l-半胱氨酸、l-丙氨酸和l-赖氨酸的另一种氨基酸成对地包含)中长双歧杆菌bl999的对数存活力损失，如实施例2中所测量。图13：在空气对流干燥后储存8周后，样本3、6、8和10(全部包含l-半胱氨酸，单独地或与选自l-精氨酸、l-丙氨酸和l-赖氨酸的另一种氨基酸成对地包含)中长双歧杆菌bl999的对数存活力损失，如实施例2中所测量。图14：在空气对流干燥后储存8周后，样本4、7、9和10(全部包含l-丙氨酸，单独地或与选自l-半胱氨酸、l-精氨酸和l-赖氨酸的另一种氨基酸成对地包含)中长双歧杆菌bl999的对数存活力损失，如实施例2中所测量。图15：在储存4、8和12周后，变型i和j以及参照物中嗜热链球菌(streptococcusthermophilus、)st496的细胞计数，如实施例3中所测量。图16：在储存4、8和12周后，变型k和l以及参照物中鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)lpr的细胞计数，如实施例4中所测量。图17：在储存15、30、60、90和180天后，变型m和参照物中乳酸双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)bl818的细胞计数，如实施例5中所测量。具体实施方式定义“保护剂”：出于本发明的目的，“保护剂”应理解为有效改善活微生物在干燥、储存和/或重构期间的存活力的组合物。“干燥”或“用温热气体干燥”：出于本发明的目的，“干燥”和“用温热气体干燥”可无差别使用，是指在温度高于室温的气体作用下使浓缩物脱水形成粉末的任何方法。气体可加压或处于大气压下。这样的方法为例如喷雾干燥、常压干燥、空气对流干燥或流化床干燥。在最优选的实施方案中，干燥是指喷雾干燥。“重构”：出于本发明的目的，重构是指粉末在液体诸如水、特定重构介质(分析微生物学中使用的)或者饮品(例如牛奶或果汁)中的溶解或悬浮。用于重构的液体可为冷的或热的。优选地是指用水重构。组合物本发明的组合物包含至少一种包括多糖的载体材料、至少一种抗氧化剂以及至少一种选自半胱氨酸、赖氨酸、丙氨酸和精氨酸的氨基酸。优选地，本发明的组合物不是营养组合物，优选地不是完全营养组合物，即这种饮品或食物不提供满足食用它的人或动物的营养需求的均衡营养，优选地，这种营养组合物不构成食用它的个体的全部膳食。在本发明的一个优选实施方案中，该组合物为保护剂。更优选地，其为用于活微生物、更优选地活细菌、最优选地活益生菌的保护剂。甚至更优选地，其为用于在干燥、储存和/或重构期间保护活微生物(诸如细菌)的保护剂。最优选地，其为用于在使用温热气体的干燥工序(诸如喷雾干燥)中、在储存期间和/或在重构期间保护活微生物的保护剂。载体包括多糖。例如，载体可为麦芽糖糊精、糊精、环糊精、淀粉、低聚糖或纤维素。优选地，其为麦芽糖糊精。例如，可使用de为5至12的麦芽糖糊精。载体构成组合物的大部分。载体对于组合物进行稳定的干燥工序是至关重要的，例如，当组合物与微生物一起干燥形成培养物粉末时。载体使得例如喷雾干燥可以在较低温度下进行，并且可以避免粉末在喷雾干燥塔中产生粘性。优选地，基于组合物的总干重计，载体以20至60重量％、更优选地30至56重量％的量存在。在一个实施方案中，载体由如上文所定义的多糖组成。抗氧化剂可为任何种类的抗氧化剂，例如为维生素c、维生素e、谷胱甘肽、辅酶q10、β-胡萝卜素、番茄红素、维生素a或其衍生物。优选地，其为维生素c或其衍生物，最优选地抗坏血酸钠。在一个实施方案中，抗氧化剂不是氨基酸半胱氨酸、赖氨酸、丙氨酸和精氨酸中的一者，甚至更优选地不是氨基酸。抗氧化剂为本发明组合物的重要组分。当与活微生物混合时，其有助于在干燥、储存和/或重构期间保护它们。优选地，基于组合物的总干重计，抗氧化剂(诸如抗坏血酸钠)以13至50重量％、更优选地20至40重量％的量存在。组合物还包含至少一种选自半胱氨酸、赖氨酸、丙氨酸和精氨酸的氨基酸。优选地，组合物包含氨基酸半胱氨酸、赖氨酸、丙氨酸和精氨酸中至少两种的组合，更优选地这些氨基酸中至少三种的组合。在一个优选的实施方案中，氨基酸组合包括赖氨酸和/或半胱氨酸。这些氨基酸优选为其l-对映异构体的形式(l-半胱氨酸、l-赖氨酸、l-丙氨酸和l-精氨酸)。优选地，基于组合物的总干重计，总氨基酸以3.5至37重量％、更优选地3.5至34重量％、最优选地8至34重量％的量存在。基于组合物的总干重计，赖氨酸、丙氨酸和精氨酸各自优选地以0至34重量％、更优选地8至20重量％的量存在。