阿尔茨海默病(ad)作为痴呆症的主要病因，在65-69岁之间的人群中有1％的发病率，95岁及以上的人群中发病率增加到40-50％。ad患者表现出的警示性的临床症状包括认知损害和记忆功能缺陷。在这些患者中，ad的存在是通过死后的组织病理学检查发现在大脑皮层中存在大量的老年斑块负荷和神经原纤维缠结(nft)而证实。成熟的老年斑块是由淀粉样蛋白前体蛋白的酶促处理产生的细胞外β-淀粉样肽和衍生自过度磷酸化的tau蛋白的细丝的细胞内神经原纤维缠结(nft)组成。过度磷酸化的tau的聚集体，例如神经原纤维缠结，与阿尔茨海默病中的认知损害程度有关。在ad和各种其它tau病变中，tau聚集体出现在与疾病风险、发作和/或进展有关的特定脑区域和模式中，并且这些区域和模式是技术人员已知的。在ad患者中，含tau的缠结首先出现在与记忆紧密相关的脑区域，且病理学研究表明缠结可能相比斑块而言与认知能力的相关性更强。技术人员可以使用这些区域和模式中由tau成像剂产生的信号来更好地监测和诊断所述特定疾病状态的风险、发作和进展。(参见correlationofalzheimerdiseaseneuropathologicchangeswithcognitivestatus:areviewoftheliterature.nelsonpt等人,jneuropatholexpneurol.2012may；71(5):362-81.)因此，迫切需要寻求用于检测和/或定量患者tau沉积物的简单无创方法。(参见m.maruyama等人,“imagingoftaupathologyinatauopathymousemodelandinalzheimerpatientscomparedtonormalcontrols”,neuron,79:1094-1108,2013,c.mathisandw.klunk,“imagingtaudepositsinvivo:progressinviewingmoreoftheproteopathypicture”,neuron,79:1035-10-37,2013)。
用于tau的pet成像的现有试剂在本领域是已知的，例如wo2009/102498所述的试剂，以及最近在临床评估中的化合物[18f]t807(也称为av-1451)，其在wo2013/176698中所述。(还参见[(18)f]t807,anoveltaupositronemissiontomographyimagingagentforalzheimer'sdisease.xiacf等人,alzheimer’sdement.2013nov；9(6):666-76.)
然而，现有的tau成像化合物具有可以通过设计创新试剂来改进的技术性质，所述创新试剂可提供增强的tau成像，具有改善的tau信号和最小化的非tau信号。因此，非常需要用于检测和/或定量患者中的tau的改进方法。
使用改进的成像剂对脑部进行tau成像有几个潜在的好处。增强的tau成像将通过识别潜在患者(脑中具有高水平tau，可能具有增加的发生ad机会的那些患者)从而改善诊断。用改进的pet剂进行成像也可用于监测tau的蓄积和定位，和/或ad和/或其它tau病变的进展，并且当抗tau的药物治疗变得可用时，tau成像可以提供监测治疗的基本工具。
本发明提供了用于tau成像的新化合物、组合物、制剂和方法。因此，还需要改进技术增强患者中的tau成像的能力，以提升诊断tau成像的临床益处和影响。与已知试剂相比，改进的成像剂将提供改善的tau成像，产生由于强的tau信号和减少的非tau信号而更清晰的图像。
本发明提供了化合物3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶，本文还称为“化合物8”，其结构可以通过式i化合物代表：
本发明还提供了化合物3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶，本文还成为“化合物4”，其结构可以通过式ii化合物代表：
本发明进一步提供了式i化合物和/或式ii化合物和/或其混合物用于制备tau成像剂和用于taupet成像的用途。
本发明进一步提供了用于制备式i化合物或式ii化合物的中间体。本发明提供由式7化合物制备的式ii的化合物(表示为下文化合物8)：
本发明还提供由式ia或式ib化合物制备的式i化合物。本发明的优选物质是式ia的化合物。
本发明另一种优选的物质是式ib化合物：
本发明提供式i、ia、ib或ii的化合物用于制备用来在人中对tau进行成像的放射性药剂的用途。另一方面，本发明提供了制备式i、ia、ib或ii的化合物的方法。另一方面，本发明提供了由式ia或ib化合物制备化合物8的方法。特别优选的是由式ia化合物制备化合物8或其可药用盐的方法。另一方面，本发明提供了包含化合物8或其可药用盐和可药用稀释剂或载体的药物组合物。另一方面，本发明提供了药物组合物，所述组合物包含化合物8或其可药用盐，以及化合物4或其可药用盐，以及可药用稀释剂或载体。另一方面，本发明提供了药物组合物，所述组合物包含化合物8或其可药用盐，其配制在10％etoh(v/v)、0.45％(w/v)抗坏血酸钠在0.9％氯化钠溶液中的溶液中，优选用于人。另一方面，本发明提供了药物组合物，所述组合物包含化合物8或其可药用盐，其由式ia或ib化合物制备，配制在10％etoh(v/v)、0.45％(w/v)抗坏血酸钠在0.9％氯化钠溶液中的溶液中，优选用于人。本发明还提供了tau成像方法，包括将可检测的量的(优选由式ia或ib化合物制备的)化合物8或其可药用盐或其组合物引入患者。
本发明提供了制备式i化合物的方法：
包括将用下式代表的4-甲基苯磺酸1-(8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)氮杂环丁烷-3-基酯：
与[18f]氟化物来源反应。
本发明提供了制备式i化合物的方法：
包括将式ib化合物：
与[18f]氟化物来源反应。
本发明提供了tau成像的方法，包括：将可检测的量的下述化合物引入哺乳动物：
使所述化合物与tau有足够的时间结合，和
检测所述化合物。
提供以下流程、制备和实施例以更好地阐明本发明的实施。这些流程、制备和实施例的步骤的合适反应条件在本领域中是公知的，并且反应条件的适当改变(包括溶剂和共反应剂的替换)在本领域技术人员能力范围内。
此外，本领域技术人员将认识到，在某些情况下，引入部分的顺序并不重要。制备式i或式ii化合物所需的步骤的具体顺序取决于所合成的特定化合物、起始化合物和取代部分的相对不稳定性，这是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员将认识到并非所有取代基都与所有反应条件相容。这些化合物可以通过本领域众所周知的方法在合成中的方便位点进行保护或修饰。如果需要，本发明的中间体和最终产物可以通过常规技术如重结晶或在固体载体如硅胶或氧化铝上的色谱法进一步纯化。
本发明的化合物优选配制成通过各种途径给药的放射性药物组合物。优选地，这样的组合物用于静脉内使用，优选用于人。这类药物组合物及其制备方法在本领域中是公知的。参见例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy(p.p.gerbino,第21版,lippincottwilliams&wilkins,2006)。使用tau成像剂用于taupet成像的方法是本领域技术人员已知的。参见例如[(18)f]t807,anoveltaupositronemissiontomographyimagingagentforalzheimer'sdisease.xiacf等人,alzheimer’sdement.2013nov；9(6):666-76.)。[(18)f]t807也称为[18f]av-1451。
