用于从组织样品提取DNA和RNA的组合物和方法与流程

本申请要求于2015年7月24日提交的USSN 62/196,774的权益和优先权，其通过引用的方式全文纳入本文用于所有目的。

政府资助的声明

[不适用]

背景技术：

基因表达谱分析的使用不仅在各种研究应用中流行，而且正迅速成为许多治疗方案的一部分。例如，确定组织中的基因表达水平对于精确诊断人类疾病非常重要，并被越来越多地用于决定患者的治疗过程。药物基因组学方法可鉴别可能对特定药物做出响应的患者，并可以开辟新治疗方法。

例如，胸苷酸合酶(TS)是DNA生物合成中的整合酶，其中它催化脱氧尿苷单磷酸(dUMP)到脱氧胸苷单磷酸(dTMP)的还原性甲基化，并提供了在细胞内从头合成嘧啶核苷酸的路径(Johnston et al.(1995)Cancer Res.,55:1407-1412)。胸苷酸合酶是化疗药物的靶标，最常见的是抗叶酸剂5-氟尿嘧啶(5-FU)。作为治疗结肠癌、头颈癌和乳腺癌的有效药剂，人们认为5-FU的主要作用是抑制TS活性，导致细胞内胸腺嘧啶水平消耗，并随后导致细胞死亡。

还已知胸苷酸合酶在肿瘤耐药性发展中具有临床重要性，如通过研究证明的，所述研究显示暴露于5-FU后瘤细胞中TS蛋白的急性诱导和TS酶水平的增加(Spears et al.(1982)Cancer Res.42:450-456；Swain et al.(1989)J.Clin.Oncol.7:890-899)。肿瘤响应细胞毒性剂如5-FU而急性过表达TS的能力可能在氟尿嘧啶耐药性的发展中起作用。TS蛋白水平似乎与5-FU治疗的有效性直接相关，蛋白与RNA表达之间存在直接相关性，而TS表达是结直肠癌和乳腺癌中很有效的预后标记物(Jackman et al.(1985)Experimental and Clinical Progress in Cancer Chemotherapy,F.M.Muggia ed.,Martinus et al.(1992)Cancer Res.,52:108-116)。在晚期转移性疾病中，已证明通过RT-PCR定量的高TSmRNA和高TS蛋白表达都预示对以下癌症的基于氟嘧啶的治疗的不良响应：结直肠癌(Johnston et al.(1995)同上；Farrugia et al.(1997)Proc.Annu.Meet Am.Assoc.Cancer Res.38:A4132；Leichman et al.(1997)J.Clin.Oncol.15(10):3223-3229)、胃癌(Lenz et al.(1998)Clin.Cancer Res.,4(5):1227-1234)、和头颈癌(Johnston et al.(1995)Cancer Res.,55:1407-1412；Leichman et al.(1997)J.Clin.Oncol.15(10):3223-3229)。

类似地，KRAS致癌基因的突变预示在结直肠癌中对帕尼单抗和西妥昔单抗的非常不良的响应(Lièvre et al.(2006)Cancer Res.,66(8):3992-3995)。目前，预测结直肠癌患者是否会对一种EGFR抑制药物做出响应的最可靠的方法之一是测试编码KRAS的基因中的某些“活化”突变，其发生在40％的结直肠癌中。研究显示，其肿瘤表达KRAS基因的突变体的患者不会对西妥昔单抗或帕尼单抗做出响应。

这类信息的一个重要来源来自从活检样本常规制备的福尔马林固定石蜡包埋的组织(“FFPET”)样品形式，所述活检样本取自经历针对各种不同疾病的各种诊断和/或治疗方案的患者。这些样品通常与相应的临床记录相关联，并常常在诊断和治疗方式的确定中起重要作用。例如，肿瘤活检FFPET样品通常与癌症阶段分类、患者存活和治疗方案相关联，从而提供可以交叉参照并与基因表达模式相关的潜在丰富信息。然而，从FFPET样品中分离的核酸的质量和数量不佳导致其在基因表达谱分析研究中的利用不足。

已知可从FFPET样品中纯化和分析RNA(Rupp and Locker(1988)Biotechniques 6:56-60)，然而，从FFPET样品中分离的RNA常常被中度至高度地降解和碎片化。除了被降解和碎片化之外，福尔马林对RNA的化学修饰限制了寡聚dT引物与聚腺苷酸尾的结合，并能阻碍逆转录的效率。

鉴于这些难题，已证明由于产生可PCR扩增的遗传物质所需要的多个步骤使得分析来自福尔马林固定石蜡包埋的组织(FFPET)的核酸具有挑战性。从FFPET中分离核酸的过程可包括石蜡的去除(去石蜡)、保存样品的裂解(蛋白酶消化)、固定过程中获得的交联的逆转以及核酸的基于固相的纯化。这些方案通常是的复杂且劳动密集的。

技术实现要素：

本申请提供用于从细胞或组织样品(例如，细针抽吸物和/或固定包埋的组织样品(例如，FFPET样品、和/或冷冻切片)中分离核酸的方法和试剂。在一些实施方案中，所述方法是简单的、易于半自动化或完全自动化的，并且通常需要最少的操作时间，同时提取高的产量和PCR可扩增质量的核酸。

本文所考虑的各种实施方案可包括但不必限于以下的一种或多种：

实施方案1：用于从细胞或组织样品中提取核酸的裂解溶液，所述裂解溶液包含：浓度大于约300mM的NaCl₂；足以将所述溶液的pH维持在范围为约pH 6.8至约pH 7.3的pH的缓冲剂；螯合剂；浓度小于约50mM的MgCl₂；以及洗涤剂。

实施方案2：实施方案1的裂解溶液，其中所述裂解溶液是用于福尔马林固定石蜡包埋的组织样品。

实施方案3：实施方案1的裂解溶液，其中所述裂解溶液是用于细针抽吸物和/或细胞涂片。

实施方案4：根据实施方案1-3中任一项所述的裂解溶液，其中所述溶液包含消泡剂。

实施方案5：根据实施方案1-4中任一项所述的裂解溶液，其中所述溶液包含防腐剂/杀生物剂。

实施方案6：根据实施方案1-5中任一项所述的裂解溶液，其中所述缓冲剂是HEPES钠盐缓冲剂。

实施方案7：根据实施方案1-6中任一项所述的裂解溶液，其中所述缓冲剂的浓度为约10mM至最高达约100mM，或为约20mM至最高达约50mM，或为约50mM。

实施方案8：根据实施方案1-7中任一项所述的裂解溶液，其中所述溶液的pH为约6.8至约7.2。

实施方案9：根据实施方案1-8中任一项所述的裂解溶液，其中所述NaCl的浓度为约300mM至约500mM，或为约350mM至最高达约450mM，或为约400mM。

实施方案10：根据实施方案1-9中任一项所述的裂解溶液，其中所述螯合剂包含选自以下的试剂：N-乙酰基-L-半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)和膦酸盐螯合剂。

实施方案11：根据实施方案1-10中任一项所述的裂解溶液，其中所述螯合剂包含EDTA。

实施方案12：根据实施方案1-11中任一项所述的裂解溶液，其中所述溶液中的所述螯合剂的浓度为约5mM至约100mM，或为约10mM至约50mM，或为约25mM。

实施方案13：根据实施方案1-12中任一项所述的裂解溶液，其中所述MgCl₂的浓度为约2mM至最高达约20mM，或为约5mM至最高达约15mM，或为约10mM。

实施方案14：根据实施方案1-13中任一项所述的裂解溶液，其中所述洗涤剂是离子洗涤剂或非离子洗涤剂。

实施方案15：根据实施方案1-13中任一项所述的裂解溶液，其中所述洗涤剂包括选自以下的洗涤剂：N-月桂酰肌氨酸、十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基甲基溴化铵(CTAB)、正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、CHAPS、正辛酰蔗糖、正辛基-β-D-吡喃麦芽糖苷、正辛基-β-D-硫代吡喃葡萄糖苷、和正庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷。

