用于制备二醇的方法

专利名称：用于制备二醇的方法
用于制备二醇的方法本发明涉及用于生物制备二醇的新方法，包括培养经遗传修饰以供生物产生脂族二醇的微生物，其中所述微生物包含用两种酶对羟基-2-酮基脂族酸代谢物脱羧的代谢途径具有2-酮酸脱羧酶活性的酶和具有羟基醛还原酶活性的酶。本发明还涉及经修饰以供产生脂族二醇的微生物。
背景技术：
通过培养产生二醇的微生物而发酵产生此类二醇在本领域是已知的，包括用经遗传修饰以供改善二醇产生的微生物进行的发酵产生。此类二醇的产生描述于下述文献 W01996/035796、W02001/012833、W02004/033646、US7267972 及其他。具体而言，已描述了 1，3-丙二醇的产生，其涉及维生素B12依存性酶，从而使得生产工艺非常昂贵。当下对经修饰以从可再生碳源产生二醇和/或对二醇的产生有潜在的促进，特别是具有维生素B12非依存性途径的微生物的备选方案有需求。这些技术改进可在于基于此种产生所必需的能量所产生的产物的总体产率，和最终地，在于为了分离所述产物以及产物的销售和其他用途而有待特别控制的杂质和副产物的水平。

发明内容
本发明涉及经遗传修饰以供生物产生脂族二醇的微生物，其中所述微生物包含供用具有2-酮酸脱羧酶活性的酶对羟基-2-酮基-脂族酸进行脱羧的代谢途径，用具有羟基醛还原酶活性的酶将从所述脱羧步骤获得的产物进一步还原为相应的脂族二醇，且其中所述微生物经遗传修饰以供改善所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物的产生。本发明的微生物一般选自下组细菌、酵母和真菌。优选地，所述微生物选自肠杆菌禾斗(Enterobacteriaceae)、梭菌禾斗(Clostridiaceae)、芽抱杆菌禾斗(Bacillaceae)、链霉菌禾斗(Streptomycetaceae)和棒杆菌禾斗(Corynebacteriaceae) 0依照第一个实施方案所述微生物包含编码2-酮酸脱羧酶活性的内源基因。其优选选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) (Pdc 1, Pdc5, Pdc6, Aro 10, Thi3)；乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) (Kivd)；丙酮丁酉享梭菌(Clostridium acetobutylicum) (Pdc)；拟南芥(Arabidopsis thaliana) (Pdc2, Pdc3)；树干毕赤酵母(Pichia stipitis) (Pdc 1, Pdc2, Aro 10)；运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis) (Pdc)；结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)。该具有内源2_酮酸脱羧酶活性的微生物可进一步修饰以增强编码2-酮酸脱羧酶的内源基因的表达。根据本发明的另一个实施方案，所述微生物并不包含编码2-酮酸脱羧酶的内源基因。此种缺乏内源2-酮酸脱羧酶的微生物优选选自大肠杆菌(Escherichia coli)或谷 M1 酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或才古草芽 包杆菌(Bacillus subtilis)。对于此类微生物，本发明的微生物包含编码2-酮酸脱羧酶的异源基因。根据另一个实施方案，所述微生物包含编码羟基醛还原酶活性的内源基因。其优选选自大肠杆菌(yqhD, fucO, dkgA，dkgB)；酿酒酵母(ADH1，ADH2，...)；和所有具有至少一种具有醛还原酶活性或醇脱氢酶活性的酶的生物。该具有内源羟基醛还原酶活性的微生物可进一步经修饰以增强编码羟基醛还原酶的内源基因的表达。用本发明的微生物产生的脂族二醇是具有包含2至6个碳原子，优选2、3或4个碳原子的直链或支化的烷基链的脂族二醇。在一个优选实施方案中，所述脂族二醇是乙二醇，而所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物是羟基丙酮酸。在另一个优选实施方案中，所述脂族二醇是1，3_丙二醇，而所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物是4-羟基-2-酮基丁酸。在另一个优选实施方案中，所述脂族二醇是1，4_ 丁二醇，而所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物是5-羟基-2-酮基戊酸。本发明还涉及用于生物产生脂族二醇的方法，包括下述步骤-在包含碳源的适当培养基上培养如上和如下所述的本发明的微生物，和-从培养基回收所述脂族二醇。根据本发明的优选实施方案，所述二醇经进一步纯化。发明详述微生物本发明的微生物是经遗传修饰或遗传工程改造的微生物。这表明，根据这些术语的通常含意，本发明的微生物并不见于自然界，而是通过导入或通过缺失新遗传元件 (genetic element)来修饰。其亦可通过在特定选择压力下组合定点诱变和进化迫使新代谢途径的发展和进化而受转化(参见，例如W02004/076659)。根据本发明，术语“微生物”指细菌、酵母或真菌。优选地，所述微生物选自肠杆菌禾斗(Enterobacteriaceae)、梭菌禾斗(Clostridiaceae)、芽抱杆菌禾斗(Bacillaceae)、 链霉菌科(Streptomycetaceae)禾口棒杆菌科(Corynebacteriaceae)0更优选地，所述微生物是埃希氏菌属(Escherichia)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、 克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)、沙门氏菌属(Salmonella)或棒杆菌属 (Corynebacterium)的菌种。甚至更优选地，所述微生物是菌种大肠杆菌(Escherichia coli)或谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)或丙酮丁酉享梭菌(Clostridium acetobutylicum)或枯草芽孢杆菌。如果外源基因与所有允许其在宿主微生物中表达的元件一同导入微生物，所述微生物可表达这些外源基因。用外源DNA转化微生物对于本领域技术人员是常规工作。外源基因可整合入宿主基因组，或通过质粒或载体在染色体外表达。不同类型的质粒对于本领域技术人员是已知的，其在复制起点及其细胞内拷贝数方面有所不同。用于控制基因表达的重要元件为启动子。在本发明一个优选实施方案中，可使用不同强度的启动子表达基因，所述启动子可为诱导型的。这些启动子可为同源的或异源的。 本领域技术人员知道如何选择最为便利的启动子，例如启动子Ptrc、Ptac, Plac或lambda 启动子cl被广泛使用。在具体实施方案中，内源基因亦可经修饰以调制(modulate)其表达和/或活性， 其通过在编码序列中导入突变以修饰基因产物或通过导入异源序列附加至内源调节元件或取代内源调节元件来进行。内源基因的调制可有两种方式一方面，上调和/或增强基因产物的活性；或者另一方面，下调和/或降低内源基因产物的活性。根据本发明术语“基因的减弱”表示对基因表达的部分或完全阻遏 (suppression)，从而所述基因称为“被减弱的”。该对表达的阻遏可为基因表达的抑制，基因表达所需的启动子区的全部或部分的缺失，基因编码区中的缺失，或用较弱的天然或合成启动子替代野生型的启动子。优选地，基因的减弱基本上为该基因的完全缺失，其可由促进本发明的菌株的鉴定、分离和纯化的选择性标记基因所取代。优选通过同源重组技术使基因失活(Datsenko,K. A. &ffanner,B. L. (2000)"One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K_12using PCR products". Proc.Natl. Acad. Sci. USA 97: 6640-6645)。在本发明的其他实施方案中，亦可将内源序列敲除(knocked out)或缺失，以偏向所述新代谢途径。所有用于转化微生物的技术，以及用于增强本发明蛋白质产生所用的调节元件在本领域中是公知的，并可从文献中获得，所述文献包括申请人自己关于在多种微生物中修饰生物合成途径的专利申请，包括 WO 2008/052973、WO 2008/052595、WO 2008/040387、WO 2007/144346、WO 2007/141316、WO 2007/077041, WO 2007/017710, WO 2006/082254、WO 2006/082252、WO 2005/111202、WO 2005/073364、WO 2005/047498、WO 2004/076659，其内容通过提述并入本文。基因和酶活性在本发明的描述中，酶活性亦通过引用编码具有此种活性的酶的基因来命名。除非另行提及，基因和蛋白质一般使用来自大肠杆菌的基因的命名法来鉴定。然而，根据本发明，这些命名法的使用具有更加一般性的含意，并涵盖其他生物，更特别是微生物中，所有相应的基因和蛋白质，所述基因和蛋白质的功能性同源物、功能性变体和功能性片段。在本申请中鉴定的基因及其登录号列于图4。使用用于已知酶活性的IUBMB酶命名作为参考，本领域技术人员能够确定其他生物、细菌菌种、酵母、真菌等中的相同酶活性。该常规工作有利地使用共有序列完成，所述共有序列可通过与来源于其他微生物的蛋白质实施序列比对来确定。用于确定两个蛋白质序列之间同源性百分比的方法对于本领域技术人员是已知的。举例而言，其可在使用可从网站http://www. ebi. ac. uk/clustalw/获得的CLUSTALW 软件用该网站上指示的缺省参数进行序列比对之后完成。根据该比对，通过记录与总残基数比较的在相同位置处相同残基的数目，可容易地进行对同一性百分比的计算。或者，可使用例如可从网站http://www. ncbi. nlm. nih. rov/BLAST/获得的BLAST程序用该网站上指示的缺省参数来进行自动计算。PFAM(隐蔽马尔科夫模型和比对的蛋白家族数据库http://VWW. sanRer. ac. uk/ Software/Pfam/)代表蛋白序列比对的大集合。每个PFAM使得显现多重比对，观察蛋白质结构域，衡量生物之间的分布，访问其他数据库和显现已知蛋白的结构成为可能。COG(蛋白质的直向同源组的簇；http://www. ncbi. nlm. nih. gov/COG/)是通过比较来自代表30个主要系统发生谱系的66个经完整测序的基因组的蛋白序列而获得的。每个COG由至少三个谱系限定，其允许鉴定古老的保守域。与所引用蛋白质分享同源性的蛋白质可从其他微生物获得或为天然蛋白质的变体或功能性片段。术语“功能性变体或功能性片段”意指所述多肽的氨基酸序列可能并不严格地限于自然界中观察到的序列，而是可以含有其他氨基酸。术语“功能性片段”意指所述多肽的序列可包括少于原始序列的氨基酸，但仍旧包括足以赋予参照的原始序列的酶活性的氨基酸。在本领域公知多肽可通过取代、插入、缺失和/或添加一个或多个氨基酸来修饰同时保留其酶活性。举例而言，在给定位置将一个氨基酸用化学上等同而不影响蛋白质功能性质的氨基酸取代是常见的。就本发明而言，取代定义为下述组之一内部的交换■小脂族、非极性或略带极性的残基Ala、Ser, Thr, Pro, Gly■极性、荷负电残基及其酰胺ASp、ASn、Glu、Gln■极性、荷正电残基HiS、Arg、LyS■大脂族、非极性残基Met、Leu、lie, Val, Cys■大芳族残基Wie、Tyr、Trp0可预期导致一种荷负电残基取代另一种(如谷氨酸取代天冬氨酸)或一种荷正电残基取代另一种(如赖氨酸取代精氨酸)的变化产生功能性等同产物。氨基酸序列中氨基酸修饰的位置和受修饰氨基酸的数量并无具体限制。本领域技术人员能够知道可导入而不影响蛋白质活性的修饰。举例而言，可预期在蛋白质N端或C 端部分中的修饰在某些情况下并不改变蛋白质的活性。术语“变体”指受到例如上文所定义的修饰而仍旧保留原始酶活性的多肽。术语“编码(encoding或coding) ”指多核苷酸通过转录和翻译机制产生氨基酸序列的过程。该过程基于遗传密码，遗传密码为DNA中碱基序列和蛋白质中氨基酸序列之间的关系。遗传密码的一个主要特征是其简并性，意指一个氨基酸可由多于一个碱基三联体 (一个“密码子”)所编码。其直接后果是相同的氨基酸序列可由不同的多核苷酸所编码。 本领域技术人员公知密码子的使用可根据生物而变化。在编码相同氨基酸的密码子中，给定微生物可优选地使用其中一些。因此，设计适应于特定微生物的密码子选择以优化相应的蛋白质在该生物中的表达可能是有利的。在一些情况下，基因或酶可由其活性的名称所命名。在一些其他情况下，根据“活性”的命名可意指两种或多种组合时具有所需活性的酶的组合。在此种情况下，该组合中的每个酶可由在不同调节元件的控制下的不同基因，或由在相同操纵子控制下的基因组合所编码。编码2-酮酸脱羧酶活性的基因在本领域是公知的，包括来自不同物种的Pdc基因，且更具体而言为来自酿酒酵母的Pdcl、Pdc5、Pdc6、ArolO和 1 3基因，来自乳酸乳球菌的kivD基因；来自丙酮丁醇梭菌的pdc基因；来自拟南芥的Pdc2和Pdc3基因；来自树干毕赤酵母的Pdcl、Pdc2和ArolO基因；来自运动发酵单胞菌的pdc基因。由来自大肠杆菌的基因sucA编码的2-酮戊二酸脱羧酶复合物的第一个亚基亦具有2-酮酸脱羧酶活性， 由大肠杆菌的基因dxs编码的酶亦如此。本定义涵盖所述基因和蛋白质的功能性同源物、 功能性变体和功能性片段。编码羟基醛还原酶活性的基因在本领域亦为公知的，包括来自大肠杆菌的yqhD、 fucO、dkgA、dkgB基因和来自酿酒酵母的ADHl和ADH2基因。本定义涵盖所述基因和蛋白质的功能性同源物、功能性变体和功能性片段。
