相关申请的交叉引用及优先权
本申请要求于2015年6月17日提交的美国临时申请号62/180,892的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术：
当特定的微生物较为昂贵或者当微生物可以用作饲料或饲料补充剂时，繁殖微生物，即增加微生物的量可能是可取的。繁殖，特别是酵母繁殖可能具有挑战性。例如，当在葡萄糖上生长时，如果培养基中的葡萄糖浓度较高(例如，超过5克/升)，即使在充分曝气的条件下，一些微生物如酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)也可能对众所周知的“克勒勃屈利效应(crabtreeeffect)”敏感。在高葡萄糖水平下，酵母可以通过发酵途径开始制造乙醇，而不是通过呼吸途径生产更多酵母(即，高葡萄糖水平抑制呼吸)。为了减少或防止克勒勃屈利效应，酵母制造商经常通过补料分批或缓慢加料工艺来使酵母生长，其中以避免过度生产乙醇的速率引入用于生产酵母生物质的碳源(葡萄糖)。然而，补料分批系统可能相对较昂贵且对于乙醇生产商来说控制和管理具有挑战性。
期望开发使用分批工艺方案而不是补料分批工艺方案来繁殖微生物(比如，酵母)的方法，因为分批工艺的控制可能较简单并且对工艺参数的变化(例如，对于不同水平的碳源和克勒勃屈利效应)耐受性较高。
此外，期望使用替代的、更容易获得的和/或更经济的繁殖培养基用成分(例如，碳源、营养源等)。
技术实现要素：
本发明公开了使用甘油作为碳源和酒糟成分作为营养源的微生物繁殖方法和系统。对于可以使用甘油代替葡萄糖或除了葡萄糖外使用甘油进行繁殖的微生物，使用甘油可以避免使用葡萄糖观察到的克勒勃屈利效应。例如，甘油的水平可以在很宽的范围(例如，包括与会诱导克勒勃屈利效应的葡萄糖水平对应的水平)内变化，然而经由有氧呼吸途径的繁殖持续而不切换到厌氧发酵途径以至于过度生产乙醇。因为使用甘油可以避免克勒勃屈利效应，所以可以使用批量工艺来进行繁殖。
使用至少一部分酒糟成分作为繁殖培养基的营养源的一部分(或全部)可以提供与常规营养源(比如，酵母提取物)同样好或更优的结果。而且，在繁殖培养基的营养部分中使用至少一部分酒槽成分允许了来自玉米产乙醇工艺的副产物的使用。
在繁殖微生物(比如，酵母)中也可以使用较少量的初始细胞团(例如，每升培养基低至1.0克酵母、每升培养基低至0.02克酵母、或甚至更低)。
可以使用甘油来繁殖或发酵的微生物，包括一些基因修饰的酵母。有利地，使用甘油可以防止“污染物”酵母(比如，不喜欢在作为碳源的甘油上生长的酿酒酵母)与靶向繁殖的微生物竞争。
根据本发明的一个方面，公开一种繁殖微生物的方法，所述方法包含：
使所述微生物的第一细胞团在组合物上生长，所述组合物包含碳源和营养源，其中所述碳源包含甘油，并且所述营养源包含酒槽成分以繁殖所述微生物的第一细胞团，从而形成所述微生物的第二细胞团。
根据本发明的另一个方面，公开一种繁殖微生物的方法，所述方法包含：
(a)将组合物与微生物的第一细胞团合并，所述组合物包含：
(i)包含甘油的碳源；和
(ii)包含酒糟成分的营养源；以及
(b)使所述微生物的第一细胞团在所述组合物上生长一段时间以形成所述微生物的第二细胞团。
根据本发明的另一个方面，公开一种用于繁殖微生物的系统，所述系统包含：
(a)繁殖反应器容器，其中所述繁殖反应器容器含有组合物，所述组合物包含：
(i)包含甘油的碳源；
(ii)包含酒糟成分的营养源；以及
(iii)微生物的第一细胞团；其中所述微生物可以使用所述组合物作为饲料源，并且其中所述繁殖反应器容器被配置用于所述微生物的第一细胞团的生长以形成微生物的第二细胞团；以及
(b)曝气器，所述曝气器连接至所述繁殖反应器容器。
附图说明
图1显示根据本发明实施例的繁殖系统的流程图。
图2显示根据本发明实施例的繁殖系统的流程图。
图3a显示根据实施例1报道的一个实施例在甘油和稀酒糟上的酵母细胞有氧生长(以g/l计)。
图3b显示根据实施例1报道的一个实施例在甘油和稀酒糟上的酵母细胞有氧生长(以g/l计)。
图4a显示根据实施例2报道的一个实施例在甘油和稀酒糟上的酵母细胞有氧生长(以g/l计)。