基于组合物的总干重计，半胱氨酸优选地以0至12重量％、更优选地2至10重量％、最优选地2至8重量％的量存在。使用浓度比其它氨基酸更低的半胱氨酸是有利的，因为这会带来感官益处。具体地，将半胱氨酸的浓度限制为基于组合物的总干重计至多10重量％、优选地至多8重量％改善了组合物的味道，从而使消费者可接受性得到改善。特别优选的氨基酸组合包括-半胱氨酸和丙氨酸；-半胱氨酸、赖氨酸和丙氨酸；-赖氨酸和精氨酸；-半胱氨酸和精氨酸；-半胱氨酸、赖氨酸和精氨酸；-赖氨酸、丙氨酸和精氨酸；以及-半胱氨酸、精氨酸和丙氨酸。本发明人惊奇地发现，当培养物粉末中使用(优选地以上述量使用)半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸和丙氨酸时具有优异的保护效果，从而使活微生物在粉末的干燥、储存和/或重构期间损失减少。特别地，实施例1显示，与所有其它测试的单独成分(包括其它氨基酸，诸如脯氨酸、谷氨酸钠或谷氨酰胺)以及各种其它种类的物质和混合物(诸如糖、糖醇、蛋白质、树胶、纤维和乳剂)相比，半胱氨酸、赖氨酸、丙氨酸和精氨酸具有更好的保护效果。实施例1中的成分组合测试也显示，使用这些氨基酸时获得了最佳结果。当组合物中包含氨基酸时，尤其是当存在半胱氨酸和/或赖氨酸时，观察到协同效应。实际上，如实施例2所示，相比于包含单种氨基酸的组合物，在相同的总氨基酸浓度下，包含两种氨基酸(包括赖氨酸和/或半胱氨酸)的组合物对干燥、储存和/或重构期间的活微生物显示出更好的保护效果。载体材料、抗氧化剂以及至少一种选自赖氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和精氨酸的氨基酸是组合物的基本成分。组合物可包含另外的组分。然而，本发明人已经发现，当以有限的浓度使用甚至避免使用某些类型的成分时，可获得改善的保护效果。因此，优选地，基于组合物的总干重计，组合物中乳糖和肌醇的浓度在0至10重量％的范围内。更优选地，组合物不含乳糖和肌醇。本发明人惊奇地发现，这种具有低乳糖和肌醇含量的组合物对干燥、储存和/或重构期间的活微生物具有优异的保护效果。出于本发明的目的，“肌醇”是指其任何立体异构体形式(肌肉肌醇、鲨肌醇、粘质肌醇、d-手性肌醇、新肌醇、l-手性肌醇、异肌醇、表肌醇和顺式肌醇)。肌醇的最常见形式是肌肉肌醇，因此在一个实施方案中，肌醇被定义为肌肉肌醇。在一个优选的实施方案中，所有必需成分(载体、抗氧化剂以及任意一种或多种氨基酸赖氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和/或精氨酸)的总浓度占80至100重量％，其它成分的总浓度占0至20重量％，这些百分比基于组合物的总干重定义。在本发明的最优选实施方案中，组合物基本上由至少一种载体、至少一种抗氧化剂以及至少一种选自赖氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和精氨酸的氨基酸组成，如上述实施方案中的任一实施方案所定义，优选地以所示的量存在。更优选地，组合物由至少一种载体、至少一种抗氧化剂以及至少一种选自赖氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和精氨酸的氨基酸组成，如上述实施方案中的任一实施方案所定义，优选地以所示的量存在。最优选地，组合物由麦芽糖糊精、抗坏血酸钠以及至少一种选自赖氨酸、半胱氨酸、丙氨酸和精氨酸的氨基酸组成，如上述实施方案中的任一实施方案所定义，优选地以所示的量存在。组合物的用途根据任一上述实施方案的组合物可有利地用于在干燥工序(诸如喷雾干燥)、储存和/或重构期间保护活微生物。优选地，在干燥工序(优选地喷雾干燥工序)之后进行储存和/或重构。优选地，保护剂可使干燥工序以及随后的37℃下储存12周期间的活微生物损失限制在最大1.5log，更优选地小于1log，并且可在粉末形式的产品中实现室温下12个月的货架期。绝对对数存活力损失会根据微生物菌株、储存温度、储存时间和储存期间介质(例如其中掺入了微生物的产品)的水活性而不同。不管特定菌株测量的绝对对数存活力损失如何，与在干燥、储存和/或重构期间未使用本发明组合物的相同微生物菌株相比，并且优选地还与在干燥、储存和/或重构期间使用由载体和单独的抗氧化剂(即不含氨基酸)组成的保护剂的相同微生物菌株相比，本发明实现的保护效果涉及该微生物菌株存活力对数损失的降低。活微生物可为任何种类的活微生物。优选地，微生物为细菌，更优选地有益细菌(例如益生菌)。