发酵产生本发明还涉及脂族二醇的发酵产生，包括下述步骤-在包含碳源的适当培养基上培养微生物，和-从培养基回收所述脂族二醇。所述发酵一般在发酵罐中用适应于所用微生物、含有至少一种简单碳源以及若需要还含有共底物的适当培养基进行。“适当培养基”表示包含对细胞生长和/或维持必需或有益的营养的培养基(例如无菌的液体培养基)，所述营养如碳源或碳底物，氮源例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、 麦芽提取物、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和磷酸铵；磷源例如磷酸单钾(monopotassium phosphate)或磷酸二钾(dipotassium phosphate)；微量元素(例如金属盐)，例如镁盐、 钴盐和/或锰盐；以及生长因子如氨基酸、维生素、生长促进剂(growth promoter)等。作为用于大肠杆菌的已知培养基的实例，所述培养基可与M9培养基(Anderson， 1946,Proc. Natl. Acad. Sci. USA 32 :120-128)、M63培养基(Miller, 1992 ；A Short Course in Bacterial Genetics :A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)或与如由Schaefer等所定义的培养基(1999，Anal. Biochem. 270 :88-96)具有相同或类似组成。作为用于谷氨酸棒杆菌的培养基的另一个实例，所述培养基可为与BMCG培养基 (Liebl 等，1989，AppI. Microbiol. Biotechnol. 32 :205-210)或如 Riedel 等所述的培养基 (2001, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 3 :573-583)具有相同或类似组成。根据本发明，术语“碳源(carbon source或source of carbon)，，或“碳底物，，指任何可由本领域技术人员用于支持微生物正常生长的碳源，包括己糖(如葡萄糖、半乳糖或乳糖)，戊糖，单糖，二糖，寡糖(如蔗糖、纤维二糖或麦芽糖)，糖蜜，淀粉或其衍生物，半纤维素，甘油，及其组合。特别优选的简单碳源是葡萄糖。另一个优选的简单碳源是蔗糖。在本发明的一些实施方案中，所述培养基包含碳源，所述碳源是另一个使用生物质作为起始材料的过程的副产物，或是最终机械和/或化学和/或酶以及在这些情况下体外或体内的生物质降解如纤维素降解的产物。有利地选取和/或修饰本发明的微生物以使用所述碳源作为生长于培养基上的唯一碳源。选用于在特定碳源上生长的微生物在本领域是已知的，在微生物中为了使其在所述特定碳源上生长而待导入的修饰也是已知的。本领域技术人员能够限定用于本发明的微生物的培养条件。具体而言细菌在20°C 至55°C的温度发酵，优选25°C至40°C，且更具体而言对于谷氨酸棒杆菌为约30°C而对于大肠杆菌为约37°C。从培养基回收脂族二醇对于本领域技术人员是常规工作。在本发明的一个方面，进一步纯化回收的脂族二醇。用于从培养基回收二醇及其纯化的方法在本领域是已知的，并公开于下述文献 提交于2008年10月3日的PCT/EP2008/063287和提交于2007年11月30日的PCT/ EP2007/063068,以及其他。
具体实施例方式本发明的其他实施方案将如下所述。修饰微生物以偏好羟基-2-酮基-脂族酸代谢物的产生，并将从同一羟基-2-酮基-脂族酸代谢物的脱羧步骤获得的产物转化为相应的脂族二醇。下述描述针对大肠杆菌，该微生物缺乏内源2-酮酸脱羧酶活性。因此，将编码该活性的异源基因导入该微生物。将该微生物修饰以优化用于产生羟基-2-酮基脂族酸代谢物的途径并将从同一羟基-2-酮基脂族酸代谢物的脱羧步骤获得的产物转化为脂族二醇亦基于大肠杆菌已知的代谢途径和内源基因完成。然而，本领域技术人员可使用类似策略在其他具有已知基因和途径的微生物中导入或缺失相应基因。I.乙二醇的制备本发明的乙二醇产生的生物合成途径包含三个酶反应，始于3-磷酸羟基丙酮酸前体(丝氨酸的前体)的转化。首先，磷酸酶活性使磷酸羟基丙酮酸可以转化为羟基丙酮酸。然后羟基丙酮酸由2-酮酸脱羧酶活性转化为羟乙醛。最终羟基醛还原酶活性使羟乙醛可以转化为乙二醇。另一种用于产生乙二醇的途径以L-丝氨酸作为前体而起始。首先转氨酶或氨基酸氧化酶活性使得丝氨酸可以转化为羟基丙酮酸。接下来两个步骤类似于上述第一途径。全局的生物合成途径表示于

图1。本发明提供了一种用于发酵产生乙二醇、其衍生物或前体的方法，包括在包含碳源的适当培养基中培养微生物特别是细菌，并从所述培养基回收乙二醇。在一个优选实施方案中，所述方法用含有至少一种编码具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽的基因和一种编码具有羟基醛还原酶活性的多肽的基因的微生物特别是细菌进行。 这些基因可为外源的或内源的，且可在染色体上或在染色体外表达。在本发明另一个实施方案中，所述方法用其中中间产物3-磷酸甘油酸的利用度增加的微生物特别是细菌进行。优选地，该增加是通过减弱编码磷酸甘油酸变位酶的基因特别是基因gpmA和pgml之一或二者的表达水平来取得的。这可通过用较弱启动子取代这些基因的野生型启动子，或通过使用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定的元件来完成。若需要，亦可通过缺失相应的DNA序列来达成基因的完全减弱。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物，即呈现3-磷酸甘油酸利用度增加的微生物特别是细菌，具体而言为其中编码磷酸甘油酸变位酶的基因的表达，优选为基因gpmA和pgml之一或二者的表达减弱的微生物，优选细菌。在另一个实施方案中，所述方法是用其中流向丝氨酸生物合成途径受刺激的微生物特别是细菌进行的。这可通过增加分别由serA和serC基因编码的3-磷酸甘油酸脱氢酶和/或磷酸丝氨酸氨基转移酶的表达水平来达成。3-磷酸甘油酸脱氢酶和/或磷酸丝氨酸氨基转移酶表达水平的增加可通过导入驱动所述serA和/或serC基因表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述serA和/或 serC基因来达成。serA基因的表达亦可通过用Irp突变的等位基因(如对应于Irp蛋白质中GLU114ASP取代的Irp-I等位基因)替代野生型Irp基因(编码亮氨酸应答性调节蛋白)从而导致serA基因转录的组成型激活来增加。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物，特别是细菌。在本发明的具体实施方案中，可将减少krA蛋白对反馈抑制剂丝氨酸的敏感度从而允许在丝氨酸存在下的活性增加的突变(反馈脱敏等位基因)导入所述serA基因。脱敏等位基因，即反馈不敏感等位基因的实例已描述于EP 0931833 (Ajinomoto)或EP 0620853(Wacker)。在另一个实施方案中，所述方法用其中流向羟基丙酮酸生物合成途径受刺激的微生物特别是细菌进行。该结果可通过增加丝氨酸转氨酶或丝氨酸氧化酶(对于以丝氨酸作为前体起始的途径)表达水平，或通过增加3-磷酸羟基丙酮酸磷酸酶的表达来达成。增加丝氨酸氧化酶的表达水平可通过导入并过表达来自混浊红球菌(R. opacus)的编码L-氨基酸氧化酶的基因，或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述基因来达成。丝氨酸转氨酶表达的增加可通过导入驱动大肠杆菌的serC基因的表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述serC基因来达成。3-磷酸羟基丙酮酸磷酸酶表达的增加可通过导入驱动大肠杆菌的yeaB基因或serB基因的表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述yeaB基因或serB基因来达成。3-磷酸羟基丙酮酸磷酸酶表达的增加亦可通过导入并过表达来自酿酒酵母的基因GPP2或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入GPP2基因来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物，特别是细菌。在本发明的另一个实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现丝氨酸向除了乙二醇之外的其他化合物的转化水平的减弱。该结果可通过减弱消耗丝氨酸的酶像丝氨酸脱氨酶(由sdaA和sdaB和tdcG编码)、丝氨酸转乙酰酶(由cysE编码)、色氨酸合酶(由 trpAB编码)或丝氨酸羟甲基转移酶(由glyA编码)的水平来达成。这些基因可通过用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件或用较低强度的启动子取代天然启动子来减弱。 若需要，基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物特别是细菌。在本发明的另一个实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现羟基丙酮酸向除了羟乙醛以外的其他化合物转化水平的减弱。该结果可通过减弱消耗羟基丙酮酸的酶像羟基丙酮酸还原酶(由ghrA编码)或羟基丙酮酸异构酶(由hyi编码)的水平来达成。这些基因可通过用较低强度的启动子或使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件替代天然启动子来减弱。若需要，所述基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物，特别是细菌。在本发明的另一个实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现羟乙醛向除了乙二醇以外的其他化合物转化水平的减弱。该结果可通过减弱消耗羟乙醛的酶像羟基苏氨酸醛缩酶(由ItaE编码)或羟乙醛脱氢酶(由aldA、aldB编码)的水平来达成。这些基因可通过用较低强度的启动子或使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件替代天然启动子来减弱。若需要，所述基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物，特别是细菌。在本发明的一个方面，通过使用不依赖于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)作为磷供体的糖输入系统，像已知转运葡萄糖的galP，或通过向糖-磷酸转移酶系统提供更多的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)增加了糖输入的效率。存在多种可用于在微生物中增加PEP利用度的手段。 具体而言，这可通过减弱反应PEP —丙酮酸来达成。优选地，在所述菌株中减弱至少一种选自pykA和pykF的编码丙酮酸激酶的基因以获得该结果。另一种增加PEP利用度的方式是偏好反应丙酮酸一PEP。这可通过增加催化上述反应的磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性来达成。 该酶由PPsA基因编码。因此，在微生物中，优选增加ppsA基因的表达。两种修饰均可同时存在于微生物中。II. 1，3-丙二醇的制备本发明的产生1，3_丙二醇的生物合成途径包含三个酶反应，始于L-高丝氨酸前体(从L-天冬氨酸获得)的转化。首先，高丝氨酸转氨酶或高丝氨酸氧化酶活性使L-高丝氨酸可以转化为4-羟基-2-酮基丁酸G-hydroxy-2-ketobutyrate)。其次2_酮酸脱羧酶活性使得4-羟基-2-酮基丁酸可以转化为3-羟基丙醛。然后用羟基醛还原酶活性使 3-羟基丙醛转化为1，3-丙二醇。全局的生物合成途径表示于图2。本发明提供了一种用于发酵产生1，3-丙二醇、其衍生物或前体的方法，包括在包含碳源的适当培养基中培养微生物特别是细菌，并从所述培养基回收1，3-丙二醇。在一个优选实施方案中，所述方法用含有至少一种编码具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽的基因和一种编码具有羟基醛还原酶活性的多肽的基因的微生物特别是细菌进行。 这些基因可为外源的或内源的，且可在染色体上或在染色体外表达。在另一个实施方案中，所述方法是用其中流向草酰乙酸生物合成途径受刺激的微生物特别是细菌进行的；该结果可通过增加由PPC基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的表达水平来达成。磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表达的增加可通过导入驱动所述PPC基因表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述PPC基因来达成。中间产物草酰乙酸的利用度亦可通过减弱分别由PckA和/或maeA和/或maeB 基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和/或苹果酸酶的基因的表达水平来增加。这可通过用较弱启动子替代这些基因的野生型启动子，或通过使用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件来完成。若需要，基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物特别是细菌，即呈现草酰乙酸利用度增加的微生物特别是细菌。在另一个实施方案中，所述方法用其中流向高丝氨酸生物合成途径受刺激的微生物特别是细菌进行。这可通过增加分别由thrA和asd基因编码的天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶和/或天冬氨酸半醛脱氢酶的表达来达成。增加天冬氨酸激酶和高丝氨酸脱氢酶和/或天冬氨酸半醛脱氢酶的表达可通过导入驱动所述thrA和/或asd基因的表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述thrA和/ 或asd基因来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物特别是细菌。在本发明的一个具体实施方案中，可将降低thrA基因对反馈抑制剂苏氨酸的敏感性的突变(反馈脱敏等位基因)导入所述thrA基因，并因此在苏氨酸存在下允许活性增加。在另一个实施方案中，所述方法用其中流向4-羟基-2-酮基丁酸生物合成途径受刺激的微生物特别是细菌进行。该结果可通过增加高丝氨酸转氨酶或高丝氨酸氧化酶的表达来达成。增加高丝氨酸氧化酶的表达可通过导入并过表达来自混浊红球菌(R.opaCus) 的编码L-氨基酸氧化酶的基因，或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述基因来达成。增加高丝氨酸转氨酶表达水平可通过导入驱动大肠杆菌的serC基因的表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述serC基因来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物特别是细菌。在本发明的另一个实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现高丝氨酸向除了 1，3_丙二醇之外的其他化合物的转化水平的减弱。该结果可通过减弱消耗高丝氨酸的酶像高丝氨酸激酶和苏氨酸合酶(由thrB和thrC编码)、高丝氨酸0-转琥珀酰酶(由 metA编码)、或二氢吡啶二羧酸合酶(由dapA编码)的水平来达成。这些基因可通过用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件或用较弱的启动子取代天然启动子来减弱。若需要，基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物特别是细菌。在本发明的另一种实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现3-羟基丙醛向除了 1，3_丙二醇以外的其他化合物转化水平的减弱。该结果可通过减弱消耗3-羟基丙醛的酶像3-羟基丙醛脱氢酶(由aldA、aldB编码)的水平来达成。这些基因可通过用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件或用较低强度的启动子替代天然启动子来减弱。 若需要，所述基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物特别是细菌。在本发明的一个方面，通过使用不依赖于磷酸烯醇丙酮酸(PEP)作为磷供体的糖输入系统，像已知转运葡萄糖的galP编码的系统，或通过向糖-磷酸转移酶系统提供更多的磷酸烯醇丙酮酸(PEP)增加了糖输入的效率。存在多种可用于在微生物中增加PEP利用度的手段。具体而言，这可通过减弱反应PEP—丙酮酸来达成。优选地，在所述菌株中减弱至少一种选自PykA和pykF的编码丙酮酸激酶的基因以获得该结果。另一种增加PEP利用度的方式是偏好反应丙酮酸一PEP。这可通过增加催化上述反应的磷酸烯醇丙酮酸合酶的活性来达成。该酶由PPsA基因编码。因此，在微生物中，优选增加ppsA基因的表达。两种修饰均可同时存在于微生物中。III. 1，4-丁二醇的制备本发明的产生1，4_ 丁二醇的生物合成途径包含五个酶反应，始于2-酮戊二酸前体(三羧酸循环的代谢物)的转化。首先，4-酮戊二酸单酰CoA 合成酶 0-oxoglutaryl-CoA synthetase)活性使 2-酮戊二酸可以转化为4-酮戊二酸单酰CoA。然后通过两种活性的组合将该化合物转化为5-羟基-2-酮基戊酸，首先为醛脱氢酶，其次为醇脱氢酶，两者均由丙酮丁醇梭菌的基因 adhE2或大肠杆菌的基因adhE编码。然后2_酮酸脱羧酶活性使得5_羟基-2-酮基戊酸可以转化为4-羟基丁醛，其依赖于羟基醛还原酶活性进一步转化为1，4_ 丁二醇。全局的生物合成途径表示于图3。本发明提供了一种用于发酵产生1，4_ 丁二醇、其衍生物或前体的方法，包括在包含碳源的适当培养基中培养微生物特别是细菌，并从所述培养基回收1，4_ 丁二醇。在一个优选实施方案中，所述方法用含有至少一种编码具有2-酮酸脱羧酶活性的多肽的基因和一种编码具有羟基醛还原酶活性的多肽的基因的微生物特别是细菌进行。这些基因可为外源的或内源的，且可在染色体上或在染色体外表达。在另一个实施方案中，所述方法是用其中流向草酰乙酸生物合成途径受刺激(进入三羧酸循环)的微生物特别是细菌进行的。这可通过增加由PPC基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的表达来达成。增加磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的表达可通过导入驱动所述PPC基因表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述ppc基因来达成。中间产物草酰乙酸的利用度亦可通过减弱分别由pckA和/或maeA 和/或maeB基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和/或苹果酸酶的基因的表达水平来增加。 这可通过用较弱启动子替代这些基因的野生型启动子，或通过使用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件来完成。若需要，基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物特别是细菌，即呈现2-酮戊二酸利用度增加的微生物特别是细菌。在另一个实施方案中，所述方法用其中流向2-酮戊二酸生物合成途径受刺激的微生物特别是细菌进行。这可通过增加分别由gltA和icd基因编码的柠檬酸合酶和/或异柠檬酸脱氢酶的表达来达成。增加柠檬酸合酶和/或异柠檬酸脱氢酶的表达可通过导入驱动所述gltA和/或icd基因的表达的人工启动子，通过增加细胞中的拷贝数或通过将增加相应蛋白质活性的突变导入所述gltA和/或icd基因来达成。异柠檬酸脱氢酶的活性通过由AceK催化的磷酸化或脱磷酸化反应来调制。磷酸化减少Icd的活性而脱磷酸化重新激活Icd酶。因此，Icd酶的活性亦通过导入与野生型AceK酶相比具有减少的激酶活性或增加的磷酸酶活性的突变体aceK基因来控制。AceK活性的水平亦可通过减弱所述aceK 基因的表达来减少。这可通过用较弱启动子替代该基因的野生型启动子，或通过使用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件来完成。若需要，基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。中间产物2-酮戊二酸的利用度亦可通过减弱分别由sucAB或sue⑶ 和/或aceA或aceB基因编码的2_酮戊二酸脱羧酶或琥珀酰CoA合成酶和/或异柠檬酸裂合酶或苹果酸合酶的基因的表达来增加。这可通过用较弱启动子替代这些基因的野生型启动子，或通过使用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件来完成。向三羧酸循环的流动亦可通过减弱对阻遏编码三羧酸循环的基因的ArcA的阻遏(由arcA基因编码)来增加。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物特别是细菌，即呈现2-酮戊二酸利用度增加的微生物特别是细菌。 在另一个实施方案中，所述方法用其中流向5-羟基-2-酮基戊酸生物合成途径受刺激的微生物特别是细菌进行。这可通过增加4-酮戊二酸单酰CoA合成酶(产生AMP的， 如由prpE基因编码的；或产生ADP的，如由sucC^n sucD基因编码的)和/或醛还原酶/醇脱氢酶的表达来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案中的微生物特别是细菌。在本发明的另一个实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现2-酮戊二酸向除了 1，4_ 丁二醇之外的其他化合物的转化水平的减弱；这可通过减弱消耗2-酮戊二酸的酶像谷氨酸脱氢酶或谷氨酸合酶(由gdhA和gltB编码)的水平来达成。这些基因可通过用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件或用较弱的启动子取代天然启动子来减弱。若需要，基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物特别是细菌。在本发明的另一种实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现4-羟基丁醛向除了 1，4_ 丁二醇以外的其他化合物转化水平的减弱。这可通过减弱消耗4-羟基丁醛的酶像4-羟基丁醛脱氢酶(由aldA、aldB编码)的水平来达成。这些基因可通过用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件或用较弱的启动子替代天然启动子来减弱。若需要， 所述基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物特别是细菌。在本发明的另一个实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以在厌氧条件下产生 1，4_ 丁二醇。为了取得此种能力，在所述微生物中，缺失了 PTS-糖转运系统以通过渗透酶 /激酶转运系统代谢糖。为了产生足量的ATP以供微生物在厌氧条件下生长，必须通过由大肠杆菌中的PckA基因编码的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶活性从磷酸烯醇丙酮酸产生草酰乙酸。对于每摩尔产生的草酰乙酸，生成一摩尔的ATP。以类似方式，2-酮戊二酸至4-酮戊二酸单酰CoA的转化必须通过4-酮戊二酸单酰CoA合成酶来达成。产生ADP的活性，如由大肠杆菌中sucC和sucD基因编码的，对于每摩尔产生的4-酮戊二酸单酰CoA仅消耗一摩尔ATP。所描述的从D-葡萄糖产生1，4_ 丁二醇的代谢途径特别适用于厌氧生长条件。此种途径的全局反应平衡为D-葡萄糖+ADP+Pi - 1,4- 丁二醇+甲酸+C02+ATP+H20。在本发明的另一个实施方案中，修饰所述微生物特别是细菌以呈现乙酰CoA至除1，4-丁二醇之外的其他化合物的转化水平的减弱；该结果可通过减弱消耗乙酰CoA的酶像乙酸激酶和磷酸乙酰转移酶(由ackA和pta编码)的水平来达成。这些基因的减弱可通过用使相应的信使RNA或蛋白质不稳定化的元件或用较弱的启动子替代天然启动子来进行。若需要，所述基因的完全减弱亦可通过缺失相应的DNA序列来达成。本发明亦涉及用于本发明该具体实施方案的微生物特别是细菌。实施例实施例1构建表达2-酮酸脱羧酶编码基因和羟基醛还原酶编码基因的菌株 MG1655(pME101-kivDll-yqhD-TT07)1. 1构建质粒pM-PtrC01-kivDll-TT07以供过表达编码α -酮基异戊酸脱羧酶的乳酸乳球菌的kivD 编码α -酮基异戊酸脱羧酶的乳酸乳球菌kivD的合成基因由Geneart (Germany) 制备。该基因的密码子选择和GC含量根据供应商的矩阵(supplier matrix)适应于大肠杆菌。该合成基因的表达是由组成型Ptrc启动子驱动的。将转录终止子添加至该基因下游。 将构建体克隆入供应商的PM载体并通过测序验证。若需要，将该合成基因克隆入PMElOl 载体(该载体来源于质粒pCL1920(Lerner&Inouye，1990，NAR 18，15p 4631))，接着用其转化大肠杆菌菌株。Ptrc01-kivDll-TT07 限制性位点(BamHI，HindIII，EcoRV) (SEQ ID NO 1)ggatccatgcaagcttatgcgatatcPtrcOl 启动子(SEQ ID NO 2)gagctgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaataaggaggtataac对大肠杆菌优化的kivDll基因序列(CAG34226.) (SEQ ID NO 3)atgtataccgtgggtgattatctgctggatcgtctgcatgaactgggcattgaagaaattttcggcgttccgggtg
