核酸的外泌体包装的制作方法

本发明一般涉及外泌体包装。更特别地，本发明涉及用于产生富集有目标核酸的外泌体的方法和核酸构建体。
背景技术：
：：2006年，诺贝尔医学奖授予RNA干扰(RNAi)的发现。早期的研究显示，RNAi触发剂诸如小干扰RNA(siRNA)可以容易地被设计为以特异性且有效的方式几乎沉默任何基因。这表明基因沉默核酸诸如siRNA可用于治疗各种疾病。发现反义寡核苷酸(AON)和RNA干扰(RNAi)基因沉默途径为研究人员提供了用于沉默目标基因表达的工具。这些途径都是通过将小核酸分子引入细胞中而触发的。这些小核酸分子通常被设计为与从一个或多个目标基因转录的mRNA至少部分互补，并且小核酸分子(即基因沉默核酸)识别/结合mRNA通常通过空间阻断/防止翻译或者酶促降解或裂解mRNA来触发mRNA降解。通常，RNA干扰是一种长度约21个核苷酸的双链RNA分子可以强效沉默或阻遏具有互补mRNA序列的特定基因的表达的机制。从植物到蠕虫以及人类的生物体都有内源性RNA沉默系统，其中Argonaute(AGO)蛋白结合小RNA以沉默基因表达。在人类中，通过裂解和降解与基因沉默核酸(即siRNA引导链)完全互补的RNA，或阻遏不完全互补的mRNA的翻译(诸如在miRNA基因沉默核酸的情况下)，降低基因表达。在人类中，小RNA基因沉默子的主要类别被称为微RNA(miRNA)，其通过阻遏具有部分互补的结合位点的mRNA翻译来调控大型基因网络(Fabian,2010,AnnuRevBiochem,79:351)。miRNA是发育、肿瘤发生和神经变性疾病的必要调控剂(Pencheva,2013,NatCellBiol,15:546；Croce,2009,NatRevGenet,10:704；Abe,2013,TrendsCellBiol,23:30)。miRNA的这些关键作用已经促使一些公司开发抑制或替代miRNA的RNA-基药物。例如，针对丙型肝炎的II期临床试验中的基于miRNA治疗剂显示出显著的临床受益。正在开发用于癌症、心脏病和炎性病症(如炎性肠病和关节炎)等的其它miRNA治疗剂。完全互补的siRNA引发靶RNA的酶促裂解和降解，从而引发明显、快速且特异性的单基因沉默。这些完全互补的小RNA通常被称为siRNA或RNAi，在研究中经常用于研究特定基因的功能，并正在开发用于患者的治疗性治疗。例如，在临床前研究中，单剂量的siRNA可以在六周内消除肝脏中>80％的基因表达，仅具有最小的脱靶效应(Coelho,2013,NEnglJMed,369:819；Kanasty,2013,NatureMaterials,12:967)。用单一siRNA几乎完全消除特定基因的表达的能力或用siRNA汇集物几乎完全消除一个选定组的基因的表达的能力对许多疾病具有巨大的治疗潜力，所述疾病从由引起病状的病毒或遗传突变蛋白质引起的那些疾病开始，诸如在亨廷顿氏病(Huntington’sdisease)和癌症中。病毒RNA或细胞RNA在产生致病蛋白之前的近乎消除可能代表了针对这些疾病的强有利的治疗策略。RNAi也可用于通过调节(tailoring)细胞响应或增强对给定途径或生理过程的组合效应来增加现有药物的功效。RNA沉默的强大潜力导致快速开发出几个大型RNAi治疗方案。然而，这些治疗剂的药物输送已经提出了重大挑战(Kanasty,2013,NatureMaterials,12:967；Whitehead,2009,NatRevDrugDiscov,8:129)。现在输送至肝脏在临床上似乎是强健的。靶向肝脏的miRNA和RNAi/siRNA治疗剂处于几个II期临床试验中。然而，向其它器官和细胞类型递送的挑战已经减缓了其它有前景的小RNA治疗法用于其他器官和细胞类型的癌症、心脏病、炎性和神经变性疾病的进展(Kanasty,2013,NatureMaterials,12:967；Whitehead,2009,NatRevDrugDiscov,8:129)。