益生菌被定义为对宿主的健康或良好状态具有有益效果的微生物细胞制备物(salminens，ouwehanda.bennoy.等人，“probiotics：howshouldtheybedefined”trendsfoodsci.technol.1999：10107-10)。当微生物能够在受控的培养条件下繁殖并形成菌落或悬浮液时，或者当使用本领域技术人员已知的方法(例如流式细胞术)可建立微生物代谢活性和/或膜完整性时，该微生物被认为是“活的”。本申请中提供的实施例表明，本发明的组合物在干燥和随后的储存和重构期间成功地保护了多种微生物菌株。因此，效果不是菌株特异性的，可应用于多种微生物菌株。可受本发明组合物保护的细菌的示例包括双歧杆菌(bifidobacteria)、乳杆菌(lactobacilli)、乳球菌(lactococci)、肠球菌(enterococci)、链球菌(streptococci)、明串珠菌(leuconostoc)、埃希氏菌(escherichia)、丙酸杆菌(propionibacteria)或它们的组合，优选地长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)、乳双歧杆菌(bifidobacteriumlactis)、动物双歧杆菌(bifidobacteriumanimalis)、短双歧杆菌(bifidobacteriumbreve)、婴儿双歧杆菌(bifidobacteriuminfantis)、青春双歧杆菌(bifidobacteriumadolescentis)、嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(lactobacilluscasei)、副干酪乳杆菌(lactobacillusparacasei)、唾液乳杆菌(lactobacillussalivarius)、鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)、约氏乳杆菌(lactobacillusjohnsonii)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)、乳酸乳球菌(lactococcuslactis)、嗜热链球菌(streptococcusthermophilus)、二丁酮乳球菌(lactococcusdiacetylactis)、乳脂乳球菌(lactococcuscremoris)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)、德氏乳杆菌乳酸亚种(lactobacillusdelbruckiisubsp.lactis)、瑞士乳杆菌(lactobacillushelveticus)、大肠杆菌(escherichiacoli)、屎肠球菌(enterococcusfaecium)、假肠膜明串珠菌(leuconostocpseudomesenteroides)、两歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)、加氏乳杆菌(lactobacillusgasseri)、清酒乳杆菌(lactobacillussakei)、唾液链球菌(streptococcussalivarius)和/或它们的混合物以及它们的任何亚种。可受有效保护的细菌菌株的示例包括长双歧杆菌bl999(atccbaa-999)、长双歧杆菌(cncmi-2618)、短双歧杆菌(cncmi-3865)、乳酸双歧杆菌bl818(cncmi-3446)、约氏乳杆菌la1(cncmi-1225)、副干酪乳杆菌(cncmi-2116)、鼠李糖乳杆菌lpr(cgmcc1.3724)、嗜热链球菌(cncmi-1422)、嗜热链球菌st496(cncmi-4153)、干酪乳杆菌(cncmi-1518)、干酪乳杆菌(aca-dc6002)、大肠杆菌nissle、保加利亚乳杆菌(lactobacillusbulgaricus)(cncmi-1198)、乳酸乳球菌(cncmi-4154)或它们的组合。在一个实施方案中，微生物选自长双歧杆菌bl999(atccbaa-999)、嗜热链球菌st496(cncmi-3915)、鼠李糖乳杆菌lpr(cgmcc1.3724)和乳酸双歧杆菌bl818(cncmi-3446)。培养物粉末本发明人目前已经开发出在储存和/或重构期间具有改善的稳定性的培养物粉末。培养物粉末包含活微生物和基质，基质包含如在上文在标题“组合物”下所述的实施方案中的任一实施方案中定义的组合物。