实施方案16：实施方案13的裂解溶液，其中所述洗涤剂包含

实施方案17：根据实施方案1-16中任一项所述的裂解溶液，其中所述洗涤剂占所述溶液的约0.1％至约2％，或所述溶液的约0.5％至约1.5％所述溶液，或所述溶液的约1％。

实施方案18：根据实施方案4-17中任一项所述的裂解溶液，其中所述消泡剂包括有机消泡剂乳液或基于硅氧烷的消泡剂乳液。

实施方案19：实施方案18的裂解溶液，其中所述消泡剂包括硅氧烷乳液。

实施方案20：实施方案18的裂解溶液，其中所述消泡剂包含活性硅消泡剂的10％乳液和非离子型乳化剂(SE-15)。

实施方案21：根据实施方案4-20中任一项所述的裂解溶液，其中所述消泡剂是以所述裂解溶液的约0.001％至最高达约0.05％、或约0.005％至最高达约0.03％、或约0.008％至最高达约0.02％的量存在，或以所述裂解溶液的约0.01％的量存在。

实施方案22：根据实施方案5-17中任一项所述的裂解溶液，其中所述杀生物剂包括选自以下的一种或多种试剂：叠氮化钠、脱氢乙酸钠、十水合硼酸钠、和乙二胺四乙酸二钠。

实施方案23：实施方案22的裂解溶液，其中所述杀生物剂包含叠氮化钠。

实施方案24：根据实施方案5-23中任一项所述的裂解溶液，其中所述杀生物剂是以所述裂解溶液的约0.001％至最高达约0.05％、或约0.005％至最高达约0.03％，或约0.008％至最高达约0.02％的量存在，或以所述裂解溶液的约0.01％的量存在。

实施方案25：实施方案1的裂解溶液，其中所述溶液包含：约400mM NaCl；约50mM HEPES钠盐(MW 260.29)；约25mM EDTA；约10mM MgCl₂；和约1％Tween 20。

实施方案26：实施方案25的裂解溶液，其中所述溶液的pH值为约6.90至约7.25。

实施方案27：实施方案25的裂解溶液，其中所述溶液的pH值为约6.95至约7.15。

实施方案28：根据实施方案25-27中任一项所述的裂解溶液，其中所述溶液包含约0.01％的消泡剂。

实施方案29：实施方案28的裂解溶液，其中所述消泡剂是SE-15。

实施方案30：根据实施方案25-29中任一项所述的裂解溶液，其中所述溶液包含约0.01％的叠氮化钠。

实施方案31：根据实施方案1-30中任一项所述的裂解溶液，其中所述溶液还包含蛋白酶。

实施方案32：实施方案的裂解溶液31，其中所述蛋白酶选自蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和木瓜蛋白酶。

实施方案33：实施方案的裂解溶液31，其中所述蛋白酶是蛋白酶K。

实施方案34：根据实施方案31-33中任一项所述的裂解溶液，其中所述蛋白酶的浓度为14mg/mL至约22mg/mL并且以约10μL至最多达约100μL、或约20μL至最多达约50μL、或约20μL至最多达约40μL的量被加入到所述裂解溶液中。

实施方案35：一种用于从细胞或组织样品中提取核酸的方法，所述方法包括：在实施方案1-34中任一项所述的裂解溶液中孵育一种或多种细胞或组织样品，其中所述孵育是在范围为约50℃至约100℃的温度下进行，并且所述孵育持续约10分钟至最高达约24小时的时间。

实施方案36：实施方案35的方法，其中所述温度为约60℃至约90℃，或为约70℃至约90℃，或为约75℃至约85℃，或约80℃。

实施方案37：根据实施方案35-36中任一项所述的方法，其中所述孵育持续约15分钟至最高达约12小时、或约20分钟至最高达约8小时、或约30分钟至最高达约6小时、或约30分钟至最高达约4小时、或约30分钟至最高达约2小时、或约15分钟、或约30分钟、或约45分钟、或约60分钟、或约90分钟，或约120分钟的时间。

实施方案38：根据实施方案35-37中任一项所述的方法，其中所述方法还包括从所述裂解溶液回收所述核酸。

实施方案39：实施方案38的方法，其中所述回收包括将低级醇加入所述溶液中。

实施方案40：实施方案39的方法，其中所述低级醇包括乙醇或异丙醇。

实施方案41：实施方案39的方法，其中所述低级醇包括乙醇。

实施方案42：根据实施方案35-41中任一项所述的方法，其中所述核酸是脱氧核糖核酸(DNA)。

实施方案43：根据实施方案35-41中任一项所述的方法，其中所述核酸是核糖核酸(RNA)。

实施方案44：根据实施方案35-43中任一项所述的方法，其中所述细胞或组织样品选自组织活检物(tissue biopsy)、抽吸物(aspirate)、细胞涂片(cell smear)、擦拭物(wipe)、刮擦物(scrape)、存档的样品(archived sample)、固定的组织切片、冰冻切片、细胞按钮(cell button)和组织微阵列。

实施方案45：实施方案44的方法，其中所述细胞或组织样品包括从钻取(punch)活检物获得的样品。

实施方案46：实施方案44的方法，其中所述细胞或组织样品包括从口腔刮擦或妇科刮擦获得的样品。

实施方案47：实施方案44的方法，其中所述细胞或组织样品包括使用选自以下装置获得的样品：多用压舌板(multispatula)、延长的尖端刮刀(extended tip spatula)、细胞刷(cytobrush)、细胞挑针(cytopick)、子宫颈刷(cervexbrush)、拭子(swab)、贝恩刷(baynebrush)、轮廓刷(profilebrush)、球形抽吸器(bulb aspirator)、Ayre刮刀、和Aylesbury装置。

实施方案48：实施方案44的方法，其中所述细胞或组织样品包括细针抽吸物和/或细胞涂片。

实施方案49：实施方案44的方法，其中所述细胞或组织样品包括固定的石蜡包埋的组织样品。

实施方案50：实施方案44的方法，其中所述细胞或组织样品包括福尔马林固定石蜡包埋的组织样品。

实施方案51：实施方案44的方法，其中所述细胞或组织样品包括组织切片。

实施方案52：实施方案51的方法，其中所述组织切片的厚度为约1μm至约15μm。

实施方案53：实施方案52的方法，其中所述组织切片具有的厚度为约8μm或更小、或约6μm或更小、或约5μm或更小、或约4μm或更小、或约3μm或更小、或约2μm或更小。

实施方案54：根据实施方案35-53中任一项所述的方法，其中所述组织样品来自癌组织。

实施方案55：实施方案54的方法，其中所述组织样品包括来自选自以下癌症的样品：卵巢癌(ovarian cancer)、胰腺癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、乳腺癌、结直肠癌、睾丸癌、白血病、淋巴瘤、脑肿瘤、宫颈癌、肉瘤、前列腺肿瘤、膀胱肿瘤、网状内皮组织肿瘤、肾母细胞瘤(Wilm’s tumor)、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌(ovarian carcinoma)、骨肉瘤、肾癌和头颈癌。

实施方案56：根据实施方案35-55中任一项所述的方法，其中所述方法不包括进一步的脱蜡步骤和/或用于脱蜡的额外试剂。

实施方案57：根据实施方案35-56中任一项所述的方法，其中所述方法不使用用于脱蜡的有机溶剂。

实施方案58：根据实施方案35-57中任一项所述的方法，其中所述孵育不是在存在有机溶剂的情况下进行。

实施方案59：根据实施方案35-58中任一项所述的方法，其中所述裂解的组织样品与低级醇混合并储存。

实施方案60：实施方案59的方法，其中所述低级醇包括乙醇或异丙醇。

实施方案61：实施方案59的方法，其中所述低级醇包括乙醇。

实施方案62：根据实施方案59-61中任一项所述的方法，其中所述组织样品被储存在-20℃或更低的温度下。

实施方案63：根据实施方案59-62中任一项所述的方法，其中所述裂解溶液储存至少6小时的时间、或至少一天的时间、或至少两天的时间、或至少4天的时间、或至少一周的时间、或至少两周的时间、或至少一个月的时间、或至少两个月的时间、或至少三个月的时间、或至少6个月的时间、或至少一年的时间、或至少两年的时间、或至少5年的时间，并在之后的RT-PCR中提供一致的循环阈值。