已经测试了许多递送RNAi治疗剂的策略，包括脂质颗粒、siRNA修饰、纳米颗粒和适体(Kanasty,2013,NatureMaterials,12:967；Whitehead,2009,NatRevDrugDiscov,8:129)。大型荷电药物由于具有有窗孔的内皮容易渗透肝脏。使用先进的脂质体技术，诸如稳定核酸脂质颗粒(StableNucleicAcidLipidParticles，SNALP)和下一代脂质体技术已经实现了向肝脏的有效输送(Zimmerman,2006,Nature,441:111；Haussecker,2012,MolecularTherapyNucleicAcids,1:e8)。使用经GalNAc化学修饰的miRNA分子或使用复杂聚合物也可以在临床上实现肝脏输送。使用类似方法输送至其它组织已经不太成功，并且一直是将其它RNAi治疗剂引入临床试验和治疗用途的障碍(Coelho,2013,NEnglJMed,369:819；Kanasty,2013,NatureMaterials,12:967；Haussecker,2012,MolecularTherapyNucleicAcids,1:e8)。最近的研究已经证明，在细胞之间运输大分子的内生系统可以适用作诸如siRNA的某些治疗剂的药物递送媒介物(Raposo,2013,JCellBiol,200:373；Validi,2007,NatCellBiol,9:654)。细胞外囊泡称为外泌体，它是微小囊泡(40-120nm)，在细胞之间传递包括RNA在内的分子，并且一系列研究表明，如果包括RNAi治疗剂在内的药物可被包装至外泌体中，则外泌体将它们递送至多种组织，包括心脏、肝脏和肺，并且甚至穿过血脑屏障进入神经元(Zhuang,2011,MolTher,19:1769；Alvarez-Erviti,2011,NatBiotechnology,29:341)。例如，当鼻内注射在小鼠中时，外泌体将如姜黄素的药物递送至脑中(Thery,2006,CurrProtocCellBiol,第3章,Unit322)。静脉内注射在外周中的外泌体可以将RNAi治疗剂递送至脑中，并且实现在脑中靶标的表达减少60％(Alvarez-Erviti,2011,NatBiotechnol,29:341)。这些发现证明了外泌体作为用于RNAi治疗剂和其它药物的药物递送媒介物的强大潜力。然而，将基因沉默核酸包装至外泌体中仍然是一个特别困难的挑战。先前已经研究了GMP临床级外泌体的放大生产(Lamparski,2002,JImmunolMethods,270:211)。外泌体最初基于它们改变抗原呈递和免疫响应的潜在能力已经被作为潜在的癌症治疗剂进行了研究。然而，在若干临床试验中，尝试最大化外泌体的免疫原性导致癌症患者体内对肿瘤响应只有最小的影响(Vlaud,2011,JImmunother,34:65)。证据表明可能制造临床级外泌体，并且外泌体通常是无毒的并且具有最小的免疫原性。从这些过程的建立中获得的知识可能有助于产生用于药物递送的临床级外泌体。的确，在若干临床试验中，甚至来源于高免疫原性树突细胞的外泌体对癌症患者体内的肿瘤响应的影响可以忽略不计，所以来自其它细胞类型的外泌体当用于药物递送时可能具有最小的免疫原性。有证据表明，临床使用适合的外泌体作为药物递送媒介物可能既可行又安全。外泌体是40-120nm的囊泡，在表面和内部的细胞质内含物上具有一个亚组的质膜受体。外泌体是将囊泡出芽至被称为多泡核内体的内体腔管中产生的。多泡核内体与质膜的融合将封闭的囊泡即外泌体释放至细胞外空间(Colombo,2014,AnnuRevCellDevBiol,30:255)。由于这种独特的生物发生过程，外泌体在其表面上含有一个独特亚组的质膜受体。已经揭示了质膜受体可以引起其在外泌体上强烈富集的几个性质。这一知识可以并且已经被用于设计外泌体以靶向特定的细胞和组织。富集在外泌体上的受体的性质(如豆蔻酰化(Fang,2007,PLoSBiol,5:e158)、C1C2区(Zeelenberg,2008,CancerRes,68:1228)、LAMP2胞浆区(Alvarez-Erviti,2011,NatBiotechnol,29:341)可用于设计外泌体表面上靶向特定组织如脑癌或乳腺癌的新受体的富集(Alvarez-Erviti,2011,NatBiotechnol,29:341；Ohno,2013,MolTher,21:185)。