attataatctgcagtttctggatcagattattagccataaagatatgaaatgggtgggtaatgccaatgaactgaatgcaagctatatggcagatggttatgcccgtaccaaaaaagcagcagcatttctgaccacctttggtgttggtgaactgagcgcagttaatggtctggctggtagctatgcagaaaatctgccggttgttgaaattgttggtagcccgaccagcaaagttcagaatgaaggcaaatttgtgcatcataccctggccgatggtgattttaaacatttcatgaaaatgcatgaaccggttaccgcagcacgtaccctgctgaccgcagaaaatgcaaccgttgaaattgatcgtgttctgagcgcactgctgaaagaacgtaaaccggt gtatattaatctgccggtggatgttgcagcagcaaaagcagaaaaaccgagcctgccgctgaaaaaagaaaatagcaccagcaataccagcgatcaggaaattctgaataaaattcaggaatccctgaaaaacgccaaaaaaccgattgtgattaccggtcatgaaattattagctttggcctggaaaaaaccgttacccagtttattagcaaaaccaaactgccgattaccaccctgaattttggtaaaagcagcgttgatgaagcactgccgagctttctgggtatttataatggcaccctgagcgaaccgaatctgaaagaatttgtggaaagcgcagatttcattctgatgctgggtgttaaactgaccgatagctctaccggtgcatttacccatcatctgaatgaaaacaaaatgattagcctgaatattgatgaaggcaaaatttttaatgaacgcattcagaattttgattttgaaagcctgattagcagcctgctggatctgagcgaaatcgaatataaaggcaaatatattgataaaaaacaggaagattttgttccgagcaatgcactgctgtctcaggatcgtctgtggcaggcagttgaaaatctgacccagagcaatgaaaccattgttgcagaacagggcaccagcttttttggtgcaagcagcatttttctgaaaagcaaaagccattttattggtcagccgctgtggggtagcattggttatacctttccggcagcactgggtagccagattgcagataaagaaagccgtcatctgctgtttattggtgatggtagcctgcagctgaccgttcaggaactgggtctggccattcgcgaaaaaattaatccgatttgctttattatcaataatgatggctataccgtggaacgtgaaattcatggtccgaatcagagctataatgatattccgatgtggaattatagcaaactgccggaatcttttggtgcaaccgaagatcgtgttgtgagcaaaattgtgcgcaccgaaaatgaatttgtgagcgtgatgaaagaagcacaggcagatccgaatcgtatgtattggattgaactgattctggccaaagaaggtgcaccgaaagttctgaaaaaaatgggcaaactgttcgccgaacagaataaaagctaa终止子序列T7Te (参照 Harington K. J.，LaughlinR. B.和 Liang S. ProcNatl Acad Sci U S A. 2001Apr 24 ；98 (9) :5019-24. ) (SEQ ID NO 4) :attacgtagaAGATCTt cctggctcaccttcgggtgggcctttctg 限制性位点(SmaI，BamHI，EcoRI) (SEQ ID NO 5) ccccgggatgcggatccatgcgaattc对于从低拷贝载体表达，如下所述构建ρΜΕΙΟΙ质粒。将pCL1920质粒使用PME101F 和PME101R寡核苷酸进行PCR扩增，并将来自载体pTRC99A携带IacI基因和Ptrc启动子的BstZ17I-XmnI片段插入经扩增的载体。将所得的载体用NcoI和BamHI限制性酶切并将携带kivDll基因的载体用AftIII和BamHI限制性酶切。然后将含有kivDll的片段克隆入载体ρΜΕΙΟΙ 将所得的质粒命名为pME101-kivDll-TT07PME IOlF(SEQ ID NO 6) :ccgacagtaa gacgggtaag cctgPME101R(SEQ ID NO 7) :agcttagtaa agccctcgct ag1. 2构建质粒pME101-kivDll-yqhD-TT07以供过表达编码α -酮基异戊酸脱羧酶的乳酸乳球菌的kivD和编码甲基乙二醛还原酶的大肠杆菌的yqhD将所述ρΜΕΙΟΙ载体和携带kivDll基因的载体用SnaBI和BglII限制性酶切，并将含有yqhD的片段克隆入载体ρΜΕΙΟΙ。将所得的质粒命名为pME101-kivDll-yqhD-TT07。将yqhD基因从大肠杆菌MG1655菌株的基因组DNA用寡核苷酸yqhD F和yqhD R 进行PCR扩增yqhD F (SEQ ID NO 8)T TACGTA cccagcaaagggagcaagtaatgaacaac
-供添加SnaBI限制性位点的区(斜体粗体大写)-同源于大肠杆菌MG1655yqhD区 3153357 至 3153385 的区(小写)yqhD R(SEQ ID NO 9)a agatct tcTTAGCGGGCGGCTTCGTATATAC-同源于大肠杆菌MG1655yqhD区3154540至31M518的区(大写)-供添加BglII限制性位点的区(斜体粗体小写)用限制性酶SnaBI和BglII切割经PCR扩增的片段，并将其克隆入载体 pME101-kivDll-TT07 的 SnaBI-BglII 位点，得到载体 pME101-kivDll-yqhD_TT07。实施例2构建乙二醇途径流量增加的菌株MG1655AsdaAAsdaBApykFPtrc 18-gpmA Ptrc 18-gpmB(pME 101-kivDll-yqhD-TT07)2. 1 构建 MG1655 Δ sdaA Δ sdaB 菌株为了缺失sdaA基因，使用由Datsenko&WarmerQOOO)所述的同源重组策略。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，使用了下述寡核苷酸ΔsdaAF(SEQ ID NO 10)gtcaggagtattatcgtgattagtctattcgacatgtttaaggtggggattggtccctcatcttcccat accgtagggccTGTAG GCTGGAGCTGCTTCG 具有-与sdaA 基因的序列(1894941-1895020)(参照序列见网站 http/A enolist. pasteur. fr/Colibri/)同源的区(小写)，-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B. L. ,2000,PNAS, 97 :6640-6645)的区(大写粗体)，Δ sdaAR (SEQ ID NO 11)GGGCGAGTAAGAAGTATTAGTCACACTGGACTTTGATTGCCAGACCACCGCGTGAGGTTTCGCGGTATT TGGCGTTCATGTCCCATATGAATATCCTCCTAAG 具有-与sdaA 基因的序列(1896336-1896254)(参照序列见网站 http/A enolist. pasteur. fr/Colibri/)同源的区(大写)，-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B. L. ,2000,PNAS, 97 :6640-6645)的区(大写粗体)。将寡核苷酸Δ sdaAF和Δ sdaAR用于从pKD4质粒扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入株MG 1655(pKD46)。选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸sdaAF和sdaAR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名 % MG1655 Δ sdaA: :Km. sdaAF (SEQ ID NO 12) :cagcgttcgattcatctgcg(同源于 1894341 至 1894360 的序列)。sdaAR (SEQ IDNO 13)GACCAATCAGCGGAAGCAAG (同源于 1896679 至 1896660 的序列)。然后选择卡那霉素抗性转化体并通过PCR分析用之前限定的寡核苷酸sdaAF和 sdaAR验证AsdaA: :Km。所得的菌株命名为MG1655 Δ sdaA: Km。然后通过转导将DsdaB: :Cm 导入菌株MG1655AsdaA: :Km。MG1655AsdaB: :Cm首先是使用如前所述的相同方法用下述寡核苷酸构建的
Δ sdaBF (SEQ ID NO 14)cggcattggcccttccagttctcataccgttggaccaatgaaagcgggtaaacaatttaccgacgatct gattgcccgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG 具有-与sdaB 基因的序列(2927627-2927705)(参照序列见网站 http//genolist. pasteur. fr/Colibri/)同源的区(小写)，-供扩增氯霉素抗性盒(参照序列见Datsenko, K. A. &ffanner, B. L.，2000，PNAS, 97 =6640-6645)的区(大写粗体)，Δ sdaBR (SEQ ID NO 15)CGCAGGCAACGATCTTCATTGCCAGGCCGCCGCGAGAGGTTTCGCGGTACTTGGCGTTCATATCTTTAC CTGTTTCGTACCATATGAATATCCTCCTTAG 具有-与sdaB 基因的序列(2928960-2928881)(参照序列见网站 http//genolist. pasteur. fr/Colibri/)同源的区(大写)，-供扩增氯霉素抗性盒(参照序列见Datsenko, K. A. &ffanner, B. L.，2000，PNAS, 97 =6640-6645)的区(大写粗体)。将寡核苷酸Δ sdaBF和Δ sdaBR用于从质粒pKD3扩增氯霉素抗性盒。然后将所得的PCR产物通过电穿孔导入菌株MG1655(pKD46)。然后选择氯霉素抗性转化体， 并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸sdaBF和sdaBR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为 MG1655 Δ sdaB Cm. sdaBF (SEQ ID NO16) =Gcgtaagtacagcggtcac (同源于 2927450 至四27468 的序列)。sdaBR (SEQ IDNO 17) :CGATGCCGGAACAGGCTACGGC (同源于 2929038至四四017的序列)。为了转移Δ sdaB: :Cm，使用噬菌体Pl转导的方法。将菌株 MG1655 Δ sdaB: :Cm的噬菌体裂解液的制备物用于转导入菌株MG1655 Δ sdaA: :Km。然后选择氯霉素抗性转化体，并通过PCR分析用前述限定的寡核苷酸sdaBF和 sdaBR验证AsdaB: :Cm。所得的菌株命名为MG1655 Δ sdaA: :Κι Δ sdaB: :Cm。然后消除卡那霉素和氯霉素抗性盒。然后将携带作用于卡那霉素和氯霉素抗性盒的FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔导入重组位点。在42°C的系列培养之后，卡那霉素和氯霉素抗性盒的丧失通过PCR分析用如前所用的相同寡核苷酸(sdaAF/sdaAR和sdaBF/sdaBR)进行验证。所得的菌株命名为MG1655DsdaAA sdaB。2. 2 构建菌株 MG1655 Δ sdaA Δ sdaB Δ pykF6为了缺失pykF基因，使用了 Datsenko&WarmerQOOO)所述的同源重组策略。该策略允许允许氯霉素或卡那霉素抗性盒的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，使用了下述寡核苷酸ApykFF (SEQ ID NO 18)cccatccttctcaacttaaagactaagactgtcatgaaaaagaccaaaattgtttgcaccatcggaccg aaaaccgaaTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-与pykF 区的序列(1753689-1753766)(参照序列见网站 http//www. ecoRene. org/)同源的区(小写)，-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B. L. ,2000,PNAS, 97 :6640-6645)的区(大写)，
