适合用于液化中的具有普鲁兰酶活性的多肽的制作方法

对序列表的引用本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。本发明涉及热稳定普鲁兰酶变体在由含淀粉材料生产发酵产物的方法中的用途，并且涉及具有普鲁兰酶活性的多肽。发明背景淀粉通常由约80％支链淀粉和20％直链淀粉组成。支链淀粉是其中的直链α-1,4d-葡萄糖残基由α-1,6糖苷键连接的分支多糖。支链淀粉被水解1,4-α-糖苷键以产生支链和直链寡糖的α-淀粉酶部分地降解。支链淀粉被α-淀粉酶的延长降解导致所谓的α-极限糊精的形成，α-极限糊精不易被α-淀粉酶进一步水解。支链寡糖可以被去分支酶水解为直链寡糖。剩余的支链寡糖可以被葡糖淀粉酶解聚为d-葡萄糖，葡糖淀粉酶将直链寡糖水解为d-葡萄糖。可攻击支链淀粉的去分支酶被分成两类：分别是异淀粉酶(e.c.3.2.1.68)和普鲁兰酶(e.c.3.2.1.41)。异淀粉酶水解支链淀粉和β-极限糊精中的α-1,6-d-支链糖苷键，并可通过异淀粉酶不能攻击普鲁兰的特性以及通过它们对于α-极限糊精的有限作用而与普鲁兰酶相区别。本领域众所周知在淀粉转化过程中添加异淀粉酶或普鲁兰酶。普鲁兰酶是具有普鲁兰6-葡聚糖-水解酶活性(ec3.2.1.41)的淀粉去分支酶，该酶催化普鲁兰中α-1,6-糖苷键的水解，从而释放具有还原碳水化合物端的麦芽三糖。通常，普鲁兰酶与α淀粉酶和/或葡糖淀粉酶组合使用。普鲁兰酶在本领域是已知的。us6,074,854和us5,817,498披露了来自脱支芽孢杆菌(bacillusderamificans)的普鲁兰酶。wo2009/075682披露了源自嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌(bacillusacidopullulyticus)的普鲁兰酶。wo2015/007639披露了通过将来自嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的普鲁兰酶的n-末端片段与来自脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶的c-末端片段融合而获得的杂合普鲁兰酶。源自芽孢杆菌属的现有技术普鲁兰酶到目前为止尚不足够热稳定以便在常规的淀粉转化过程的液化过程中加入。本发明的目的在于提供适合用于含淀粉材料的液化中的具有增加的热活性的普鲁兰酶变体。技术实现要素：本发明涉及变体普鲁兰酶，其中该普鲁兰酶至少包含以下取代组合：n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c，并且任选地进一步包含n222p+q252a+q256r；其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性。本发明的另外的方面涉及使用α-淀粉酶和本发明的热稳定普鲁兰酶用于在高于初始糊化温度的温度下液化含淀粉材料的方法。因此，在第二方面，本发明涉及用于由含淀粉材料生产糖浆的方法，该方法包括以下步骤：a)使用α-淀粉酶和本发明的变体普鲁兰酶在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；b)使用葡糖淀粉酶进行糖化。在第三方面，本发明涉及用于由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：a)使用α-淀粉酶和本发明的变体普鲁兰酶在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；c)使用发酵生物体进行发酵。在第四方面，本发明涉及包含本发明的变体普鲁兰酶和稳定剂的组合物。本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生所述变体的方法。附图说明图1示出了在80℃液化和标准实验室规模发酵测定中，仅be369淀粉酶对照和四个剂量的热稳定普鲁兰酶p380-2的平均乙醇产率(以％w/v计)。如通过jmp软件确定的，所有p380-2剂量都产生了在统计学上比be369对照更多的乙醇。当对照设为100％时，对于p380-2处理乙醇百分比的增加是1.4％-2.9％。图2示出了来自测试在单独用淀粉酶液化30分钟后向80℃浆液中添加p380-2的实验的乙醇产率。除去几个异常值，jmp统计分析显示两个剂量的p380-2在乙醇产率上都高于淀粉酶对照。图3示出了两个淀粉酶对照(α-淀粉酶be369(aa369)和α-淀粉酶共混物aa)和五个剂量的p598或p604在80℃液化和标准实验室规模发酵测定后的平均乙醇产率(以％w/v计)。如通过sasjmp软件中的anova和tukey-kramer检验确定的，p604的每克干固体50微克酶蛋白的剂量产生了在统计学上比α-淀粉酶共混物aa对照更多的乙醇。所有p604剂量都产生了在统计学上比aa369对照更多的乙醇。p598的每克干固体5和50微克酶蛋白产生了在统计学上比aa369对照更多的乙醇。图4示出了两个对照(aa369和α-淀粉酶共混物aa)和五个剂量的p598和p604在80℃液化和54小时发酵测定后的平均残余dp4+浓度。54小时发酵后，p604的每克干固体10、20和50微克酶蛋白的剂量的dp4+浓度在统计学上低于α-淀粉酶共混物aa对照。图5示出了两个对照(aa369和α-淀粉酶共混物aa)和五个剂量的p598和p604在80℃液化和54小时发酵测定后的平均残余dp3浓度。p598的每克干固体50微克酶蛋白的剂量和p604的每克干固体5、10、20和50微克酶蛋白的剂量具有比α-淀粉酶共混物aa对照在统计学上更低的残余dp3浓度。图6示出了两个对照(aa369和α-淀粉酶共混物aa)和五个剂量的p598和p604在80℃液化和54小时发酵测定后的平均残余dp2浓度。与α-淀粉酶共混物aa对照相比，所有剂量的p604在发酵结束时都剩余了在统计学上显著更少的dp2。p598的每克干固体50微克酶蛋白的剂量具有比α-淀粉酶共混物aa对照在统计学上更低的dp2。定义等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体基因座的基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异通过突变天然地产生，并且可能导致群体内的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽没有改变)或可能编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。催化结构域：术语“催化结构域”意指酶的含有该酶的催化机构的区域。cdna：术语“cdna”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的剪接的mrna分子进行反转录而制备的dna分子。cdna缺乏可存在于对应基因组dna中的内含子序列。最初的初级rna转录物是mrna的前体，其在呈现为成熟的剪接的mrna之前要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工。编码序列：术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框决定，该开放阅读框架从起始密码子(如atg、gtg或ttg)开始并且以终止密码子(如taa、tag或tga)结束。编码序列可以是基因组dna、cdna、合成dna或其组合。控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有多个接头。表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。表达载体：术语“表达载体”意指线状或环状dna分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地连接至供用于其表达的控制序列。片段：术语“片段”意指从成熟多肽或结构域的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽；其中片段具有普鲁兰酶活性。宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不一致的亲本细胞的任何后代。分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于在自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加物质的量而修饰的任何物质(例如，宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中；例如，宿主细胞可以经遗传修饰以表达本发明的多肽。来自该宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如n-末端加工、c-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。本领域已知，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的c-末端和/或n-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的c-末端和/或n-末端氨基酸)。成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的多核苷酸。核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。可操作地连接：术语“可操作地连接”意指将控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置这样使得该控制序列指导该编码序列的表达的构型。普鲁兰酶：术语“普鲁兰酶”意指具有普鲁兰6-葡聚糖-水解酶活性(ec3.2.1.41)的淀粉去分支酶，该酶催化普鲁兰中α-1,6-糖苷键的水解，从而释放具有还原碳水化合物端的麦芽三糖。出于本发明的目的，根据实例中所述的程序可以确定普鲁兰酶活性。在本发明的上下文中，变体普鲁兰酶具有增加的热活性。使用如在实例中所述的phadebas测定，将增加的热活性确定为当在76℃-81.5℃下测量时相对于在65℃或75℃下的活性的相对活性。具体而言，当在76℃下测量时，相对于在65℃下的活性，适用于本发明方法的普鲁兰酶变体具有至少30％，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少95％的相对活性。更具体而言，当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，适用于本发明方法的普鲁兰酶变体具有至少50％，更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少95％的相对活性。野生型普鲁兰酶：术语“野生型”普鲁兰酶意指由天然存在的微生物(如在自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的普鲁兰酶。序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列一致性”描述。出于本发明的目的，使用如在emboss包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件，rice等人,2000,trendsgenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的needle程序中所实施的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的needle输出(使用-非简化(-nobrief)选项获得)用作百分比一致性并且计算如下：(一致的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)出于本发明的目的，使用如在emboss包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件，rice等人,2000，同上)(优选5.0.0版或更新版本)的needle程序中所实施的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性。所使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5和ednafull(ncbinuc4.4的emboss版本)取代矩阵。将标记为“最长一致性”的needle输出(使用-非简化选项获得)用作百分比一致性并且计算如下：(一致的脱氧核糖核苷酸x100)/(比对长度-比对中的空位总数)严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃下使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃下使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/毫升剪切并变性的鲑鱼精子dna和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃下使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准dna印迹程序，在42℃下在5xsspe、0.3％sds、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子dna和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃下使用2xssc、0.2％sds将载体材料洗涤三次，每次15分钟。子序列：术语“子序列”意指从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失一个或多个(例如，几个)核苷酸的多核苷酸；其中子序列编码具有普鲁兰酶活性的片段。s8a蛋白酶：术语“s8a蛋白酶”意指属于亚家族a的s8蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶(ec3.4.21.62)是亚家族s8a中的一个亚组，然而，来自嗜热球菌属pk的本发明s8a蛋白酶是一种枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶，其尚未被包括在iubmb分类系统中。根据本发明的s8a蛋白酶水解底物suc-ala-ala-pro-phe-pna。对硝基苯胺(pna)的释放导致在405nm处的吸光度增加，并且与酶活性成比例。最适ph＝ph8，并且最适温度＝60℃。变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，几个)位置包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的具有普鲁兰酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸置换占用某一位置的氨基酸；缺失意指去除占用某一位置的氨基酸；并且插入意指在邻接并且紧随占用某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。在描述变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用已接受的iupac单字母或三字母氨基酸缩写。在本发明的上下文中，变体普鲁兰酶具有增加的热活性。使用如在实例中所述的phadebas测定将增加的热活性确定为当在76℃-79℃下测量时相对于在65℃下的活性的相对活性，或者使用如在实例中所述的phadebas测定将增加的热活性确定为当在78℃-81.5℃下测量时相对于在75℃下的活性的相对活性。具体而言，当在76℃下测量时，相对于在65℃下的活性，适用于本发明方法的普鲁兰酶变体具有至少30％，更具体地至少40％、更具体地至少50％、更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少95％的相对活性。更具体而言，当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，适用于本发明方法的普鲁兰酶变体具有至少50％，更具体地至少60％、更具体地至少70％、更具体地至少80％、更具体地至少90％、更具体地至少95％的相对活性。变体命名规则出于本发明的目的，将披露为seqidno:3的成熟杂合普鲁兰酶多肽用于确定另一种普鲁兰酶中对应的氨基酸残基。将另一种普鲁兰酶的氨基酸序列与披露为seqidno:3的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用如在emboss包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件，rice等人,2000,trendsgenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的needle程序中所实施的needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定与披露为seqidno:3的成熟多肽中的任何氨基酸残基对应的氨基酸位置编号。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种普鲁兰酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于muscle(通过对数预期的多序列比较；3.5版或更新版本；edgar,2004,nucleicacidsresearch[核酸研究]32:1792-1797)、mafft(6.857版或更新版本；katoh和kuma,2002,nucleicacidsresearch[核酸研究]30:3059-3066；katoh等人,2005,nucleicacidsresearch[核酸研究]33:511-518；katoh和toh,2007,bioinformatics[生物信息学]23:372-374；katoh等人,2009,methodsinmolecularbiology[分子生物学方法]537:39-64；katoh和toh,2010,bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)以及采用clustalw(1.83或更新版本；thompson等人,1994,nucleicacidsresearch[核酸研究]22:4673-4680)的embossemma。当其他酶与seqidno:3的多肽相背离这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其关系时(lindahl和elofsson,2000,j.mol.biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可以使用搜索程序来获得，所述搜索程序采用多肽家族的概率表现(谱(profile))来搜索数据库。