的确，特定的区(如C1C2、LAMP2胞浆区)可附着在质膜受体上，导致它们被选择性地分选至外泌体上。因此，使用外泌体作为药物递送媒介物的两个主要障碍(大量生产和组织特异性靶向)可以以这种方式解决。然而，也许使用外泌体或外泌体-样囊泡作为用于治疗性核酸诸如基因沉默核酸的药物递送媒介物的剩下的主要障碍可能是包装siRNA/RNAi/miRNA或其它目标核酸至外泌体中的能力。与产生它们的细胞相比，外泌体具有高度选择性含量的蛋白质和RNA。例如，一些miRNA在细胞中几乎检测不到，而在外泌体中则很丰富。不幸的是，相反的情况经常是这样的，其中细胞miRNA在产生其的外泌体中是不可检测的。因此，用于包装所需的核酸序列诸如基因沉默核酸至外泌体中以及在外泌体中富集它们的技术策略是合乎期望的。已经尝试了几次来确定在外泌体中富集miRNA或其它RNA的策略。在外泌体中检索引起RNA富集的序列基序有复杂的结果。初步检索发现了几个假定的短基序，但尚未测试这些基序引起RNA分选至外泌体中的能力(Batagov,2011,BMCGenomics,12(3):S8；Villarroya-Beltri,2013,NatCommun,4:2980)。最近的一篇文章表明，miRNA中的碱基基序可以将它们在外泌体中的富集提升2-5倍(Villarroya-Beltri,2013,NatCommun,4:2980)。未测试这种相对适度的效应是否在其它细胞类型中得以维持。这一点尤其重要，因为新出现的证据表明，由不同细胞类型(诸如最适于产生临床级外泌体的那些)产生的外泌体可能并不总是共有生物发生机制和其它性质。一些研究已经使用电穿孔或相关方法将RNAi治疗剂假定性地引入外泌体中(Alvarez-Erviti等,NatBiotechnol,29:341(2011))。许多人怀疑以在临床使用的大量生产中保持一致的外泌体功能的方式在直径为100nm的囊泡的膜中持续产生5-10nm(RNAi治疗剂～5nm)的孔的能力。的确，随后的研究表明，当使用相同技术进行电穿孔时，大部分RNAi治疗剂沉淀(Kooijmans,2013,JControlRelease,172:229)。这表明将RNAi治疗剂物理引入外泌体中不可能产生一致的纯外泌体产物。迄今为止，还没有广泛适用且稳健的用于包装目标核酸于所述的外泌体内的机制。用于包装目标核酸于外泌体中和/或用于输送目标核酸至细胞的替代、额外和/或改进的方法是被期望的。技术实现要素：在一个实施方案中，本文提供了用于产生包含基因沉默核酸、目标核酸或其前体的外泌体或外泌体-样囊泡的方法，所述方法包括：-引入核酸构建体至外泌体-产生细胞中或在外泌体-产生细胞中表达核酸构建体，所述核酸构建体包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸、目标核酸或其前体；和-从所述细胞产生外泌体或外泌体-样囊泡。在以上方法的另一个实施方案中，所述方法还可包括收集或富集所产生的外泌体或外泌体-样囊泡的可选步骤。在以上一种或多种方法的又另一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含茎-环二级结构。在以上一种或多种方法的又一个实施例中，所述前-miR-451结构模拟物可包含具有平末端、5’突出端、3’突出端或5’和3’松散端的茎-环二级结构。在以上一种或多种方法的又一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含具有约25-54个核苷酸(nt)的总长的茎-环二级结构。在以上一种或多种方法的又另一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含具有约40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52个核苷酸(nt)的总长的茎-环二级结构。