实施方案64：根据实施方案35-63中任一项所述的方法，其中所述方法还包括扩增全部或一部分的所述核酸。

实施方案65：实施方案64的方法，其中所述方法还包括利用所述核酸作为PCR扩增的模板。

实施方案66：实施方案64的方法，其中所述方法还包括在RT PCR中利用所述核酸。

实施方案67：实施方案64的方法，其中所述方法进一步包括在GeneXpert系统中扩增所述核酸。

实施方案68：根据实施方案35-67中任一项所述的方法，其中所述核酸被用于确定为至少一种靶RNA的表达的存在和/或表达水平，所述靶RNA为mRNA。

实施方案69：根据实施方案35-67中任一项所述的方法，其中所述核酸被用于确定选自以下的至少一种靶RNA的表达的存在和/或表达水平：KRT20、IGF2、ANXA10、CRH、ABL、ERBB1、ERBB2、ERBB3、ERBB4、ESR1、PGR、MPO、CDKN2A、MKI67、TOP2A、MCM5、BIRC5、MMP9和MCM2、PTEN、APC、KRAS、GATA3、PIC3CA、MAP3K1、TP53，以及任何这些的突变。

实施方案70：根据实施方案35-69中任一项所述的方法，其中核酸是从原始裂解样品扩增两个或更多不同的时间。

实施方案71：实施方案70的方法，其中所述两个或更多个不同的时间是至少6小时的时间、或至少一天的时间、或至少两天的时间、或至少4天的时间、或至少一周的时间、或至少两周的时间、或至少一个月的时间、或至少两个月的时间、或至少三个月的时间、或至少6个月的时间、或至少一年的时间、或至少两年的时间、或至少5年的时间。

实施方案72：根据实施方案70-71中任一项所述的方法，其中第二次或以后的扩增包括重复试验。

实施方案73：根据实施方案70-71中任一项所述的方法，其中第二次或以后的扩增包括反射盒试验(reflex cartridge test)。

实施方案74：用于定量测量固定的石蜡包埋的组织样品中的靶基因的基因表达的方法，其包括：根据实施方案35-73中任一项所述的方法从福尔马林固定的石蜡包埋的生物组织样品中提取RNA；使用能够扩增靶基因mRNA的区域的一对寡核苷酸引物对提取的核酸进行扩增，从而获得扩增的样品；并确定所述靶基因mRNA的存在和/或量。

实施方案75：实施方案74的方法，其中所述靶基因mRNA的量是相对于来自分离的mRNA的内部对照基因的mRNA的量来确定。

实施方案76：根据实施方案74-75中任一项所述的方法，其中确定相对基因表达水平包括使用RT-PCR。

实施方案77：根据实施方案74-76中任一项所述的方法，其中所述内部对照基因是β-肌动蛋白。

实施方案78：根据实施方案74-77中任一项所述的方法，其中所述靶基因选自：ALK基因重排、α-甲胎蛋白(AFP)、β-2-微球蛋白(B2M)、β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)、BCR-ABL融合基因、BRAF突变V600E、CA15-3/CA27.29、CA19-9、CA-125、降钙素、癌胚抗原(CEA)、CD20、嗜铬粒蛋白A(CgA)、染色体3、染色体7、染色体17、染色体9p21、染色体20q13、细胞角蛋白片段21-1、EGFR突变分析、雌激素受体(ER)，孕酮受体(PR)、纤维蛋白/纤维蛋白原、HE4、HER4、HER2/neu、KIT、KRAS突变分析、乳酸脱氢酶、核基质蛋白22、前列腺特异性抗原(PSA)、甲状腺球蛋白、尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI-1)。

实施方案79：一种用于从细胞和/或组织样品提取核酸的试剂盒，所述试剂盒包括含有根据实施方案1-30中任一项所述的裂解溶液的容器。

实施方案80：实施方案79的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括含有蛋白酶的容器。

实施方案81：实施方案80的试剂盒，其中所述蛋白酶选自蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、和木瓜蛋白酶。

实施方案82：实施方案80的试剂盒，其中所述蛋白酶是蛋白酶K。

实施方案83：根据实施方案80-82中任一项所述的试剂盒，其中所述蛋白酶与所述裂解溶液混合在一起。

实施方案84：根据实施方案80-82中任一项所述的试剂盒，其中所述蛋白酶与所述裂解溶液在分开的容器中提供。

实施方案85：根据实施方案79-84中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括用于收集细胞或组织样品的装置。

实施方案86：实施方案85的试剂盒，其中所述试剂盒包括选自以下的装置：用于进行刮擦、擦拭的装置或装置尖端、用于获得抽吸物的装置或装置尖端、钻取活检装置和用于获得皮肤活检物的刀片。

实施方案87：实施方案86的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于获得细针抽吸物的装置或装置尖端。

实施方案88：实施方案86的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于获得真空辅助抽吸物的装置或装置尖端。

实施方案89：实施方案86的试剂盒，其中所述试剂盒包括用于进行口腔刮擦或妇科刮擦的装置。

实施方案90：实施方案86所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括选自以下的装置：多用压舌板、延长的尖端刮刀、细胞刷、细胞挑针、子宫颈刷、拭子、贝恩刷、轮廓刷、球形抽吸器、Ayre刮刀、和Aylesbury装置。

实施方案91：根据实施方案79-90中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包括被配置为接收细胞或组织样品并在所述裂解溶液或缓冲剂中储存该样品的容器。

实施方案92：实施方案91的试剂盒，其中所述被配置为接收细胞或组织样品的容器被配置用于储存和/或运输。

附图说明

图1图示地举例说明了FFPET 工作流程的一个实施方案。

图2A-2C举例说明了改变裂解溶液的盐度的结果。图2A示出了循环阈值，作为ESR和PGR的NaCl浓度的函数。图2B示出了循环阈值，作为ERBB2和CYFIP1的NaCl浓度的函数。图2C示出了循环阈值，作为MKi67的NaCl浓度的函数。

图3A和3B示出了样品随时间变化的稳定性。图3A示出了储存超过62天的样品的ESR和PGR的稳定性(循环阈值的可重复性)。图3B示出了储存超过62天的样品的ESR和PGR的稳定性(循环阈值的可重复性)。

具体实施方式

福尔马林固定石蜡包埋的组织(FFPET)样品代表了用于疾病(包括但不限于癌症)诊断和预后的最常收集和储存的样品。然而，由于FFPET核酸的质量和数量较差，历史上这些样品未被充分地用于基因表达谱分析的目的。由于产生可扩增的(例如PCR可扩增的)遗传物质需要多个步骤，因此分析来自福尔马林固定石蜡包埋的组织(FFPET)的核酸是具有挑战性的。从FFPET中分离核酸的过程通常涉及石蜡的去除(去蜡)、保存样品的裂解(蛋白酶消化)、在固定过程中获得的交联的逆转以及核酸的基于固相的纯化。

有多种用于提取PCR即用DNA/RNA的样品制备型方法，但大多数是复杂的且劳动密集的。本文所述的组合物和方法克服了这些和其他问题，并提供了可用于快速分离可扩增质量的核酸样品(例如，DNA，RNA)的试剂和方案。所提供的方法是简单的、易于半自动化或全自动化的，并且需要最少的操作时间。核酸以高产率提取并具有PCR可扩增质量。