优选地，培养物粉末包含基质和活微生物，其中所述基质由本发明的组合物组成，诸如上文在标题“组合物”下所述的组合物。最优选地，培养物粉末由基质和活微生物组成，其中所述基质包含上文在标题“组合物”下所述的本发明组合物，或甚至更优选地由上文在标题“组合物”下所述的本发明组合物组成。为了确保活微生物的有效保护，培养物粉末中的基质：微生物重量比优选地为至少1。优选地，该比例在1和1.2之间，以获得合适的保护效果并同时保持经济上有效量的微生物。优选地，基质为玻璃态。活微生物如上文在标题“组合物的用途”下所定义。本发明的培养物粉末中活微生物的量可描述为菌落形成单位(cfu)。培养物粉末中所需的活微生物的量可为非常多变的，并且取决于微生物菌株和粉末的预期用途。例如，就益生菌而言，培养物粉末可包含的量为每克培养物粉末至少1e+10cfu、更优选地至少3e+10cfu、最优选地至少1e+11cfu。本发明的培养物粉末中的微生物可为包含微生物和发酵培养基的固体内容物的干生物质的形式。因此，粉末可包含氮源(诸如酵母提取物)、碳源(诸如糖)和/或适合用于微生物生长的发酵培养基中的各种盐。粉末还可包含氮源和碳源的发酵衍生物以及发酵期间由微生物产生的生物活性成分。基于微生物组分(生物质)的总干重计，这类成分通常以0至60重量％、优选地0至50％的量存在。当在生物质与基质混合之前洗涤生物质时，这类附加成分作为微生物级分的一部分以特别少的量存在。除了微生物和基质之外，培养物粉末可包含其它成分。这类成分通常可为另外的载体，例如多糖、二糖或脱脂奶粉。优选地，基质呈玻璃态，而另外的成分不呈玻璃态。用于产生培养物粉末的方法本发明的方法的第一步为通过微生物发酵产生生物质。有氧或无氧条件下的发酵方法是众所周知的。本领域技术人员能够确定发酵培养基的合适组分，并且基于其常识根据待培养的微生物来调节发酵条件。发酵培养基通常包含：-氮源，诸如酵母提取物，-碳源，诸如糖，-微生物所需的各种生长因子(例如矿物质、维生素等)，和-水。发酵优选地以两个步骤进行，先进行起子(starter)发酵，然后进行主发酵步骤。起子发酵和主发酵的发酵培养基可为不同的，也可为相同的。该方法的第二步为生物质的浓缩。这也可使用本领域技术人员已知的方法进行，例如离心或过滤。基于生物质的总干重(即发酵培养基和产生的微生物的总量)计，浓缩后生物质的总固体含量优选地占10至35重量％、优选地14至35重量％。任选地，浓缩可以在洗涤步骤之前进行或与洗涤步骤组合进行，以除去发酵培养基的残留物和/或发酵期间产生的化合物。例如，可通过浓缩生物质、将浓缩的生物质重新悬浮在缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)或类似组合物中并重新浓缩生物质来进行洗涤。该方法的第三步为调理活微生物。在该操作期间，使本发明组合物形式的基质与活微生物接触。本发明的组合物如上文在标题“组合物”下所述的实施方案中的任一实施方案所定义。优选地，所述基质为保护剂。调理步骤优选地包括以下子步骤：a)制备基质的水性溶液，优选地总固体(ts)含量为40至65％，更优选地45至60％。b)将步骤a)中制备的水性溶液添加至生物质，直至获得基于基质和生物质的总干重(总固体含量)计40至60重量％、优选地50至60重量％、最优选地55％的基质浓度；c)使生物质和基质保持接触20至150分钟的持续时间；d)将ph调节在6.5至8.5之间，优选地在6.8至7.2之间。在该方法的一个替代方案中，步骤c)在步骤d)之前进行。在另一个替代方案中，步骤d)在步骤c)之前进行。生物质与保护剂之间所需的接触时间可分批地或以连续工序实现。当分批进行时，将保护剂和生物质在分批罐中混合并在整个调理持续时间内保持搅拌，任选地在低温条件下、优选地在t＜10℃下进行该工序以防止不期望的微生物的生长和孢子萌发。在连续工序中，生物质与保护剂之间所需的接触时间可用具有相应平均停留时间的连续搅拌罐反应器或具有相应停留时间的活塞流反应器(类似于保持管)来实现。然后使用本领域已知的任何使用温热气体的干燥方法(例如喷雾干燥、流化床干燥、空气对流干燥或大气干燥，更优选地喷雾干燥)来干燥经调理的生物质。例如，ep0818529中描述的条件可应用于喷雾干燥工序，该专利的全部内容以引用方式并入本文。任选地，干燥的培养物粉末可与附加成分干混。这类成分可例如为另外的载体，诸如多糖(如上文所定义)、二糖或脱脂奶粉。产品本发明还提供包含根据上述实施方案中任一实施方案的培养物粉末的产品。