在以上一种或多种方法的又另一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含具有约4、5、6、7或8nt的总环长的茎-环二级结构。在以上一种或多种方法的又一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含在茎中具有至少一个碱基对错配的茎-环二级结构。在以上一种或多种方法的又另一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含在茎中具有位于Drosha裂解位点相邻的前三个碱基对内的至少一个碱基对错配的茎-环二级结构。在以上一种或多种方法的另一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含具有延伸至Ago2裂解位置或在Ago2裂解位置之前或在Ago2裂解位置之后的3’末端的茎-环二级结构，使得所述前-miR-451结构模拟物包括5’突出端部分和3’碱基-配对部分。举例来说，在某些实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含具有5’突出端部分和3’碱基-配对的(或基本上碱基-配对的或部分碱基-配对的)部分的茎-环二级结构，其从全长缩短并且可落在全长减去一个(-1)核苷酸和成熟长度或者在两者之间。在以上一种或多种方法的又一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含包括3’部分在内的单链结构，其任选地为模拟成熟miR-451的环-衍生的序列。在某些另外的实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可为约22-35nt长。在某些另外的实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可为约23-24nt长。在以上一种或多种方法的另一个实施方案中，所述细胞可为天然产生富集有miR-451的外泌体的细胞。在以上一种或多种方法的又一个实施方案中，所述细胞可为原代人间充质干细胞、原代小鼠巨噬细胞、人乳腺癌细胞系诸如MDA-MB-231、小鼠或人神经元细胞系诸如Neuro2a或SHSY、小鼠星形胶质细胞细胞系诸如C8Da或SIM、小鼠小神经胶质细胞系诸如BV2、小鼠运动神经元细胞系诸如NSC-34或MN-1、HeLa、小鼠胚胎成纤维细胞或小鼠树突细胞诸如JAWSII。在某些实施方案中，该细胞可为MEF或JAWSII细胞。在以上一种或多种方法的一个实施方案中，所述基因沉默核酸可为非成熟miR-451的基因沉默核酸。在如上所述的任何方法的另一个实施方案中，所述细胞可为胚胎干细胞(ESC)克隆H1或H9细胞、间充质干细胞(MSC)或具有低Ago2表达或活性水平的细胞。举例来说，具有低Ago2表达或活性水平的细胞可包括黑素瘤细胞系、HepG2细胞系、MCF-7细胞系、用来那度胺处理的细胞或使用诸如Crispr、TALEN锌指或技术人员已知的其它方法的技术衍生的具有Ago2遗传缺失的细胞。在某些实施方案中，该细胞可为Ago2敲除细胞。在如上所述的任何方法的又另一个实施方案中，所述细胞可为胚胎干细胞(ESC)克隆H9细胞。在如上所述的任何方法的又一个实施方案中，所述基因沉默核酸可为miRNA、shRNA、Crispr引导RNA或siRNA，可为miRNA、shRNA、Crispr引导RNA或siRNA的前体，或可来源于miRNA、shRNA、Crispr引导RNA或siRNA。在如上所述的任何方法的另一个实施方案中，可将所述细胞在无血清培养基中，或在不存在血清的情况下，或在经特别处理以从其中消除或去除外泌体和/或外泌体-样囊泡的血清(即外泌体-排除的血清培养基)中培养，同时产生外泌体或外泌体-样囊泡。在如上所述的任何方法的又一个实施方案中，所述方法还可包括纯化或浓缩由所述细胞产生的外泌体。