本发明的优选制剂是由式ia化合物制备的化合物8的制剂。特别优选的是根据流程2的本文所述的方法由式ia化合物制备的化合物8。特别优选的是根据实施例2的本文描述的方法由式ia化合物制备的化合物8。化合物8的优选制剂配制在10％etoh(v/v)、0.45％(w/v)抗坏血酸钠在0.9％氯化钠溶液中的溶液中，优选用于人。本发明的另一个实施方案是由式ia化合物制备并配制在10％etoh(v/v)、0.45％(w/v)抗坏血酸钠在0.9％氯化钠溶液中的溶液中的化合物8的制剂。特别优选的是根据流程1的本文所述的方法制备的化合物4。特别优选的是根据实施例2的本文描述的方法由式ia化合物制备并且配制在10％etoh(v/v)、0.45％(w/v)抗坏血酸钠在0.9％氯化钠溶液中的溶液中的化合物8。本发明提供了一种tau成像的方法，其包括将根据本文实施方案描述的可检测的量的诊断组合物引入哺乳动物中，并使所述诊断组合物与tau有足够的时间结合；并检测所述诊断组合物。特别优选的是tau成像方法，其包括将可检测的量的根据实施例2的本文描述的方法由式ia化合物制备并配制在10％etoh(v/v)、0.45％(w/v)抗坏血酸钠在0.9％氯化钠溶液中的溶液中的化合物8的诊断组合物引入哺乳动物。
已经发现式i和ii的新化合物对于tau成像、优选包括人的临床成像具有令人惊讶和出人意料的优点。优选的化合物，即式i的化合物，在本文中也称为化合物8，具有用于tau成像的特别有用的性质的组合，包括对tau的高亲和性、选择性、摄取、清除和代谢特性。体内的化合物8证明了有利的组织分布、药代动力学和代谢稳定性。离体和/或在体外，化合物8证明了对tau的高亲和力结合，并标记了来自ad脑的含有tau的组织样品，具有相对于aβ和/或非tau结合的高选择性。化合物8显示对tau的高亲和力和选择性，呈现出对疾病状态、组织和细胞位置特异性的放射照相信号。由化合物8产生的放射照相信号反映了与不希望的非tau信号相比改善的tau检测，以及可用于临床放射性药物成像剂的体内组织分布和代谢谱。与已知试剂相比，具有这种特别有用性质的组合的化合物8提供了增强的tau图像，产生了由于稳定的tau信号和减少的非tau信号而具有改善的清晰度的图像。这种令人惊讶的有利的性质组合提供了一种有效的临床的tau成像剂，其有助于对患者的tau成像。在临床taupet成像中使用化合物8将对ad的评估和/或诊断具有重要的积极影响，并且将促进tau的检测、治疗、监测和评估以及涉及tau的疾病诊断。
附图简述
图1：3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)放射合成的代表性半制备型hplc色谱。上图显示了具有γ检测的hplc色谱。下图显示了具有uv检测的hplc色谱。标记为“切割峰”的部分表示为获得产物3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)而收集的相应流份。
图2：3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)的代表性分析型hplc(qc)色谱。上面标记的图(hplcγ检测器)显示了3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)的放射色谱。下面标记的图(hplcuv检测器)显示了3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)的紫外色谱。上图中的主峰表示6.589分钟的峰值保留时间，下图中的主峰表示峰值保留时间6.607分钟。
图3：用于kd测定的3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)在ad脑切片的放射自显影。参见试验实施例4以获得实验设置和分析的解释。
图4：用于选择性测定的3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶在ad脑切片的放射自显影。参见试验实施例5以获得实验设置和分析的解释。
图5：用于选择性测定的3-(4-(2-[18f]-氟乙基)哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶在ad脑切片的放射自显影。参见试验实施例5以获得实验设置和分析的解释。
图6：用于选择性测定的3-(4-[18f]-氟哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶在ad脑切片的放射自显影。参见试验实施例5以获得实验设置和分析的解释。
图7：3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶，即化合物8在正常的和ad脑切片上的放射自显影。参见试验实施例6以获得实验设置和分析的解释。
图8：3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)和[18f]av-1451(还称为[18f]t807)在使用无醇洗涤的正常与ad脑切片上的放射自显影。参见试验实施例6以获得实验设置和分析的解释。
图9：3-(4-(2-[18f]-氟乙基)哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(akat821)相对于3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)的小鼠pet/ct时间活性曲线。
图10：3-(4-[18f]-氟哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(akat798)相对于3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)的小鼠pet/ct时间活性曲线。
实施例和制备
一般方法
除非另有说明，否则所有反应均在氮气氛下进行。产品使用自动化的teledyne
缩写表示本领域技术人员已知的常见和普通用法，并且本文使用的具体缩写具有以下含义：
缩写：
bpv散装产品小瓶
bs宽单峰
cdcl3氘代氯仿
ch2cl2二氯甲烷
d双峰
dad二极管阵列检测器
dd双二重峰
dt双三重峰
dmpao[(2,6-二甲基苯基)氨基](氧代)乙酸
dmso二甲基亚砜
dmso-d6六氘代二甲基亚砜
etoh乙醇
hplc高效液相色谱
hrms高分辨质谱
ihc免疫组织化学
k2co3碳酸钾
lcms液相色谱质谱
n正相
nmr核磁共振
phf配对螺旋细丝
ppm百万分之
qtof四极杆飞行时间
s单峰
suv标准化的摄取值
suvr标准化的摄取值比率
t三重峰
uplc超高效液相色谱
pbs磷酸盐缓冲盐水
wfi注射用水
流程