例如，psi-blast程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(atschul等人,1997,nucleicacidsres.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，甚至可以实现更高的敏感度。程序如genthreader(jones,1999,j.mol.biol.[分子生物学杂志]287:797-815；mcguffin和jones,2003,bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(psi-blast、二级结构预测、结构比对谱和溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，gough等人,2000,j.mol.biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可以用于比对未知结构的序列与存在于scop数据库中的超家族模型。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的scop超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(holm和sander,1998,proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(shindyalov和bourne,1998,proteinengineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，holm和park,2000,bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。在描述本发明的变体中，以下所述的命名法适于方便参考。采用已接受的iupac单字母或三字母氨基酸缩写。取代。对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、取代氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“thr226ala”或“t226a”。多个突变由加号(“+”)分开，例如“gly205arg+ser411phe”或“g205r+s411f”表示在位置205和位置411处的甘氨酸(g)和丝氨酸(s)分别被精氨酸(r)和苯丙氨酸(f)取代。缺失。对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“gly195*”或“g195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如“gly195*+ser411*”或“g195*+s411*”。插入。对于氨基酸插入，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸表示为“gly195glylys”或“g195gk”。将多个氨基酸的插入表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、插入氨基酸#1、插入氨基酸#2等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后插入赖氨酸和丙氨酸表示为“glyl95glylysala”或“g195gka”。在此类情况下，通过将小写字母添加至在所插入的氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号中来对所插入的氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此将是：多种改变。包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如“arg170tyr+gly195glu”或“r170y+g195e”表示在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。不同改变。在可以在某一位置引入不同的改变的情况下，所述不同的改变由逗号分开，例如“arg170tyr,glu”表示在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“tyr167gly,ala+arg170gly,ala”指定以下变体：“tyr167gly+arg170gly”、“tyr167gly+arg170ala”、“tyr167ala+arg170gly”和“tyr167ala+arg170ala”。贯穿本说明书，在一些实施例中，本发明的变体已经通过给出存在于seqidno:3中的指明位置的氨基酸以及取代后存在的氨基酸进行了描述。这并不意味着指明位置的起始氨基酸不能是不同的氨基酸。当然在特定位置的起始氨基酸取决于亲本普鲁兰酶的选择。本发明的本质特征是取代后存在的所得氨基酸。如果亲本普鲁兰酶在特定位置已经具有所希望的氨基酸，则这意味着它应该被维持。例如，披露为seqidno:3的亲本普鲁兰酶在位置492处具有丙氨酸。因此根据本发明，位置492在根据本发明的变体中也应该具有492a。具体实施方式本发明涉及衍生自杂合亲本普鲁兰酶的变体普鲁兰酶。通过将来自从嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌中分离的野生型普鲁兰酶(seqidno:1)的n-末端氨基酸1-451与来自从脱支芽孢杆菌中分离的另一种野生型普鲁兰酶(seqidno:2)的c-末端氨基酸452-828融合来构建杂合亲本普鲁兰酶。将所得杂合普鲁兰酶(在本文披露为seqidno:3)用作亲本普鲁兰酶。编码亲本普鲁兰酶的多核苷酸序列在本文被包括为seqidno:4，其中核苷酸1-99编码信号肽，并且核苷酸100-2583编码seqidno:3中披露的成熟多肽。与亲本相比，根据本发明的变体具有改进的特性。在一个实施例中，改进的特性是增加的热活性。下面将更详细地描述为了获得增加的热活性而有待取代的位置。热活性的增加可以通过在本文中在普鲁兰酶测定部分中所述的phadebas测定确定为在65℃-81.5℃的范围内、ph5.0测量的相对活性。在具体实施例中，当在76℃下测量时，相对于在65℃下的活性，根据本发明的变体具有至少30％的相对活性。在另一个实施例中，当在78℃下测量时，相对于在65℃下的活性，所述变体具有至少50％的相对活性。在另一个实施例中，当在78℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在另一个实施例中，当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。因此，在一个方面，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中该变体包含以下取代组合中的至少一种：368g+393a+431e+432f+492a,s+610r+624s+631s+632c；368g+393a+431e+432f+492a,s+610r+624s+631s+632c+20g+28k+80y+187r+310a+311k+387l+459g+586s+699r+798r；222p+252a+256r+368g+393a+431e+432f+492a,s+610r+624s+631s+632c；222p+252a+256r+368g+393a+431e+432f+492a,s+610r+624s+631s+632c+20g+28k+80y+187r+310a+311k+387l+459g+586s+699r+798r；其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性。在另一个方面，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中该变体包含以下取代组合中的至少一种：n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c；n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c；n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性。当在76℃下测量时，相对于在65℃下的活性，根据本发明的变体具有至少30％的相对普鲁兰酶活性。因此，在一个实施例中，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中该变体包含以下取代组合：n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在76℃下测量时，相对于在65℃下的活性，该变体具有至少30％的相对普鲁兰酶活性。因此，在另一个实施例中，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中该变体包含以下取代组合：n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在65℃下的活性，该变体具有至少50％的相对活性。因此，在另一个实施例中，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中该变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在76℃下测量时，相对于在65℃下的活性，该变体具有至少30％的相对普鲁兰酶活性。因此，在另一个实施例中，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中该变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在65℃下的活性，该变体具有至少50％的相对活性。从以上变体之一开始，热活性已经进一步增加。因此，在仍另外的实施例中，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中该变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下缺失和取代组合中的至少一种：p30*+v31*+n32*；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+n197t；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+n202k；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a345p；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+m402s；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+f456w；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+i460v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+n479h；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+i514v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+d615e；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a345p+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a345p+i514v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a345p+i460v+i514v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+i460v+i514v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+n202k+a345p+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a345p+m402s+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+n202k+a345p+m402s+e560r；p30+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+f456w；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+i460v+i514v；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r+d615e；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+i514v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+f456w；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+f456w+i460v+514v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+n479h；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+i460v+n479h+i514v+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+n197t+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a252i+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560rq29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560rq29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在65℃下的活性，所述变体具有至少50％，具体地至少60％，更具体地至少70％，甚至更具体地至少80％的相对活性。在更具体的实施例中，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合中的至少一种：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在一个具体的实施例中，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在一个具体的实施例中，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在一个具体的实施例中，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在一个具体的实施例中，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在一个具体的实施例中，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在一个具体的实施例中，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在一个具体的实施例中，本发明涉及普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。多核苷酸本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。核酸构建体本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在其插入载体以前操纵多核苷酸可以是令人希望的或必需的。用于利用重组dna方法修饰多核苷酸的技术在本领域是众所周知的。控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子含有介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以是从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyl)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penp)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amym)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、枯草芽孢杆菌xyla和xylb基因、苏云金芽孢杆菌cryiiia基因(agaisse和lereclus,1994,molecularmicrobiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(egon等人,1988,gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(daga)和原核β-内酰胺酶基因(villa-kamaroff等人,1978,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(deboer等人,1983,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]80:21-25)。另外的启动子描述于gilbert等人,1980,scientificamerican[科学美国人]242:74-94中的“usefulproteinsfromrecombinantbacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；以及sambrook等人,1989，同上。串联启动子的实例披露于wo99/43835中。控制序列还可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列被可操作地连接至编码变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中具有功能的任何终止子。细菌宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprh)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyl)和大肠杆菌核糖体rna(rrnb)。