ApykFR (SEQ ID NO 19)ggacgtgaacagatgcggtgttagtagtgccgctcggtaccagtgcaccagaaaccataactacaacgt cacctttgtgCATATGAATATCCTCCTTAG具有-与pykF 区的序列(17551四_1755051)(参照序列见网站 http //www, ecogene. org/)同源的区(小写)，-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B. L. ,2000,PNAS, 97 :6640-6645)的区(大写)。将寡核苷酸Δ pykFF和Δ pykFR用于从pKD4质粒扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入菌株MG 1655 (pKD46)。然后选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸pykFF和pykFR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名 % MG1655 Δ pykF Km. pykFF (SEQ IDNO 20) :gcgtaaccttttccctggaacg (同源于 1753371 至 1753392 的序列)。Pyki7R(SEQ ID NO 21) :gcgttgctggagcaacctgccagc (同源于 1755518 至 1755495的序列)。为了转移ApykF: :Km，使用噬菌体Pl转导的方法。将菌株MG1655 Δ pykF: :Km的噬菌体裂解液的制备物用于转导入菌株AsdaA AsdaB。然后选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用前述限定的寡核苷酸pykFF和 pykFR 验证 ApykF: Km。所得的菌株命名为 MG1655 Δ sdaA Δ sdaB Δ pykF: :Km。然后消除卡那霉素抗性盒。然后将携带作用于卡那霉素抗性盒FRT位点的FLP重组酶的质粒PCP20通过电穿孔导入重组位点。在42°C的系列培养之后，卡那霉素抗性盒的丧失通过PCR分析用如前所用的相同寡核苷酸(sdaAF/sdaARsdaBF/sdaBR和pykFF/pykFR) 进行验证。所得的菌株命名为MG1655AsdaA AsdaBApykF。2. 3 构建菌株 MG1655 Δ sdaA Δ sdaB ApykF Ptrcl8-gpmA Ptrcl8-gpmB为了增加3-磷酸甘油酸的水平，构建了突变体Ptrcl8-gpmA和Ptrcl8-gpmB。首先，为了减少磷酸甘油酸变位酶gpmA基因的表达，将其启动子用经修饰的具有弱活性的组成型trc启动子替代。通过转导将Ptrc 18-gpmA转化入MG1655AsdaAAsdaB ApykF菌株。首先使用如前所述的相同方法用下述寡核苷酸构建菌株 MG1655Ptrcl8-gpmA::Km Ptrcl8-gpmAF(SEQ ID NO 22)CCACTGACTTTCGCCATGACGAACCAGAACCAGCTTAGTTACAGCCATAATATACCTCCTTATTCCACA CAgTATACGAGCCGGATGATTAATcGcCAACAGCTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG 具有-与gpmA 基因的序列(786771-786819)(参照序列见网站 http//^enolist. pasteur. fr/Colibri/)同源的区(大写)，-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B. L. ,2000,PNAS, 97 :6640-6645)的区(大写粗体)，-trc启动子序列的区(大写斜体)，其中-35和-10框用下划线标示。Ptrc18-gpmAR(SEQ ID NO 23)ggttatgcgtaagcattgctgttgcttcgtcgcggcaatataatgagaattattatcattaaaagatgatttgaggagtaagtatCATATGAATATCCTCCTTAG 具有-与gpmA基因上游区的序列(786903-786819)(参照序列见网站http:// genolist. pasteur. fr/Colibri/)同源的区(小写)，-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B. L. ,2000,PNAS, 97 :6640-6645)的区(大写粗体)。将寡核苷酸Ptrcl8-gpmAF和Ptrc 18-gpmAR用于从pKD4质粒扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入菌株MG 1655(pKD46)，其中表达的Red重组酶允许同源重组的发生。然后选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸gpmAF和gpmAR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655Ptrcl8-gpmA: :Km. gpmAF(SEQ ID NO 24) :CCTTCCTCTTTCAGCAGCTTACC(同源于 786673 至 786695 的序列)。 gpmAR (SEQ ID NO 25) :cgacgatcagcgcaaagtgaaagg (同源于 787356 至 787333 的序列)。为了转移修饰Ptrc 18-gpmA: :Km，使用噬菌体Pl转导。下述实验方案分两步实施， 首先制备菌株MG1655Ptrcl8-gpmA: :Km的噬菌体裂解液，然后转导入菌株MG1655 Δ sdaA AsdaB ApykF。该菌株的构建如上所述。1-制备Pl噬菌体裂解液-用100 μ 1 菌株 MG1655Ptrcl8-gpmA: :Km 在 IOml 的 LB+Km 50 μ g/ml+ 葡萄糖 0. 2% +CaCl25mM中的过夜培养物接种。在37°C振荡温育30分钟。-添加在菌株MG1655上制备的100μ 1噬菌体裂解物Pl (约IxlO9个噬菌体/ml)。-在37°C振荡3小时直至所有细胞裂解。添加200μ 1氯仿并涡旋振荡。-以4500g离心10分钟以消除细胞碎片。-将上清转移至无菌试管并添加200μ 1氯仿。-在4°C储藏裂解液。2-转导-将MG1655AsdaAAsdaB ApykF菌株在LB培养基中的5ml过夜培养物以1500g 离心10分钟。-将细胞沉淀悬于2.5ml的IOmM MgS04, 5mM CaCl2 对照试管100 μ 1细胞-100 μ 1 菌株 MG1655Ptrcl8-gpmA: :Km 的噬菌体 Pl-试管100 μ 1 细胞+100 μ 1 菌株 MG1655Ptrcl8-gpmA: :Km 的噬菌体 Pl-在30°C不振荡温育30分钟。将100μ 1的IM柠檬酸钠添加于每个试管并涡旋振荡。-添加ImlLB-在37°C振荡温育1小时。-在将试管以7000rpm离心3分钟之后，铺板于LB+Km50 μ g/ml皿。-在37°C温育过夜。3-菌株的验证然后选择卡那霉素抗性转化体并通过PCR分析用之前所述的寡核苷酸gpmAF和 gpmAR验证Ptrcl8-gpmA: :Km启动子的修饰。所得的菌株命名为MG1655 Δ sdaA AsdaB ApykF Ptrc 18-gpmA::Km。然后通过转导将 Ptrcl8_gpmB 转移入菌株 MG1655 Δ sdaA AsdaB ApykF Ptrcl8-gpmA: :Km。MG1655Ptrcl8-gpmB: :Cm首先是使用如前所述的相同方法用下述寡核苷酸构建的
Ptrc18-gpmBR(SEQ ID NO 26)CGGCGTTCCACTGCGTTTCACCGTGGCGGACTAGGTATACCTGTAACATAATATACCTCCTTATTCCAC ACAgTATACGAGCCGGATGATTAATcGcCAACAGCTCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG 具有-与gpmB 基因的序列 0631414-4631366)(参照序列见网站 http//genolist. pasteur. fr/Colibri/)同源的区(大写)，-供扩增氯霉素抗性盒(参照序列见Datsenko, K. A. &ffanner, B. L.，2000，PNAS, 97 =6640-6645)的区(大写粗体)，-trc启动子序列的区(大写斜体)，其中-35和-10框用下划线标示。Ptrc 18-gpmBF (SEQ ID NO 27)Gcgggattggtggtcgcacagacaacttggtgcaaacagcattactcagaaaattaacgttacagcagt atacggaaaaaaagcCATATGAATATCCTCCTTAG 具有-与gpmB基因上游区的序列(4631观0_4631365)(参照序列见网站http:// genolist. pasteur. fr/Colibri/)同源的区(小写)，-供扩增氯霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K. A. &ffanner, B. L.，2000, PNAS, 97 :6640-6645)的区(大写粗体)。将寡核苷酸Ptrc 18-gpmBF和Ptrc 18-gpmBR用于从pKD3质粒扩增氯霉素抗性盒。 然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入株MG 1655 (pKD46)，其中表达的Red重组酶使得同源重组发生。然后选择氯霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸gpmBF和 gpmBR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655Ptrcl8-gpmB: :Cm gpmBF (SEQ ID NO 28) :ccttacgaccaatctcatcaataccgg(同源于 4630906 至 ^3O932 的序列)。gpmBR(SEQID NO 29) :GCAATACCATGACTCACCAGC (同源于 4631823 至 4631803 的序列)。为了转移修饰Ptrcl8_gpmB: :Cm，使用噬菌体Pl转导。将菌株 MG1655Ptrcl8-gpmB: :Cm的噬菌体裂解液用于转导入菌株MG1655 Δ sdaA Δ sdaB Δ pykF PtrC18-gpmA::Km。然后选择氯霉素抗性转化体并通过PCR分析用之前限定的寡核苷酸 gpmBF 和 gpmBR 验证 Ptrcl8_gpmB: :Cm。所得的菌株命名为 MG1655 Δ sdaA Δ sdaB ApykF Ptrcl8-gpmA::Km Ptrcl8-gpmB: :Cm。然后可消除卡那霉素和氯霉素抗性盒。然后将携带作用于卡那霉素和氯霉素抗性盒的FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔导入重组位点。在42°C的系列培养之后，卡那霉素和氯霉素抗性盒的丧失通过PCR分析用如前所用的相同寡核苷酸(gpmAF/gpmAR和gpmBF/gpmBR)进行验证。所得的菌株命名为 MG1655AsdaAAsdaB ApykF Ptrcl8-gpmA Ptrcl8-gpmB。2.4构建菌株]\^1655厶8(1&八厶8(1&8厶？71^ Ptrcl 8-gpmA Ptrcl8_gpmB(pME101-k ivDll-yqhD-TT07)然后将pME101-kivDll-yqhD_TT07 质粒导入菌株 MG1655 Δ sdaA Δ sdaB Δ pykF Ptrcl8-gpmA Ptrcl8-gpmB。实施例3构建1，3-丙二醇途径流量增加的菌株:MG1655 Δ metA Δ pykF Δ thrLABC: :ΤΤ07_Ρ trc-thrA*l(ρΜΕ 101-kivDll-yqhD-TT07)(pMA-aaoro)3. 1 构建菌株 MG1655 Δ metA为了缺失metA基因，使用由Datsenko&WarmerQOOO)所述的同源重组策略。