该产品可为其中可掺入培养物粉末的任何类型的产品，诸如食物或饮料产品、动物饲料产品、人或动物营养补充剂、药物组合物或化妆品组合物形式的产品。该产品可旨在由最终消费者以固体(诸如粉末形式)或半固体形式(例如以糊剂形式)使用，或者在使用前重构成液体。食物和饮料产品包括旨在由人类口服的以提供营养和/或娱乐为目的所有产品。其可为例如营养组合物，诸如针对婴儿和/或幼儿、怀孕或哺乳期女性或备孕女性、由于健康状况不良需要特殊营养的个体，或者中老年人。更优选地，该营养组合物选自婴儿配方食品、婴儿谷物、较大婴儿配方食品、成长乳和用于怀孕和哺乳期女性或备孕女性的奶产品。食物和饮料产品的其它示例包括乳产品(诸如奶产品或酸奶)、汤、沙司、甜味和成味小吃、粉末状饮品和谷物产品。该产品还可为动物食物产品或动物营养补充剂的形式。优选地，该动物为哺乳动物。动物的示例包括灵长类(例如人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。营养补充剂通常以粉末或片剂或胶囊的形式存在。粉末补充剂通常包括溶解于水中或洒在食物或饮料中的补充剂。这类补充剂旨在为食用它的个体提供另外的营养物和/或健康益处以及其它有益成分，诸如有益微生物(例如益生菌)。根据本发明的补充剂可用于向人类以及如上文所定义的动物提供营养物质和/或健康益处。营养补充剂包括例如添加到母乳中的粉末补充剂，例如用于早产婴儿或低出生体重婴儿。还包括用于怀孕或哺乳期女性或备孕女性的补充剂。药物产品包括旨在治疗或预防有此需求的个体不良医疗状况的粉剂、片剂或胶囊产品。化妆品组合物通常用于对身体产生美学效果，并且可用于局部使用，或者可通过口服途径以粉剂、片剂或胶囊的形式施用。本发明的产品优选地包含活微生物，优选地有益细菌诸如益生菌，含量为基于干重计每克产品至少5e+06cfu。可基于产品的性质，例如基于味道或法规要求，从上述成分中选择基质的成分。现在将通过以下实施例更详细地描述本发明。实施例1：用于长双歧杆菌bl999(atccbaa-999)的保护剂样本制备用适于长双歧杆菌bl999生长的发酵培养基接种2％冻融细菌。起子发酵在以下条件下进行：-10小时发酵时间-用naoh将ph调到ph6。对于主发酵，应用以下条件：-16小时发酵时间，-不调ph-发酵液用co2覆盖-起子接种：2％然后通过离心将生物质浓缩至总固体含量(ts)为14％(2.5e+11cfu/g)。然后根据以下方法对离心的生物质进行调理。将每个样本的保护剂溶解于去离子水中至总固体含量为55％。将300g离心的生物质装入置于冰水浴中的烧杯中。测量生物质的总固体含量，并以55/45(基于干重)的保护剂与生物质比例加入保护剂溶液。将该混合物在冰水浴中轻轻搅拌1小时。然后将ph调至ph7。然后将经调理的浓缩物用实验室规模的喷雾干燥器(buechi，b-290，flawil，switzerland)进行喷雾干燥。空气温度为140℃，塔温通过浓缩流调节至t＝70℃。在干燥期间，将装有浓缩物的烧杯在冰水浴中冷却。预筛选在第一轮试验中，38种成分被选作潜在的保护剂。这些成分对长双歧杆菌bl999的稳定性的影响通过喷雾干燥含保护剂的生物质来测试，该保护剂包括麦芽糖糊精de12、抗坏血酸钠和一种单一附加成分，所述成分来自以下列浓度进行筛选的38种化合物列表：表2：用于预筛选的保护剂的组成成分浓度[重量％]麦芽糖糊精de1268.2抗坏血酸钠13.6单独成分18.2总计100对照用由13.6重量％的抗坏血酸钠和86.4重量％的麦芽糖糊精de12组成的保护剂来制备。将该对照用作参照物，以评估保护剂在喷雾干燥、储存和重构期间对长双歧杆菌bl999的稳定性影响。如上所述制备38种培养物粉末和对照，用38种保护剂中的一种进行调理。粉末中长双歧杆菌的细胞浓度通过传统平板接种方法来检测。这种传统平板接种方法在以下微生物学书中进行了总结：jamesmonroejay，martinj.loessner，davida.golden.2005.modernfoodmicrobiology.第7版，springerscience，newyork，n.y。对干燥之前的浓缩物、刚刚干燥的培养物粉末以及在人工气候室(t＝37℃)中于饱和乙酸钾溶液(aw＝0.22)上方储存2、3、4、6、8和/或12周后的培养物粉末进行细胞计数。如本领域熟知上述平板接种方法的技术人员所知，干燥后和储存后的细胞计数在用重构介质重构粉末后进行测量。用以下公式进行数据评估：其中x0为时间t＝0时的微生物数量，xt为t时刻的微生物数量。