图4b显示根据实施例2报道的一个实施例在甘油和稀酒糟上的酵母细胞有氧生长(以g/l计)。
具体实施方式
公开了用于繁殖微生物(比如，酵母)的方法和系统。例如，繁殖可用于复制微生物的初始(例如“起始者”)群体，从而产生足以用于发酵的更大群体的微生物并制造发酵产物。图1中示出了示例性工艺流程图。所公开的方法和系统还可用于产生或增加微生物群体的数量，可收集并干燥该微生物群体用作营养或饲料补充剂或用于其它目的。
如图1所示，在繁殖系统115中合并微生物的第一细胞团100、碳源105和营养源110，使得第一细胞团100可以复制并形成第二细胞团120。然后第二细胞团120可以用于发酵系统125中，以将一种或多种单糖(例如，来自预处理的木质纤维素生物质)130转化成发酵产物135，发酵产物135包括生化物质，比如生物燃料(例如，乙醇、丁醇，等等)。
可将一种或多种单糖转化为生化物质的微生物是众所周知的，并且包括例如细菌和/或真菌比如酵母。产物生化物质可以根据所提供的条件而变化。在许多实施例中，所述生化物质包括生物燃料比如乙醇、丁醇等。在一些实施例中，所述微生物包括一种或多种称为“产乙醇物”的产乙醇微生物。如本文所用，“产乙醇物”是指可以将一种或多种单糖(例如，葡萄糖等)至少转化成乙醇的微生物。
待繁殖的微生物可以为原核(例如，细菌)和真核(例如，酵母、真菌和藻类)微生物。示例性的细菌微生物包括埃希氏菌属(escherichia)、芽孢杆菌属(bacillus)、克雷伯氏菌属(klebsiella)、乳杆菌属(lactobacillus)、乳球菌属(lactococcus)等。示例性的藻类包括小球藻属(chlorella)、破囊壶菌属(thraustochytriu)、裂殖壶菌属(schizochytrium)、隐甲藻属(crypthecodinium)等。在一些实施例中，藻类为异养藻类。
示例性的酵母和真菌包括曲霉属(aspergillus)、假丝酵母属(candida)、毕赤酵母属(pichia)、(汉逊酵母属(hansenula))、平革菌属(phanerochaete)、克勒克酵母属(kloeckera)(汉森氏酵母属(hanseniaspora))、克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)、红酵母属(rhodotorula)、球拟酵母属(torulopsis)、接合酵母属(zygosaccharomyces)、耶氏酵母属(yarrowia)和酵母属(saccharomyces)。
在一些实施例中，所述微生物包括大肠杆菌(escherichiacoli)、产酸克雷伯氏菌(klebsiellaoxytoca)、运动发酵单胞菌(zymomonasmobilis)、热纤维梭菌(clostridiumthermocellum)、巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)、树干毕赤酵母(pichiastipites)、白色念珠菌(candidaalbicans)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)、黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)、粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)、和/或解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)。
在一些实施例中，待繁殖的微生物包括基因修饰的酵母，比如基因修饰的酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。根据一个实施例，所述酵母是酿酒酵母菌株。在一些实施例中，所述酵母是能够在甘油上生长的酿酒酵母菌株。在其他实施例中，所述酵母是能够在甘油上生长的、基因修饰的酿酒酵母菌株。在其他实施例中，所述酵母菌株是非基因修饰的菌株(例如，酿酒酵母)。