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，使用了下述寡核苷酸AmetAF (SEQ ID NO 30)ttcgtgtgccggacgagctacccgccgtcaatttcttgcgtgaagaaaacgtctttgtgatgacaactt ctcgtgcgtctTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-与metA基因区的序列0212310-4212389)(参照序列见网站http //www ecogene org/)同源的区(小写)，-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B. L. ,2000,PNAS, 97 :6640-6645)的区(大写)，AmetAR (SEQ ID NO 31)atccagcgttggattcatgtgccgtagatcgtatggcgtgatctggtagacgtaatagttgagccagtt ggtaaacagtaCATATGAATATCCTCCTTAG具有-与metA基因区的序列02132四_4213150)(参照序列见网站http //www, ecogene. org/)同源的区(大写)，-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B. L. ,2000,PNAS, 97 :6640-6645)的区(大写)。 将寡核苷酸Δ metAF和Δ metAR用于从pKD4质粒扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入株MG 1655(pKD46)。然后选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸metAF和metAR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655AmetA: Km. metAF(SEQ IDNO 32) tcaccttcaacatgcaggctcgacattggc (同源于 4212203 至 4212232 的序列)。metAR (SEQ ID NO 33) :ataaaaaaggcacccgaaggtgcctgaggt(同源于 4213301 至 4213272 的序歹Ij )。然后消除卡那霉素抗性盒。然后将携带作用于卡那霉素抗性盒的FRT位点的FLP 重组酶的质粒PCP20通过电穿孔导入重组位点。在42°C的系列培养之后，卡那霉素抗性盒的丧失通过PCR分析用如前所用的相同寡核苷酸(metAF/metAR)进行验证。所得的菌株命名为 MG1655 AmetA。3. 2 构建菌株 MG1655 Δ metA Δ pykF为了转移ApykF: :Km，使用噬菌体Pl转导。将菌株MG1655 Δ pykF: :Km(如上所述)的噬菌体裂解液的制备物用于转导入菌株MG1655 Δ metA。然后选择卡那霉素抗性转化体，且通过PCR分析用前述限定的寡核苷酸pykFF和 pykFR 验证 ApykF: :Km。所得的菌株命名为 MG1655 AmetADpykF: Km。3. 3 构建菌株 MG1655DmetA DpykF DthrLABC: TT07-Ptrc_thrA*l为了增加天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶thrA*l的反馈抗性等位基因的表达，构建了下述质粒用于获得thrA*l的pSBl和用于用Ptrc-thrA*l等位基因替代thrLABC操纵子的PSB2。质粒pSBl 来源于质粒 pCL1920(Lerner&Inouye，1990，NAR 18，15p4631)并携带从启动子Ptrc表达，具有减少的对苏氨酸的反馈抗性的天冬氨酸激酶/高丝氨酸thrA*等位基因(Lee 等 2003J. Bacteriol. 185，18pp. 5442-5451)。对于 pSBl 的构建，将 thrA 从基因组DNA使用下述寡核苷酸进行PCR扩增BspHIthrA(SEQ ID NO 34)TTATCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggc具有-与thrA 基因的序列(；341_371)(参照序列见网站 http //www, ecogene. org/)同源的区(小写)，-供BspHI限制性位点和额外碱基的区(大写)，SmaIthrA (SEQ ID NO 35)TTACCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc具有-与 thrA 基因的序列(2871-2841)(参照序列见网站 http //www, ecogene. org/) 同源的区(小写)，-供SmaI限制性位点和额外碱基的区(大写)，用限制性酶BspHI和SmaI切割经PCR扩增的片段，并将其克隆入载体 PTRC99A(Stratagene)的Ncol/Smal位点。对于从低拷贝载体表达，如下所述构建ρΜΕΙΟΙ 质粒。将pCL1920质粒使用PME101F和PME101R寡核苷酸进行PCR扩增，并将来自载体 PTRC99A携带IacI基因和Ptrc启动子的BstZ17I-XmnI片段插入经扩增的载体。将所得的载体和携带thrA基因的载体用ApaI和SmaI限制性酶切并将含有thrA的片段克隆入载体 PMElOl0为了解除(relieve)ThrA的反馈抑制，通过定点诱变(Stratagene)使用寡核苷酸 ThrA SFfor 和 ThrA SF rev 导入突变 thrAS345F，得到载体 pSBl。PME101F(SEQ ID NO 36)ccgacagtaagacgggtaagcctgPME10IR (SEQ ID NO 37)agcttagtaaagccctcgctagThrA SF FOr (SEQ ID NO 38)CGTATTTCCGTGGTGCTGATTACGCAATTCTCTTCCGAGTACTCAATCAGTTTCTGCThrA SF rev (SEQ ID NO 39)GCAGAAACTGATTGAGTACTCGGAAGAGAATTGCGTAATCAGCACCACGGAAATACG为了缺失thrLABC操纵子并将其用Ptrc_thrA*l等位基因替代，使用由 Datsenko&ffanner(2000)所述的同源重组策略。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒，以及其他DNA的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，构建了下述质粒，pSB2。质粒pSB2 来源于质粒 pUC18 (Norrander 等，Gene 26 (1983)，101-106)并携带与 Ptrc-thrA*l等位基因相关的氯霉素抗性盒，两者均在thrL上游区和thrC下游区之间克隆。对于pSB2的构建，将thrL的上游区和thrC的下游区从基因组DNA使用下述寡核苷酸进行PCR扩增HpaIupthrLF(SEQ ID NO 40)CGTAGTTAACGAATTCccaactagttgcatcatacaactaataaacgtgg
具有-与 thrL 区的序列(4638698-4638731)(参照序列见网站 http //www, ecogene. org/)同源的区(小写)，-供HpaI和EcoRI限制性位点和额外碱基的区(大写)。BstZ17IupthrLR(SEQ ID NO 41)CCCGGGGGAGGCGCCCGCGGATCCCGGTATAC CAGAAAGGCCCA CCCGAAGGTGAGCCAGGA aggtaaccagttcagaagctgctatcag 具有-与thrL区的序列(87_60)(参照序列见网站http//www, ecogene. org/)同源的区(小写)，-T7te转录终止子序列的区(大写粗体)(Harrington K. J.，Laughlin R. B.和 Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 200IApr 24 ；98 (9) :5019-24.),-由BstZ17I、BamHI、SfoI和SmaI限制性位点组成的多克隆位点区(大写)。BamHIdownthrCF(SEQ ID NO 42)TCCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTG GTATACCGGGATCCGCGG GCGCCTCCCCCGGGaatctattcattatctcaatcaggccggg具有-与 thrC 区的序列(5021-5049)(参照序列见网站 http "www, ecogene. org/)同源的区(小写)，-T7te转录终止子序列的区(大写粗体)(Harrington K. J.，Laughlin R. B.和 Liang S. Proc Natl Acad Sci U S A. 200IApr 24 ；98 (9) :5019-24.),-由BstZ17I、BamHI、SfoI和SmaI限制性位点组成的多克隆位点区(大写)。HpaIdownthrCR(SEQ ID NO 43)CGTAGTTAACGAATTCgagaatgcccgagggaaagatctg具有-与 thrC 区的序列(6054-6031)(参照序列见网站 http //www. ecoRene. org/)同源的区(小写)，-供HpaI和EcoRI限制性位点和额外碱基的区(大写)。首先，将“upthrL”和“downthrC”片段从MG1655基因组DNA分别使用 HpaIupthrLF/BstZ17IupthrLR 和 BamHIdownthrCF/HpaldownthrCR 寡核苷酸进行 PCR 扩增。其次，从“upthrL”和“doWnthrC”PCR片段(其具有由T7I~e转录终止子和由BstZ17I、 BamHI, SfoI和SmaI限制性位点组成的多克隆位点组成的重叠区)使用HpaIupthrLF/ HpaIdownthrCR寡核苷酸进行扩增。用限制性酶HpaI切割“upthrL-downthrC” PCR片段， 并将其克隆入PUC18载体的EcoRI/SfoI位点，得到pUC18_DthrLABC: :TT07_SMC质粒。然后，将氯霉素抗性盒从pKD3载体使用下述寡核苷酸进行PCR扩增BstZ17ICmF(SEQ ID NO 44)GGGGTATACtgtaggctggagctgcttcg具有-供扩增氯霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K. A. &ffanner, B. L.，2000, PNAS, 97 :6640-6645)的区(小写)，
-供BstZ17I限制性位点和额外碱基的区(大写)。BamHICmR(SEQ ID NO 45)CGCGGATCCcatatgaatatcctccttag具有-供扩增氯霉素抗性盒(参照序列见Datsenko, K. A. &ffanner, B. L.，2000，PNAS, 97 =6640-6645)的区(小写)，-供BamHI限制性位点和额外碱基的区(大写)。用限制性酶BstZ17I和BamHI切割PCR片段，并将其克隆 Λ pUC18-Δ thrLABC: TT07-SMC 质粒的 BstZ17I/BamHI 位点，得至Ij pUC18- Δ thrLABC TT07-SMC Cm 质粒。最终，将Ptrc_thrA*l等位基因从pSBl质粒用限制性酶SfoI和SmaI切害I]，并克隆入 pUC18-Δ thrLABC: :TT07_SMC: :Cm 质粒的 Sfol/Smal 位点，得到 pUC18-Δ thrLABC: :Τ T07-Ptrc-thA*l: : Cm 质粒或 pSB2。通过用EcoRI 限制性酶切割 pSB2 质粒得到 AthrLABC: TT07-Ptrc_thrA*l Cm 片段，并将其通过电穿孔导入菌株MG1655(pKD46)，其中表达的Red重组酶使得同源重组发生。然后选择氯霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸thrA*lF 和thrA*lR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名为MG1655 Δ thrLABC: TT07-Ptrc_th rA*l: :Cm. thrA*lF(SEQ ID NO 46) :cgtgttgcgtgttaccaactcg(同源于 thrL 区的序歹丨J (4638276-4638297)(参照序列见网站 http //www, ecogene. org/))。thrA*lR (SEQID NO 47) cggaaactgacgcctccgcag (同源于 thrC 区的序列(6345-6325)(参照序列见网站 http//www, ecogene. org/))。重组质粒通过DNA测序验证。为了转移 AthrLABC: :TT07-Ptrc-thrA*l: :Cm，使用噬菌体 Pl 转导。将菌株 M G1655 Δ thrLABC TT07-Ptrc_thrA*l Cm的噬菌体裂解液的制备物用于转导入菌株 MG1655 AmetA DpykF: :Km。然后选择卡那霉素和氯霉素抗性转化体并通过PCR分析用之前限定的寡核苷酸 thrA*lF 和 thrA*lR 验证 Δ thrLABC: TT07-Ptrc_thrA*l :Cm。所得的菌株命名为 MG1655 AmetAApykF: Km Δ thrLABC: TT07-Ptrc_thrA*l Cm。然后可消除卡那霉素和氯霉素抗性盒。然后将携带作用于卡那霉素和氯霉素抗性盒的FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔导入重组位点。在42°C的系列培养之后，卡那霉素和氯霉素抗性盒的丧失通过PCR分析用如前所用的相同寡核苷酸(metAF/ metAR、pykF/pykFR 和 thrA*lF/thrA*lR)进行验证。所得的菌株命名为 MG1655 Δ metA Δ ρ ykFΔthrLABC::TT07-Ptrc_thrA*l。 3. 4 构建质粒 pMA-aaoro编码氨基酸氧化酶的混浊红球菌aao基因的合成基因由Geneart (Germany)制备。 该基因的密码子选择和GC含量根据供应商的矩阵适应于大肠杆菌。该合成基因的表达是由组成型Pttrc启动子驱动的。将构建体克隆入供应商的pM载体并通过测序验证。PtrcOΙ-aaoro 限制性位点(Kpnl，EcoRI，Smal)(SEQ ID NO 48)