当在k次平行测定中测量微生物计数时，为时间t＝0时微生物的平均数量，为t时刻的平均微生物数量，t时刻的平均对数损失由下式给出：测试的单独成分选自这些分子：糖、糖醇、氨基酸和蛋白质。在同一天将组中所测试的所有成分进行喷雾干燥，同样在同一天将参照物与每个组一起再次喷雾干燥。测试的糖为蔗糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖和glucidexmdde47。与参照物相比，糖没有提供任何抵抗细菌在喷雾干燥器中经受的致命应力的保护。虽然糖对干燥期间细菌存活的影响较小，但是已观察到其对储存稳定性的影响。二糖显示出作为保护剂的最佳性能，其中蔗糖被证明是最有效的成分。结果提供在图1中。选择蔗糖和乳糖进行第二轮测试。测试的糖醇为山梨糖醇、甘露糖醇、乳糖醇、肌肉肌醇、木糖醇和甘油。经证明，对含糖醇的浓缩物进行喷雾干燥是非常困难的，因为塔中粉末具有粘性。在干燥期间，一些糖醇显示出轻微的保护效果，诸如甘油、甘露糖醇、木糖醇和山梨醇。在储存测试中，含甘油的粉末样本在不久后塌陷。这种变型的大多数细菌在储存两周后已经死亡，所以停止了储存测试。对于含山梨糖醇、甘露糖醇、肌肉肌醇和乳糖醇的变型，8周后的存活力损失最低。结果在图2中示出。对于第二轮测试，选择山梨糖醇、乳糖醇和肌肉肌醇。测试的氨基酸为l-半胱氨酸、l-赖氨酸、l-精氨酸、l-丙氨酸、l-谷氨酰胺和l-谷氨酸钠。与糖相比，一些氨基酸在干燥期间使细菌稳定。虽然参照物在干燥期间的存活力损失为1log，但对于含半胱氨酸的变型，损失只有0.2log。虽然已知抗坏血酸钠和半胱氨酸具有抗氧化性质，但令人惊奇地是，半胱氨酸具有在干燥期间保护微生物的能力，而抗坏血酸钠对干燥工序中细菌的存活没有显示出显著影响。在所有的氨基酸中，而且与该预筛选阶段中所有其它测试成分相比，含半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸或丙氨酸的样本在储存和重构期间显示出最低的损失。选择这些氨基酸进行第二轮试验。结果汇总在图3中。测试的蛋白质为明胶、热变性乳清分离蛋白(在t＝80℃下变性30分钟)、乳清分离蛋白和酪朊酸钠。这些蛋白质都没有改善干燥期间的稳定性。在储存期间，热变性乳清分离蛋白在头六周显示出积极的作用，但在8周后，存活力损失与参照物一样高。由于它们表现较差，所以第二轮试验没有选择蛋白质。结果汇总在图4中。所有其它测试成分没有显示出或显示出很少的保护活性，所以没有被选入下一轮试验：-树胶(阿拉伯树胶、λ-角叉菜胶、果胶、瓜尔胶和藻酸盐)，参见图5；-低聚糖(抗性淀粉、小麦纤维、raftilose或raftiline)，参见图6。-其它成分(盐酸甜菜碱、肉碱)和氨基酸脯氨酸，参见图7。预筛选测试清楚地表明，现有技术中提及的在干燥期间对微生物具有潜在保护效果的成分对于在使用温热气体的干燥工序(诸如喷雾干燥)中、在储存期间和/或在重构期间保护活微生物方面具有非常多变的效率。本发明人的工作已经证明，氨基酸半胱氨酸、赖氨酸、丙氨酸和精氨酸与载体和抗氧化剂的组合在喷雾干燥、随后的12周储存和重构期间保护益生菌方面具有优异的效率。成分组合的试验在预筛选步骤中选出最具前景的成分后，设置了实验设计以找出最好的保护剂混合物和最佳浓度分布。首先，进行了可行性试验，其中定义了有关加工的限制。总氨基酸的浓度必须限制在基于保护剂的总干重计总共36.5重量％。由于粉末的粘性，在较高浓度的氨基酸下几乎不可能进行喷雾干燥。对于稳定的喷雾干燥工序，必须将至少31重量％(基于保护剂的总干重计)的麦芽糖糊精掺入到保护剂混合物中。基于生物质和保护剂的总干重计，将生物质的含量固定在占最终粉末的45重量％，因此保护剂的量为55重量％。实验设计包括由预筛选试验中被鉴定为有前景的保护剂成分的各种组合组成的32种变型。根据喷雾干燥器的容纳量，将这些变型分组，每组包括5个变型和参照物，各个组在一天内进行喷雾干燥。使用先前鉴定为在喷雾干燥期间对微生物具有一些弱保护效果的保护剂混合物作为参照物。该参照物的组成提供在下表3中。除了5种变型外，参照物也在每个试验日进行喷雾干燥。在设置的试验日，参照物总是在不同的位置进行喷雾干燥，以消除生物质的储存时间不同带来的影响。当组中的所有样本都已喷雾干燥后，测量存活力损失。因此，根据对5种变型和参照物进行喷雾干燥所需要的时间，喷雾干燥后在进行测量之前的储存时间从0至6小时不等。表3：参照物的组成成分浓度[重量％]麦芽糖糊精50乳糖20肌肉肌醇9谷氨酸钠7抗坏血酸钠14总计100所有变型均按照预筛选试验所述进行制备，使用成分组合代替单一成分。