控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mrna稳定子区域，它增加基因的表达。适合的mrna稳定子区域的实例是从以下基因获得：苏云金芽孢杆菌cryiiia基因(wo94/25612)和枯草芽孢杆菌sp82基因(hue等人,1995,journalofbacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的n-末端连接的信号肽，并且指导变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地含有信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-端可以含有对于编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从以下各项的基因获得的信号肽编码序列：芽孢杆菌属ncib11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprt、nprs、nprm)和枯草芽孢杆菌prsa。另外的信号肽由simonen和palva,1993,microbiologicalreviews[微生物评论]57:109-137描述。控制序列还可以是编码位于变体的n-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(apre)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprt)、嗜热毁丝霉漆酶(wo95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻变体的n-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的n-末端。还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用adh2系统或gal1系统。表达载体本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在这样的位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列位于载体中，这样使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。重组表达载体可以是可方便地经受重组dna程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线状或闭合的环状质粒。载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何装置。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总dna，或可以使用转座子。载体优选地含有一个或多个选择性标记，所述标记容许容易地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等。选择性标记是这样的基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。载体优选地含有容许载体整合入宿主细胞基因组中或容许载体在细胞中独立于基因组自主复制的元件。对于整合入宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码变体的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组中的载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组的染色体中的精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，整合的元件应含有足够数量的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，所述碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。对于自主复制，载体可以进一步含有使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主地进行复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。细菌复制起点的实例是容许在大肠杆菌中复制的质粒pbr322、puc19、pacyc177和pacyc184的复制起点，以及容许在芽孢杆菌属中复制的质粒pub110、pe194、pta1060和pamβ1。可以将本发明的多核苷酸的多于一个的拷贝插入宿主细胞中以增加变体的产生。可以通过将序列的至少一个另外的拷贝整合入宿主细胞基因组中或通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因来获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，sambrook等人,1989，同上)。宿主细胞本发明还涉及重组宿主细胞，所述重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不一致的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单孢菌属、沙门氏菌属和脲原体属。细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。将dna引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，chang和cohen,1979,mol.gen.genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，young和spizizen,1961,j.bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829，或dubnau和davidoff-abelson,1971,j.mol.biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，shigekawa和dower,1988,biotechniques[生物技术]6:742-751)或接合(参见例如，koehler和thorne,1987,j.bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将dna引入大肠杆菌细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，hanahan,1983,j.mol.biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，dower等人,1988,nucleicacidsres.[核酸研究]16:6127-6145)。将dna引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，gong等人,2004,foliamicrobiol.(praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、接合(参见例如，mazodier等人,1989,j.bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)或转导(参见例如，burke等人,2001,proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将dna引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，choi等人,2006,j.microbiol.methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或接合(参见例如，pinedo和smets,2005,appl.environ.microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将dna引入链球菌属细胞中可以通过以下来实现：天然感受态(参见例如，perry和kuramitsu,1981,infect.immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见例如，catt和jollick,1991,microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见例如，buckley等人,1999,appl.environ.microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)或接合(参见例如，clewell,1981,microbiol.rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将dna引入宿主细胞中的任何方法。产生方法本发明还涉及产生变体的方法，所述方法包括：(a)在适于表达该变体的条件下培养本发明的宿主细胞；并且(b)回收该变体。使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。培养是使用本领域已知的程序，在适合营养培养基中发生，所述培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可以从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养培养基中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。变体可以使用本领域已知的方法检测。例如，可以使用酶测定来确定变体的活性。参见适合的普鲁兰酶活性测定的测定部分。变体可以使用本领域已知的方法回收。例如，可以通过多种常规程序从营养培养基中回收变体，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。可以通过本领域已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，所述程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦和尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、sds-page或提取(参见例如，proteinpurification[蛋白质纯化],janson和ryden编辑,vchpublishers[vch出版社],纽约,1989)。在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。发酵液配制品或细胞组合物本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，所述宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。如在本申请中使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。在实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及第二有机酸组分(包含至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在具体实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述中的两种或更多种的混合物，并且第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述中的两种或更多种的混合物。在一个方面，组合物包含有机酸，并且任选地进一步包含杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含括防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾以及本领域已知的其他试剂。细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)在允许蛋白质合成的碳限制条件下孵育生长到饱和之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。如本文所述的，全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或不溶性酶。在一些实施例中，可以除去不溶性组分以提供澄清的液体组合物。本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过wo90/15861或wo2010/096673中所述的方法来产生。酶组合物本发明还涉及包含本发明的普鲁兰酶变体和适合的稳定剂的组合物。组合物可以包含普鲁兰酶变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，组合物可以包含多种酶活性，如选自下组的一种或多种(例如，几种)酶，该组由以下各项组成：α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、蛋白酶。组合物可以根据本领域已知的方法制备，并且可以是液体或干燥组合物的形式。可以根据本领域已知的方法稳定组合物。下面给出了本发明的组合物的优选用途的实例。在具体实施例中，组合物进一步包含α-淀粉酶。α-淀粉酶优选地是细菌酸稳定的α-淀粉酶。具体地，α-淀粉酶来自微小杆菌属或芽孢杆菌属(例如像嗜热脂肪芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌)。在实施例中，α-淀粉酶来自芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如wo99/019467中的seqidno:3或本文的seqidno:5中所示的变体。在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在从位置179至位置182的区域中具有两个氨基酸的双缺失，更具体地在位置i181+g182、r179+g180、g180+i181、r179+i181或g180+g182(优选i181+g182)处的双缺失，和任选地n193f取代(使用seqidno:5进行编号)。在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置s242处具有取代，优选s242q取代。在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置e188处具有取代，优选e188p取代。在实施例中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，所述变体除在从位置179至位置182的区域中的双缺失(特别是i181*+g182*)和任选地n193f之外还具有以下突变：在实施例中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，所述变体具有以下突变：i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；i181*+g182*+n193f+v59aq89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；和-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用seqidno:5进行编号)。在实施例中，α-淀粉酶变体与seqidno:5的多肽具有至少75％的一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性。应理解的是，当提及嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，它们通常以截短的形式产生。具体地，截短可以为这样使得wo99/19467中的seqidno:3或本文的seqidno:5中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在c-末端截短以优选地具有大约490个氨基酸，如从482-493个氨基酸。优选地，嗜热脂肪芽孢杆菌变体α-淀粉酶优选地在seqidno:5的位置484之后，特别是在位置485之后、特别是在位置486之后、特别是在位置487之后、特别是在位置488之后、特别是在位置489之后、特别是在位置490之后、特别是在位置491之后、特别是在位置492之后，更特别是在位置493之后被截短。液化过程中存在的和/或添加的蛋白酶在优选实施例中，本发明的酶组合物进一步包含蛋白酶。根据本发明，热稳定蛋白酶可以任选地在液化过程中与本发明的变体普鲁兰酶和α-淀粉酶(如热稳定α-淀粉酶)一起存在和/或加入。蛋白酶根据其催化机制分为以下几类：丝氨酸蛋白酶(s)、半胱氨酸蛋白酶(c)、天冬氨酸蛋白酶(a)、金属蛋白酶(m)以及未知或还未分类的蛋白酶(u)，参见handbookofproteolyticenzymes[蛋白水解酶手册],a.j.barrett,n.d.rawlings,j.f.woessner(编辑),academicpress[学术出版社](1998)，尤其是概述部分。在优选实施例中，根据本发明使用的热稳定蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于ec3.4.24(金属内肽酶)；优选ec3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)的蛋白酶。为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“handbookofproteolyticenzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的测定，而不论其是天然存在的还是野生型蛋白酶；或者是基因工程化的还是合成的蛋白酶。可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用这样的底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。ph测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶。测定ph值的实例是ph6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。蛋白酶底物的实例为酪蛋白，如azurine-crosslinkedcasein(天青精-交联的酪蛋白，azcl-酪蛋白)。在下文“材料与方法”部分中描述了两种蛋白酶测定，其中所谓的“azcl-酪蛋白测定”是优选的测定。