如本文所用，“碳源”是指一种或多种包括至少一个碳原子的化合物，并且可被微生物(比如，酵母)用于生长和/或复制以产生另外的生物质。示例性的碳源包括单糖比如葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、木糖等；二糖比如乳糖、麦芽糖、蔗糖、纤维二糖等；寡糖；多糖比如纤维素、半纤维素、淀粉、木糖胶(xylane)等；仅包括一个碳原子的单碳底物比如甲醇；和多元醇比如甘油，但不限于此。
在一些实施例中，所述碳源可以为甘油。甘油可以从许多不同来源获得，比如来自生物柴油工业和来自乙醇生产工艺工业。甘油可以是粗制甘油。基于使用的粗制甘油类型，百分比和污染物类型可以不同，并且可以包括例如柠檬酸、硫酸、甲醇、脂肪酸、灰分、乙酸钠、源自酯交换工艺的皂和盐等。根据生物柴油生产所用的工艺，粗制甘油可以包括各种甘油纯度。甘油的纯度可以为55至99％、75至90％。甘油的示例性商业来源可以从regtm(比如reg甘油-98或reg甘油80)获得。
在一些实施例中，可以提供一定量的甘油(例如，粗制甘油)作为碳源的一部分或全部以有助于在期望的时间量内复制(繁殖)期望的微生物群体(例如产乙醇物)。在一些实施例中，所述碳源基本上由甘油组成。在一些实施例中，所述碳源基本上由粗制甘油组成。在其他实施例中，所述碳源由甘油组成。在其他实施例中，所述碳源由粗制甘油组成。在一些实施例中，甘油(例如，粗制甘油)是全部碳源，不含其他碳源比如葡萄糖。在一些实施例中，如果存在甘油以外的碳源(例如，葡萄糖)，则其以不会导致克勒勃屈利效应的量存在。在一些实施例中，可能存在的非甘油碳源(例如，葡萄糖)的量不超过每升5克。在其他实施例中，可以存在的非甘油碳源(例如，葡萄糖)的量为每升1克或以下、每升0.5克或以下、或每升0.25克或以下。在一些实施例中，所述非甘油源为葡萄糖，并且如果存在的话，可以不超过每升5克，或者可以为每升1克或以下、每升0.5克或以下、或每升0.25克或以下。
所提供的甘油可以取决于如下因素：比如存在的其他碳源的类型和数量、存在的营养源的类型和数量、ph值、温度、期望的繁殖时间段等。在一些实施例中，甘油以少于或等于5％w/v的量提供于组合物(例如，含有碳和营养源的培养基)中。在一些实施例中，甘油占所述组合物的0.1～2％w/v。在其他实施例中，甘油可以低至占所述组合物的0.2％w/v。在其他实施例中，甘油是粗制甘油，该粗制甘油为来自生物柴油生产的副产物，并且可以以少于或等于5％w/v的量提供于所述组合物中。在一些实施例中，甘油以少于或等于10％w/v的量提供于所述组合物(例如，含有碳和营养源的培养基)中。
在一些实施例中，所提供的甘油多于每升5克。在一些实施例中，所提供的甘油为3至100g/l、或5至100g/l、或5至50g/l、或15至25g/l。在一些实施例中，甘油为至少5g/l。在其他实施例中，甘油为至少3g/l。
除碳源外，还包括营养源以有助于繁殖微生物，比如产乙醇物。如本文所用，“营养源”是指微生物可以用于生长和/或复制以产生另外的微生物并且不同于碳源的一种或多种材料。
所使用的营养源包括酒糟成分(例如，全酒糟、稀酒糟和/或糖浆)。全酒糟是众所周知的并且是蒸馏发酵产物的副产物。例如，众所周知的用于制造全酒糟的工艺为玉米粒产乙醇工艺，将参照图2对该工艺进行解释。如图2所示，在系统205中制备谷物比如玉米、大麦、小麦和/或高粱200，使得其可以在系统210中发酵成包括一种或多种生化物质(比如，乙醇)的发酵产物。可以使用全谷物，或可以仅使用谷物的一个或多个部分。例如，系统205可以碾磨全谷物用于发酵或者在碾磨之前将谷物分成一个或多个分离的部分。在碾磨之后，可以进一步处理磨碎的谷物材料以将多糖和/或寡糖分解成一种或多种单糖，比如可以通过例如酵母发酵的葡萄糖。将多糖(比如，淀粉)分解成葡萄糖的方法是众所周知的且包括，例如热水(比如包括加入的酸(比如，硫酸)的热水)，和/或酶预处理。在发酵210后，发酵产物在系统215中蒸馏，其中乙醇220在蒸馏塔中从发酵醪中除去。在除去乙醇220之后，将剩余的残余物作为酒糟残余物230除去。酒糟残余物230被称为“全酒糟”。全酒糟230可以非必要地经由一个或多个系统240进一步处理，以在递送至繁殖系统115之前进一步澄清或分离全酒糟。例如，可以对全酒糟230进行固液分离工艺以生产残余物固体料流(也称为湿饼)和残余物液体料流(也称为稀酒糟)。可以进一步处理稀酒糟以通过蒸发提高固体浓度，从而得到浓缩的蒸馏物可溶物或糖浆。典型地，将糖浆混合回分离的固体料流或湿饼中，并进给至转鼓式干燥器以除去剩余水分。所得干燥固体被称为干酒糟及其可溶物或“ddgs”，并可作为动物饲料出售。