在如上所述的任何方法的又一个实施方案中，所述外泌体或外泌体-样囊泡可从无血清培养基或之前经处理或加工以去除或减少外泌体含量和/或外泌体-样囊泡含量的血清培养基(即外泌体-耗竭的血清培养基)中纯化或浓缩。在以上一种或多种方法中的任一种的又一个实施方案中，所述方法还可包括用溶酶体抑制剂或自噬抑制剂处理外泌体-产生细胞的步骤。作为非限制性实例，此类抑制剂可包括例如巴佛洛霉素A1、刀豆素或氯喹。在以上一种或多种方法中的任一种的又另一个实施方案中，所述方法还可包括抑制Ago2在外泌体-产生细胞中的表达或活性的步骤。在某些实施方案中，可使用例如，基因沉默核酸诸如但不限于siRNA、miRNA、shRNA或反义寡核苷酸抑制Ago2。在某些实施方案中，可使用例如BCI-137或另一种适合的Ago2抑制剂抑制Ago2。在另一个实施方案中，本文提供了组合物，其包含：-外泌体或外泌体-样囊泡；和-核酸构建体，其包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸，或其前体或裂解片段(诸如但不限于酶促裂解片段)；其中核酸构建体或其前体或酶促裂解片段在外泌体或外泌体-样囊泡内，在外泌体或外泌体-样囊泡的外部上，或其组合。在如上所述的组合物的一个实施方案中，所述基因沉默核酸可为非成熟miR-451的基因沉默核酸。在如上所述的任何组合物的另一个实施方案中，该组合物还可包含一种或多种外泌体-产生细胞。在如上所述的任何组合物的又另一个实施方案中，所述组合物还可包含不含外泌体和/或外泌体-样囊泡的无血清培养基或之前经处理或加工以去除或减少外泌体含量和/或外泌体-样囊泡含量的血清培养基(诸如外泌体-耗竭的血清培养基)。在如上一种或多种组合物中的任一种的又一个实施方案中，所述组合物还可包含以下中的至少一种：溶酶体抑制剂、自噬抑制剂或Ago2表达或活性的抑制剂。在另一个实施方案中，本文提供了包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸的核酸构建体用于包装所述基因沉默核酸进入外泌体-产生细胞产生的外泌体或外泌体-样囊泡中的用途，其中所述核酸构建体用于引入至所述细胞中或在所述细胞中表达。在如上用途的又另一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含茎-环二级结构。在如上一种或多种用途的又一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含具有约25-52个核苷酸(nt)的总长的茎-环二级结构。在如上一种或多种用途的又另一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含具有约40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52个核苷酸(nt)的总长的茎-环二级结构。在如上一种或多种用途的又一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含具有约4、5、6、7或8nt的总环长的茎-环二级结构。在如上一种或多种用途的又另一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含在茎中具有至少一个碱基对错配的茎-环二级结构。在如上一种或多种用途的又一个实施方案中，前-miR-451结构模拟物可包含位于Drosha裂解位点相邻的前三个碱基对内具有至少一个碱基对错配的茎-环二级结构。在如上一种或多种用途的又一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含具有延伸至Ago2裂解位置或在Ago2裂解位置之前或在Ago2裂解位置之后的3’末端的茎-环二级结构，使得所述前-miR-451结构模拟物包括5’突出端部分和3’碱基-配对部分。在如上一种或多种用途的另一个实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可包含包括3’部分在内的单链结构，其任选地为模拟成熟miR-451的环-衍生的序列。