在实施例中，通过在“材料与方法”部分中描述的azcl-酪蛋白测定确定的，热稳定蛋白酶具有蛋白酶196变体或蛋白酶pfu的至少20％，如至少30％、如至少40％、如至少50％、如至少60％、如至少70％、如至少80％、如至少90％、如至少95％、如至少100％的蛋白酶活性。对于在本发明的方法中使用的蛋白酶的来源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。蛋白酶可以是例如野生型蛋白酶的变体，只要该蛋白酶具有本文定义的热稳定性特性。在优选实施例中，热稳定蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的变体。在实施例中，在本发明的方法中使用的热稳定蛋白酶是真菌起源的，如真菌金属蛋白酶，如源自嗜热子囊菌属的菌株，优选橙色嗜热子囊菌(thermoascusaurantiacus)的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌cgmccno.0670(分类为ec3.4.24.39)的真菌金属蛋白酶。在实施例中，热稳定蛋白酶是披露于wo2003/048353中的seqidno:2所示的金属蛋白酶的成熟部分的或披露于wo2010/008841的seqidno:1的成熟部分的和如本文的seqidno:6所示的变体，该变体进一步具有选自以下列表的突变：-s5*+d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+a112p+t124v+d142l；-s5*+n26r+d79l+s87p+a112p+d142l；-n26r+t46r+d79l+s87p+a112p+d142l；-t46r+d79l+s87p+t116v+d142l；-d79l+p81r+s87p+a112p+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+t124v+d142l；-d79l+s87p+a112p+t124v+a126v+d142l；-d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+d142l；-s38t+d79l+s87p+a112p+a126v+d142l；-d79l+y82f+s87p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+a126v+d142l；-d79l+s87p+n98c+a112p+g135c+d142l；-d79l+s87p+a112p+d142l+t141c+m161c；-s36p+d79l+s87p+a112p+d142l；-a37p+d79l+s87p+a112p+d142l；-s49p+d79l+s87p+a112p+d142l；-s50p+d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+d104p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+a112p+d142l；-s70v+d79l+y82f+s87g+y97w+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+y97w+d104p+a112p+d142l；-s70v+d79l+y82f+s87g+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+d142l；-d79l+y82f+s87g+a112p+a126v+d142l；-y82f+s87g+s70v+d79l+d104p+a112p+d142l；-y82f+s87g+d79l+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+y82f+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+y82f+d104p+a112p+a126v+d142l；-a27k+d79l+s87p+a112p+d142l；-d79l+s87p+d142l。在优选实施例中，热稳定蛋白酶是披露为以下项的金属蛋白酶的变体：披露于wo2003/048353中的seqidno:2的成熟部分或披露于wo2010/008841中的seqidno:1的成熟部分或本文的seqidno:6，该变体具有以下突变：d79l+s87p+a112p+d142l；d79l+s87p+d142l；或a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。在实施例中，蛋白酶变体与披露于wo2003/048353中的seqidno:2的多肽的成熟部分或披露于wo2010/008841中的seqidno:1的成熟部分或本文的seqidno:6具有至少75％的一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性。热稳定蛋白酶还可以源自任何细菌，只要该蛋白酶具有根据本说明书定义的热稳定性特性。在实施例中，热稳定蛋白酶源自细菌火球菌属的菌株，如强烈火球菌的菌株(pfu蛋白酶)。在实施例中，蛋白酶是如美国专利号6,358,726-b1(宝酒造公司(takarashuzocompany))中的seqidno:1或本文的seqidno:7所示的蛋白酶。在另一个实施例中，热稳定蛋白酶是披露于本文的seqidno:7中的蛋白酶或是与美国专利号6,358,726-b1中的seqidno:1或本文的seqidno:7具有至少80％一致性，如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％一致性的蛋白酶。强烈火球菌蛋白酶可以购买自日本宝酒造生物公司(takarabio,japan)。因此，在本发明的具体实施例中，酶组合物进一步包含选自以下项的蛋白酶：火球菌属蛋白酶例如强烈火球菌蛋白酶(seqidno:7)、嗜热球菌属s8a蛋白酶(seqidno:8)例如海滨嗜热球菌(thermococcuslitoralis)s8a蛋白酶或嗜热子嚢菌属蛋白酶例如橙色嗜热子囊菌蛋白酶，特别是如seqidno:6所示的橙色嗜热子囊菌蛋白酶的变体，该变体包含以下项中的特定取代组合之一：d79l+s87p+a112p+d142l；d79l+s87p+d142l；或a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。在实施例中，本发明的酶组合物包含：i)嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体；ii)本发明的变体普鲁兰酶；iii)任选地蛋白酶；并且其中α-淀粉酶与蛋白酶之间的比率是在从1:1和1:50(微克α-淀粉酶:微克蛋白酶)的范围内。在实施例中，α-淀粉酶与蛋白酶之间的比率是在1:3和1:40之间，如大约1:4(微克α-淀粉酶:微克蛋白酶)的范围内。在实施例中，α-淀粉酶与普鲁兰酶之间的比率是在1:1和1:10之间，如大约1:2.5或1:5(微克α-淀粉酶:微克普鲁兰酶)。根据本发明，普鲁兰酶能以有效量添加，包括约2-100微克酶蛋白/克ds，优选5-50微克酶蛋白/克ds的优选量。普鲁兰酶活性可以确定为npun。用于确定npun的测定描述于测定部分中。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合中的至少一种：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。本发明的方法本发明涉及用于由含淀粉材料生产发酵产物的方法。具体而言，产物是醇，更具体是乙醇。诸位发明人已经发现，当具有增加的热活性的根据本发明的普鲁兰酶变体在液化过程中与至少一种α-淀粉酶一起存在或添加时，可以获得增加的乙醇产率。生产本发明发酵产物的方法在具体方面，本发明涉及用于由含淀粉材料生产糖浆的方法，该方法包括以下步骤：a)使用α-淀粉酶和本发明的变体普鲁兰酶在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；b)使用葡糖淀粉酶进行糖化。在另一个具体方面，本发明涉及用于由含淀粉材料生产发酵产物的方法，所述方法包括以下步骤：a)使用以下项在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料：α-淀粉酶和本发明的变体普鲁兰酶；b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；c)使用发酵生物体进行发酵。在优选实施例中，发酵产物是在发酵之后回收，如通过蒸馏。在实施例中，发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。液化中存在的和/或添加的α-淀粉酶在本发明方法的液化步骤a)过程中添加的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。优选的是细菌α-淀粉酶，其在液化中使用的温度下典型地是稳定的。在实施例中，α-淀粉酶来自微小杆菌属或芽孢杆菌属的菌株。在优选实施例中，α-淀粉酶来自嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，如示于wo99/019467中的seqidno:3或示于本文的seqidno:5中的序列。在实施例中，α-淀粉酶是示于本文的seqidno:5中的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，如与本文的seqidno:5具有至少80％，如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％一致性的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体是截短的，优选地在c-末端，优选地截短以具有大约491个氨基酸，如从480-495个氨基酸。在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在从位置179至位置182的区域中具有两个氨基酸的双缺失，更具体地在位置i181+g182、r179+g180、g180+i181、r179+i181或g180+g182(优选i181+g182)处的双缺失，和任选地n193f取代(使用seqidno:5进行编号)。在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置s242处具有取代，优选s242q取代。在实施例中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置e188处具有取代，优选e188p取代。在实施例中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组，所述变体除在从位置179至位置182的区域中的双缺失(特别是i181*+g182*)和任选地n193f之外还具有以下突变：在优选实施例中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；i181*+g182*+n193f+v59aq89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；和-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用seqidno:5进行编号)。根据本发明，α-淀粉酶变体与本文的seqidno:5的多肽具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性。根据本发明，α-淀粉酶能以0.1-100微克/克ds，如0.5-50微克/克ds、如1-25微克/克ds、如1-10微克/克ds、如2-5微克/克ds的浓度存在和/或添加。在实施例中，α-淀粉酶与普鲁兰酶之间的比率是在1:1和1:10之间，如大约1:2.5或1:5(微克α-淀粉酶:微克普鲁兰酶)。根据本发明，普鲁兰酶能以有效量添加，包括约2-100微克酶蛋白/克ds，优选5-50微克酶蛋白/克ds的优选量。普鲁兰酶活性可以确定为npun。用于确定npun的测定描述于测定部分中。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合中的至少一种：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。在具体实施例中，变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。液化过程中存在的和/或添加的蛋白酶在优选实施例中，本发明的方法进一步包括在液化中添加蛋白酶。根据本发明，热稳定蛋白酶可以任选地在液化过程中与本发明的变体普鲁兰酶和α-淀粉酶(如热稳定α-淀粉酶)一起存在和/或加入。关于合适的蛋白酶的更多细节，参见上面的组合物部分。在优选实施例中，热稳定蛋白酶是披露为以下项的金属蛋白酶的变体：披露于wo2003/048353中的seqidno:2的成熟部分或披露于wo2010/008841中的seqidno:1的成熟部分或本文的seqidno:6，该变体具有以下突变：d79l+s87p+a112p+d142l；d79l+s87p+d142l；或a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。在实施例中，蛋白酶变体与披露于wo2003/048353中的seqidno:2的多肽的成熟部分或披露于wo2010/008841中的seqidno:1的成熟部分或本文的seqidno:6具有至少75％的一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性。热稳定蛋白酶还可以源自任何细菌，只要该蛋白酶具有根据本说明书定义的热稳定性特性。在实施例中，热稳定蛋白酶源自细菌火球菌属的菌株，如强烈火球菌的菌株(pfu蛋白酶)。在实施例中，蛋白酶是如美国专利号6,358,726-b1(宝酒造公司)中的seqidno:1或本文的seqidno:7所示的蛋白酶。在另一个实施例中，热稳定蛋白酶是披露于本文的seqidno:7中的蛋白酶或是与美国专利号6,358,726-b1中的seqidno:1或本文的seqidno:7具有至少80％一致性，如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％一致性的蛋白酶。强烈火球菌蛋白酶可以购买自日本宝酒造生物公司。因此，在本发明的具体实施例中，酶组合物进一步包含选自以下项的蛋白酶：火球菌属蛋白酶例如强烈火球菌蛋白酶(seqidno:7)、嗜热球菌属s8a蛋白酶(seqidno:8)例如海滨嗜热球菌(thermococcuslitoralis)s8a蛋白酶或嗜热子嚢菌属蛋白酶例如橙色嗜热子囊菌蛋白酶，特别是如seqidno:6所示的橙色嗜热子囊菌蛋白酶的变体，该变体包含以下项中的特定取代组合之一：d79l+s87p+a112p+d142l；d79l+s87p+d142l；或a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶在本发明的方法(即，油回收方法和发酵产物生产过程)中，在糖化和/或发酵，优选同时糖化和发酵(ssf)中，存在和/或添加葡糖淀粉酶。在实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌起源的，优选地来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或栓菌属的菌株,优选瓣环栓菌(t.cingulata)；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属(nigrofomes)的菌株。在实施例中，葡糖淀粉酶源自篮状菌属，如埃默森篮状菌的菌株，如示于本文的seqidno:9中的菌株。在实施例中，葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：(i)包含本文的seqidno:9的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:9的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性。在实施例中，葡糖淀粉酶源自密孔菌属的菌株，特别是描述于wo2011/066576中的血红密孔菌的菌株(seqidno2、4或6)，如示为wo2011/066576中的seqidno:4或本文的seqidno:10的菌株。在实施例中，葡糖淀粉酶源自粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株，特别是如在wo2011/068803中描述的粘褶菌属的菌株(seqidno:2、4、6、8、10、12、14或16)。在优选实施例中，葡糖淀粉酶是示于wo2011/068803中的seqidno:2或本文的seqidno:11中的篱边粘褶菌。在优选实施例中，葡糖淀粉酶源自篱边粘褶菌，如示于本文的seqidno:11中的篱边粘褶菌。在实施例中，葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：(i)包含本文的seqidno:11的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:11的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性。在另一个实施例中，葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，如示于本文的seqidno:12中的密粘褶菌。在实施例中，葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：(i)包含本文的seqidno:12的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:12的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性。在实施例中，葡糖淀粉酶源自栓菌属的菌株，特别是披露于wo2006/069289中的和在本文披露为seqidno:13的瓣环栓菌的菌株。在实施例中，葡糖淀粉酶能以如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20agu/gds，优选0.001-10agu/gds，尤其是0.01-5agu/gds之间，如0.1-2agu/gds。包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括amg200l；amg300l；santmsuper、santmextral、spirizymetmplus、spirizymetmfuel、spirizymetmb4u、spirizymetmultra、spirizymetmexcel和amgtme(来自诺维信公司(novozymesa/s))；optidextm300、gc480、gc417(来自杜邦公司(dupont.))