来自谷物产乙醇生产工艺的这种酒糟成分，包括全酒糟、湿饼、稀酒糟和/或糖浆可用作繁殖微生物(比如，酵母)的营养源的至少一部分。与例如酵母提取物相比，使用全酒糟的至少一部分提供了替代的或另外的营养源。使用全酒糟(例如，稀酒糟)作为全部营养量或部分营养可以繁殖酵母，而且或优于其他营养源，比如酵母提取物。
在一些实施例中，所述营养源包括酒糟成分，比如稀酒糟、湿饼、糖浆、及其任何组合。所述营养源可以包括源自稀酒糟的糖浆、稀酒糟、或其组合。
可以提供任何数量的酒糟成分，从而有助于在给定的时间量内复制(繁殖)并产生期望的微生物群体(例如产乙醇物)。提供的酒糟成分的数量可以取决于如下因素：比如存在的其他营养源的类型和数量、存在的碳源的类型和数量、ph值、温度、期望的繁殖时间段等。在一些实施例中，所述营养源仅作为酒糟成分(比如，稀酒糟)提供。
在一些实施例中，所述营养源包括源自全玉米粒的酒糟成分，其数量为每升所述组合物(例如，包括碳和营养源的培养基)5至35克固体。在其他实施例中，所述营养源包括源自全玉米粒的稀酒糟，其数量为每升所述组合物5至35克固体。在一些实施例中，所述酒糟成分(例如，稀酒糟)含有少于5000mg/l的乙酸、少于8000mg/l的乳酸、或两者。在其他实施例中，所述营养源包括稀酒糟但不含酵母提取物、尿素、或两者。在一些实施例中，所述营养源主要为稀酒糟，并且如果包括其他营养源，比如酵母提取物或尿素，则其他营养源不超过0.3g/l。
在一些实施例中，所述营养源基本上由稀酒糟组成，在其他实施例中，所述营养源由稀酒糟组成。在一些实施例中，所述酒糟成分包含糖浆、由糖浆组成、或基本上由糖浆组成。
下面参考用于制造乙醇的产乙醇物(比如，基因修饰的酵母)来描述繁殖能够将一种或多种单糖转化成生化物质的微生物。然而，本发明不限于仅繁殖这样的酵母，并且应当理解，繁殖任何其他微生物(例如，基因修饰的或非基因修饰的)是可以设想的。
如图1所示，繁殖产乙醇物包括至少合并碳源105和营养源110以形成培养基，从而促进足量的产乙醇物(即，产乙醇物细胞团)的生长以进行接种(即，将产乙醇物接种物供应)至发酵系统125。可以在培养基形成时，培养基形成后或两者中包括微生物(例如，产乙醇物)的第一细胞团100。
根据一个示例性实施例，用于繁殖系统115的生长培养基包括水、营养源110、包括甘油的碳源105、以及非必要性地一种或多种的添加剂(未示出)，该营养源110具有全酒糟(例如，稀酒糟)作为全部或部分营养源。
用于繁殖酵母的非必要性的添加剂是众所周知的，并且包括，例如供应有产乙醇物的试剂，比如抗生素、补充性酶或辅助酶、用于调节和维持ph值的材料、为所述微生物提供营养或其它益处的营养或其他成分。非必要性的另外的营养包括，例如，酵母提取物、尿素、磷酸氢二铵、硫酸镁、硫酸锌、或其它盐等。
选择营养源与碳源的比率以使期望的微生物细胞团生长(比如，大小足够的酵母细胞团)以在纤维素乙醇工艺中进行发酵。在营养源与碳源的比率的选择中的因素包括营养源的类型和数量、碳源的类型和数量、另外的生长培养基试剂的类型和数量、微生物的类型和初始数量、微生物生长的目标时间段、ph值、温度等。另外的考虑包括是否期望在繁殖期间中使微生物适应发酵期间预期的环境。使微生物适应发酵环境可以有利地帮助微生物更有效地操作(例如，将糖转化成乙醇)。
在示例性实施例中，所述酒糟成分包括稀酒糟，并且甘油与稀酒糟固体的重量比为0.05至20、0.1至10、0.2至5、和0.5至2.5。
当所述微生物存在于生长培养基中并且存在期望的条件时，可以开始繁殖所述微生物。微生物繁殖要考虑的条件包括，例如组分的数量、ph值、微生物生长的时间段、搅拌速度(如果存在搅拌)、暴露于氧气、温度等。