在某些实施方案中，提供这样的裂解溶液，即其可被用于使用单一溶液并在单一温度下孵育以从石蜡包埋福尔马林固定的样品中提取核酸。与之前用于从组织样品分离核酸的两种缓冲剂/两种温度系统相比，这提供了显著的改进，即简单性、效率和成本。

应当注意的是，虽然下面的讨论集中于FFPE样品，本文所述的裂解试剂及其用途对基本上任何细胞或组织样品(包括但不限于新鲜组织切片、冷冻组织切片、细胞活检物、针抽吸物、细胞按钮、组织微阵列等)都是有效的。

裂解溶液

在某些实施方案中，裂解溶液包括高浓度的钠盐(例如，氯化钠)、足以使溶液的pH维持在范围为约pH 6.5至约pH 7.5(或约pH 6.8至约pH 7.3)的pH的缓冲剂、螯合剂、镁盐(例如MgCl2)和洗涤剂。在某些实施方案中，裂解溶液另外含有消泡剂、和/或防腐剂/杀生物剂、和/或蛋白酶。在某些实施方案中，裂解溶液省略了蛋白酶，其可以在临使用前添加。

裂解溶液的一个示例性但非限制性的实施方案示于表1中。

表1.示例性但非限制性的裂解溶液。

该制剂意为示例性但非限制性的。使用本文提供的教导，本领域技术人员将可获得适用于从组织样品中经1步1种温度提取核酸的其它裂解溶液。

钠盐

在各实施方案中，裂解溶液包括钠盐(NaCl)。在某些实施方案中，钠盐的浓度范围为约300mM至约500mM、或约350mM至最高达约450mM、或约400mM。在某些实施方案中，除了钠盐之外还可使用钙盐(例如，CaCl)，或者可使用钙盐(例如，CaCl)代替钠盐。

缓冲剂

在一些实施方案中，裂解溶液包括将溶液缓冲在范围为约pH 6.5至最高达约pH 7.5的pH的缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂将溶液缓冲在范围为约pH 6.6、或约pH 6.7、或约pH 6.8至最高达约pH 7.5或最高达约pH 7.4、或最高达约pH 7.3、或最高达约pH 7.2的pH。在某些实施方案中，pH被缓冲在pH 7.05(+/-0.1)。

在某些实施方案中，缓冲剂的浓度范围为约10mM至最高达约100mM、或约20mM至最高达约50mM、或约50mM。

在某些实施方案中，用于生物学的多种缓冲剂的任一种都是合适的。这些包括但不限于缓冲剂，例如柠檬酸盐缓冲剂、Tris，磷酸盐、PBS、柠檬酸盐、TAPS、Bicine、Tricine、TAPSO、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲基砷酸(Cacodylate)、SSC、MES等。表2中提供了缓冲剂化合物的示例性但非限制性列表。

表2.可用于裂解溶液的常见缓冲剂

在一个示例性但非限制性的实施方案中，所述缓冲剂是以约50mM存在的HEPES HEPES钠盐(MW 260.29)。

上文描述的各种缓冲剂的目的是示例性而非限制性的。使用本文提供的教导和实例，本领域技术人员将可获得用于根据本文所述的方法的裂解溶液中的许多其他缓冲剂。

螯合剂

如上文指出的，在一些实施方案中，裂解溶液包括一种或多种螯合剂。螯合剂为本领域技术人员所熟知的，并且包括但不限于N-乙酰-L-半胱氨酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、乙二胺-N,N'-二琥珀酸(EDDS)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)和膦酸盐螯合剂(例如包括但不限于次氮基三(亚甲基)膦酸(NTMP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMP)、二亚乙基三胺五(亚甲基)膦酸(DTPMP)、1-羟基亚乙基-1,1-二膦酸(HEDP)等)。在一些实施方案中，螯合剂包含EDTA或DTAP。在一些实施方案中，螯合剂包含EDTA。

在一些实施方案中，当存在时，螯合剂在裂解溶液中存在的浓度范围为约5mM至最高达约200mM、或约10mM至最高达约100mM。在一些实施方案中，螯合剂存在的浓度范围为约10mM、或约20mM、或约30mM、或约40mM至最高达约60mM、或最高达约70mM、或最高达约80mM，或最高达约90mM，或最高达约100mM。在一些实施方案中，螯合剂存在的浓度范围为约50mM。在一些实施方案中，螯合剂为约1mM至最高达约140mM、或约5mM至最高达约100mM、或约10mM至约50mM、或约25mM。

镁盐

在某些实施方案中，裂解溶液含有镁盐。在某些实施方案中，镁盐是MgCl₂。在某些实施方案中，裂解溶液中镁盐的浓度范围为约2mM至最高达约20mM、或约5mM至最高达约15mM、或约10mM。

洗涤剂

如上文指出的，在一些实施方案中，裂解溶液包含一种或多种洗涤剂。在一些实施方案中，洗涤剂包含离子型洗涤剂或非离子型洗涤剂。在一些实施方案中，洗涤剂包含表3中所示的一种或多种洗涤剂。

表3.用于本文所述裂解溶液的一些实施方案中的示例性但非限制性的洗涤剂。

在一些实施方案中，洗涤剂包括Tween 20，全浓度(full strength)。

在一些实施方案中，当存在时，所述洗涤剂在裂解溶液中存在的浓度范围为约5mM至最高达约200mM、或约10mM至最高达约100mM、或约20mM至最高达约50mM、或约30mM至最高达约40mM。在一些实施方案中，洗涤剂为约5mM、或约10mM、或约15mM或约20mM或约25mM至最高达约200mM或最高达约150mM、或最高达约100mM、或最高达约75mM，或最高达约50mM、或最高达约40mM。在一些实施方案中，洗涤剂以约35mM的浓度存在。在一些实施方案中，洗涤剂以约0.5％(v/v)至最高达约30％(v/v)或约1％(v/v)至最高达约20％(v/v)或约5％至最高达约15％(v/v)的百分比存在。在一些实施方案中，洗涤剂包含约0.1％至约2％的所述溶液，或约0.5％至约1.5％的所述溶液，或约1％的裂解溶液。

在一些实施方案中，在本文所述的裂解溶液中使用的洗涤剂不必限于上文所述的洗涤剂。使用本文提供的教导和实例，本领域技术人员将可获得其他洗涤剂。

额外成分

在一些实施方案中，裂解溶液另外包括以下的一种或多种：第二洗涤剂、离液剂(chaotrope agent)和/或还原剂、氯化钙或其它盐、和/或蛋白酶。

蛋白酶

在一些实施方案中，裂解溶液另外包含一种或多种蛋白酶。合适的蛋白酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶，以及其组合。示例性的合适的蛋白酶包括但不限于蛋白酶k(广谱丝氨酸蛋白酶)、枯草菌溶素胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等。

在一些实施方案中，当存在于裂解溶液中时，蛋白酶存在的量可提供的活性为裂解溶液的1U/ml至最高达约200U/ml。在一些实施方案中，所述量提供的活性为裂解溶液的约1U/ml、或约5U/ml、或约10U/ml、或约15U/ml、至最高达约200U/ml、或最高达约100U/ml、或最高达约80U/ml、或最高达约60U/ml、或最高达约40U/ml，或最高达约30U/ml。在一些实施方案中，蛋白酶的量为约0.05至约5mg/ml。在一些实施方案中，蛋白酶的量为约0.1mg/mL、或约0.2mg/mL、或约0.3mg/mL、或约0.4mg/mL、或约0.5mg/mL、或约0.6mg/mL、或约0.7mg/mL、或约0.8mg/mL至最高达约5mg/mL、或最高达约4mg/mL、或最高达约3mg/mL、或最高达约2mg/ml、或最高达约1mg/mL。

在一些实施方案中，本文描述的方法中的裂解溶液不必局限于使用上文所述的蛋白酶。使用本文提供的教导和实例，本领域技术人员将可获得其他蛋白酶。

使用方法

在各实施方案中，提供了本文描述的裂解溶液的使用方法。所述方法的一个实施方案在图1中图示地举例说明。如其中所示，将固定的石蜡包埋的组织样品的一个或多个切片在约50℃至约110℃的温度(通常约80℃的单一温度)下于裂解溶液中孵育。在某些实施方案中，裂解溶液缺少蛋白酶，但是更通常包括蛋白酶(例如蛋白酶K)。