ggtaccgaattccccgggPtrcOl 启动子和 RBS(SEQ ID NO 49)gagetgttgacaattaatcatccggctcgtataatgtgtggaaggatcccccgggtaaggaggttataa对大肠杆菌优化的aaoro基因序列(AY053450.) (SEQ ID NO 50)atggcatttacccgtcgcagctttatgaaaggtctgggtgcaaccggtggtgcaggtctggcatatggtgcaatgagcaccctgggtctggcaccgtctacagcagcaccggcacgtacctttcagccgctggcagccggtgatctgattggtaaagtgaaaggtagccatagcgttgttgttctgggtggtggtccggcaggtctgtgtagcgcatttgaactgcagaaagccggttataaagttaccgttctggaagcacgtacccgtccgggtggtcgtgtttggaccgcacgtggtggtagcgaagaaaccgatctgagcggtgaaacccagaaatgtacctttagcgaaggccatttttataatgttggtgccacccgtattccgcagagccatattaccctggattattgtcgcgaactgggtgttgaaattcagggtttcggcaatcaaaatgccaatacctttgtgaattatcagagcgataccagcctgagcggtcagagcgttacctatcgtgcagcaaaagcagatacctttggctatatgagcgaactgctgaaaaaagcaaccgatcagggtgcactggatcaggttctgagccgtgaagataaagatgcactgagcgaatttctgagcgattttggtgatctgtctgatgatggtcgttatctgggtagcagccgtcgtggttatgatagcgaaccgggtgccggtctgaattttggcaccgaaaaaaaaccgtttgccatgcaggaagttattcgtagcggtattggtcgcaattttagctttgattttggctatgatcaggccatgatgatgtttacaccggttggtggtatggatcgtatttattatgcctttcaggatcgtattggcactgataacatcgtgttcggtgccgaagttaccagcatgaaaaatgttagcgaaggtgtgaccgttgaatataccgcaggcggtagcaaaaaaagcattaccgcagattatgccatttgtaccattcctccgcatctggttggtcgtctgcagaataatctgcctggtgatgttctgaccgcactgaaagcagcaaaaccgagcagcagcggtaaactgggtattgaatatagccgtcgttggtgggaaaccgaagatcgcatttatggtggtgcaagcaataccgataaagatattagccagattatgtttccgtatgatcattataatagcgatcgtggtgttgttgttgcatattatagctctggtaaacgccaggaagcatttgaaagcctgacccatcgtcagcgtctggcaaaagcaattgcagaaggcagcgaaattcacggcgaaaaatatacccgtgatattagcagcagctttagcggtagctggcgtcgtaccaaatatagcgaaagcgcatgggcaaattgggcaggtagcggtggttctcatggtggtgcagccactccggaatatgaaaaactgctggaaccggtggataaaatttattttgccggtgatcatctgagcaatgcaatcgcatggcagcatggtgcactgaccagcgcacgtgatgttgttacccatattcatgaacgtgttgcacaggaagcctaa限制性位点(Bglll，EcoRV，Pacl，Sacl，Xbal，HindIII) (SEQ ID NO 51)gatctgatatcttaattaagagctctctagaaagctt3. 5 构建菌株 MG1655AmetAApykFAthrLABC: : TT07-Ptrc_thrA*l (pMElOl-kivD ll-yqhD-TT07)(pMA-aaoro)然后将pME101-kivDll-yqhD-TT07 和 pMA-aaoro 质粒导入菌株 MG1655 Δ metA Δ ρ ykFAthrLABC::TT07-Ptrc_thrA*l。实施例4构建1，4- 丁二醇途径流量增加的菌株:MG1655 Δ sucCD Δ aceBAK Δ arcA Δ gdhA (ρ UC19-Ptrc01/0P01/RBS01-adhE2ca-prpE-TT02) (pME101-kivDll-yqhD-TT07)4. 1 构建菌株 MG1655 Δ aceBAK Δ sucCD为了缺失aceBAK基因，使用由Datsenko&WanneH2000)所述的同源重组策略。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，使用了下述寡核苷酸AaceBAKF (SEQ ID NO 52)
ctggctttcacaaggccgtatggcgagcaggagaagcaaattcttactgccgaagcggtagaatttctg actgagctggtTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-与 aceB 区的序列 0213531-4213610)(参照序列见网站 http //www, ecogene. org/)同源的区(小写)，-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B. L. ,2000,PNAS, 97 :6640-6645)的区(大写粗体)，AaceBAKR (SEQ ID NO 53)aacatcttccacatgcccttcacgtatgcggttttgtagtgcgcgccagtaatcagcgcggaacaggtc ggcgtgcatcCATATGAATATCCTCCTTAG具有-与 aceK 区的序列 021拟98_4218220)(参照序列见网站 http //www, ecogene. org/)同源的区(小写)，-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B. L. ,2000,PNAS, 97 :6640-6645)的区(大写粗体)。将寡核苷酸AaceBAKF和Δ aceBAKR用于从pKD4质粒扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入株MG 1655(pKD46)。然后选择卡那霉素抗性盒，且抗性盒的插入通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸aceBAKF和aceBAKR验证。所得的菌株命名为 MG1655 AmetA Km. aceBAKF (SEQ ID NO 54) :cgttaagcgattcagcaccttacc (同源于 4213邪1 至 4213274 的序列)。aceBAKR (SEQ ID NO 55) :aacgcattacccactctgtttaatacg (同源于4218728至4218702的序列)。为了缺失sue⑶基因，使用由Datsenko&WanneH2000)所述的同源重组策略。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，使用了下述寡核苷酸AsucCDF (SEQ ID NO 56)tttttgcccgctatggcttaccagcaccggtgggttatgcctgtactactccgcgcgaagcagaagaag ccgcttcaaaaCATATGAATATCCTCCTTAG具有-与sucC 区的序列(762268-762；347)(参照序列见网站 http //www. ecoRene. org/)同源的区(小写)，-供扩增氯霉素抗性盒(参照序列见Datsenko, K. A. &ffanner, B. L.，2000，PNAS, 97 =6640-6645)的区(大写粗体)，AsucCDR (SEQ ID NO 57)atatccgccaggctgcgaacggttttcacgcctgcggcttccagagcagcgaatttctcatccgcagtc cctttaccggcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-与 sucD 区的序列(764241-764168)(参照序列见网站 http://www. ecoRene. org/)同源的区(大写)，-供扩增氯霉素抗性盒(参照序列见Datsenko, K. A. &ffanner, B. L.，2000，PNAS,
2597 =6640-6645)的区(大写粗体)。将寡核苷酸Dsuc⑶F和Dsuc⑶R用于从pKD3质粒扩增氯霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入株MG 1655(pKD46)。然后选择氯霉素抗性转化体，并通过 PCR分析用下述定义的寡核苷酸sucCDF和sucCDR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名 % MG1655 Δ sucCD Cm. sucCDF (SEQID NO 58) :tcgcgaatccgtgggcttcctggtaacg (同源于 761887 至 761914 的序列)。sucCDR(SEQ ID NO 59 :cctctgatgccaaccgaagagatgagccg(同源于764555至764527的序列)。为了转移AaceBAK: :Km，使用噬菌体Pl转导的方法。将菌株MG165OTaceBAK: :Km 的噬菌体裂解液的制备物用于转导入菌株MG1655 Δ suc⑶Cm。然后选择卡那霉素和氯霉素抗性转化体，并通过PCR分析用前述限定的寡核苷酸aceBAKF和aceBAKR验证AaceBAK: :Km。所得的菌株命名为 MG1655ΔsucCDCm Δ aceBAKKm。然后可消除卡那霉素和氯霉素抗性盒。然后将携带作用于卡那霉素和氯霉素抗性盒的FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔导入重组位点。在42°C的系列培养之后，卡那霉素和氯霉素抗性盒的丧失通过PCR分析用如前所用的相同寡核苷酸(aceBAKF/ aceBAKR，和 sucCDF/sucCDR)进行验证。所得的菌株命名为 MG1655 Δ sucCD Δ aceBAK。4. 2 构建菌株 MG1655 Δ sucCD Δ aceBAK Δ arcA Δ gdhA为了缺失arcA基因，使用由Datsenko&WarmerQOOO)所述的同源重组策略。该策略允许氯霉素或卡那霉素抗性盒的插入，而缺失大部分涉及的基因。