在一些实施例中，微生物的第一细胞团(例如，初始细胞团)以每升培养基少于5克产乙醇物、每升培养基少于2克产乙醇物、或每升培养基少于0.5克微生物的数量存在。在一些实施例中，所述微生物的第一细胞团为每升培养基0.5至1克微生物。
所述细胞团可以根据条件繁殖一段时间以生产期望的细胞团。典型地，期望的细胞团的大小足以在经济合意的时间段内将糖发酵成醇(例如乙醇)。示例性的时间段包括12-80小时、24-48或48-80小时。在示例性实施例中，所述微生物(例如酵母)的期望(例如，第二或最终)细胞团以每升培养基10至30克微生物的数量存在。在一些实施例中，在8至80小时的时间段内，所述微生物的第二细胞团的数量为每升培养基10至30克微生物，其中该时间段从所述微生物的第一细胞团与碳源和营养源合并以繁殖所述微生物的第一细胞团开始。在12至48小时的时间段内，所述微生物的期望的(例如，第二或最终的)细胞团以每升培养基1至20克微生物的数量存在，其中该时间段从所述微生物的第一细胞团与碳源和营养源合并以繁殖所述微生物的第一细胞团开始。
当在甘油和酒糟成分上生长时，在8-80小时的时间段内，酵母细胞的产量可以为每升0.5克至30克。在一些实施例中，酵母生长速率(酵母细胞团生产率)可以为0.1克/升/小时至0.5克/升/小时、或0.2克/升/小时至0.4克/升/小时。
根据其中微生物包括酵母的实施例，提供繁殖系统用于可以使用甘油作为碳源的酵母(例如，将在包括甘油的培养基中繁殖的酵母)的选择性生长，即使存在其它酵母(例如，作为污染物)也是如此；在提供甘油作为唯一碳源的培养基(例如，不含有大量葡萄糖或其他碳源的培养基)中，能够使用甘油作为碳源繁殖的酵母会进行繁殖，并且可能不能使用甘油作为碳源进行繁殖的其他/污染物酵母(比如，典型地在含有葡萄糖的培养基中繁殖的较常见的酵母形式)将不会以相同的速率繁殖(或根本不繁殖)。
生长培养基的ph值可以为有助于在期望的时间量内复制(繁殖)并产生期望的微生物群体(例如，产乙醇物)的ph值。在一些实施例中，ph值在4和8之间，优选在5和7之间，甚至更优选在4.5和6之间。用于调节和维持生长培养基的ph值以繁殖微生物(比如，产乙醇物)的技术是众所周知的，并且包括例如添加一种或多种酸性物质和/或添加一种或多种碱性物质。
所述生长培养基的温度可以为有助于在期望的时间量内复制(繁殖)并产生期望的微生物群体(例如，产乙醇物)的温度。在一些实施例中，所述温度为在15℃至50℃，优选20℃至40℃，甚至更优选25℃至40℃的范围内的温度。
微生物的繁殖可以根据连续工艺、补料分批工艺，分批工艺、或其组合进行。优选地，分批工艺具有与之相关的某些益处。在一些实施例中，提供一定量的甘油作为碳源，使得众所周知的“克勒勃屈利效应”不足为虑，所以可以进行分批工艺而不产生过量的乙醇。也就是说，在一些实施例中，与葡萄糖不同，相对高水平的甘油不会使繁殖工艺从呼吸途径切换为厌氧途径以至于产生乙醇而不是复制更多的微生物。分批处理工艺可能是非常可取的，因为与连续或补料分批工艺相比，分批处理工艺可能相对更容易管理和控制。
在一些实施例中，对于至少一部分繁殖工艺，搅拌生长培养基，以在整个培养基中提供足够的氧气水平，以促进有氧呼吸，从而复制所述微生物而不是例如进行厌氧发酵生产乙醇。在一些实施例中，如果没有向繁殖培养基提供足够的氧气，则该工艺可以切换至厌氧途径并促进发酵，从而过度产生醇。
根据其中微生物包括酵母的示例性实施例，为了使酵母在繁殖系统中生长(接种)，所述温度可以保持约28至32摄氏度，并且ph值为约5.2至5.8，时间为至少12小时。例如，酵母接种物可以在包括温度为约30摄氏度且ph值为约5.5的条件下孵育约17小时。
还公开可以在一个或多个阶段中进行繁殖的繁殖系统。例如，当酵母是待繁殖的微生物时，所述繁殖系统可以包括至少两个阶段。在第一阶段，酵母培养物可以生长成初始酵母接种物。在第一繁殖阶段，将初始酵母接种物引入容器中并稀释(例如，250倍)。在容器中，最初的酵母接种物和一部分碳源(例如，甘油)、一部分营养源(例如，稀酒糟)、以及水可以与非必要的添加剂(上文已讨论)一起供应。根据示例性实施例，所述温度可以保持约26至37摄氏度，并且ph值为约3.5至6.5，时间为至少24小时。例如，在包括温度为约30摄氏度且ph值为约5.5的条件下，酵母可以在第一繁殖阶段生长月24小时。