；amigasetm和amigasetmplus(来自帝斯曼公司(dsm))；g-zymetmg900、g-zymetm和g990zr(来自杜邦公司)。根据本发明的优选实施例，在糖化和/或发酵中，葡糖淀粉酶是与α-淀粉酶相结合存在的和/或添加的。下面描述了适合的α-淀粉酶的实例。在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶在实施例中，在本发明的方法中，在糖化和/或发酵中，存在和/或添加α-淀粉酶。在优选实施例中，α-淀粉酶是真菌或细菌起源的。在优选实施例中，α-淀粉酶是真菌酸稳定的α-淀粉酶。真菌酸稳定的α-淀粉酶是在3.0至7.0的ph范围内，并且优选地在3.5至6.5的范围内具有活性的α-淀粉酶，包括在约4.0、4.5、5.0、5.5和6.0的ph下的活性。在优选实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶源自根毛霉属的菌株，优选菌株微小根毛霉，如示于wo2013/006756中的seqidno:3中的菌株，如具有黑曲霉连接子和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，如示于本文的seqidno:14中的杂合体或其变体。在实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：(i)包含本文的seqidno:14的多肽的α-淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与本文的seqidno:14的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性。在优选实施例中，α-淀粉酶是示于seqidno:14中的具有以下取代或取代组合中的至少一种的α-淀粉酶的变体：d165m；y141w；y141r；k136f；k192r；p224a；p224r；s123h+y141w；g20s+y141w；a76g+y141w；g128d+y141w；g128d+d143n；p219c+y141w；n142d+d143n；y141w+k192r；y141w+d143n；y141w+n383r；y141w+p219c+a265c；y141w+n142d+d143n；y141w+k192rv410a；g128d+y141w+d143n；y141w+d143n+p219c；y141w+d143n+k192r；g128d+d143n+k192r；y141w+d143n+k192r+p219c；g128d+y141w+d143n+k192r；或g128d+y141w+d143n+k192r+p219c(使用seqidno:11进行编号)。在实施例中，α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶连接子和淀粉结合结构域(sbd)的微小根毛霉，优选披露为本文的seqidno:14，优选具有以下取代中的一种或多种：g128d、d143n，优选g128d+d143n(使用seqidno:14进行编号)。在实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶变体与本文的seqidno:14的多肽具有至少75％的一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性。在优选实施例中，在糖化和/或发酵过程中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶与α-淀粉酶之间的比率优选地可以在500:1至1:1，如从250:1至1:1、如从100:1至1:1、如从100:2至100:50、如从100:3至100:70的范围内。本发明方法的另外方面在液化步骤a)之前，本发明的方法(包括提取/回收油的方法和用于生产发酵产物的方法)可以包括以下步骤：i)优选地通过干磨来减小该含淀粉材料的粒度；ii)形成包含该含淀粉材料和水的浆液。在实施例中，至少50％，优选地至少70％，更优选地至少80％，尤其是至少90％的含淀粉材料适合通过具有#6筛网的筛子。在实施例中，液化过程中的ph是在高于4.5-6.5之间，如4.5-5.0、如大约4.8，或在5.0-6.2之间的ph，如5.0-6.0，如在5.0-5.5之间，如大约5.2、如大约5.4、如大约5.6、如大约5.8。在实施例中，液化过程中的温度高于初始糊化温度，优选在从70℃-100℃的范围内，如在75℃-95℃之间、如在75℃-90℃之间，优选在80℃-90℃之间，尤其是大约85℃。在实施例中，在步骤a)中的液化之前进行喷射蒸煮步骤。在实施例中，喷射蒸煮是在110℃-145℃之间，优选120℃-140℃，如125℃-135℃，优选大约130℃的温度下进行约1-15分钟，优选约3-10分钟，尤其是约5分钟左右。在优选实施例中，糖化和发酵顺序进行或同时进行。在实施例中，糖化是在从20℃-75℃，优选从40℃-70℃，如大约60℃的温度下，并且在4和5之间的ph下进行。在实施例中，发酵或同时糖化和发酵(ssf)在从25℃至40℃，如从28℃至35℃、如从30℃至34℃，优选约32℃左右的温度下进行。在实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。在优选实施例中，发酵产物是在发酵之后回收，如通过蒸馏。在实施例中，发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。在实施例中，含淀粉起始材料是全谷物。在实施例中，含淀粉材料选自下组，该组由以下各项组成：玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、树薯、木薯淀粉、高粱、稻以及马铃薯。在实施例中，发酵生物体是酵母，优选酵母属的菌株，尤其是酿酒酵母的菌株。在实施例中，步骤(a)中的温度高于初始糊化温度，如在80℃-90℃之间的温度下，如大约85℃。在实施例中，本发明的方法在糖化步骤b)之前进一步包括预糖化步骤，该预糖化步骤在30℃-65℃之间的温度下进行40-90分钟。在实施例中，糖化是在从20℃-75℃，优选从40℃-70℃，如大约60℃的温度下，并且在4和5之间的ph下进行。在实施例中，发酵步骤c)或同时糖化和发酵(ssf)(即，步骤b)和c))在从25℃至40℃，如从28℃至35℃、如从30℃至34℃，优选约32℃左右的温度下进行。在实施例中，发酵步骤c)或同时糖化和发酵(ssf)(即，步骤b)和c))进行6至120小时，特别是24至96小时。在实施例中，步骤e)中的分离是通过离心(优选倾滗式离心机)、过滤，优选使用压滤机、螺旋压榨机、板框压榨机、重力浓缩机或脱水机进行。在实施例中，发酵产物是通过蒸馏回收。本发明的具体方法实施例的实例生产发酵产物：在一个实施例中，本发明涉及用于由含淀粉材料生产乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：a)使用以下项在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料：-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其在从位置179至位置182的区域中具有两个氨基酸的双缺失，更具体地在位置i181+g182、r179+g180、g180+i181、r179+i181或g180+g182(优选i181+g182)处的双缺失，和任选地取代n193f；另外地以下取代集合之一：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用本文的seqidno:5进行编号)，并且其中该α-淀粉酶与seqidno:5的多肽具有至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性；-变体普鲁兰酶，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性；b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；c)使用酿酒酵母进行发酵。在另一个实施例中，本发明涉及用于由含淀粉材料生产乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：a)使用以下项在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料：-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其在从位置179至位置182的区域中具有两个氨基酸的双缺失，更具体地在位置i181+g182、r179+g180、g180+i181、r179+i181或g180+g182(优选i181+g182)处的双缺失，和任选地取代n193f；另外地以下取代集合之一：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用本文的seqidno:5进行编号)，并且其中该α-淀粉酶与seqidno:5的多肽具有至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性；-变体普鲁兰酶，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性；b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；c)使用酿酒酵母进行发酵。在另一个实施例中，本发明涉及用于由含淀粉材料生产乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：a)使用以下项在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料：-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其在从位置179至位置182的区域中具有两个氨基酸的双缺失，更具体地在位置i181+g182、r179+g180、g180+i181、r179+i181或g180+g182(优选i181+g182)处的双缺失，和任选地取代n193f；另外地以下取代集合之一：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用本文的seqidno:5进行编号)，并且其中该α-淀粉酶与seqidno:5的多肽具有至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性；-变体普鲁兰酶，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性；b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；c)使用酿酒酵母进行发酵。在另一个实施例中，本发明涉及用于由含淀粉材料生产乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：a)使用以下项在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料：-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其在从位置179至位置182的区域中具有两个氨基酸的双缺失，更具体地在位置i181+g182、r179+g180、g180+i181、r179+i181或g180+g182(优选i181+g182)处的双缺失，和任选地取代n193f；另外地以下取代集合之一：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用本文的seqidno:5进行编号)，并且其中该α-淀粉酶与seqidno:5的多肽具有至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性；-变体普鲁兰酶，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性；b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；c)使用酿酒酵母进行发酵。在另一个实施例中，本发明涉及用于由含淀粉材料生产乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：a)使用以下项在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料：-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其在从位置179至位置182的区域中具有两个氨基酸的双缺失，更具体地在位置i181+g182、r179+g180、g180+i181、r179+i181或g180+g182(优选i181+g182)处的双缺失，和任选地取代n193f；另外地以下取代集合之一：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用本文的seqidno:5进行编号)，并且其中该α-淀粉酶与seqidno:5的多肽具有至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性；-变体普鲁兰酶，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性；b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；c)使用酿酒酵母进行发酵。在另一个实施例中，本发明涉及用于由含淀粉材料生产乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：a)使用以下项在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料：-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其在从位置179至位置182的区域中具有两个氨基酸的双缺失，更具体地在位置i181+g182、r179+g180、g180+i181、r179+i181或g180+g182(优选i181+g182)处的双缺失，和任选地取代n193f；另外地以下取代集合之一：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用本文的seqidno:5进行编号)，并且其中该α-淀粉酶与seqidno:5的多肽具有至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性；-变体普鲁兰酶，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性；b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；c)使用酿酒酵母进行发酵。在另一个实施例中，本发明涉及用于由含淀粉材料生产乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：a)使用以下项在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料：-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其在从位置179至位置182的区域中具有两个氨基酸的双缺失，更具体地在位置i181+g182、r179+g180、g180+i181、r179+i181或g180+g182(优选i181+g182)处的双缺失，和任选地取代n193f；另外地以下取代集合之一：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用本文的seqidno:5进行编号)，并且其中该α-淀粉酶与seqidno:5的多肽具有至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性；-变体普鲁兰酶，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性；b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；c)使用酿酒酵母进行发酵。在另一个实施例中，本发明涉及用于由含淀粉材料生产乙醇的方法，所述方法包括以下步骤：a)使用以下项在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料：-源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其在从位置179至位置182的区域中具有两个氨基酸的双缺失，更具体地在位置i181+g182、r179+g180、g180+i181、r179+i181或g180+g182(优选i181+g182)处的双缺失，和任选地取代n193f；另外地以下取代集合之一：-e129v+k177l+r179e；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；-e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用本文的seqidno:5进行编号)，并且其中该α-淀粉酶与seqidno:5的多肽具有至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性；-变体普鲁兰酶，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性；b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；c)使用酿酒酵母进行发酵。在优选实施例中，使用葡糖淀粉酶和α-淀粉酶进行步骤b)中的糖化，该α-淀粉酶被选择为具有黑曲霉葡糖淀粉酶连接子和淀粉结合结构域(sbd)的微小根毛霉α-淀粉酶，优选披露为本文的seqidno:14，优选具有以下取代中的一种或多种：g128d、d143n，优选g128d+d143n(使用seqidno:14进行编号)。c)使用发酵生物体进行发酵。发酵培养基进行发酵的环境通常称为“发酵培养基(fermentationmedia或fermentationmedium)”。发酵培养基包括发酵底物，即被发酵生物体代谢的碳水化合物源。根据本发明，发酵培养基可以包含用于发酵生物体的营养素和生长刺激剂。营养物和生长刺激剂在发酵领域中广泛使用，且包括氮源如氨；尿素、维生素和矿物质或其组合。发酵生物体术语“发酵生物体”是指适合用于发酵过程中并且能够生产所希望的发酵产物的任何生物体，包括细菌和真菌生物体，尤其是酵母。