在某些实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可为约22-35nt长或可为22nt长、35nt长或在其间的任何单个整数。在某些另外的实施方案中，所述前-miR-451结构模拟物可为约23-24nt长。在如上一种或多种用途的另一个实施方案中，所述细胞可为天然产生富集有miR-451的外泌体的细胞。在如上一种或多种用途的又另一个实施方案中，所述细胞可为原代人间充质干细胞、原代小鼠巨噬细胞、人乳腺癌细胞系诸如MDA-MB-231、小鼠或人神经元细胞系诸如Neuro2a或SHSY、小鼠星形胶质细胞细胞系诸如C8Da或SIM、小鼠小神经胶质细胞系诸如BV2、小鼠运动神经元细胞系诸如NSC-34或MN-1、HeLa、小鼠胚胎成纤维细胞或小鼠树突细胞诸如JAWSII。在某些实施方案中，所述细胞可为MEF或JAWSII细胞。在如上所述的任何用途的一个实施方案中，所示基因沉默核酸可为非成熟miR-451的基因沉默核酸。在如上所述的任何用途的另一个实施方案中，所述细胞可为胚胎干细胞(ESC)克隆H1或H9细胞、间充质干细胞(MSC)或具有低Ago2表达或活性水平的细胞。在如上所述的任何用途的又另一个实施方案中，所述细胞可为胚胎干细胞(ESC)克隆H9细胞。在如上所述的任何用途的又一个实施方案中，所述基因沉默核酸可为miRNA、shRNA、Crispr引导RNA或siRNA，可为miRNA、shRNA、Crispr引导RNA或siRNA的前体，或可来源于miRNA、shRNA、Crispr引导RNA或siRNA。在如上所述的任何用途的另一个实施方案中，可将所述细胞在无血清培养基中，或在之前经处理或加工以去除或减少外泌体含量和/或外泌体-样囊泡含量的血清培养基(即外泌体-耗竭的血清培养基)中培养。在如上所述的一种或多种用途中的任一种的又另一个实施方案中，所述核酸构建体可以与溶酶体抑制剂、自噬抑制剂或Ago2表达或活性的抑制剂中的至少一种组合使用。在另一个实施方案中，本文提供了包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸的核酸构建体。在如上所述的核酸构建体的另一个实施方案中，所述核酸构建体可用于包装基因沉默核酸或其前体进入外泌体-产生细胞产生的外泌体或外泌体-样囊泡中，其中所述核酸构建体用于引入至细胞中或在细胞中表达。在如上所述的核酸构建体的另一个实施方案中，所述基因沉默核酸可为非成熟miR-451的基因沉默核酸。在另一个实施方案中，本文提供了用于制备富集有目标核酸序列或其前体的外泌体或外泌体-样囊泡的方法，所述方法包括：-引入核酸构建体至外泌体-产生细胞中或在外泌体-产生细胞中表达核酸构建体，所述核酸构建体包含掺入前-miR-451结构模拟物中的目标核酸序列；和-使所述细胞产生外泌体或外泌体-样囊泡。在以上方法的另一个实施方案中，所述方法还可包括收集或富集所产生的外泌体或外泌体-样囊泡的可选步骤。在以上一种或多种方法的又一个实施方案中，所述基因沉默核酸可为非成熟miR-451的基因沉默核酸。在一个实施方案中，本文提供了核酸递送组合物，其包含：-外泌体或外泌体-样囊泡；和-核酸构建体，其包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸，或其前体或裂解片段；其中所述核酸构建体或其前体或裂解片段被包含或包装在所述外泌体或外泌体-样囊泡内，运载在所述外泌体或外泌体-样囊泡或其组合的外部上。在如上所述的核酸递送组合物的一个实施方案中，所述基因沉默核酸可为非成熟miR-451的基因沉默核酸。在如上所述的核酸递送组合物的另一个实施方案中，所述外泌体或外泌体-样囊泡可由胚胎干细胞(ESC)克隆H1或H9细胞或间充质干细胞(MSC)或如本文所述的另一种细胞产生。在如上所述的核酸递送组合物的又另一个实施方案中，所述外泌体或外泌体-样囊泡可由在无血清培养基或在之前经处理或加工以去除或减少外泌体含量和/或外泌体-样囊泡含量的血清培养基(即外泌体-耗竭的血清培养基)中的细胞产生。