可以从裂解溶液中回收核酸，例如，使用醇萃取(例如，醇沉淀)。该过程导致相对高产量的提取，并产生足够质量的核酸(例如DNA、RNA)用于靶核酸序列的PCR扩增、检测和/或定量。在一些实施方案中，孵育持续最高达约3小时的时间。然而，在典型的实施方案中，孵育可以为约15、20或30分钟至最高达约1小时。如上文所述，在一些实施方案中，不需要蛋白酶。类似地，在一些实施方案中，所述方法不包括进一步的脱蜡步骤和/或用于脱蜡的额外试剂。在一些实施方案中，所述方法不使用用于脱蜡的有机溶剂和/或所述孵育不是在存在有机溶剂的情况下进行。因此，所述方法是快速的、简单的、并且易于进行自动化和高通量方法学。

使用本文描述的方法和试剂提取的核酸具有良好的质量，可容易地被扩增，以检测和/或定量样品中的一种或多种靶核酸序列。核酸与许多扩增方法中的任一种相容，所述方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)(参见例如Innis et al.(1990)PCR Protocols.A guide to Methods and Application.Academic Press,Inc.San Diego)(包括RT-PCR)、连接酶链式反应(LCR)(参见，例如，Wu and Wallace(1989)Genomics 4:560；Landegren et al.(1988)Science 241:1077；Barringer et al.(1990)Gene 89:117)、转录扩增(参见例如Kwoh et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA_86:1173)、自我维持的序列复制(参见例如Guatelli et al.(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87:1874)、点PCR、连接接头(linker adapter)PCR等。

此外，一个令人惊讶的发现是，与各种市售裂解系统相比，根据使用本文所述的材料(尤其是使用本文所述的裂解溶液)的方法处理的样品(参见，例如，表1)给出更早的Ct结果，有时优于2Ct、或优于3Ct或优于4Ct。

另外，进行裂解产物的稳定性研究，其中在预定的试验日期将FFPE细胞按钮和FPE患者样品裂解、与乙醇混合、然后储存于-20℃(参见，例如，实施例1，实验G，进行至第62天，和图3A和3B)。在一个实验中，对于所有目标，在62天过程中观察到了62天的一致循环阈值。因此，可以测量从原始裂解卷轴(scroll)的多次拉动，以进行重复试验(如果需要)或反射盒试验。

虽然在某些实施方案中，提取的核酸在扩增反应中使用，其它用途也是可想到的。因此，例如，提取的核酸(或其扩增产物)可用于各种杂交方案，包括但不限于基于核酸的微阵列。在一些实施方案中，任何基于核酸的微阵列可以与本文所述的方法一起使用。这样的微阵列包括但不限于可商购的微阵列，例如可从Affymetrix,Inc.(Santa Clara，CA)、Agilent Technologies,Inc.(Santa Clara，CA)、Illumina,Inc.(San Diego，Calif.)、GE Healthcare(Piscataway，NJ)、NimbleGen Systems,Inc.(Madison，WI)、Invitrogen Corp.(Carlsbad，Calif.)等获得的微阵列。

因此本文所述的方法和试剂适用于旨在发现与疾病诊断和预后相关的基因表达特征的基础研究。所述方法也适用于疾病的诊断和/或预后、确定具体的治疗方案、监测治疗效果等。在一些实施方案中，所述方法也适用于其中核酸质量差的其他领域，例如法医学、考古学、医学史、古生物学等。鉴于本文提供的教导和方案，本领域技术人员将容易认识到这些和其他应用。

样品

使用本文所述的方法，可以从任何生物样品中分离DNA和/或RNA。这样的样品包括但不限于新鲜样品或细胞/组织抽吸物、冷冻切片、针吸活检物、细胞培养物、固定组织样品、细胞按钮、组织微阵列等。所述方法特别适合用于固定的石蜡包埋的组织(例如FFPET)样品。虽然组织学样品通常是用醛固定剂例如福尔马林(甲醛)和戊二醛来固定，但认为本文所述的方法额外地与使用其它固定技术(例如醇浸泡等)固定的组织一起工作。

示例性的样品包括但不限于，来自人体组织、实验室动物组织、伴侣动物组织、或家畜动物组织的FFPET样品。因此，例如，样品包括来自人的组织样品，包括但不限于来自健康人的样品(例如健康人组织样品)、来自患病受试者和/或患病组织的样品、用于诊断和/或预后测定的样品等。合适的样品还包括来自非人动物的样品。例如来自非人灵长类动物的FFPET样品可以在本文描述的方法中使用，例如黑猩猩、大猩猩、猩猩、长臂猿、猴、猕猴、狒狒、白眉猴(mangabey)、疣猴、叶猴、狨猴、狐猴、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、仓鼠、猫狗、白鼬、鱼、牛、猪、绵羊、山羊、马、驴、鸡、鹅、鸭、火鸡、两栖动物或爬行动物。

此外，任何年龄的FFPET样品可用于本文所描述的方法，其包括但不限于新鲜的FFPET样品、小于一周、小于两周、小于一个月、小于两个月、小于三个月、小于六个月、小于九个月、小于一年、至少一年、至少两年、至少三年、至少四年、至少五年、至少六年、至少七年、至少八年、至少九年、至少十年、至少十五年、至少二十年或时间更长的FFPET样品。

在一些实施方案中，本文所述的方法是对取自固定的包埋的组织样品(例如，FFPET样品)的一个或多个切片进行。这些切片可以具有任何所需的厚度。因此，在一些实施方案中，考虑到了薄切片和厚切片，包括但不限于小于1微米厚、约1微米厚、约2微米厚、约3微米厚、约4微米厚、约5微米厚、约6微米厚、约7微米厚、约8微米厚、约9微米厚、约10微米厚、约15微米厚或约20微米厚的切片，这取决于所需的应用。在某些应用中，切片可以是例如最高达约1微米厚、最高达约2微米厚、最高达约3微米厚、最高达约4微米厚、最高达约5微米厚、最高达约6微米厚、最高达约7微米厚、最高达约8微米厚、最高达约9微米厚、最高达约10微米厚、最高达约15微米厚、最高达约20微米厚或最高达约25或30微米厚。在一些实施方案中，这些切片可以由一系列尺寸限定，包括但不限于约1微米至约5微米厚、约1微米至约20微米厚、约1微米至约10微米厚、或约5微米至约10微米厚。

在许多情况下，固定的包埋的组织样品(例如，FFPET样品)包括患病组织(例如肿瘤或其他癌性组织)的区域。尽管这样的FFPET样品可用于本文所述的方法中，但是不包含患病组织区域的FFPET样品(例如来自正常的、未处理的，安慰剂处理的或健康组织的FFPET样品)也可用于本文所述的方法中。在本文所述方法的一些实施方案中，在如本文所述分离核酸之前，在FFPET样品或其一个或多个切片中鉴定所期望的患病区域或组织、或包含特定组织中的特定部位、特征或结构的区域，以增加从所需区域获得的核酸的百分比。可以使用本领域技术人员已知的任何方法来鉴定这样的部位或区域，这些方法包括但不限于肉眼鉴定、染色(例如苏木精和曙红染色)、免疫组织化学标记等。无论如何，在一些实施方案中，组织样品或其切片的所需区域可以通过宏观切割或显微切割来切割，以使用本文所述的方法获得用于分离核酸样品的起始材料。