在第二繁殖阶段，来自第一繁殖阶段的酵母接种物典型地在转移至另一个容器后稀释(例如，10倍)。在该容器中，可以连同非必要的添加剂(上文已讨论)一起供应来自第一繁殖阶段的酵母接种物和一部分碳源(例如，包括甘油和/或其它糖的液体成分)、一部分营养源(例如，稀酒糟)和水。根据示例性实施例，所述温度可以保持约26至37摄氏度，且ph值为约3.5至6.5，时间为至少24小时。例如，在包含温度为约30摄氏度且ph值为约4.5至约5.5的条件下，酵母可以在第二繁殖阶段生长约24小时。
根据一个实施例，所述酵母细胞团在第一阶段增长约200至500倍，在第二阶段增长约20至40倍。
繁殖后，将微生物细胞团提供给发酵系统，比如系统125，从而使生物质(比如预处理的木质纤维素材料)发酵并生产乙醇。
实施例1
使用甘油的酵母、酿酒酵母有氧繁殖
使用能够在甘油上生长的酿酒酵母菌株。所使用的生长培养基包括甘油和澄清的稀酒糟，甘油即来自生物柴油制造工艺的副产品，纯化至工业级，纯度约95％，澄清的稀酒糟即从淀粉到乙醇生物炼制的副产品。其中通过离心去除大部分悬浮固体的稀酒糟的液体部分称为澄清的稀酒糟。在bioflo310的5l反应器中制备培养基(1.5l)。基于澄清的稀酒糟(cts)中的总固体，将cts加入所述反应器中。来自cts的目标固体为20g/l。加入来自生物柴油生产的工业级甘油以在最终的混合物中得到1.5％w/v甘油。加入0.24g/l尿素作为另外的氮源。将lactoside247tm以5ppm终浓度加入1.5l培养基中从而防止任何细菌污染。两个反应器中各制备有完全相同的培养基。但是，将葡萄糖加入其中一个反应器中，达到0.25％w/v的目标初始浓度。尽管甘油的目标为1.5％w/v，但最终的混合物达到1.9％w/v甘油。这很可能是由于稀酒糟贡献的一些甘油。此外，加入一个反应器中的葡萄糖最终浓度为0.3％w/v。所述容器连接至各自的bioflo310单元。使用硫酸将两个反应器中的培养基的ph值调节至4.5。使用活性干燥形式(ady)的酵母以1g/l的剂量接种每个反应器。搅拌设定为750rpm，曝气设定为1.5slpm(标准升每分钟)，相当于1vvm(每体积培养基每分钟的空气体积)。在整个繁殖期间温度设定为31.1℃(88°f)。定期抽取样品并通过hplc分析甘油、葡萄糖、有机酸、和乙醇以及细胞干重。甘油、葡萄糖、乙醇和细胞干重的结果示于图3a(含另外的葡萄糖)和3b(不含另外的葡萄糖)。
这些结果表明所使用的酵母菌株在甘油作为主要碳源时有氧生长良好。供应另外的葡萄糖不是必要的。在含有和不含另外的葡萄糖补充物的培养基中，繁殖结束时生产的细胞团分别为15.8g/l和17.8g/l。不添加葡萄糖的培养基中的细胞产量最终为每克甘油0.9克。在不添加葡萄糖的情况下生产的细胞团和产量优于补充有葡萄糖的培养基。在这两种情况下，没有观察到乙醇的产生。当使用甘油作为大部分碳源时，减少或没有发生克勒勃屈利效应。在有氧生长期间，酵母也消耗超过90％的由澄清的稀酒糟引入培养基的乳酸(0.6g/l起始乳酸)和乙酸(例如，0.4g/l的起始乙酸)。
实施例2
使用能够在甘油上生长的酿酒酵母菌株。本研究中的生长培养基由粗制甘油和稀酒糟组成，所述粗制甘油即来自生物柴油制造工艺的副产物，纯度约80％，所述稀酒糟即从淀粉到乙醇生物炼制的副产物。在bioflo310的5l反应器中制备培养基(2.0l)。基于酒糟中的总固体，将稀酒糟(ts)加入所述反应器中。来自ts的目标固体为20g/l。加入来自生物柴油生产的粗制甘油以在最终的混合物中得到1.5％w/v甘油。添加0.24g/l尿素作为另外的氮源。将lactoside247以5ppm终浓度加入2.0l培养基中以防止任何细菌污染。两个反应器中各制备有完全相同的培养基。但是，将葡萄糖加入其中一个反应器中，达到0.25％w/v的目标初始浓度。