流程1提供了3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的合成。合成开始时通过铜催化的将市售2-溴-4-甲基苯胺和2,4-二溴吡啶偶联、随后进行分子内环化形成苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶核心。所需产物3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶是通过第二次铜催化的偶联3-溴-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(3)和3-氟氮杂环丁烷盐酸化物获得。经硅胶柱色谱，用quadrasilmp树脂清除金属后，并研磨，得到3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物4)，为黄色固体(4.44g，总收率21％)。
流程1：合成3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶
流程2提供了4-甲基苯磺酸1-(8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)氮杂环丁烷-3-基酯的合成，其是制备3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的前体。铜催化的3-溴-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(3)和3-羟基氮杂环丁烷的偶联得到羟基中间体1-(8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)氮杂环丁烷-3-醇(5)，其经硅胶柱色谱进一步纯化。然后将清洁的中间体与甲苯磺酸酐和三乙胺反应，然后通过硅胶柱色谱法得到所需产物4-甲基苯磺酸1-(8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)氮杂环丁烷-3-基酯(6)，为浅褐色固体(3.21g,31％总产率)。
流程2：合成4-甲基苯磺酸1-(8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)氮杂环丁烷-3-基酯(6)
根据流程3，从其中r为合适的离去基团的式7化合物制备3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)。更具体地说，其中r为离去基团例如甲基磺酰基(甲磺酰基)或4-甲基苯磺酰基(甲苯磺酰基)的式7化合物可以与18f氟化物([18f]f-)的合适来源在合适的碱如碳酸钾的存在下反应。18f氟化物([18f]f-)的来源包括[18f]fk222。合适的溶剂包括二甲基亚砜。
流程3：合成3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(8)
实施例1
合成3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物4)
步骤1:合成3-溴-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物3)
在1l圆底烧瓶中将2,4-二溴吡啶(20.0g,84.6mmol)、碘化亚铜(3.22g,16.9mmol)、1,10-二氮菲(6.10g,33.8mmol)、碳酸铯(110g,338mmol)、
步骤2:合成3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物4)
向3-溴-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(6.52g,25.0mmol)、3-氟氮杂环丁烷盐酸化物(3.90g,35.0mmol)、碘化亚铜(i)(475mg,2.50mmol)、[(2,6-二甲基苯基)氨基](氧代)乙酸(dmpao,963mg,4.99mmol)和磷酸钾(15.9g,74.9mmol)的固体混合物中加入二甲基亚砜(110ml)。开始搅拌并将氮气鼓入该浆体中15分钟。在该系统中装上回流冷凝器，顶部空间用氮气冲扫，并将该混合物在90℃加热48小时。加入另外的3-氟氮杂环丁烷盐酸化物(1.39g,12.5mmol)、碘化亚铜(i)(166mg,0.871mmol)、dmpao(344mg,1.78mmol)和磷酸钾(5.56g,26.2mmol)，并在90℃继续搅拌另外24小时。将反应混合物冷却至室温，并在剧烈搅拌下缓慢加入水(1000ml)中。经真空过滤分离沉淀的固体，将该水性滤液用10％甲醇在二氯甲烷中的溶液萃取(3x250ml)。将有机萃取物与来自最初含水滤液的分离的固体合并，用硫酸钠干燥，并减压浓缩。将分离出的粗固体(6.46g)预吸收到硅胶(40g)上并通过硅胶色谱使用0-20％乙酸乙酯在二氯甲烷中的溶液梯度洗脱，然后在0-10％甲醇在二氯甲烷中的溶液洗脱纯化。将合并的流份浓缩并将所得深黄色固体(5.43g)悬浮于二氯甲烷(40ml)中并超声处理。加入乙醚(800ml)并通过过滤分离该亮黄色固体，用另外的乙醚(400ml)洗涤，并在高真空下干燥。用quadrasilmp树脂(1.60g)处理分离的产物(4.62g)在10％甲醇/二氯甲烷(200ml)中的溶液，并将该浆体在室温下搅拌2小时。过滤该浆体并用甲醇/二氯甲烷(100ml)冲洗该固体。将合并的有机物减压浓缩，将所得固体悬浮于二氯甲烷中，超声处理，并用乙醚(750ml)研磨。通过真空过滤收集沉淀的固体，用乙醚冲洗，并真空干燥，得到标题化合物，为黄色粉末(4.44g,17.4mmol,2步总产率70％):1hnmr(400.13mhz,cdcl3)δppm:8.11(dd,j＝0.7,7.5hz,1h),7.63(d,j＝8.3hz,1h),7.47-7.48(m,1h),7.23(ddd,j＝0.5,1.5,8.3hz,1h),6.26(d,2.1hz,1h),6.13(dd,j＝2.5,7.3hz,1h),5.35-5.54(m,1h),4.24-4.34(m,2h),4.07-4.17(m,2h),2.53(s,3h)；13cnmr(100.62mhz,cdcl3)δppm:150.7,150.3(d,j＝1.5hz),143.7,129.5,129.0,126.5,125.5,118.1,109.4,101.0,91.6,82.2(d,j＝206.9hz),59.1(d,j＝24.9hz),21.8；19fnmr(376.44mhz,cdcl3)δppm:–180.4；hrms(m/z):实测值：256.1244(m+h),计算值c15h15n3f:256.1250,err＝–2.3ppm；元素分析(gli方法me-14):计算值c15h14fn3c70.57h5.53n16.46,实测值c70.17h5.68n16.43,最大差异＝0.41。
制备1
合成4-甲基苯磺酸1-(8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)氮杂环丁烷-3-基酯(化合物6)
步骤1:合成1-(8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)氮杂环丁烷-3-醇(化合物5)