尽管，在某些实施方案中，本文所述的裂解试剂和方法特别适合用于福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)样品，但是应当理解的是，所述试剂和方法需要被限制为用于这样的样品。例如，在某些实施方案中，本文所述的裂解试剂和方法可以用于整个细胞，其例如涂布在载玻片上作为涂片。在某些实施方案中，涂片来源于细针抽吸物。涂片可以是与FNA相关联的载体，其中将吸出的样品涂抹到载玻片上作为涂片。可以将细胞染色以进行肉眼观察，但是也可以不将它们染色，并简单地使其风干。在某些实施方案中，可以将这些未染色的涂片细胞从载玻片上刮下并与本文所述的裂解试剂和方法一起使用。

在另一个示例性但非限制性的方法中，细针抽吸物细胞可被直接注入裂解试剂。样品可以继续裂解过程。在某些实施方案中，可以将样品(在裂解试剂中)运送到其中可以完成分析过程的不同位置。在某些实施方案中，细针抽吸样品也可以被制成FFPE细胞按钮。

细针抽吸物的使用提供了避免制备福尔马林固定石蜡包埋的样品的繁琐的过程的方法并可显著加速测试过程。这种方法在世界的发展中地区可能非常有用。

另外，对于细针抽吸物，还将理解的是，所述试剂(例如，裂解溶液)和其使用方法易于与基本上任何细胞收集方法一起使用。这样的方法包括但不限于刮擦物(例如，口腔刮擦、妇科刮擦、咽喉刮擦、外科手术过程中的刮擦等)、擦拭物(例如使用棉签获得的)和抽吸物，包括但不限于真空辅助活检物。

在某些示例性但非限制性的实施方案中，样品包括来自癌症的包含细胞的患病区域或组织。在一些实施方案中，癌症包括选自以下的癌症：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症(例如卡波西肉瘤、淋巴瘤)、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎/横纹肌样瘤、胆管癌、肝外癌、膀胱癌、骨癌(例如尤因肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤)、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤(例如，星形细胞瘤、脑和脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤(例如，儿童、胃肠的)、心脏肿瘤、子宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、结直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、导管癌例如(胆、肝外)、导管原位癌(DCIS)、胚胎性肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(例如眼内黑色素瘤、成视网膜细胞瘤)、骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、胆囊癌、胃(胃)癌、胃肠类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤(例如卵巢癌、睾丸癌、颅外癌、性腺外癌、中枢神经系统)、妊娠滋养细胞肿瘤、脑干癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、组织细胞增多症、朗格汉斯细胞癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌瘤、卡波西肉瘤、肾癌(例如肾细胞、肾母细胞瘤和其他肾肿瘤)、朗格汉斯细胞组织细胞增多症、喉癌、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞性白血病(CML)，毛细胞、唇和口腔癌，肝癌(原发)、原位小叶癌(LCIS)、肺癌(例如儿童的、非小细胞、小细胞)、淋巴瘤(例如AIDS相关的、伯基特(例如非霍奇金淋巴瘤)、皮肤T细胞(例如蕈样霉菌病、塞扎里综合征)、霍奇金、非霍奇金、原发性中枢神经系统(CNS))、巨球蛋白血症、瓦尔登斯特伦病、男性乳腺癌、骨的恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、黑色素瘤(例如儿童的、眼内(眼))、默克尔细胞癌、间皮瘤、转移性鳞状颈癌、中线道癌(medline tract carcinoma)、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样霉菌病、骨髓增生异常综合征、慢性骨髓性白血病(CML)、多发性骨髓瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、唇和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞瘤)、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、原位中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌，肾盂和输尿管移行细胞癌，横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(例如尤因、卡波西、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、软组织、子宫)、塞扎里综合征、皮肤癌(例如黑色素瘤、默克尔细胞癌、基底细胞癌、非黑色素瘤)、小肠癌、鳞状细胞癌、隐匿性原发性鳞状颈癌(squamous neck cancer with occult primary)、胃(胃)癌、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、滋养细胞肿瘤、输尿管和肾盂癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症( macroglobulinemia)、肾母细胞瘤等。

应当认识到，本文描述的方法被认为与基本上任何固定的(例如，福尔马林固定、戊二醛固定等)石蜡包埋的组织样品相容。这样的样品包括但不限于活检物和细针抽吸物和存档样品(例如组织微阵列)等。

加热

在一些实施方案中，在裂解溶液中加热一个或多个组织切片。就此而言，应注意的是，在使用较薄切片的情况下，可能并可以期望使用多个切片(例如，至少2个切片、或至少3个切片、或至少4个切片、或至少5个切片或至少6个切片、或至少7个切片、或至少8个切片、或至少9个切片、或至少10个切片)。特别是在切片厚度为5μm或更小的情况下，可能需要多个切片。

在一些实施方案中，在约40℃至最高达约110℃的温度下在裂解溶液中加热切片。在一些实施方案中，在从约40℃、或从约45℃、或从约50℃、或从约55℃、或从约60℃、或从约65℃、或从约70℃、或从约74℃至最高达约110℃、或最高达约100℃、或最高达约95℃、或最高达约90℃的温度范围内加热切片。在一些实施方案中，在约80℃至约90℃的温度范围内加热所述切片。在某些实施方案中，在80℃下加热。

在一些实施方案中，孵育时间为约10分钟至最高达约4小时。在一些实施方案中，孵育时间为从约10分钟、或从约15分钟、或从约20分钟、或从约25分钟、或从约30分钟至最高达约24小时、或最高达约12小时、或最高达约6小时、或最高达约4小时、或最高达约3.5小时、或最高达约3小时、或最高达约2.5小时、或最高达约2小时、或最高达约1.5小时或更最高达约1小时。在一些实施方案中，孵育时间在约30分钟至最高达约1小时的范围内。

在一个示例性但非限制性实施方案中，在约80℃的温度下在裂解溶液(例如，如表1中所示的溶液)中孵育(加热)一个或多个切片约60分钟。在另一个示例性但非限制性的实施方案中，在约90℃的温度下在裂解溶液(例如，表1所示的溶液)中孵育(加热)一个或多个切片约30分钟。

这些加热温度和时间是示例性的，并不旨在进行限制。使用本文提供的教导，技术人员可以在特定的时间和温度下优化用于特定样品类型的方案。

核酸回收

在裂解溶液中加热所述组织切片后，可回收提取的核酸(例如，DNA、RNA)。许多用于DNA和/或RNA回收的方法是本领域技术人员已知的。

在一些实施方案中，将核酸沉淀和/或结合到固体基质上。通过使用醇(例如低级醇，例如C₁-C₆醇)，可容易地完成沉淀和/或与基质的结合。在一些实施方案中，醇是乙醇或异丙醇。在一些实施方式中，醇是乙醇。应该认识到，在一些实施方案中，可以使用无水醇。

在一些实施方案中，醇被用来简单地沉淀核酸。在一些实施方案中，在存在相容的固相的情况下使用醇沉淀所述核酸，导致核酸结合到所述固相上。

例如，在一些实施方案中，醇处理是在存在玻璃或纤维素基质的情况下进行，使核酸与所述基质结合。可洗去剩余的污染物，同时保留随后准备用于扩增或其他用途的回收的核酸。

在一些实施方案中，固相包括玻璃、二氧化硅、或纤维素。固相可以由容器的壁、作为纤维(例如玻璃纤维)、作为膜(例如纤维素膜)，以小珠(例如微粒或纳米粒子等)的形式等等提供。

在某些实施方案中，核酸回收可以在盒中进行，例如如下所述。

提取的DNA和/或RNA的示例性用途

使用本文描述的方法和试剂提取的核酸具有良好的质量，可容易地被扩增，以检测和/或定量样品中的一种或多种靶核酸序列。所述核酸特别适合于PCR扩增反应，包括但不限于RT-PCR。虽然在一些实施方案中，提取的核酸用于扩增反应，但也考虑到了其他用途。因此，例如，提取的核酸(或其扩增产物)可用于各种杂交方案，包括但不限于基于核酸的微阵列。

本文描述的核酸提取方法和试剂可应用于旨在发现与疾病诊断和预后相关的基因表达特征的基础研究。所述方法也适用于疾病的诊断和/或预后、确定具体的治疗方案、监测治疗效果等。