在另一个实施方案中，本文提供了如上所述的核酸递送组合物用于沉默由基因沉默核酸靶向的基因细胞表达的用途。在另一个实施方案中，本文提供了用于鉴定候选外泌体-产生细胞是否为适用于使用包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸、目标核酸或其前体的核酸构建体产生经富集的外泌体或外泌体-样囊泡的外泌体-产生细胞的方法，所述方法包括：量化由所述候选外泌体-产生细胞产生的外泌体的miR-451含量并确定miR-451是否为外泌体富集的；其中miR-451的外泌体富集指示所述候选外泌体-产生细胞适用于产生经富集的外泌体或外泌体-样囊泡。在以上方法的又一个实施方案中，可通过比较miR-451外泌体水平与参考内源性表达的miRNA(并非miR-451)的外泌体水平确定miR-451的外泌体富集。在以上方法的又另一个实施方案中，所述参考内源性表达的miRNA可为miR-16或let-7a或其组合。在以上用于产生外泌体的一种或多种方法中的任一种的另一个实施方案中，所述方法还可包括用溶酶体抑制剂或自噬抑制剂处理所述外泌体-产生细胞的步骤。在以上用于产生外泌体的一种或多种方法中的任一种的又另一个实施方案中，所述方法还可包括抑制Ago2在外泌体-产生细胞中的表达或活性。在某些实施方案中，可使用siRNA、反义寡核苷酸或其它基因沉默核酸抑制Ago2。应理解，实施方案是为了意在用于本领域技术人员的说明目的而提供的，并不意味着以任何方式进行限制。附图说明图1显示了从MDA-MB-231(乳腺癌上皮细胞系)或小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的培养基进行外泌体富集的说明。(A)来自MDA-MB-231和MEF细胞的外泌体制剂的大小(x-轴)的动态光散射分析。(B)来自MDA-MB-231和MEF细胞的外泌体制剂中囊泡的大小的Nanosight颗粒追踪分析。(C)针对外泌体标记(Flottilin2,Tsg101,Alix)，其它区室标记(Tom20，线粒体)的来自MDA-MB-231和MEF细胞的总细胞裂解物和外泌体制剂的当量(μg蛋白质)的蛋白质印迹分析。(D)来自MDA-MB-231和MEF细胞的外泌体制剂的代表性电子显微镜图像；图2显示了miR-451的独特生物发生途径。(A)前-miR-451是较短的发夹结构，其以非DICER依赖性和AGO2依赖性方式裂解。前-miR-451是不需要Dicer裂解的miRNA的独特实例。经过Drosha初步裂解为成为比大多数前-miRNA更短的发夹结构后，前-miR-451被Argonaute2(AGO2)裂解。随后修整所得RNA的3’末端产生成熟miR-451。一些研究已经证明可将多种其它miRNA或沉默RNA插入到前-miR-451主链中，并且其仍然以非Dicer依赖性、AGO2依赖性方式加工以成为有效的成熟沉默RNA(Cheloufi,Nature,2010；Cifentes,Science,2010；Yang,PNAS,2010；YangRNA2012)。的确，成熟miR-451的序列(图2A中的第4项)可以用几乎任何其它适合的RNA序列替代，并且加工可以以大致相同的方式进行。举例来说，本文提供的数据显示了例如可以用miR-106或miR-155替代成熟-miR-451。(B)在由DROSHA初步处理后，典型的前-miRNA(通常～70-120个核苷酸并具有双链发夹环结构)被DICER裂解。前-miRNA被DICER裂解以产生短的～21个核苷酸双链RNA。去除一条链后，产生成熟的miRNA，诸如此处显示的例如miR-16。对每种类型的miRNA的生物发生的连续步骤编号；图3显示了在前-mIR-451主链中的插入导致miRNA在外泌体中强烈富集。(A)通过RT-qPCR在外泌体和外泌体-产生细胞(MDA-MB-231)中测量内源性miRNA(let-7a，miR-106，miR-155，miR-451)的比率。y轴是log10。miR-451在外泌体中高度富集。