然后进行喷雾干燥，干燥后储存12周，并在2、4、6、8和12周后进行分析，如上文关于预筛选试验所述。使用相同的数学公式进行数据分析。包括最具前景的变型的两个组的结果提供在图9和图10中。这些试验中包括的变型的组成提供在下表4中。表4：变型a至h的组成图9所示的结果表明，变型b和不含本发明中所需的氨基酸赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸和/或丙氨酸中任一者的参照物具有更弱的保护效果，因为这两种样本的对数存活力损失比本发明的变型的对数存活力损失高很多。在本实验设计中表现最好的变型是含有三种氨基酸且不含其它成分(即由谷氨酸钠、麦芽糖糊精和氨基酸赖氨酸、半胱氨酸和丙氨酸组成)的变型d。在图10中，根据本发明的变型f和g还显示出比变型e和h(不含氨基酸)更好的保护效果。该实施例表明，包括广泛的总浓度范围(基于保护剂的总干重计3.8至36.5重量％的范围)的氨基酸半胱氨酸、赖氨酸、丙氨酸和精氨酸的不同混合物的保护剂均提供了保护效果。实施例2：不同氨基酸比例的比较制备包含长双歧杆菌bl999(atccbaa-999)和基质的培养物粉末样本，该基质包含麦芽糖糊精、抗坏血酸钠和单独的或成对组合的氨基酸半胱氨酸、赖氨酸、丙氨酸和精氨酸，如下表5所示。表5：测试样本的基质中的氨基酸组成样本号赖氨酸(％)精氨酸(％)半胱氨酸(％)丙氨酸(％)1340002034003003404000345171700617017071700178017170901701710001717所有的百分比均相对于基质的总重量以重量定义。样本用55％的基质和45％的长双歧杆菌bl999(atccbaa-999)制备，该百分比基于培养物粉末的总干重以重量定义。该基质由33％的麦芽糖糊精dex、33％的抗坏血酸钠和34％的氨基酸组成(如表5所示)构成，该百分比相对于基质的总重量以重量定义。如下所述制备样本。使用与实施例1相同的发酵培养基，让长双歧杆菌bl999在co2顶部空间气氛下的7l发酵罐(newmbr，ch-zürich)中于37℃下生长16小时。未控制发酵的ph。将从发酵罐收集的细胞悬浮液在5℃下以4500rpm离心20分钟(sorvallrc3cplus)。弃去上清液后，将生物质储存在4℃下，然后与保护基质混合。通过滴加30％naoh将浓缩物的ph调至7.0，然后用实验室规模的分析型对流干燥器(acd)干燥(由ivv-fraunhoferinstitut(de-freising)制造)。空气湿度、空气温度、空气流量等相关干燥参数调节如下：-空气流：40m3/h-干燥空气的温度：60℃-干燥空气的相对湿度8％-持续时间660秒如实施例1所述，在干燥之后，以及在人工气候室中于饱和乙酸钠溶液(aw＝0.22)上方在t＝37℃下储存8周后，分析每个样本的对数损失。使用实施例1中描述的方法测量干燥前和储存8周后长双歧杆菌bl999的细胞浓度。也可使用实施例1中描述的等式计算对数损失。结果提供在图11至图14中。这些图表明，与仅使用一种氨基酸的样本相比，在保护剂中使用成对氨基酸的样本显示出降低的对数存活力损失。唯一的例外是用丙氨酸和精氨酸这两种氨基酸的组合产生的样本，与单独的精氨酸或丙氨酸相比，其显示出增加的存活力损失。尽管已证明丙氨酸和精氨酸组合的效果比起单独成分有所降低，但该结果证明了丙氨酸和精氨酸作为单一成分或成对组合具有显著保护效果。这些结果证明了，与使用单一氨基酸相比，成对使用的氨基酸之间(尤其是当存在半胱氨酸和/或赖氨酸时)产生协同作用，因为在相同浓度下，成对氨基酸提供比单一氨基酸更好的稳定性。实施例3：用于嗜热链球菌st496(cncmi-3915)的保护剂已经进行了比较实验来评估根据本发明的组合物在储存和重构期间保护微生物嗜热链球菌st496(cncmi-3915)的性能。制备参照物和两种样本(变型i和j)。使用先前鉴定为在喷雾干燥期间对微生物具有一些弱保护效果的保护剂混合物作为参照物。该参照物的组成提供在上表3中。每个测试样本中使用的保护剂组成在下表6中给出。对于所有样本，基于总固体计，基质浓度为55重量％，微生物浓度为45重量％。表6：样本i和j的组成成分变型i变型j麦芽糖糊精de655.0050.00抗坏血酸钠22.3225.00l-赖氨酸盐酸盐9.3410.30l-半胱氨酸盐酸盐一水合物4.004.40l-丙氨酸9.3410.30总计100.00100.00如下所述，用相同的方法制备参照物和测试样本。将起子培养物以2％的浓度接种到含氮源、碳源和微量元素的合适培养基之后，在3000l生物反应器中于40℃、恒定ph下生产嗜热链球菌9小时。