尽管甘油的目标是1.5％w/v，但最终的混合物达到1.7％w/v甘油。这很可能是由于稀酒糟贡献的一些甘油。另外，加入一个反应器中的葡萄糖最终浓度为0.3％w/v。所述容器连接至各自的bioflo310单元。使用硫酸将两个反应器中的培养基的ph值调节至4.5。使用活性干燥形式的酵母(ady)以1g/l的剂量接种每个反应器。搅拌设定为750rpm，并且曝气设定为2.0slpm(标准升/分钟)，相当于1vvm(每体积培养基每分钟的空气体积)。在整个繁殖期间温度设定为31.1℃(88°f)。定期抽取样品并分析甘油、葡萄糖、有机酸、和乙醇以及细胞干重。甘油、葡萄糖、乙醇和细胞干重的结果示于图4a(含另外的葡萄糖)和4b(不含葡萄糖)。
这些结果表明，即使来自生物柴油制造的甘油在纯化之前处于其粗制形式，所使用的酵母菌株在甘油作为主要碳源时有氧生长良好。即使在使用粗制甘油时，补充另外的葡萄糖也不是必要的。在不添加葡萄糖的情况下生产的细胞团和产量优于补充有葡萄糖的培养基。在不含另外的葡萄糖补充物的培养基中，繁殖结束时生产的细胞团为12.1g/l。该培养基中的细胞产量最终为每克甘油0.7克。这两种情况下都没有观察到乙醇的产生。在有氧生长期间，酵母也消耗超过90％的由稀酒糟引入培养基的乳酸和乙酸。
下面提供一些另外的非限制性实施例以进一步举例说明本发明：
1.一种繁殖生物体的方法，所述方法包含：
使微生物的第一细胞团在组合物上生长，所述组合物包含碳源和营养源，其中所述碳源包含甘油，并且所述营养源包含酒槽成分以繁殖所述微生物的第一细胞团，从而形成所述微生物的第二细胞团。
2.一种繁殖微生物的方法，所述方法包含：
(a)将组合物与微生物的第一细胞团合并，所述组合物包含：
(i)包含甘油的碳源；和
(ii)包含酒糟成分的营养源；以及
(b)使所述微生物的第一细胞团在组合物上生长一段时间以形成所述微生物的第二细胞团。
3.一种繁殖微生物的系统，所述系统包含：
(a)繁殖反应器容器，其中所述繁殖反应器容器含有组合物，所述组合物包含：
(i)包含甘油的碳源；
(ii)包含酒糟成分的营养源；以及
(iii)所述微生物的第一细胞团；其中所述微生物可以使用所述组合物作为饲料源，并且其中所述繁殖反应器容器配置用于所述微生物的第一细胞团的生长以形成微生物的第二细胞团；和
(b)曝气器，所述曝气器连接至所述繁殖反应器容器。
4.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述碳源基本上由甘油组成且所述营养源基本上由酒糟组成。
5.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述碳源由甘油组成且所述营养源由酒糟组成。
6.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述碳源基本上由甘油组成。
7.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述碳源由甘油组成。
8.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述营养源基本上由酒糟成分组成。
9.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述营养源由酒糟成分组成。
10.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述甘油是来自生物柴油生产工艺的粗制甘油。
11.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述粗制甘油的纯度为75至90％。
12.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述甘油的含量为少于所述组合物的5％w/v。
13.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述甘油的含量为大于所述组合物的5g/l。