为此目的，使用了下述寡核苷酸AarcAF (SEQ ID NO 60)cccgcacattcttatcgttgaagacgagttggtaacacgcaacacgttgaaaagtattttcgaagcgga aggctatgTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG具有-与 arcA 区的序列(4638322-4638M5)(参照序列见网站 http //www. ecoRene. org/)同源的区(小写)，-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B. L. ,2000,PNAS, 97 :6640-6645)的区(大写粗体)，AarcAR (SEQ ID NO 61)ccagatcaccgcagaagcgataaccttcaccgtgaatggtggcgatgatttccggcgtatccggcgtag attcgaaatgCATATGAATATCCTCCTTAG具有-与 arcA 区的序列(4637621-4637699)(参照序列见网站 http //www. ecoRene. org/)同源的区(大写)，-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B. L. ,2000,PNAS, 97 :6640-6645)的区(大写粗体)。将寡核苷酸DarcAF和DarcAR用于从pKD4质粒扩增卡那霉素抗性盒。然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入株MG 1655(pKD46)。然后选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用下述定义的寡核苷酸arcAF和arcAR验证抗性盒的插入。所得的菌株命名% MG1655 Δ arcA: :Km. arcAF(SEQ ID N062) :cgacaattggattcaccacg (同源于 4638746 至 4638727 的序列)。arcAR(SEQ IDNO 63) :gcggtattgaaaggttggtgc (同源于 4637308 至 4637328的序列)。为了转移AarcA: :Km，使用噬菌体Pl转导。将菌株MG1655DarcA: :Km的噬菌体裂解液的制备物用于转导入菌株MG1655 Δ sue⑶Δ aceBAK。然后选择卡那霉素抗性转化体，并通过PCR分析用前述限定的寡核苷酸arcAF和 arcAR 验证 AarcA::Km。所得的菌株命名为 MG1655 Δ sucCD Δ aceBAK Δ arcA: :Km。为了缺失gdhA基因，使用由Datsenko&WarmerQOOO)所述的同源重组策略。使用寡核苷酸Δ gdhAF和Δ gdhAR来从质粒pKD3扩增所述氯霉素抗性盒。Δ gdhAF (SEQ ID NO 64) taaacaacataagcacaatcgtattaatatataagggttttatatctat
g TGTAGGCTGGAGCTGCTTCG 具有-与 gdhA 基因上游的序列(1840；348 至 1840397) (http //ecogene. org/blast. Eim)同源的区(小写)，-供扩增卡那霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A.&Wanner，B.L.,2000,PNAS, 97 =6640-6645)的区(大写粗体)，Δ gdhAR (SEQ ID NO 65)taagcgtagcgccatcaggcatttacaacttaaatcacaccctgcgcca
g CATATGAATATCCTCCTTAG具有-与gdhA 基因下游区和末端的序列(1840348 至 1840397) (http //ecogene. org/ blast. DhD)同源的区(小写)，-供扩增氯霉素抗性盒(参照序列见Datsenko，K.A. &Wann印，B. L.，2000, PNAS, 97 =6640-6645)的区(大写粗体)，然后将获得的PCR产物通过电穿孔导入菌株MG 1655(pKD46)。然后选择氯霉素抗性转化体，并通过PCR分析用寡核苷酸Ptrc-gdhAverF和gdhA R验证抗性盒的插入。Ptrc-gdhAverF(SEQ ID NO 66)CCTTAACGTTATTGTCTCTGC-与 gdhA 基因上游区的序列(1840168 至 1840188) (http //ecoRene. orfi/blast. Eim)同源的区，gdhA R (SEQ ID NO 67)GGAGGAAGCCCCAGAGCAGG-与gdhA 基因下游区的序列(1842274 至 1842四3) (http //ecoRene. orR/blast. Eim)同源的区。所得的菌株命名为MG1655AgdhA: :Cm。为了转移Δ gdhA: :Cm，使用噬菌体Pl转导。将菌株MG1655 Δ gdhA: Cm的噬菌体裂解液用于转导入菌株MG1655 Δ sucCD Δ aceBAK Δ arcA: :Km。然后选择卡那霉素和氯霉素抗性转化体，且通过PCR分析用前述限定的寡核苷酸Ptrc-gdhAverF和gdhA R验证AgdhA: :Cm。所得的菌株命名为 MG1655 Δ sucCD Δ aceBAK Δ arcA:Km ΔgdhA::Cm。
然后消除卡那霉素和氯霉素抗性盒。然后将携带作用于卡那霉素和氯霉素抗性盒的FRT位点的FLP重组酶的质粒pCP20通过电穿孔导入重组位点。在42°C的系列培养之后，卡那霉素和氯霉素抗性盒的丧失通过PCR分析用如前所用的相同寡核苷酸(aceBAKF/ aceBAKR、sucCDF/sucCDR、arcAF/arcAR、和 gdhAverF/gdhAR)进行验证。所得的菌株命名为 MG1655 Δ sucCD Δ aceBAK AarcA Δ gdhA.4. 3构建供过表达丙酮丁醇梭菌的双功能性乙醛CoA/醇脱氢酶adhE2和大肠杆菌的丙酰 CoA 合成酶 prpE 基因的质粒pUC19-Ptrc01/0P01/RBS01-adhE2ca-prpE-TT02将来自丙酮丁醇梭菌、编码双功能性乙醛CoA/醇脱氢酶的adhE2基因克隆于质粒 PUC19。将编码丙酰CoA合成酶的prpE基因克隆于adhE2的上游。adhE2基因是从丙酮丁醇梭菌菌株ATCC824的巨大质粒(megaplasmid) pSoll (33722 至 36298 位)用寡核苷酸 adhE2Ca F 和 adhE2Ca R 用 PCR 扩增的。adhE2Ca F(SEQ ID NO 68)ggtaccggatccgggccc gagctgttgacaattaatcat CCggCtCgtataatgtgtgg aattgtgagcggat aacaattTACGTA taaggaggtatatt ATGAAAGTTACAAATCAAAAAGAAC 具有-供添加KpnI、BamHI、ApaI限制性位点的区(粗体小写)-供添加启动子PtrcOl的区(下划线小写)-供添加操纵子序列OPOl的区(斜体小写)-供添加SnaBI限制性位点的区(粗体大写)-供添加RBSO1序列的区(小写)-与丙酮丁醇梭菌33722至33752的adhE2区同源的区(下划线大写)adhE2Ca R(SEQ ID NO 69)GAGCTCAAGCTT aacagataaaacgaaaggcccagtctttcgactgagcctttcgttttatttg
^igcctagggctagctctagattaaTTM. AATGATTTTATATAGATATCCTTAAGTTCAC,具有-供添加HindIIKSacI限制性位点的区(大写)-供添加终止子TT02的区(下划线粗体小写)-供添加PacI、XbaI、NheI、AvrII限制性位点的区(斜体)-与丙酮丁醇梭菌36264至36四8的adhE2区同源的区(下划线大写)。将该PCR片段用BamHI和HindIII消化，并克隆入用相同限制性酶消化的载体 PUC19。所得的质粒命名为 pUC19-Ptrc01/0P01/RBS01-adhE2ca-TT02。为了扩增prpE基因，使用大肠杆菌的染色体DNA作为模板和引物prpEF和prpE R 实施PCR。prep F (SEQ ID NO 70)tctagaggatcc aagttcaacaggagagcattatg-供添加限制性位点^CbaI和BamHI的区(粗体下划线)-与 351910 至 351932 的区同源的区(http//ecoRene. orR/blast. php)(小写)pr印 R_(SEQ ID NO 71)ggatccgctagccctaggtacgta ctactcttccatcgcctggc-供添加限制性位点BamHI、NheI、AvrII、SnaBII的区(粗体下划线)
-与 353816 至 353797 的区同源的区(http //ecogene. org/blast. php)(小写)将该PCR片段用^CbaI和NheI消化，并克隆入用相同限制性酶消化的载体 pUC19-Ptrc01/0P01/RBS01-adhE2ca-TT02。所得的质粒命名为 pUC19_Ptrc01/0P01/ RBS01-adhE2ca-prpE-TT02。4.4 构建 MG1655 AsucCD AaceBAK AarcA Δ gdhA (pUC19_Ptrc01/0P01/ RBS01-adhE2ca-prpE-TT02) (pME101-kivDll-yqhD-TT07)菌株然后将ρ UC19-PtrcO l/0P01/RBS01-adhE2ca-prpE-TT02 禾口 pME101-kivDll-yqhD-TT07 质粒导入菌株 MG1655 AsucCD AaceBAK AarcA Δ gdhA。实施例5在锥形瓶中发酵乙二醇生产菌株在500ml带隔板的锥形瓶培养中使用补充10g/l MOPS和10g/l葡萄糖并调整至 pH 6. 8 的改良 M9 培养基(Anderson, 1946，Proc. Natl. Acad. Sci. USA32 :120-128)评价菌株的性能。若需要，以50mg/l的浓度添加大观霉素，和/或若需要，以30mg/l的浓度添加氯霉素。使用24h预培养来将50ml培养物接种至约0. 3的0D600nm。将培养物在37°C和 200rpm在振荡器上维持直至培养基中的葡萄糖耗尽。在培养结束时，通过使用用于分离的 Biorad HPX 97H柱和用于检测的折光计的HPLC来分析葡萄糖和主要产物。乙二醇的产生通过气相色谱/质谱(GC/MQ用偶联于Hewlett Packard 5973kries质量选择性检测器 (EI)和 HP-INNOWax 柱长，0. 20mm i. d.，0. 20 微米的薄膜厚度)的 Hewlett Packard 689(^erieS气相色谱仪来确证。将生成的乙二醇的保留时间和质谱与乙二醇可信样品进行比较。所述生产菌株和参照菌株的性能比较在下表中给出。(对于生产菌株的构建，见下)
权利要求
1.一种经遗传修饰用于生物产生脂族二醇的微生物，其中所述微生物包含用具有 2-酮酸脱羧酶活性的酶对羟基-2-酮基脂族酸代谢物进行脱羧的代谢途径，用具有羟基醛还原酶活性的酶将从所述脱羧步骤获得的产物进一步还原为相应的脂族二醇，且其中所述微生物经遗传修饰以供改善所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物的产生。
2.权利要求1的微生物，其选自下组细菌、酵母和真菌。
3.权利要求1或2任一项的微生物，其中其选自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、梭菌禾斗(Clostridiaceae)、芽抱杆菌禾斗(Bacillaceae)、链霉菌禾斗(Streptomycetaceae)禾口棒 If (Corynebacteriaceae)。
4.权利要求1至3任一项的微生物，其中所述微生物包含编码2-酮酸脱羧酶的内源基因。
5.权利要求4的微生物，其中所述微生物经进一步修饰以增强编码2-酮酸脱羧酶的内源基因的表达。
6.权利要求1至3任一项的微生物，其中所述微生物包含编码2-酮酸脱羧酶的异源基因。
7.权利要求1至6任一项的微生物，其中所述脂族二醇是乙二醇，且所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物是羟基丙酮酸。
8.权利要求1至6任一项的微生物，其中所述脂族二醇是1，3_丙二醇，且所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物是4-羟基-2-酮基丁酸。
9.权利要求1至6任一项的微生物，其中所述脂族二醇是1，4_丁二醇，且所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物是5-羟基-2-酮基戊酸。
10.一种用于发酵产生脂族二醇的方法，包括下述步骤-在包含碳源的适当培养基上培养权利要求1至9任一项的微生物，和 -从培养基回收所述脂族二醇。
11.权利要求10的方法，其中所述二醇经进一步纯化。
12.权利要求10或11任一项的方法，其中所述碳源选自己糖、戊糖、单糖、二糖、寡糖、 糖蜜、淀粉及其组合。
13.权利要求12的方法，其中所述碳源选自葡萄糖和蔗糖。
全文摘要
本发明涉及用于生物制备二醇的新颖方法，包括培养经遗传修饰以供生物产生脂族二醇的微生物，其中所述微生物包含用具有2-酮酸脱羧酶活性的酶对羟基-2-酮基脂族酸代谢物脱羧的代谢途径，从所述脱羧步骤获得的产物进一步还原为相应的脂族二醇，且其中所述微生物经遗传修饰以供改善所述羟基-2-酮基脂族酸代谢物的产生。本发明还涉及用于产生脂族二醇的经修饰的微生物。
文档编号C12N9/88GK102341502SQ200980157747
公开日2012年2月1日 申请日期2009年12月29日 优先权日2008年12月31日
发明者C.伯伊萨特, P.苏凯尔 申请人:代谢探索者公司