尤其适合的发酵生物体能够使糖(如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵成(即，转化成)所希望的发酵产物(如乙醇)。发酵生物体的实例包括真菌生物体，如酵母。优选的酵母包括酵母属的菌株，特别是酿酒酵母。在发酵(如ssf)过程中，有活力的发酵生物体的合适的浓度在本领域是众所周知的，或可以由本领域的技术人员容易地确定。在一个实施例中，将发酵生物体(如乙醇发酵酵母(例如，酿酒酵母))添加至发酵培养基中，使得每ml的发酵培养基的有活力的发酵生物体(如酵母)计数在从105至1012，优选从107至1010的范围内，尤其是约5x107个。可商购的酵母的实例包括例如redstartm和ethanolredtm酵母(可获得自富酶泰斯公司/乐斯福公司(fermentis/lesaffre)，美国)、fali(可获得自弗莱希曼酵母公司(fleischmann’syeast)，美国)、superstart和thermosacctm新鲜酵母(可获得自乙醇技术公司(ethanoltechnology)，威斯康星州，美国)、biofermaft和xr(可获得自nabc-北美生物制品公司(northamericanbioproductscorporation)，佐治亚州，美国)、gertstrand(可获得自格特·斯特兰德公司(gertstrandab)，瑞典)以及fermiol(可获得自帝斯曼特殊产品公司(dsmspecialties))。含淀粉材料根据本发明可以使用任何适合的含淀粉材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适合用于本发明方法中的含淀粉材料的实例包括全谷物、玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻、豌豆、豆类或甜薯或其混合物或者由其衍生的淀粉或谷类。还考虑了糯型与非糯型(waxyandnon-waxytypes)的玉米与大麦。在优选实施例中，用于根据本发明的乙醇生产的含淀粉材料是玉米或小麦。发酵产物术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物体进行的发酵步骤在内的方法生产的产物。根据本发明考虑的发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇；多元醇如甘油、山梨醇和肌醇)；有机酸(例如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、丁二酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，h2和co2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、b12、β-胡萝卜素)；和激素。在优选实施例中，发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(maltliquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。优选地，本发明的方法是用于生产醇，如乙醇。根据本发明获得的发酵产物(如乙醇)可以用作典型地与汽油共混的燃料。然而，在乙醇的情况下，它还可以用作饮用乙醇。发酵产物的回收发酵或ssf之后，可以将发酵产物与发酵培养基分开。可以蒸馏浆液以提取所希望的发酵产物(例如，乙醇)。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物。还可以通过汽提或本领域熟知的其他方法来回收发酵产物。在以下编号的实施例中进一步定义本发明：实施例1.一种变体普鲁兰酶，其中该普鲁兰酶至少包含以下取代组合：n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c，并且任选地进一步包含n222p+q252a+q256r；其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且其中所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性。实施例2.根据实施例1所述的变体，其中当在76℃下测量时，相对于在65℃下的活性，所述变体具有至少30％的相对活性。实施例3.根据实施例1所述的变体，其中该变体普鲁兰酶进一步包含n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r。实施例4.根据实施例1和3所述的变体，其中当在78℃下测量时，相对于在65℃下的活性，所述变体具有至少50％的相对活性。实施例5.根据实施例3所述的变体，其中该变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下缺失和取代组合之一：p30*+v31*+n32*；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+n197t；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+n202k；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a345p；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+m402s；p30*+v31*n32*+d57n+d58p+f456w；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+i460v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+n479h；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+i514v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+d615e；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a345p+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a345p+i514v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a345p+i460v+i514v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+i460v+i514v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+n202k+a345p+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a345p+m402s+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+n202k+a345p+m402s+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+f456w；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+i460v+i514v；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r+d615e；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+i514v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+f456w；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+n479h；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+i460v+n479h+i514v+e560r；p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+n197t+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a252i+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在65℃下的活性，所述变体具有至少50％，具体地至少60％，更具体地至少70％，甚至更具体地至少80％的相对活性。实施例6.根据实施例5所述的变体，其中该变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。实施例7.根据实施例5所述的变体，其中该变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在78℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。实施例8.根据实施例5所述的变体，其中该变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。实施例9.根据实施例5所述的变体，其中该变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。实施例10.根据实施例5所述的变体，其中该变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。实施例11.根据实施例5所述的变体，其中该变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。实施例12.根据实施例5所述的变体，其中该变体普鲁兰酶选自普鲁兰酶变体，其中所述变体包含以下取代组合：n222p+q252a+q256r+n368g+n393a+q431e+l432f+a492a,s+n610r+g624s+t631s+s632c+n20g+y28k+h80y+q187r+e310a+d311k+q387l+q459g+d586s+e699r+s798r；并且该变体进一步包含以下取代组合：q29g+p30*+v31*+n32*+d57n+d58p+a195g+n197t+n202k+a345p+m402s+f456w+i460v+n479h+i514v+e560r；并且其中该变体具有普鲁兰酶活性，并且所述变体与seqidno:3的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％，但小于100％的序列一致性，并且其中当在79℃下测量时，相对于在75℃下的活性，所述变体具有至少70％的相对活性。实施例13.一种编码如实施例1-12中任一项所述的普鲁兰酶的多核苷酸。实施例14.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含如实施例13所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在表达宿主中的产生的一个或多个控制序列。实施例15.一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含如实施例13所述的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽的产生的一个或多个控制序列。实施例16.一种全培养液配制品或细胞培养组合物，该全培养液配制品或细胞培养组合物包含如实施例1-12中任一项所述的多肽。实施例17.一种组合物，该组合物包含如实施例1-12中任一项所述的变体普鲁兰酶和稳定剂。实施例18.根据实施例17所述的组合物，该组合物进一步包含α-淀粉酶。实施例19.根据实施例18所述的组合物，其中该α-淀粉酶来自微小杆菌属或芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如在seqidno:5中所示的α-淀粉酶。实施例20.如实施例16所述的组合物，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体优选地在seqidno:5的位置484之后，特别是在位置485之后、特别是在位置486之后、特别是在位置487之后、特别是在位置488之后、特别是在位置489之后、特别是在位置490之后、特别是在位置491之后、特别是在位置492之后，更特别是在位置493之后被截短。实施例21.如实施例19或1207中任一项所述的组合物，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置i181+g182、r179+g180、g180+i181、r179+i181或g180+g182(优选i181+g182)处具有双缺失，和任选地n193f取代(使用seqidno:5进行编号)。实施例22.如实施例19-21中任一项所述的组合物，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置s242处具有取代，优选s242q取代。实施例23.如实施例19-22中任一项所述的组合物，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置e188处具有取代，优选e188p取代。实施例24.如实施例19-23中任一项所述的组合物，其中该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-i181*+g182*+n193f+v59aq89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；和-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用seqidno:5进行编号)，并且其中该α-淀粉酶变体与seqidno:5的多肽具有至少75％的一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性。实施例25.根据实施例17-24中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含蛋白酶，优选选自以下项的蛋白酶：火球菌属蛋白酶例如示为seqidno:7的强烈火球菌蛋白酶、示为seqidno:8的嗜热球菌属s8a蛋白酶例如海滨嗜热球菌s8a蛋白酶或嗜热子嚢菌属蛋白酶例如橙色嗜热子囊菌蛋白酶，特别是橙色嗜热子囊菌蛋白酶的变体seqidno:6，该变体包含以下项中的特定取代组合之一：d79l+s87p+a112p+d142l；d79l+s87p+d142l；或a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。实施例26.一种产生根据实施例1-12中任一项所述的多肽的方法，该方法包括在有益于产生该多肽的条件下培养如实施例15所述的宿主细胞。实施例27.一种用于由含淀粉材料生产糖浆的方法，该方法包括以下步骤：a)使用α-淀粉酶和如实施例1-12中任一项所述的变体普鲁兰酶在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；b)使用葡糖淀粉酶进行糖化。实施例28.一种用于由含淀粉材料生产发酵产物的方法，该方法包括以下步骤：a)使用α-淀粉酶和如实施例1-12中任一项所述的变体普鲁兰酶在高于初始糊化温度的温度下液化该含淀粉材料；b)使用葡糖淀粉酶进行糖化；c)使用发酵生物体进行发酵。实施例29.根据实施例27-28中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶来自微小杆菌属或芽孢杆菌属，如嗜热脂肪芽孢杆菌的菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，如在seqidno:5中所示的α-淀粉酶。实施例30.如实施例29所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体优选地在seqidno:5的位置484之后，特别是在位置485之后、特别是在位置486之后、特别是在位置487之后、特别是在位置488之后、特别是在位置489之后、特别是在位置490之后、特别是在位置491之后、特别是在位置492之后，更特别是在位置493之后被截短。实施例31.如实施例29-30中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置i181+g182、r179+g180、g180+i181、r179+i181或g180+g182(优选i181+g182)处具有双缺失，和任选地n193f取代(使用seqidno:5进行编号)。实施例32.如实施例29-31中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置s242处具有取代，优选s242q取代。实施例33.如实施例29-32中任一项所述的方法，其中该嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在位置e188处具有取代，优选e188p取代。实施例34.如实施例29-33中任一项所述的方法，其中该α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的组：-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e；-i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+h208y+k220p+n224l+q254s；-i181*+g182*+n193f+v59aq89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v；和-i181*+g182*+n193f+e129v+k177l+r179e+k220p+n224l+s242q+q254s(使用seqidno:5进行编号)，并且其中该α-淀粉酶变体与seqidno:5的多肽具有至少75％的一致性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的一致性。实施例35.如实施例27-34中任一项所述的方法，该方法进一步包括在步骤a)中存在蛋白酶，优选选自以下项的蛋白酶：火球菌属蛋白酶例如示为seqidno:7的强烈火球菌蛋白酶、示为seqidno:8的嗜热球菌属s8a蛋白酶例如海滨嗜热球菌s8a蛋白酶或嗜热子嚢菌属蛋白酶例如橙色嗜热子囊菌蛋白酶，特别是橙色嗜热子囊菌蛋白酶的变体seqidno:6，该变体包含以下项中的特定取代组合之一：d79l+s87p+a112p+d142l；d79l+s87p+d142l；或a27k+d79l+y82f+s87g+d104p+a112p+a126v+d142l。实施例36.