向3-溴-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(6.57g,25.2mmol)、氮杂环丁烷-3-醇盐酸化物(5.52g,50.4mmol)、碘化亚铜(i)(480mg,2.52mmol)、[(2,6-二甲基苯基)氨基](氧代)乙酸(dmpao,972mg,5.04mmol)和磷酸钾(21.4g,101mmol)的固体混合物中加入二甲基亚砜(110ml)。开始搅拌，并将氮气鼓入该浆体15分钟。该系统装有回流冷凝器，顶部空间用氮气冲扫，将该混合物在90℃下加热24小时。将反应混合物冷却至室温并在剧烈搅拌下缓慢加入水(1000ml)中。通过真空过滤分离沉淀的固体并溶于10％甲醇在二氯甲烷的溶液(500ml)中。将含水滤液用10％甲醇在二氯甲烷中的溶液(3×250ml)萃取。将有机萃取物与来自最初含水滤液的分离固体的溶液合并，并将该混合物用硫酸钠干燥、过滤并减压浓缩。将所得固体溶于二氯甲烷，预吸收到硅胶上，并通过硅胶色谱使用0-30％甲醇在二氯甲烷中的溶液梯度洗脱纯化，得到标题产物，为灰绿色固体(3.18g,50％):1hnmr(400.13mhz,dmso-d6，含有tfa-d)δppm:8.95(d,j＝7.6hz,1h),8.06(s,1h),7.51(d,j＝8.2hz,1h),7.36(dd,j＝0.9,8.3hz,1h),6.76(dd,j＝2.3,7.5hz,1h),6.27(d,j＝2.1hz,1h),4.66-4.71(m,1h),4.38-4.41(m,2h),3.92-3.95(m,2h),2.48(s,3h)；13cnmr(100.62mhz,dmso-d6withtfa-d)δppm:153.6,144.6,132.4,129.5,128.6,128.1,126.9,112.0,111.9,104.3,83.3,61.0,60.16,21.0；hrms(m/z):实测值：254.1296(m+h),计算值c15h16n3o:254.1293,err＝1.2ppm。
步骤2:4-甲基苯磺酸1-(8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)氮杂环丁烷-3-基酯(化合物6)
将1-(8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)氮杂环丁烷-3-醇(化合物5)(3.18g,12.6mmol)在二氯甲烷(135ml)中的混悬液用三乙胺(17.5ml,126mmol)处理，搅拌10分钟，并随后加入对甲苯磺酸酐(12.31g,37.7mmol)。将反应物在室温下搅拌22小时。加入另外的对甲苯磺酸酐(1.84g，5.6mmol)并将反应物搅拌6小时。将反应混合物浓缩，重新悬浮于二氯甲烷(175ml)中，并用1n氢氧化钠水溶液(150ml)处理。将该混合物剧烈搅拌1.5小时，转移至分液漏斗中并分离各层。用1n氢氧化钠水溶液(2×100ml，1×150ml)剧烈振荡有机层。将有机层用硫酸镁干燥，过滤，浓缩，并在高真空下干燥。将分离的棕色固体在10％甲醇在二氯甲烷的溶液中的溶液在减压下在硅胶(24g)上浓缩。将标题化合物经硅胶色谱使用0-10％甲醇在二氯甲烷中的溶液梯度洗脱纯化。将所得固体悬浮于二氯甲烷(约50ml)中，超声处理，并用乙醚(750ml)研磨。过滤收集沉淀的固体，用乙醚冲洗，真空干燥，得到4-甲基苯磺酸1-(8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)氮杂环丁烷-3-基酯，为浅褐色固体(3.21g,7.89mmol,63％产率):1hnmr(400.13mhz,dmso-d6，含有tfa-d)δppm:9.01(d,j＝7.7hz,1h),8.11(bs,1h),7.85-7.88(m,2h),7.52-7.55(m,3h),7.39(dd,j＝1.0,8.3hz,1h),6.82(dd,j＝2.2,7.5hz,1h),6.38(d,j＝2.3hz,1h),5.32-5.37(m,1h),4.94-4.54(m,2h),4.21-4.25(m,2h),2.46(s,3h)；13cnmr(100.62mhz,dmso-d6withtfa-d)δppm:153.3,145.6,144.3,132.6,132.2,130.4,129.5,128.7,128.3,127.7,126.9,112.2,112.0,104.4,84.4,68.5,58.4,21.1,21.0；hrms(m/z):实测值：408.1401(m+h),计算值c15h16n3o:408.1382,err＝4.7ppm；元素分析(gli方法me-14):计算值c22h21n3o3sc64.85h5.19n10.31,实测值c64.38h5.27n10.27,最大差异＝0.48。
实施例2
合成3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)
合成3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶使用getracerlabfxf-n自动放射合成器进行，起始活性为1-2ci。典型的合成时间为～60±5分钟，衰减校正的产率范围为22-44％。[18f]氟化物活性保留在sep-pakaccellplusqmacarbonatepluslightcartridge(每柱46mg吸附剂，40μm粒度，waters部件号186004540)上，并使用0.8ml穴状配体2.2.2-k2co3水溶液[分别是穴状配体2.2.2(7mg)和碳酸钾(0.75mg)在乙腈(0.4ml)和wfi(注射用水,0.4ml)中的溶液]洗脱至反应容器。通过在氮气流和真空下在70℃加热4.5分钟使洗脱的活性成分干燥。然后将温度在真空下升高至100℃持续5分钟，得到无水穴状配体2.2.2-k2co3[18f]氟化物。
将4-甲基苯磺酸1-(8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)氮杂环丁烷-3-基酯[1mg在无水二甲基亚砜(2ml)中的溶液]的溶液加入装有无水穴状配体2.2.2-k2co3[18f]氟化物的反应瓶中，并将所得混合物在140℃保持10分钟，然后用1ml的1n氢氧化钠溶液在65℃水解3分钟。冷却至60℃，将粗的反应混合物用2ml0.5n盐酸(hcl)(1ml1nhcl+1mlwfi)中和。然后将反应粗产物加载至半制备型hplc柱上使用等度洗脱纯化(参加图1的代表性色谱)。半制备型柱:agilentzorbaxeclipseplus苯基-己基,custompn,5μm,9.4mmx250mm,流速＝4ml/min；280nm；保留时间约12-13分钟。流动相组成:76％9mmhcl在wfi中(3ml3nhcl在1lwfi中),24％乙腈(hplc级)。
将包含纯化的3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的hplc流份用0.5％(w/v)抗坏血酸钠在wfi(40ml)中的溶液稀释。然后将该稀释的溶液通过
表1.用于3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的分析型hplc方法a
a.分析型柱条件如下:agilentzorbaxeclipsexdb-c184.6mmx150mm,partno.993967-902,流速＝1ml/min；uv＝320nm。
评估3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)的初步稳定性。取批量样品(大小范围为235mci至471mci)并通过hplc分析6小时时间段内的放射化学纯度。用抗坏血酸钠配制的批次保持96-97％纯度达6小时，而无抗坏血酸钠配制的批次随时间推移变质并在5小时降解。细节见表2。