本文描述的方法简单且有效地产生非常适用于RT-PCR系统的提取的核酸。虽然它们可以用于任何这样的系统中，但是在一些实施方案中，如本文实施例中所示，核酸特别适合用于盒和系统(Cepheid Systems Inc.)。

所述系统是一个封闭的、自包含的、完全集成的和自动化的平台，它表示分子分析的自动化中的模式转变，以最小的污染风险且及时的方式产生准确的结果。系统将使用实时PCR(聚合酶链式反应)扩增的机载(on-board)(盒中)样品制备与检测功能结合在一起，以在盒(盒)中进行完全集成和自动化的核酸分析。所述系统被设计成纯化、浓缩、检测和鉴定靶核酸序列，从而递送直接来自样品的答案(参见例如美国专利号5,958,349、6,403,037、6,440,725、6,783,736和6,818,185，每一篇均通过引用的方式全文纳入本文)。在各实施方案中，盒的组件可包括但不限于包含试剂的处理室、过滤器以及用于提取、纯化和扩增靶核酸的捕获技术。阀使得能够将流体从一个室转移到另一个室并含有核酸裂解和过滤组分。光学窗口能够实时地进行光学检测(例如，PCR扩增产物)。可以提供允许非常快速的加热和/或热循环的反应管。

在某些实施方案中，示例性的盒包括排列在中央阀组件的周围并且选择性地与所述中央阀组件的流体连通的多个室，其中配置所述中央阀组件以适应柱塞(plunger)，所述柱塞能够将流体引入或引出与所述中央阀处于流体连通的室。阀组件的旋转决定了哪个室与中央阀处于流体连通中。

因此，在一些实施方案中，提供了用于鉴定和/或定量测量固定的石蜡包埋的组织样品中的靶核酸序列的方法(任选地利用盒和系统)。在一些实施方案中，所述方法包括根据本文所述的任何提取方法从固定的石蜡包埋的生物组织样品中提取核酸(例如，DNA、RNA)，使用能够扩增靶核酸的区域的寡核苷酸引物对来对提取的核酸进行扩增，以获得扩增的样品；并确定靶核酸的存在和/或数量。在一些实施方案中，靶核酸是DNA(例如，基因)。在一些实施方案中，靶核酸是RNA(例如，mRNA，非编码RNA等)。

在一些实施方案中，使用本文所述的方法提取的核酸非常适合用于诊断方法、预后方法、监测治疗(例如癌症治疗)的方法等。因此，在一些示例性但非限制性的实施方案中，从固定的石蜡包埋的样品(例如从FFPET样品)中提取的核酸可用于鉴定基因的存在和/或表达水平、和/或基因的突变状态。

这样的方法特别适合于鉴定一种或多种癌症标记物的存在、和/或表达水平、和/或突变状态。因此，在一些实施方案中，使用本文所述的方法提取的核酸被用于检测一种或多种癌症标记物的存在和/或拷贝数量、和/或表达水平和/或突变状态。表4中示出了示例性但非限制性的癌症标记物。

表4.示例性但非限制性的癌症标记物和相关用途。

在一些实施方案中，靶核酸包括在美国专利公开号2012/0171686和2009/0062135(通过引用的方式将它们所列的靶核酸序列纳入本文)中描述的微小RNA。在一些实施方案中，靶核酸包含用于肺癌的存在和/或严重性和/或预后的核酸标记物。在一些实施方案中，靶核酸包含美国专利公开号2010/0233704中描述的用于肺癌(例如，非小细胞肺癌)的靶核酸标记物，通过引用的方式将其所列的靶核酸序列纳入本文。在一些实施方案中，靶核酸包含用于宫颈癌和/或宫颈发育不良的存在和/或严重性和/或预后的核酸标记物。在一些实施方案中，靶核酸包含美国专利公开号2010/0240049中描述的用于宫颈发育不良和/或宫颈癌的靶核酸标记物，通过引用的方式将其所列的靶核酸序列纳入本文。

前述的靶核酸是示例性和非限制性的。使用本文提供的教导，本领域技术人员将可获得许多其它靶核酸序列。

在一些实施方案中，每个靶核酸(例如RNA)的正常水平(“对照”)可确定为正常细胞或其他参照材料的特征性的平均(或中位)水平或范围，可将其与样品中测量的水平相比较。可以将正常受试者中靶核酸(例如RNA)的测定平均值(或中值)或范围用作检测超过正常水平的靶RNA的基准，所述靶RNA指示疾病状态(例如，癌症的存在或倾向)。在一些实施方案中，可以使用来自一个或多个个体的个体或混合的含RNA样品(例如在宫颈癌的情况下，来自接受用于良性妇科疾病的子宫切除术的患者)来确定靶核酸的正常水平。

在一些实施方案中，确定靶核酸(例如，RNA)表达的正常水平包括检测包含杂交到核酸(选自靶RNA、靶RNA的DNA扩增子、靶RNA的互补序列)的探针的复合物。也就是说，在一些实施方案中，可以通过检测靶RNA的DNA扩增子或靶RNA的互补序列而不是靶RNA自身来确定正常的表达水平。在一些实施方式中，确定这种复合物的正常水平并将其用作对照。在一些实施方案中，所述复合物的正常水平与靶RNA的正常水平相关。

在一些实施方案中，对照包括来自单个个体的细胞(已知是来自同一受试者的健康细胞)的RNA。在一些实施方案中，对照包含来自多个个体的细胞混合物的RNA。在一些实施方案中，从获得测试样品的个体的解剖学和/或细胞学正常区域获取对照。在一些实施方案中，对照包含可商购的人RNA，例如在宫颈癌的情况下，人宫颈总RNA(Ambion；AM6992)。在一些实施方案中，正常水平或正常范围已经在测试样本的水平升高之前被预先确定。

在一些实施方案中，靶RNA的正常水平可以从一个或多个连续的细胞系来确定，通常是先前显示出具有与正常细胞中表达水平相似的至少一种靶RNA的表达水平的细胞系。

在一些实施方案中，一种方法包括：检测至少一种靶RNA的表达水平。在一些实施方案中，一种方法进一步包括将至少一种靶RNA的表达水平与所述至少一种靶RNA的正常表达水平进行比较。在一些实施方案中，一种方法进一步包括将至少一种靶RNA的表达水平与所述至少一种靶RNA的对照表达水平进行比较。在一些实施方案中，所述至少一种靶RNA的对照水平是所述至少一种靶RNA在正常细胞中的表达水平。在一些这样的实施方案中，对照水平可称为正常水平。在一些实施方案中，与正常细胞中至少一种靶RNA的表达水平相比，至少一种靶RNA的更高的表达水平指示宫颈发育不良。

在一些实施方案中，所述至少一种靶RNA的表达水平来自例如已确认的肿瘤的参照表达水平对比。在一些这样的实施方案中，与参照样品相比，所述至少一种靶RNA的相似的表达水平指示肿瘤的存在。

在一些实施方案中，至少一种靶RNA的表达水平比各自至少一种靶RNA的正常表达水平高至少约2倍，指示疾病状态的存在(例如，癌症)。在一些实施方案中，至少一种靶RNA的表达水平比由正常细胞组成的对照样品中各自至少一种靶RNA的水平高至少约2倍，指示癌症的存在。在一些实施方案中，至少一种靶RNA的表达水平比由正常细胞组成的对照样品中各自至少一种靶RNA的表达水平高至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍，指示癌症的存在。在一些实施方案中，至少一种靶RNA的表达水平比至少一种靶RNA的正常表达水平高至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍或至少约10倍，指示癌症的存在。

在一些实施方案中，例如在相同的测定法或分批测定中，靶RNA的对照表达水平同时确定为样品中的靶RNA的表达水平。在一些实施方案中，靶RNA的对照表达水平不是同时确定为样品中靶RNA的表达水平。在一些这样的实施方案中，先前已经确定了对照表达水平。