14.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述酒糟成分包含谷物材料发酵的副产物。
15.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述谷物材料包含全玉米粒材料的至少一部分。
16.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述酒糟成分以每升培养基5至35克固体的数量提供。
17.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述酒糟成分含有少于5000mg/l的乙酸。
18.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述酒糟成分含有少于8000mg/l的乳酸。
19.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述酒糟成分为稀酒糟。
20.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述稀酒糟含有少于5000mg/l的乙酸。
21.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述稀酒糟含有少于8000mg/l的乳酸。
22.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述微生物的第一细胞团以少于每升培养基5克的数量存在。
23.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述微生物的第二细胞团以每升培养基10至30克的数量存在。
24.如实施例1的方法或系统，其中所述生长的进行时间为12至24小时的时间段。
25.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述生长为分批或连续工艺。
26.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述微生物的第一细胞团在所述时间段的至少一部分中暴露于有氧条件下。
27.如前述权利要求中任一项的方法或系统，其中在整个生长时间段中，所述微生物的第一细胞团或所述微生物的第二细胞团基本上不生产乙醇。
28如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述微生物的第一细胞团包含一种或多种产乙醇物。
29.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述微生物的第一细胞团包含酵母。
30.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述酵母包含基因修饰的酵母。
31.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述酵母选自假丝酵母属(candida)、毕赤酵母属(pichia)、(汉逊酵母属(hansenula))、克勒克酵母属(kloeckera)(汉森氏酵母属(hanseniaspora))、克鲁维酵母菌属(kluyveromyces)、红酵母属(rhodotorula)、球拟酵母属(torulopsis)、接合酵母属(zygosaccharomyces)、耶氏酵母属(yarrowia)和酵母属(saccharomyces)。
32.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述酵母为酿酒酵母物种。
33.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述微生物的第一细胞团包含藻类。
34.如前述实施例中任一项的方法或系统，其中所述藻类包含小球藻属(chlorella)、破囊壶菌属(thraustochytriu)、裂殖壶菌属(schizochytrium)、或隐甲藻属(crypthecodinium)。