表2.3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶稳定性结果
试验实施例3
使用来自阿尔茨海默病捐献者的tau，进行3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶相对于[18f]av-1451的ki测定，和3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的kd。
phf制备：
使用jicha等人所述方法(g.a.jicha,a.o'donnell,c.weaver(1999)“hierarchicalphosphorylationofrecombinanttaubythepaired-helicalfilament-associatedproteinkinaseisdependentoncyclicamp-dependentproteinkinase”jneurochem.72(1):214)的改进方法，从阿尔茨海默病患者脑组织分离纯化的可溶的phf。简言之，ad患者皮质用手持式kinematicapolytron匀浆，随后使用parr细胞破碎弹装置进行高压批次气体膨胀。将粗的匀浆物以28kg离心以沉淀细胞碎片。通过亲和色谱使用affigel-10柱从上清液中分离可溶的phf，柱上有已被固定的tau抗体mc1，该抗体能识别tau的病理学构象(g.a.jicha,r.bowser,i.g.kazam(1997),“alz-50andmc-1,anewmonoclonalantibodyraisedtopairedhelicalfilaments,recognizeconformationalepitopesonrecombinanttau”jneuroscires.48(2):12.)
3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的ki测定：
未标记化合物的ic50(即，减少放射性配体特异性结合50％的竞争性配体的摩尔浓度)通过竞争性放射性配体结合测定，其中[18f]av-1451与phf的结合与多种浓度的未标记的化合物竞争。反应混合物(200μl)含有phf(0.12ug)、0.1-0.5nm的[18f]av-1451和从316nm连续稀释至0.01nm的冷化合物；在96孔聚丙烯微孔板中在含有0.01％牛血清白蛋白的ph7.4的pbs中进行测定。非特异性结合定义为放射性配体在一种已知的phf配体t808/av-680(5μm)(zhang,j.(2012),“ahighlyselectiveandspecificpettracerforimagingoftaupathologies”jalzheimersdis.,31(3):601)存在下的结合。在37℃孵育1.5小时后，使用milliporemultiscreenhts多头抽真空装置将结合的放射性收集到multiscreenhts96孔玻璃纤维fb过滤板上，随后用pbs(ph7.4)洗涤5次。在wizard2480自动γ-计数器[perkinelmer]中测定含有结合的[18f]av-1451的滤板的放射性。使用这些测定条件，总结合部分通常小于加入的放射性配体的10％。使用activitybase或xlfit模型205(或相当的模型)确定ic50，其中：
y＝a+(b-a)/(1+((c/x)^d)
y＝％抑制率
x＝冷竞争配体的浓度(nm)
a＝最小y(0％)
b＝最大y(100％)
c＝ic50
d＝坡度因子
使用cheng-prusoff方程(chengy.,prusoffw.h.(1973),"relationshipbetweentheinhibitionconstant(ki)andtheconcentrationofinhibitorwhichcauses50percentinhibition(i50)ofanenzymaticreaction"biochempharmacol22(23):3099–3108)，由ic50值计算ki(即未标记的化合物结合的平衡解离常数)：
ki＝ic50/(1+[l]/kd)
[l]＝[18f]av-1451的浓度(通常约0.5nm)
kd＝[18f]av-1451的解离常数(0.57nm)
相对于[18f]av-1451，3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶在从阿尔茨海默病患者获得的tau上的ki为0.6nm，表明这种化合物结合tau。因此，使用化合物8的pet成像和成像图案的检查将可用于检测患者中tau的存在并可证实ad或非ad的tau蛋白病的诊断。
3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的kd测定：
放射性标记的化合物3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的解离常数[kd]通过饱和结合测定，其中放射性配体的总的和非特异性结合是在多个放射性配体浓度下测量。反应混合物(250μl)含有phf(1500.15μg)和在pbs中从25nm连续稀释至0.3nm的3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶；试验在含有0.01％牛血清白蛋白的pbs中在96孔聚丙烯微孔板中进行。非特异性结合被定义为在t808/av-680(10μm)存在下放射性配体的结合。在37℃孵育1.5小时后，通过在milliporemultiscreenhts96-孔玻璃纤维fb过滤板上使用milliporemultiscreenhts多头抽真空装置真空过滤收集结合的放射性，随后用pbs洗涤5次。在wizard2480自动伽马计数器[perkinelmer]中分析含有结合的3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的滤器的放射性。使用这些测定条件，总结合部分通常小于添加的放射性配体的10％。使用graphpadprism通过非线性回归分析法分析总结合和非特异性结合数据以确定放射性配体的kd。
3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶对从阿尔茨海默病捐献者获得的tau的kd是0.85±0.02nm，说明该化合物以高亲和性结合tau。因此，使用化合物8的pet成像和对成像图案的检查将有利于在患者中检测tau的存在，并能证实ad或非ad的tau病变的诊断。
试验实施例4
3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶与人ad患者脑组织中天然的tau聚集体的结合的kd测定