如实施例27-35中任一项所述的方法，其中在糖化步骤b)和/或发酵步骤c)中存在的和/或添加的该葡糖淀粉酶是真菌起源的，优选地来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或栓菌属的菌株,优选瓣环栓菌；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属的菌株。实施例37.如实施例36所述的方法，其中该葡糖淀粉酶源自埃默森篮状菌，如示于本文的seqidno:9中的埃默森篮状菌。实施例38.如实施例37所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：(i)包含本文的seqidno:9的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与seqidno:9的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性。实施例39.如实施例36所述的方法，其中该葡糖淀粉酶源自篱边粘褶菌，如示于seqidno:11中的篱边粘褶菌。实施例40.如实施例39所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：(i)包含seqidno:11的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与seqidno:11的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性。实施例41.如实施例36所述的方法，其中该葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，如示于seqidno:12中的密粘褶菌。实施例42.如实施例41所述的方法，其中该葡糖淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：(i)包含seqidno:12的多肽的葡糖淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，该氨基酸序列与seqidno:12的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性。实施例43.如实施例27-42中任一项所述的方法，其中葡糖淀粉酶与α-淀粉酶组合存在于糖化和/或发酵中。实施例44.如实施例43所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在的该α-淀粉酶是真菌或细菌起源的。实施例45.如实施例43或44所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的该α-淀粉酶源自根毛霉属的菌株，优选菌株微小根毛霉，如具有黑曲霉连接子和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，如示于seqidno:14中的杂合体。实施例46.如实施例43-45中任一项所述的方法，其中在糖化和/或发酵中存在的该α-淀粉酶选自下组，该组由以下各项组成：(i)包含seqidno:14的多肽的α-淀粉酶；(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，该氨基酸序列与seqidno:14的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性。实施例47.如实施例46所述的方法，其中该α-淀粉酶包含以下取代中的一种或多种：g128d、d143n，优选g128d+d143n。实施例48.如实施例27-47中任一项所述的方法，该方法在液化步骤a)之前进一步包括：i)优选地通过干磨来减小该含淀粉材料的粒度；ii)形成包含该含淀粉材料和水的浆液。实施例49.如实施例27-48中任一项所述的方法，其中至少50％，优选至少70％，更优选至少80％，尤其是至少90％的含淀粉材料适合通过具有#6筛网的筛子。实施例50.如实施例27-49中任一项所述的方法，其中液化中的ph在高于4.5-6.5之间，如大约4.8，或在5.0-6.2之间的ph，如5.0-6.0，如在5.0-5.5之间，如大约5.2、如大约5.4、如大约5.6、如大约5.8。实施例51.如实施例27-50中任一项所述的方法，其中液化中的温度高于初始糊化温度，如在从70℃-100℃的范围内，如在75℃-95℃之间、如在75℃-90℃之间，优选在80℃-90℃之间，尤其是大约85℃。实施例52.如实施例27-51中任一项所述的方法，其中在步骤a)中的液化之前进行喷射蒸煮步骤。实施例53.如实施例52所述的方法，其中该喷射蒸煮是在110℃-145℃之间，优选120℃-140℃，如125℃-135℃，优选大约130℃的温度下进行约1-15分钟，优选约3-10分钟，尤其是约5分钟左右。实施例54.如实施例27-53中任一项所述的方法，其中糖化是在从20℃-75℃，优选从40℃-70℃，如大约60℃的温度下，并且在4和5之间的ph下进行。实施例55.如实施例28-54中任一项所述的方法，其中发酵或同时糖化和发酵(ssf)在从25℃至40℃，如从28℃至35℃、如从30℃至34℃，优选约32℃左右的温度下进行。实施例56.如实施例28-55中任一项所述的方法，其中该发酵产物是在发酵之后回收，如通过蒸馏。实施例57.如实施例28-56中任一项所述的方法，其中该发酵产物是醇，优选乙醇，尤其是燃料乙醇、饮用乙醇和/或工业乙醇。实施例58.如实施例27-57中任一项所述的方法，其中该含淀粉起始材料是全谷物。实施例59.如实施例27-58中任一项所述的方法，其中该含淀粉材料源自玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、树薯、木薯淀粉、高粱、稻或马铃薯。实施例60.如实施例28-59中任一项所述的方法，其中该发酵生物体是酵母，优选酵母属的菌株，尤其是酿酒酵母的菌株。实施例61.根据实施例15所述的重组宿主细胞，其中该宿主细胞是酵母宿主细胞，特别是酵母属的菌株，更特别是酿酒酵母。实施例62.根据实施例61所述的宿主细胞在淀粉糖化中的用途。实施例63.如实施例1-12中任一项所述的变体普鲁兰酶在酿造过程中的用途。实施例64.一种生产啤酒麦芽汁的方法，该方法包括向醪液中添加如实施例1-12中任一项所述的普鲁兰酶。通过以下实例进一步描述本发明，所述实例不应理解为对本发明范围的限制。实例酶蛋白酶pfus：源自强烈火球菌的蛋白酶，示于seqidno:7中。α-淀粉酶be369(aa369)：嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，在本文披露为seqidno:5，并且进一步具有突变：i181*+g182*+n193f+v59a+q89r+e129v+k177l+r179e+q254s+m284v，截短至491个氨基酸(使用seqidno:5进行编号)。α-淀粉酶共混物aa：包含以下项的共混物：α-淀粉酶aa369和蛋白酶pfus(剂量：2.1μgep/gdsaa369，3.0μgep/gdspfus，其中ep是酶蛋白并且ds是总干固体)。葡糖淀粉酶a：包含以下项的共混物：在wo99/28448中披露为seqidno:34的埃默森篮状菌葡糖淀粉酶(teamg)、在wo06/69289中披露为seqidno:2的瓣环栓菌葡糖淀粉酶(tcamg)和披露于本文的seqidno:14中的具有以下取代g128d+d143n(使用seqidno:14进行编号)的具有黑曲霉葡糖淀粉酶连接子和淀粉结合结构域(sbd)的微小根毛霉α-淀粉酶(agu:agu:fau-f中活度比为约29:8:1)。葡糖淀粉酶b：与葡糖淀粉酶共混物a相同，进一步具有含里氏木霉纤维素酶制剂的纤维素酶组合物，该里氏木霉纤维素酶制剂含有烟曲霉纤维二糖水解酶i(wo2011/057140)、烟曲霉纤维二糖水解酶ii(wo2011/057140)、烟曲霉β-葡糖苷酶变体(wo2012/044915)和青霉属(埃默森)gh61多肽(wo2011/041397)(剂量：teamg60μgep/gds；tcamg20μgep/gds；rpaa11μgep/gds；纤维素酶组合物30μgep/gds)。酵母：来自美国富酶泰斯公司(fermentis)的ethanolredtm测定蛋白酶测定1)动力学suc-aapf-pna测定：pna底物：suc-aapf-pna(bacheml-1400)。温度：室温(25℃)测定缓冲液：100mm琥珀酸，100mmhepes，100mmches，100mmcabs，1mmcacl2，150mmkcl，0.01％tritonx-100，用hcl或naoh调节至ph值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0及11.0。将20μl蛋白酶(稀释于0.01％tritonx-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μlpna底物(50mg，溶解在1.0mldmso中，并进一步地用0.01％tritonx-100稀释45倍)开始进行测定。监测od405的增加作为蛋白酶活性的量度。2)端点suc-aapf-pnaak测定：pna底物：suc-aapf-pna(bacheml-1400)。温度：受控的(测定温度)。测定缓冲液：100mm琥珀酸，100mmhepes，100mmches，100mmcabs，1mmcacl2，150mmkcl，0.01％tritonx-100，ph7.0。将200μlpna底物(50mg，溶解在1.0mldmso中，并进一步地用测定缓冲液稀释45倍)用移液管移至eppendorf管中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％tritonx-100中)。通过将eppendorf管转移至设定为测定温度的eppendorf恒温混匀仪中来启动测定。将管在eppendorf恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400rpm)下孵育15分钟。通过转移管返回至冰浴并添加600μl500mm琥珀酸/naoh(ph3.5)来停止孵育。通过涡旋混合eppendorf管后，将200μl混合物转移至微量滴定板中。读取od405作为蛋白酶活性的量度。在测定中包括空白缓冲液(bufferblind)(代替酶)。葡糖淀粉酶活性(agu)能以葡糖淀粉酶单位(agu)来测量葡糖淀粉酶活性。novo葡糖淀粉酶单位(agu)定义为在以下标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶量：37℃，ph4.3，底物：麦芽糖23.2mm，缓冲液：乙酸盐0.1m，反应时间5分钟。可以使用自动分析仪系统。将变旋酶添加到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得存在的任何α-d-葡萄糖变为β-d-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在以上提到的反应中与β-d-葡萄糖特异性地反应，形成nadh，使用光度计在340nm下测定该nadh作为原始葡萄糖浓度的量度。amg孵育：底物：麦芽糖23.2mm缓冲液：乙酸盐0.1mph：4.30±0.05孵育温度：37℃±1℃反应时间：5分钟酶工作范围：0.5-4.0agu/ml颜色反应：glucdh：430u/l变旋酶：9u/lnad：0.21mm缓冲液：磷酸盐0.12m；0.15mnaclph：7.60±0.05孵育温度：37℃±1℃反应时间：5分钟波长：340nm更详细描述这种分析方法的文件夹(eb-sm-0131.02/01)可以从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件夹特此包括。α-淀粉酶活性酸性α-淀粉酶活性(afau)能以afau(酸性真菌α-淀粉酶单位)测量酸性α-淀粉酶活性，其相对于酶标准品确定。1afau定义为在下述标准条件下每小时降解5.260mg淀粉干物质的酶量。酸性α-淀粉酶，其为内切α-淀粉酶(1,4-α-d-葡聚糖-葡聚糖水解酶，e.c.3.2.1.1)，水解淀粉分子内部区域中的α-1,4-糖苷键以形成具有不同链长的糊精和寡糖。与碘形成的颜色的强度和淀粉浓度成正比。使用反向比色法在指定的分析条件下测定淀粉浓度的降低作为酶活性。蓝色/紫色t＝23秒脱色标准条件/反应条件：更详细描述这种分析方法的文件夹eb-sm-0259.02/01可以从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件夹特此包括。fau-f的确定相对于具有声明强度的酶标准品测量fau-f真菌α-淀粉酶单位(fungalalpha-amylaseunits(fungamyl))。更详细描述这种分析方法的文件夹(eb-sm-0216.02)可以从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件夹特此包括。α-淀粉酶活性(knu)可以使用马铃薯淀粉作为底物确定α-淀粉酶活性。这种方法是基于由酶分解改性的马铃薯淀粉，并且该反应通过将淀粉/酶溶液的样品与碘溶液混合来追踪。最初形成黑蓝色，但淀粉分解过程中蓝色变弱并且逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准品比较。一千novoα淀粉酶单位(knu)定义为在标准条件下(即，在37℃+/-0.05；0.0003mca2+；和ph5.6)下将5260mg可溶的淀粉干物质merckamylum糊精化的酶量。更详细描述这种分析方法的文件夹eb-sm-0009.02/01可以从丹麦的诺维信公司索取得到，通过引用将该文件夹特此包括。pnp-g7测定可以通过采用g7-pnp底物的方法确定α-淀粉酶活性。缩写为4,6-亚乙基(g7)-对硝基苯基(g1)-□,d-麦芽庚糖苷的g7-pnp是一种可以被内切淀粉酶如α-淀粉酶切割的嵌段寡糖。切割之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化水解的底物以释放自由pnp分子，该分子具有黄颜色并且因而可以通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)下测量。包含g7-pnp底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏公司/日立公司(roche/hitachi)制造(目录号11876473)。试剂：来自这个试剂盒的g7-pnp底物包含22mm4,6-亚乙基-g7-pnp和52.4mmhepes(2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，ph7.0。α-葡糖苷酶试剂包含52.4mmhepes、87mmnacl、12.6mmmgcl2、0.075mmcacl2、≥4ku/l的α-葡糖苷酶。通过将1mlα-葡糖苷酶试剂与0.2mlg7-pnp底物混合，制成底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。稀释缓冲液：50mmmops，0.05％(w/v)tritonx100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(c14h22o(c2h4o)n(n＝9-10)))，1mmcacl2，ph8.0。程序：将有待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的ph是7。通过将20μl稀释的酶样品转移至96孔微量滴定板中并添加80μl底物工作溶液来进行测定。将溶液混合并在室温下预孵育1分钟并且在od405nm下经5分钟每20秒测量吸收。在一组给定的条件下，时间依赖性吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比。淀粉酶样品应稀释至斜率低于0.4吸光度单位/分钟的水平。phadebas活性测定：α-淀粉酶活性还可以通过使用phadebas底物(例如来自麦戈尔生命科学公司(maglelifesciences)，隆德，瑞典)的方法来确定。phadebas片剂包括互联的淀粉聚合物，所述聚合物呈不溶于水的球状微球形式。将蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联的淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可以通过在620nm下测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。将有待分析的淀粉酶样品稀释于具有所希望ph的活性缓冲液中。将一个底物片剂悬浮于5ml活性缓冲液中并在磁力搅拌器上混合。在混合底物过程中，将150μl转移至微量滴定板(mtp)或pcr-mtp中。将30μl稀释的淀粉酶样品添加至150μl底物中并混合。在37℃下孵育15分钟。通过添加30μl1mnaoh并混合来停止反应。以4000xg离心mtp5分钟。将100μl转移至新的mtp中并且测量620nm下的吸光度。淀粉酶样品应稀释成使得620nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。还原糖活性测定：α-淀粉酶活性还可以通过用例如玉米淀粉底物的还原糖测定来确定。通过与对羟基苯甲酸酰肼(phbah)反应来确定用α-淀粉酶水解淀粉中的α-1,4-糖苷键所形成的还原端的数目。在与phbah反应之后，可以通过在405nm下的吸光度来测量还原端的数目并且还原端的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。通过在milliq水中蒸煮5分钟来溶解玉米淀粉底物(3mg/ml)并且在测定之前冷却。关于终止液，制备ka-na-酒石酸盐/naoh溶液(k-na-酒石酸盐(merck8087)50g/l，naoh20g/l)并且通过将对羟基苯甲酸酰肼(phbah，sigmah9882)添加至ka-na-酒石酸盐/naoh溶液中至15mg/ml来新鲜制备终止液。在pcr-mtp中，将50μl活性缓冲液与50μl底物混合。添加50μl稀释的酶并混合。在pcr仪中在所希望的温度下孵育5分钟。通过添加75μl终止液(ka-na-酒石酸盐/naoh/phbah)来停止反应。在pcr仪中在95℃下孵育10分钟。将150μl转移至新mtp中并测量405nm下的吸光度。淀粉酶样品应稀释成使得405nm下的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。测定：为了确定残余淀粉酶活性，可以使用ultr淀粉酶测定试剂盒(e33651，英杰公司(invitrogen)，拉霍亚(lajolla)，加州，美国)。底物是玉米淀粉衍生物dqtm淀粉，它是用fl染料标记至这样的程度以使得荧光被淬灭的玉米淀粉。将含有大约1mg冻干底物的一个小瓶溶解于100微升的50mm乙酸钠(ph4.0)中。将小瓶涡旋20秒并且在室温下在黑暗中放置，并偶尔混合直到溶解为止。