通过离心浓缩发酵结束后的生物质并用基质调理1小时。生物质和基质在经过调理且ph调为7后，使用大小接近工业规模干燥塔的喷雾干燥塔进行大规模喷雾干燥。喷雾干燥后，用参照物和试验样本进行加速储存试验。在对培养物粉末进行喷雾干燥后，以1∶100的比例将培养物粉末与脱脂奶粉混合。然后将该混合物在37℃且aw＝0.25的条件下储存12周。喷雾干燥后和储存4、8和12周后，测量参照物和测试样本中的细胞计数。如实施例1所述测量细胞计数。结果在图15中示出。从图中可以看出，与参照物相比，变型i和j(根据本发明)在储存12周和重构后总微生物细胞计数显著更高。这表明本发明的组合物在喷雾干燥后的储存和重构期间有效地保护了活嗜热链球菌st456。当将该观察结果与其它实施例中得到的结果相结合时，可以看出，本发明组合物的保护效果不是菌株特异性的，其对多种微生物菌株有效。此外，该效果是用不同浓度的保护组合物成分实现的。该实施例还表明，当大规模生产培养物粉末时获得了保护效果。实施例4：用于鼠李糖乳杆菌lpr(保藏号cgmcc1.3724)的保护剂已经进行了比较实验来评估根据本发明的组合物在喷雾干燥、储存和重构期间保护微生物鼠李糖乳杆菌lpr(保藏号cgmcc1.3724)的性能。制备参照物和两种样本(变型k和l)。使用先前鉴定为在喷雾干燥期间对微生物具有一些弱保护效果的保护剂混合物作为参照物。该参照组合物提供在上表3中。每个测试样本中使用的保护剂组成在下表7中给出。对于所有样本，基于总固体计，基质浓度为55重量％，微生物浓度为45重量％。表7：样本k和l的组成如下所述，用相同的方法制备参照物和测试样本。将起子培养物以4％的浓度接种到含氮源、碳源和微量元素的合适培养基(用于获得高产率)后，在3000l生物反应器中于37℃、恒定ph下生产鼠李糖乳杆菌16小时。通过离心浓缩发酵结束后的生物质并用基质调理1小时。生物质和基质在经过调理且ph调为7后，使用大小接近工业规模干燥塔的喷雾干燥塔进行大规模喷雾干燥。喷雾干燥后，用参照物和试验样本进行加速储存试验。在对培养物粉末进行喷雾干燥后，以1∶100的比例将培养物粉末与脱脂奶粉混合。然后将该混合物在37℃且aw＝0.24的条件下储存12周。喷雾干燥后和储存4、8和12周后，测量参照物和测试样本中的细胞计数。如实施例1所述测量细胞计数。结果在图16中示出。从图中可以看出，与参照物相比，变型k和l(根据本发明)在储存12周和重构后总微生物细胞计数显著更高。这表明本发明的组合物在喷雾干燥后的储存和重构期间有效地保护了活鼠李糖乳杆菌lpr。当将该观察结果与其它实施例中得到的结果相结合时，可以看出，本发明组合物的保护效果不是菌株特异性的，其对多种微生物菌株有效。此外，该效果是用不同浓度的保护组合物成分实现的。该实施例还表明，当大规模生产培养物粉末时获得了保护效果。实施例5：用于乳双歧杆菌bl818(保藏号cncmi-3446)的保护剂已经进行了比较实验来评估根据本发明的组合物在喷雾干燥、储存和重构期间保护微生物乳双歧杆菌bl818(保藏号cncmi-3446)的性能。制备参照物和一种测试样本(变型m)。使用先前鉴定为在喷雾干燥期间对微生物具有一些弱保护效果的保护剂混合物作为参照物。该参照物的组成提供在上表3中。该测试样本中使用的保护剂组成在下表8中给出。对于所有样本，基于总固体计，基质浓度为55重量％，微生物浓度为45重量％。表8：样本m的组成成分变型m麦芽糖糊精de652.00抗坏血酸钠23.80l-赖氨酸盐酸盐10.00l-半胱氨酸盐酸盐4.20l-丙氨酸10.00总计100.00使用相同的方法制备参照物和测试样本。喷雾干燥后，将参照物和测试样本在37℃且aw＝0.17的条件下进行180天的加速储存试验。喷雾干燥后和储存15、30、60、90和180天后，测量参照物和测试样本中的细胞计数。如实施例1所述测量细胞计数。结果在图17中示出。从图中可以看出，与参照物相比，变型m(根据本发明)在储存180天和重构后的总微生物细胞计数显著更高。这表明本发明的组合物在喷雾干燥后的储存和重构期间有效地保护了活乳双歧杆菌bl818。本发明样本中的对数存活力损失(如实施例1所述计算)在180天后仅为0.24，表现出非常有效的保护效果。当将该观察结果与其它实施例中得到的结果相结合时，本实施例表明，本发明组合物的保护效果不是菌株特异性的，其对多种微生物菌株有效。此外，该效果是用不同浓度的保护组合物成分实现的。该实施例还表明，当大规模生产培养物粉末时获得了保护效果。pctpctpctpct仅供国际局使用pct当前第1页12