在使用根据本领域技术人员已知方法的抗tau和抗淀粉样蛋白免疫染色方法鉴定过的人ad脑切片上，在结合天然tau聚集体的3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的kd测定中使用放射自显影法[参见例如(18)f]t807,anoveltaupositronemissiontomographyimagingagentforalzheimer'sdisease.xiacf等人,alzheimer’sdement.2013nov；9(6):666-76),(zhang,j.(2012),“ahighlyselectiveandspecificpettracerforimagingoftaupathologies”jalzheimersdis.,31(3):601)。该实验使用来自两个ad脑(富含tau和富含淀粉样蛋白的(tau+aβ+)脑以及缺乏tau和富含淀粉样蛋白的(tau-aβ+)脑)的每一个的15个相邻额叶切片定义非特异性结合。将切片用在结合缓冲液(2.5％二甲基亚砜+2.5％乙醇的pbs溶液，ph7.4)中从约250nm连续稀释的0.5ml3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶覆盖。在室温孵育60分钟后，通过连续洗涤循环(在pbs中2分钟、30％乙醇/pbs中2分钟、在70％乙醇/pbs中2分钟、在pbs中2分钟)除去未结合的配体。在罩盖下干燥后，将这些切片暴露于成像屏幕过夜。使用gehealthcarelifesciencestyphoonfla7000phosphorimager读取荧光成像屏上记录的放射自显影信号。使用fujifilmmultigauge软件测量灰质的信号强度。通过3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的结合浓度相对于游离化合物浓度的非线性回归分析确定化合物的kd。
用于kd测定的ad脑切片上的3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的放射自显影如图3所示。3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶对于ad脑组织的天然tau-聚集体的kd通过非线性回归分析确定为2.4nm，表明该化合物结合tau。因此，使用化合物8进行pet成像，并检查成像图案，将有助于检测患者中tau的存在，并且可以证实ad或非ad的tau病变的诊断。
试验实施例5
3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶对ad患者脑组织中tau蛋白和β淀粉样蛋白的选择性
方法
基于脑切片的抗tau和抗淀粉样蛋白免疫染色结果，选择三组人脑切片进行放射自显影实验以确定3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的天然tau-结合选择性。a组为tau-富集的ad脑切片(标记为tau+aβ+)，b组为tau-缺乏的ad脑切片(标记为tau-aβ+)，c组为tau-aβ-正常脑切片。如图4所示，使用的a组人ad脑切片是#0185、#28770、#30121、#30311和#30461。b组中的人ad脑切片是#33562、#32656、#33998、#35682和#33563。c组的正常人脑切片为#29092和#32566。根据试验实施例5，使用来自相同供体的组织切片来计算所有三种化合物的选择性。为了定量β淀粉样蛋白负荷，在相邻的10μm切片上使用淀粉样蛋白示踪剂[18f]w372对这三组大脑中的每一组进行放射自显影。[18f]w372是由siemens发现并在ind105173下评估的选择性淀粉样蛋白结合示踪剂。将切片用0.5ml的3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(在2.5:2.5:95dmso:etoh:1xpbs中，约20μci/载玻片)覆盖并孵育1.5小时。然后使用连续的洗涤循环(1分钟pbs、2分钟30％etoh/pbs、2分钟70％etoh/pbs、1分钟pbs)去除任何未结合的示踪剂。将切片风干，置于磷光成像板fujiip板)上并暴露过夜。使用gehealthcarelifesciencestyphoonfla7000phosphorimager读取ip平板。使用fujifilmmultigauge软件测量灰质的信号强度。在减去背景信号(c组皮层区域的信号)后，用[18f]w372对来自各相邻切片的放射自显影的相应信号将a组和b组各个切片的信号进行标准化。计算是基于b组脑切片#32656和#33998，其通过免疫组织化学检测不到tau病理。b组脑切片内3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的标准化信号是3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶与获自天然β-淀粉样蛋白聚集体结合产生的[f18]w372的相对信号水平。a组切片中3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶与天然tau-聚集体的结合水平通过减去可归因于与β-淀粉样蛋白结合的总信号的量来评估(通过将来自相邻切片中的与β-淀粉样蛋白结合的[18f]w372的总信号乘以从b组切片测定的3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶与[18f]w372的相对信号来计算)。然后将得到的差异除以可归因于结合β-淀粉样蛋白的信号，从而评估3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的选择性。
三组人脑切片上3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的放射自显影如图4中所示。观察到a组(tau+aβ+)切片的灰质(皮层区)上的强信号，而在b组(tau-aβ+)中，检测到切片的皮质区域上的弱信号或无信号。在c组的正常脑组织(tau-aβ-)的切片上没有看到放射自显影信号。这些结果表明3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶与特别是人ad脑的天然tau聚集体结合，并且与天然β-淀粉样蛋白聚集体具有微弱的或无相互作用。
由于ihc结果显示b组脑部分#32656和#33998缺乏tau蛋白聚集体，所以这些ad脑切片的皮质区域上的放射自显影的标准化信号源自3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶与天然β-淀粉样蛋白聚集体的结合。3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶与天然tau聚集体结合相对于与天然β-淀粉样蛋白聚集体结合的选择性由a组(tau+aβ+)信号与脑切片#32656和#33998的信号比率来反映。
在试验实施例5中概述和在图4所示的实验中，化合物3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)基于5个tau+aβ+脑标本和2个tau-aβ+脑标本显示对于tau:aβ约26.6±4.5的选择性比率。如本部分所用，标本是指来自不同供体的组织样本。如试验实施例5中所概括和图4中所示，化合物3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)呈现灰质与白质(gm/wm)信号比约为17.3±1.7。在正常脑切片上3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)的放射自显影信号是弱的甚至是平的，灰质和白质之间几乎没有差异，表明了低的非特异性结合。根据试验实施例5的试验，观察到3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)与天然tau聚集体的结合相比与人ad脑的灰质区域中天然β-淀粉样蛋白聚集体的结合的选择性比率达到约27倍。