在一些实施方案中，靶RNA的表达水平不与对照表达水平进行比较，例如，当已知正常细胞中靶RNA的表达水平非常低，或者根本未表达时。在这样的实施方案中，样品中靶RNA的高水平的检测指示癌症。

试剂盒

在某些实施方案中，提供了用于从细胞和/或组织样品中提取核酸的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒通常将包括含有如本文所述的裂解溶液的容器。在某些实施方案中，试剂盒进一步包括含有蛋白酶(例如，蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶等)的容器。在某些实施方案中，蛋白酶和裂解溶液混合在一起。在某些实施方案中，蛋白酶和裂解溶液在分开的容器中提供。

在某些实施方案中，试剂盒还可以包括用于收集细胞或组织样品的装置。示例性的装置包括但不限于选自以下的装置：用于进行刮擦、擦拭的装置或装置尖端、用于获得抽吸物的装置或装置尖端、钻取活检装置、和用于获得皮肤活检物的刀片。例如，在某些实施方案中，试剂盒包括用于获得细针抽吸物和/或用于获得真空辅助抽吸物的装置或装置尖端。在某些实施方案中，试剂盒包括用于进行口腔刮擦或妇科刮擦的装置。示例性的装置包括但不限于多用压舌板、延长的尖端刮刀、细胞刷、细胞挑针、子宫颈刷、拭子、贝恩刷、轮廓刷、球形抽吸器、Ayre刮刀、和Aylesbury装置等。在典型的实施方案中，用于收集细胞或组织样品的装置被提供在包装中，其在使用之前保持样品收集装置的无菌性。

在某些实施方案中，试剂盒可以包括被配置成接收细胞或组织样品并在所述裂解溶液或缓冲剂中储存该样品的容器。在某些实施方案中，被配置为接收细胞或组织样品的容器被配置为用于储存和/或运输。因此，在某些实施方案中，所提供的被配置为接收细胞或组织样品的容器具有标签以识别样品，并且在某些实施方案中，具有可密封包装以在储存和/或运输期间保持所述容器和/或运输容器。

在某些实施方案中，试剂盒可任选地进一步包括无菌拭子(例如，酒精棉签)用于清洗样品部位，和/或干燥垫(例如，纱布垫)用于干燥所述部位，和/或敷料(例如绷带)用于在获得样品后敷裹所述部位。

在某些实施方案中，用于单次收集操作的组分被一起包装在包装中。这样的包装可以包括例如一次性使用的一次性样品装置、任选的无菌拭子、任选的干燥垫以及任选的敷料。在某些实施方案中，试剂盒包括至少2个包装、或者至少3个包装、或者至少4个包装、或者至少5个包装、或者至少6个包装、或者至少7个包装、或者至少8个包装。

在某些实施方案中，试剂盒可以进一步包含说明材料，其教导使用试剂盒组分的收集方法，以及任选地，提供指导以克服收集期间可能出现的问题。说明材料还可以包括关于裂解试剂的使用的信息和/或说明，和/或用于细胞或组织样品的收集、和/或储存，和/或运输的说明。在某些实施方案中，试剂盒另外含有试剂和/或教导使用裂解缓冲剂来分离和回收核酸的说明。

通常和典型地，说明材料是以书面形式提供，并且可以印刷在试剂盒组分本身上(例如盒子、容器的盖上，封皮上，或者可以作为插入/说明页或小册子来提供)。尽管说明材料通常包括书面或印刷材料，但它们并不限于此。本发明考虑到了能够储存这样的说明并将它们传达给最终用户的任何介质。这样的介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如CD ROM)等。这样的介质可以包括提供这种说明材料的互联网站点的地址。

实施例

提供以下实施例以举例说明但非限制要求保护的发明。

实施例1

从福尔马林固定石蜡包埋的组织中提取核酸的裂解溶液参数的检验

实验A：

目标：使用测试缓冲剂进行蛋白酶K处理，然后在患者015445T2上进行修改的FFPE裂解。

样品：FFPE患者载玻片(4)，015445T2。4μm厚，应用于玻璃载玻片上。

IHC/FISH：ER：丰富，PR：丰富，HER2：扩增。

表5.结果。

实验B：

目标：在Pt 015445T2载玻片上用0.01％乳液代替消泡剂测试FFPE裂解试剂。

样品：FFPE患者载玻片，015445T2。4um厚，应用于玻璃载玻片。

IHC/FISH：ER：丰富，PR：丰富，HER2：扩增。

表6.结果。

实验C：

目标：优化在非机载(off board)裂解期间(加热步骤之前)添加的PK的量。

样品Alamak FFPE细胞按钮，BT474。

表7.结果。

实验D，不同的NaCl浓度A：

表8.结果—NaCl浓度的影响

图2A示出了ESR和PGR的循环阈值，作为NaCl浓度的函数。图2B显示ERBB2和CYFIP1的循环阈值，作为NaCl浓度的函数。图2C显示MKi67的循环阈值，作为NaCl浓度的函数。

实验E，不同的NaCl浓度B：

目标：用m3FFPE、m3cFFPE、m3dFFPE和m3eFFPE裂解制剂处理BT474细胞按钮样品。

样品：BT474FFPE细胞按钮，切割并储存在4℃。4μm厚，应用于玻璃载玻片。

设置：

每个载玻片均被转移至带标签的1.5mL试管。

1.2mL的每种指定裂解试剂被加入到其试管中。

20μL蛋白酶K被添加到每个样品中。

将样品涡旋5秒，然后在80℃下孵育30分钟。

将样品涡旋5秒，并进行脉冲离心。

将每个样品转移到含1.2mL的100％乙醇的带标签的5mL小瓶中。

将每个样品涡旋至少15秒。

用室11中的反应小珠和室2和5中的液体试剂来制备盒A的NGB。

将来自每个样品的4个520μL等分试样转移到他们指定的盒中的室3中。

所有的盒均使用140421Strat+2X超声处理ADF运行。

表9.结果。

实验F，不同的消泡剂浓度。

目标：用具有不同的消泡剂浓度的m3f FFPE裂解试剂处理BT474FFPE细胞按钮。

样品：BT474FFPE细胞按钮。载玻片4μm厚，应用于玻璃载玻片。

设置：

每个载玻片均被转移至带标签的1.5mL试管。

1.2mL的每种指定裂解试剂被加入到其试管中。

将样品涡旋5秒，然后在80℃下孵育30分钟。

将样品涡旋5秒，并进行脉冲离心。

将每个样品转移到含1.2mL的100％乙醇的带标签的5mL小瓶中。

将每个样品涡旋至少15秒。

用室11中的反应珠和室2和5中的液体试剂来制备盒A的NGB。

将每种测试条件的4个520μL等分试样转移到他们指定的盒中的室3中。

所有的盒均使用140421Strat+2X超声处理ADF运行。

表10.结果：

实验G，样品稳定性研究：

另外，进行裂解产物的稳定性研究，其中在预定的测试日期裂解FFPE细胞按钮和FPE患者样品，与乙醇混合，然后在-20℃下储存(参见，例如，下表11和图3A和3B)。

表11.稳定性研究结果。

图3示出储存超过62天的样品的ESR和PGR的稳定性(可重复循环阈值)。图3B示出储存超过62天的样品的ESR和PGR的稳定性(可重复循环阈值)。

实验H，组织微阵列的分析：

目标：在Stratifier测定法中测试载玻片1的芯(core)(来自Yale的TMA30块)。

测试样品：单个载玻片上的30个芯，来自Yale的TMA块。载玻片YTMA 308-1，乳腺ER，1-29-15，载玻片1。载玻片切割为4μm厚。

表12.结果：

表13.结果：

表14.结果：

应当理解，本文所描述的实施例和实施方案仅用于举例说明的目的，基于它们的各种修饰或改变将被本领域技术人员想到，并且被包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请均以引用的方式全文纳入本文用于所有目的。