然后添加900微升的100mm乙酸盐、0.01％(w/v)x100、0.125mmcacl2，ph5.5，充分涡旋并在室温下在黑暗中储存直到准备使用为止。通过以10倍稀释于残余活性缓冲液(100mm乙酸盐、0.01％(w/v)x100、0.125mmcacl2，ph5.5)中来制备储备底物工作溶液。孵育之后立即将酶在100mm乙酸盐、0.01％(w/v)x100、0.125mmcacl2，ph5.5中稀释至10-20ng酶蛋白/ml的浓度。为了测定，在黑色384孔微量滴定板中，将25微升的底物工作溶液与25微升稀释的酶混合10秒。在每个孔中在25℃下于15分钟内每分钟测量一次荧光强度(激发：485nm，发射：555nm)并计算荧光强度相对于时间的曲线的斜率作为vmax。曲线应是线性的，并且调整了残余活性测定使得稀释的参照酶溶液在活性测定的线性范围内。普鲁兰酶测定普鲁兰酶活性(npun)测定相对于诺维信普鲁兰酶标准品测量以npun计的内切普鲁兰酶活性。一个普鲁兰酶单位(npun)定义为在标准条件下(0.7％红色普鲁兰(redpullulan)(麦格酶公司(megazyme))，ph5，40℃，20分钟)每分钟释放1微摩尔葡萄糖的酶量。使用红色普鲁兰以npun/ml测量活性。将1ml稀释的样品或标准品在40℃下孵育2分钟。添加0.5ml2％红色普鲁兰、0.5mkcl、50mm柠檬酸，ph5并混合。将管在40℃下孵育20分钟并且通过添加2.5ml80％乙醇终止。将管在室温下静置10-60分钟，随后以4000rpm离心10分钟。然后在510nm下测量上清液的od并使用标准曲线计算活性。红色普鲁兰测定(麦格酶公司)底物溶液0.1g红色普鲁兰(megazymes-rpul)0.75ml2m乙酸钠，ph5.514.25mlh2o将10μl的酶样品与80μl的底物溶液混合，并且在设定温度(例如55℃、60℃、65℃)下孵育20min。将50μl的乙醇添加至反应混合物中并且以3500rpm离心10min。小心地取出上清液并且确定吸光度a510。pahbah普鲁兰测定底物溶液0.15gbh4普鲁兰25ml50mm乙酸钠缓冲液，ph5.5pahbah溶液0.0552g乙酸铋(iii)0.2gpahbah0.5g酒石酸钠钾，四水合物10ml500mmnaoh将10μl的酶样品与110μl的底物溶液混合，并且在设定温度(例如55℃、60℃、65℃)下孵育20min。将40μl的pahbah溶液添加至反应混合物中，在50℃下再孵育20min，并且确定吸光度a405。lintner可溶性糯性淀粉测定底物溶液0.2glintner糯性玉米淀粉2.5ml2m乙酸钠97.5mlh2o将5μl的酶样品与100μl的底物溶液混合，并且在设定温度(例如55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)下孵育20min。将100μl的0.15％i2/1.5％ki溶液添加至反应混合物中，并且确定吸光度a610。phadebas测定(用于确定相对活性)底物溶液：1片phadebasα-淀粉酶片剂5ml50mm乙酸钠缓冲液，ph540秒微波炉高至沸腾终止液：18％乙酸测定方法：在96孔pcr管中的酶反应将10μl的酶样品与100μl的底物溶液混合，并且在设定温度(例如55℃、60℃、65℃)下孵育20min。将50μl的终止液添加至反应混合物中并且以3500rpm离心10分钟。小心地取出上清液并且读取在a600处的吸光度。实例1：由杂合亲本普鲁兰酶构建普鲁兰酶变体p380和p507通过将来自从嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌中分离的天然普鲁兰酶(seqidno:1)的n-末端氨基酸1-451与来自从脱支芽孢杆菌中分离的天然普鲁兰酶(seqidno:2)的c-末端氨基酸452-828融合来构建杂合普鲁兰酶。将这种杂合普鲁兰酶(在本文披露为seqidno:3)用作用于构建变体普鲁兰酶p380(和p380-2)和p507(和p507-2)的亲本普鲁兰酶。在下表1中披露了引入杂合亲本酶中的取代。表1.变体普鲁兰酶p380和p507实例2：普鲁兰酶变体p380-2和p507-2的相对活性测量所选普鲁兰酶变体的相对活性测量通过在普鲁兰酶测定部分中所述的phadebas测定在65℃-79℃的范围内、ph5.0进行。结果示于下表2中。表2.实例3：普鲁兰酶文库的构建使用组织试剂盒[马歇雷-纳高公司(macherey-nagel)]根据其程序分离来自具有以上实例1中所述的普鲁兰酶变体p380-2(seqidno:15/16)或p507-2(seqidno:17/18)的普鲁兰酶基因的枯草芽孢杆菌菌株的基因组dna。如下构建普鲁兰酶文库。设计在靶位点处具有nnk或所希望的突变的反向或正向引物，所述靶位点彼此具有15bp的重叠，并且使用引物1f或2f以及反向引物和正向引物以及引物1r或2r，使用适当的模板基因组dna在以下条件下进行两个pcr。将生成的pcr片段通过凝胶和pcr净化试剂盒[马歇雷-纳高公司]纯化并且通过infusion克隆(clontech公司)连接至载体。然后，将infusion混合物引入大肠杆菌dh5α,jet感受态大肠杆菌细胞bdl中。引物f1atgtattatggagctctataaaaatgaggagggaaccgaatgtccctaatacgttctag(seqidno:19)引物r1ttattgattaacgcgtttaattttgatcaatgacatc(seqidno:20)引物f2atgtattatggagctctataaaaatgaggagggaaccgaatggctaaaaaactaatttatg(seqidno:21)引物r2ttattgattaacgcgtttactttttaccgtggtctg(seqidno:22)phusion聚合酶(赛默科技公司(thermoscientific))共20μlpcr程序：98℃/30sec30x(98℃/10sec,60℃/20sec,72℃/3min)72℃/5min4℃/∞实例4：筛选热活性将如在实例3中构建的芽孢杆菌属文库在220rpm、37℃下在96孔mtp中发酵，所述mtp含有tb-gly培养基(13.3g/lbactotm胰蛋白胨，26.6g/lbactotm酵母提取物d，4.4g/l甘油)，该培养基含有6mg/l氯霉素，并且在若干温度下通过在普鲁兰酶测定部分中所述的lintner可溶性淀粉测定和/或phadebas测定测量普鲁兰酶活性。表3a列出了普鲁兰酶变体的相对活性，它们示出比其亲本普鲁兰酶更高的热活性。表3b列出了普鲁兰酶变体的相对活性，它们示出比其亲本普鲁兰酶更高的热活性。表3c列出了普鲁兰酶变体的相对活性，它们示出比其亲本普鲁兰酶更高的热活性。表4.p507-2的热稳定化变体的取代实例5：芽孢杆菌属菌株的发酵在220rpm、37℃下，在回转式摇床上的500ml带挡板烧瓶中发酵表达所述变体的枯草芽孢杆菌菌株，所述烧瓶含有100mltb-gly(添加有6mg/l氯霉素)。离心培养物(20000xg，20min)，并且小心地从沉淀慢慢倒出上清液。将上清液通过0.45μm过滤装置过滤以除去剩余的芽孢杆菌属宿主细胞。实例6：普鲁兰酶的纯化通过β-环糊精亲和柱并且随后通过阴离子交换柱色谱法进行普鲁兰酶的纯化。纯化之后，将普鲁兰酶用20mm乙酸钠缓冲液(ph5.5)透析并浓缩。实例7：酶热稳定性测量将纯化的酶用50mm乙酸钠(ph5.0或4.3)稀释至0.5mg/ml并与等体积的用milli-q水稀释的syproorange(英杰公司)混合。将三十微升的混合物溶液转移至lightcycler480多孔板96(罗氏诊断公司(rochediagnostics))中并将板密封。tsa的设备参数：仪器：lightcycler480实时pcr系统(罗氏应用科学部(rocheappliedscience))扫描速率：0.02℃/秒扫描范围：37℃-96℃扫描速率：1.26℃/min积分时间：0.5秒激发波长465nm发射波长580nm将获得的荧光信号标准化到0和1的范围内。解链温度(tm)定义为标准化值最接近0.5时的温度。实例8：普鲁兰酶变体p380-2的液化和发酵测试在实验室规模液化和发酵测定中对热稳定化普鲁兰酶变体p380-2进行应用测试。磨碎的玉米和涡流(backset)从工业乙醇工厂获得。将玉米浆液制成30.5％干固体(％ds)，其中涡流包含率为30％。将浆液在不锈钢labomat罐中制备。labomat是用于制备实验室规模液化物的机器，因为它使用密封罐，从而消除水蒸发，提供持续的混合，并且可以在玉米液化所需的高温下运行。在测量和调整ph之前，将浆液平衡15-30分钟。将所有浆液的ph调整到4.95和5.05之间在本实验中使用的淀粉酶是以2.1μg/gds的剂量给料的be369。以4个不同剂量(5、10、20和50微克酶蛋白/克干固体)对p380-2普鲁兰酶进行测试。对照是仅be369淀粉酶。调整浆液ph后，以合适的剂量加入酶。在插入labomat之前密封并混合罐。labomat设置为：升至80℃，在80℃下共保持120分钟并且顺时针混合30秒，然后逆时针混合30秒。液化后，将罐取出并在冰水浴中孵育10-20分钟以帮助快速冷却至室温。液化物中添加的尿素的终浓度为1000ppm，并且添加的青霉素的终浓度为3ppm。检查ph，并且如果需要的话重新调整到4.95和5.05之间。将大约5克的每种液化物等分到预称重的钻过孔的15ml翻转顶部离心管中。对于每种液化物，有5个重复管。液化物等分后，将填充的管再次称重。在本实验中使用的葡糖淀粉酶是以0.5agu/克干固体的剂量给料的葡糖淀粉酶a共混物。使用的酵母是ethanolred。通过将5.5克活性干酵母加入100毫升温自来水中并在32℃下孵育30分钟，偶尔手动混合将其再水合。为了开始发酵，向每个管给料葡糖淀粉酶a、水和再水合酵母。将发酵物在32℃水浴中孵育54小时，每天手动混合两次。通过加入10微升/克40％硫酸的醪液来停止发酵。然后将管涡旋以混合并以3000rpm离心10分钟以除去固体。将液体样品通过0.45微米针筒式滤器过滤到hplc小瓶中。使用hplc(使用标准燃料程序)来量化乙醇、残余糊精(dp1-4+，果糖)、有机酸(乙酸和乳酸)和甘油。统计分析使用sasjmp软件(版本11)完成。结果如图1所示，显示当将热稳定普鲁兰酶变体p380-2加入液化混合物中时，乙醇产率明显增加。实例9：普鲁兰酶变体p380-2的液化和发酵测试进行第二个实验，其中在加入p380-2普鲁兰酶之前，将加入了淀粉酶的玉米浆液在80℃水浴中加热30分钟。玉米浆液以与上述相同的方式制备(在加盖的nalgene瓶中而不是不锈钢labomat罐)。将be369淀粉酶以2.1μg/gds的剂量给料，将浆液加盖并在80℃水浴中孵育，在前30分钟每2-3分钟手动振摇。p380-2普鲁兰酶以0、5或10微克/克干固体的剂量给料。将液化再继续90分钟，偶尔手动混合。液化后，将醪液冷却至室温，并且如前所述加入尿素至1000ppm并且加入青霉素至3ppm。如上所述进行小规模发酵，其中葡糖淀粉酶a以0.5agu/克干固体的剂量给料。图2所示的结果清楚地表明，当在醪液达到80℃后加入热稳定普鲁兰酶变体p380-2时，乙醇产率也增加。实例10：普鲁兰酶变体p598和p604的液化和发酵测试在实验室规模液化和发酵测定中对热稳定化普鲁兰酶变体p598和p604进行应用测试。磨碎的玉米从工业乙醇工厂获得。将玉米浆液制成32％干固体(％ds)。将浆液在不锈钢labomat罐中制备。labomat是用于制备实验室规模液化物的机器，因为它使用密封罐，从而消除水蒸发，提供持续的混合，并且可以在玉米液化所需的高温下运行。在测量和调整ph之前，将浆液平衡15-30分钟。将所有浆液的ph调整到5.0和5.2之间。在本实验中使用的淀粉酶产品(用于所有普鲁兰酶处理)是以0.021％重量的酶产品/重量的磨碎玉米的剂量给料的α-淀粉酶共混物aa。以5个不同剂量(1、5、10、20和50微克酶蛋白/克干固体)对p598和p604普鲁兰酶进行测试。对照是仅以0.0857knu(ah)/克干固体的剂量给料的aa369产品或仅以0.021％重量的产品/重量的玉米的剂量给料的α-淀粉酶共混物aa。调整浆液ph后，以合适的剂量加入酶。在插入labomat之前密封并混合罐。labomat设置为：升至80℃，在80℃下共保持120分钟并且顺时针混合30秒，然后逆时针混合30秒。液化后，将罐取出并在冰水浴中孵育10-20分钟以帮助快速冷却至室温。对于包括普鲁兰酶处理的所有含α-淀粉酶共混物aa的醪液，液化物中添加的尿素的终浓度为250ppm，并且对于aa369对照是1000ppm。将青霉素添加到3ppm的终浓度。检查ph但不重新调整。将大约5克的每种液化物等分到预称重的钻过孔的15ml翻转顶部离心管中。对于每种液化物，有4个重复管。液化物等分后，将填充的管再次称重。在本实验中使用的葡糖淀粉酶是以0.6agu/克干固体的剂量给料的葡糖淀粉酶共混物b。使用的酵母是fermentisethanolred。通过将2.75克活性干酵母加入50毫升温自来水中并在32℃下孵育30分钟，偶尔手动混合将其再水合。为了开始发酵，向每个管给料葡糖淀粉酶共混物b、水和再水合酵母(向每个管中添加100微升再水合酵母)。将发酵物在32℃水浴中孵育54小时，每天手动混合两次。通过加入10微升/克40％硫酸的醪液来停止发酵。将管涡旋以混合并以3000rpm离心10分钟以除去固体。将液体样品通过0.45微米针筒式滤器过滤到hplc小瓶中。使用hplc(使用标准燃料程序)来量化乙醇、残余糊精(dp1-4+，果糖)、有机酸(乙酸和乳酸)和甘油。统计分析使用sasjmp软件(版本11)完成。序列表<110>诺维信公司（novozymesa/s）<120>适合用于液化中的具有普鲁兰酶活性的多肽<130>13195-wo-pct<160>22<170>patentin3.5版<210>1<211>829<212>prt<213>芽孢杆菌属17840<400>1aspserthrserthrgluvalilevalhistyrhisargpheaspser151015asntyralaasntrpaspleutrpmettrpprotyrglnprovalasn202530glyasnglyalaalatyrglupheserglylysaspasppheglyval354045lysalaaspvalglnvalproglyaspaspthrglnvalglyleuile505560valargthrasnasptrpserglnlysasnthrseraspaspleuhis65707580ileaspleuthrlysglyhisgluiletrpilevalglnglyasppro859095asniletyrtyrasnleuseraspalaglnalaalaalathrprolys100105110valserasnalatyrleuaspasnglulysthrvalleualalysleu115120125thrasnprometthrleuseraspglyserserglyphethrvalthr130135140asplysthrthrglygluglnileprovalthralaalathrasnala145150155160asnseralasersersergluglnthraspleuvalglnleuthrleu165170175alaseralaproaspvalserhisthrileglnvalglyalaalagly180185190tyrglualavalasnleuileproargasnvalleuasnleuproarg195200205tyrtyrtyrserglyasnaspleuglyasnvaltyrserasnlysala210215220thralapheargvaltrpalaprothralaseraspvalglnleuleu225230235240leutyrasnsergluthrglyprovalthrlysglnleuglumetgln245250255lysseraspasnglythrtrplysleulysvalproglyasnleulys260265270asntrptyrtyrleutyrglnvalthrvalasnglylysthrglnthr275280285alavalaspprotyrvalargalaileservalasnalathrarggly290295300metilevalaspleugluaspthrasnproproglytrplysgluasp305310315320hisglnglnthrproalaasnprovalaspgluvaliletyrgluval325330335hisvalargasppheserileaspalaasnserglymetlysasnlys340345350glylystyrleualaphethrgluhisglythrlysglyproaspasn355360365vallysthrglyileaspserleulysgluleuglyileasnalaval370375380glnleuglnproilegluglupheasnserileaspgluthrglnpro385390395400asnmettyrasntrpglytyraspproargasntyrasnvalproglu405410415glyalatyralathrthrprogluglythralaargilethrglnleu420425430lysglnleuileglnserilehislysaspargilealaileasnmet435440445aspvalvaltyrasnhisthrpheasnvalglyvalserasppheasp450455460lysilevalproglntyrtyrtyrargthraspseralaglyasntyr465470475480thrasnglyserglyvalglyasngluilealathrgluargpromet485490495valglnlysphevalleuaspservallystyrtrpvallysglutyr500505510hisileaspglypheargpheaspleumetalaleuleuglylysasp515520525thrmetalalysileserlysgluleuhisalaileasnproglyile530535540valleutyrglygluprotrpthrglyglythrserglyleuserser545550555560aspglnleuvalthrlysglyglnglnlysglyleuglyileglyval565570575pheasnaspasnileargasnglyleuaspglyasnvalpheasplys580585590seralaglnglyphealathrglyaspproasnglnvalasnvalile595600605lysasnglyvalmetglyserileseraspphethrseralaproser610615620gluthrileasntyrvalthrserhisaspasnmetthrleutrpasp625630635640lysileseralaserasnproasnaspthrglnalaaspargilelys645650655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