当与3-(4-(2-[18f]-氟乙基)哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(也称为t821，如下所示)和3-(4-[18f]-氟哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(也称为t798，如下所示)(它们在us2011/0182812中作为taupet成像剂列出)进行比较时，使用3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)的放射自显影选择性的结果令人惊讶地说明了在这些试验中的有利的选择性。
在试验实施例5中所概述和图5中所示的实验中，化合物3-(4-(2-[18f]-氟乙基)哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(t821)基于5个tau+aβ+脑标本和2个tau-aβ+脑标本显示对tau:aβ的选择性比率约为2.22±0.45。如试验实施例5所概述和图5所示，化合物3-(4-(2-[18f]-氟乙基)哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(t821)呈现灰质与白质(gm/wm)信号比约为11.7±1.2。因此，化合物3-(4-(2-[18f]-氟乙基)哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(t821)与正常人脑中的tau、淀粉样蛋白和未确定的结合位点结合。选择性的缺乏是t821用于tau成像的一个缺点。
在试验实施例5中所概述和图6所示的实验中，化合物3-(4-[18f]-氟哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(t798)基于5个tau+aβ+脑标本和2个tau-aβ+脑标本显示对于tau:aβ约8.4±1.7的选择性比率。如试验实施例5中所概述和图6所示，化合物3-(4-[18f]-氟哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(t798)基于5个tau+aβ+脑标本呈现灰质与白质(gm/wm)信号比约为18.0±3.2。因此，化合物3-(4-[18f]-氟哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(t798)与tau、淀粉样蛋白和正常人脑中未确定的结合位点结合。这种选择性的缺乏是t798用于tau成像的缺点。
因此，相对于化合物8，t821和t798显示出不仅在tau和a-β淀粉样蛋白之间的选择性差，而且在相对缺乏tau和a-β淀粉样蛋白的正常人脑组织中观察到的tau和未鉴定的结合位点之间选择性差(参见图4的化合物8，图5的t821，图6的t798)。由于缺乏选择性，3-(4-(2-[18f]-氟乙基)哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶和3-(4-[18f]-氟哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶不是有用的pettau成像试剂。相比之下，3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)与天然tau聚集体结合相比与人ad脑灰质区域中天然β-淀粉样蛋白聚集体的结合的选择性约为27倍。与已知试剂相比，化合物8的这种令人惊讶的选择性结合性质对于tau成像将是特别有利的，并且可以提供改善的tau图像，产生由于强的tau信号和减少的非tau信号而更清晰的图像。技术人员将知道如何单独使用或与现有的β淀粉样蛋白显像剂比较使用3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)，以评估在临床患者成像中的tau蓄积和分布。
试验实施例6
3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶与正常人脑切片缺乏结合
为了显示没有非tau的结合，在正常人脑组织上从3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶得到放射自显影扫描。实验方法与实施例5中提供的相同，除了仅将20uci的18f-配体应用于组织切片且洗涤条件不太严格。图7显示当使用连续洗涤循环时(pbs中2分钟，10％乙醇/pbs2分钟，30％乙醇/pbs中2分钟，pbs中2分钟)，正常组织中的放射性信号显著低于ad脑组织中的放射性信号。ad脑组织中的信号(ad30121，额叶皮质)可以被非放射性标记的化合物或已知的taupet示踪剂t807(也称为av-1451)阻断，正如阻断tau特异性结合所预期。放射自显影进一步在洗涤溶液中不含乙醇的情况下进行。图8显示与[18f]t807(也称为av-1451)相比，tau示踪剂3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶在正常皮质或白质组织中具有低得多的放射自显影信号。与[18f]t807/av-1451相比，这大大减少了化合物8在正常组织上的非tau结合，代表了令人惊讶的有利的改进。
试验实施例7
用3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶获得的小鼠pet/ct扫描
使用3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶从cd-1野生型小鼠获得动态微正电子发射断层扫描(mpet)成像。每个受试者的微型计算机断层扫描(mct)被用作图像分析的解剖参考。通过使用融合的mpet/mct图像生成时间-活性曲线(tac)来评估示踪剂在脑、肌肉、骨、肝和肾中的生物分布。ineton多模式扫描仪(德国西门子)用于mpet/mct。所有动物工作都按照科学机构动物管理和使用委员会批准的程序进行。
将动物用3％异氟烷/97％氧气麻醉并放置在扫描仪床上。首先进行一次短的高分辨率ct扫描以进行解剖学定位，然后进行120分钟的pet扫描。在pet扫描期间，水加热系统放置在床下方以帮助维持体温。在pet收集开始后3分钟内，将[18f]-标记的化合物3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶通过尾静脉注射向动物施用(总体积200μl盐水中的250μci)。对采集时间的每一分钟生成pet图像。通过基于融合的pet/ct图像在视觉上绘制感兴趣的区域来获得示踪剂的摄取，并且使用inveonresearchworkplace软件(西门子，德国)确定相应的活性值。所有值均以每克的注射剂量百分比(％id/g)表示。
从3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶得到的时间活性曲线与从已知的taupet示踪剂t807/av-1451获得的那些进行比较。3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶以比[18f]av-1451更高的％id/g进入大脑，可快速清除，并且在骨组织中没有显著的放射性摄取。这些性质对于改进的脑成像剂是有利的。
试验实施例8
3-(4-(2-[18f]-氟乙基)哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(t821)和3-(4-[18f]-氟哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(t798)相对于3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)的小鼠pet/ct时间活性曲线。
3-(4-(2-[18f]-氟乙基)哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(t821)(见图9)和3-(4-[18f]-氟哌啶-1-基)-8-甲氧基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(t798)(见图10)的小鼠pet/ct时间活性曲线如试验实施例7(t821和t798如us2011/0182812中所述)中所述获得。图9和图10说明t821和t798放射性的骨摄取随时间增加，表明可以标记骨的放射性氟离子的可能释放。因此，当用t821和/或t798进行成像时，来自颅骨的不希望的非taupet信号可能干扰来自大脑皮层的期望的tau信号。因此，除了t821和t798缺乏选择性之外，由于来自骨的放射性信号干扰，这些化合物将进一步表现为人脑taupet示踪剂的不良候选物。相反，3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)在骨中放射性信号可忽略不计，与t821和t798相比，具有显著优异且令人惊讶的脑摄取。3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶具有令人惊讶的有利性能，其作为所需的改良的taupet成像试剂，包括有利的组织分布、良好的pk性质和稳定的tau选择性特性。化合物8的有利性质对于提供增强的人taupet成像是有用的。所述关键性质的这种组合是未知的，并且不能从现有的tau成像化合物预测。
试验实施例9
3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)在正常小鼠中的生物学分布
为了测定正常小鼠的器官分布、脑渗透和清除率，我们将3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶注射入正常小鼠，随后进行安乐死，并在注射后2、60、120和180分钟进行解剖。在麻醉状态下，将0.2ml含有20μci的3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶直接注入尾静脉。每个时间点使用三只小鼠并以交错方式处死。收集以下器官和液体：血液、脾脏、甲状腺、睾丸、心脏、肝脏、胰脏、肾脏、肌肉、皮肤、胃、骨骼、肺、大脑、肠、泌尿生殖系统。将器官称重并用自动伽玛计数器(perkinelmer)计数每个器官的放射性。对皮肤、骨骼、肌肉和血液，计数样本并估计器官或流体的总重量。计数注射剂量的样本作为参考。计算每个器官每克组织的注射剂量百分比(％id/g)。
3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶的9.53％剂量/g水平是在2分钟的时间点在大脑中获得的。在30分钟时点之前从大脑清除至低于峰值的10％并持续2小时。放射性主要在前两分钟内分布于肝脏、肠和肾脏，并在两小时研究期间持续存在于肠内(表4和表5)。
肝脏和肠中的放射性水平以及包括膀胱在内的泌尿生殖系统中的适度存在表明化合物及其代谢物通过肝脏和消化系统清除。骨组织放射性增加的情况表明，化合物及其代谢物在头两个小时内不经历脱氟。肌肉摄取保持在2％id/g以下，这有利于pet成像的投影的人类信噪比。这些结果表明化合物8显示出令人惊讶的有利的组织分布、药代动力学和体内代谢稳定性。这些性质对于改进的脑tau成像剂特别有利。
表4：每克的3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶在正常小鼠中的生物学分布
表5：每器官的[18f]3-(3-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶在正常小鼠中的生物学分布
试验实施例10
阿尔茨海默病患者脑中的tau蛋白的3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)pet成像
3-(3-[18f]-氟氮杂环丁烷-1-基)-8-甲基苯并[4,5]咪唑并[1,2-a]吡啶(化合物8)作为用于在ad或其它神经变性疾病的患者中tau蛋白沉积成像的pet放射性配体的临床评价是通过用化合物8完成一次或多次pet扫描，在健康志愿者、ad患者或慢性创伤性脑病(cte)个体中进行。在化合物8或[18f]av-1451注射后，动态pet成像在西门子ecatexacthr+上历经150分钟采集(0-60和90-150分钟成像片段)。化合物8或[18f]av-1451扫描在两个成像阶段中以类似方式获得。也获得了脑部mri。将pet和mri图像对齐并标准化，并将基于atlas的感兴趣体积(voi)应用于动态pet系列。根据动力学特性以及目标区域与小脑标准摄取值比率(在100-120分钟之间的suvr)在健康志愿者与ad或cte受试者之间评估化合物8或[18f]av-1451。
个体内的化合物8和[18f]av-1451之间在健康对照和ad个体中的分布相似。对于ad患者，化合物8和[18f]av-1451在ad个体中显示出相似的tau透过脑部摄取的个体内分布。与健康对照相比较，ad个体的皮质脑区域观察到对于化合物8和[18f]av-1451两者都具有更高的摄取。化合物8在～8suv时表现出较高的峰值脑部脑摄取，而对于[18f]av-1451而言是～6suv。化合物8和[18f]av-1451显示出相似的从大脑清除特性。化合物8代谢迅速，在注射后60分钟剩余5±3％(n＝7)完整的母体化合物。
化合物8suvr曲线在健康志愿个体中在皮层区域快速平衡，其值在1.0-1.1左右，而在皮质下区域(壳核、丘脑)，其摄取比[18f]av-1451似乎减少。在ad个体中，与[18f]av-1451类似，化合物8suvr曲线在研究时间范围内未达到平衡(150分钟)，而化合物8与[18f]av-1451相比显示略高的suvr值。化合物8的图像更清晰并被解释为较低的非特异性背景信号。化合物8suvr图显示健康志愿者和ad个体之间良好的分离，其中对所有区域平均后，健康志愿个体的平均suvr为～1.1，ad个体的平均suvr为～1.6。与[18f]av-1451相比，化合物8在健康志愿者和ad个体中显示较高的脑摄取，化合物8最大suv比[18f]av-1451高约50％。
化合物8在cte个体中的分布显示摄取增加的小焦点区域。对于cte个体，在高摄取的焦点区域(下侧顶叶皮质、顶上皮质和后颞皮质的亚区域)中手动划定较小的感兴趣体积。化合物8在这些亚区域的suvr曲线显示信号升高，达到约1.5的值，但其它皮层区域仍然接近1.0，类似于健康的志愿个体。
在例如试验实施例10和上述其它试验实施例中所述的那些结果支持使用化合物8作为改进的且有利的pet成像探针，用于检测ad患者和/或其它神经变性病症例如cte中聚集的tau蛋白的水平。