(B)在前-miR-451主链中插入miR-106或miR-155导致它们在来自MDA-MB-231细胞的外泌体中富集至与miR-451相当的水平。(C)通过RT-qPCR在外泌体和外泌体-产生细胞(MEF，小鼠胚胎成纤维细胞)中测量内源性miRNA(let-7a，miR-106，miR-155)的比率。y轴是log10。在这些细胞中，miR-451不是内源性表达的。(D)在前-miR-451主链中插入miR-106或miR-155导致它们在来自MEF细胞的外泌体中高度富集；图4显示了在某些条件下，将miRNA插入前-miR-451主链中可能导致外泌体中miRNA的富集达到1000倍。用含miR-199、miR-155或miR-106的前-miR-451表达质粒(“技术”)转染MEF细胞，并且将外泌体纯化并在外泌体和细胞上进行RT-qPCR。前-miR-451对插入的miRNA在细胞中的水平具有可忽略的影响，但引起外泌体中的miRNA的100-1000倍的增加；图5显示了胚胎干细胞(ES)产生大量外泌体。(A，B)来自具有外泌体标记Alix、Flotillin2和CD63的人胚胎干细胞的外泌体制剂的蛋白质印迹。ES1是人ES细胞系H1。ES2是人ES细胞系ES2。MSC1-3是从Wharton’sjelly获得的间充质干细胞的三种制剂。根据文献，MSC比许多细胞类型产生更多的外泌体。ES细胞似乎释放大量的外泌体，并且可能对于外泌体的大规模生产作为治疗剂非常有用。(C)来自ES细胞的外泌体也含有Argonaute2(AGO2)，即一种参与前-miR-451加工成成熟miR-451的蛋白质。结果表明ES细胞外泌体可能是用于负载siRNA至使用前-miR-451主链中的特别令人感兴趣的候选物；图6显示了选择产生丰富外泌体的干细胞。(A)使用由差速离心制备的外泌体制剂的动态光散射强度测定相对外泌体量。胚胎干细胞(ESC)克隆H9与四种遗传差异诱导的多能细胞(iPs)中的一种产生可检测水平的外泌体。(B)通过动态光散射测量相同的外泌体制剂的外泌体大小。注意，来自ESC克隆H9的外泌体产生的外泌体很小(60nm)，但在正常范围内(40nm–120nm)内。(C)通过动态光散射测量ESC克隆H1和两批间充质干细胞(MSC)的外泌体大小。(D)来自这些细胞类型的外泌体制剂中的外泌体标记Flotillin2的蛋白质印迹证明外泌体的存在和相对丰度。(E)使用来自如(D)所示的细胞的外泌体制剂的动态光散射强度测量相对外泌体量；通过蛋白质印迹确定的丰度和动态光散射密切相关。(E)注意，ESC克隆H1比克隆H9产生多10倍的外泌体，且比MSC多若干倍的外泌体，被广泛认为产生大量外泌体。因此，ESC克隆H1和MSC可能被鉴定为主要候选物；图7显示了miR-451在来自人胚胎干细胞(H9系)的外泌体中强烈富集。这表明人胚胎干细胞且特别是这种细胞系用于使用前-miR-451主链包装siRNA至外泌体中可能是特别有趣的；图8显示了核酸茎-环主链可能在总长度、茎碱基配对和/或环长度方面发生改变，同时仍允许在测试条件下在外泌体中富集目标核酸(在本实例中为siRNA)。编码前-miR-451茎环主链和插入的GFPsiRNA的质粒从野生型(WT)(如A所示)突变以延长茎(B)、环(D)，并中断茎中的碱基配对(C)，如所示。将这些质粒转染至细胞中，并且在2-3天后纯化外泌体并进行RT-qPCR。量化了外泌体中归一化至miR-16和let-7a的GFPsiRNA的丰度(富集倍数)，结果在(E)中示出；图9显示了模拟各种加工阶段的miR-451的RNA衍生物可以比传统的具有3’突出端的双链siRNA更有效地提供在外泌体中富集完整的靶标核酸(在本实例中为siRNA)。测试在各种加工阶段模拟WT前-miR-451的合成RNA构建体的外泌体富集。将构建体转染至细胞中，并通过差速离心进行外泌体纯化后通过RT-qPCR测量外泌体富集。将miR-451衍生的成熟siRNA归一化至外泌体中的let-7a和miR-16的水平细胞。经测试的构建体包括在Drosha加工(A)之后的WT前-mIR-451构建体、Ago2-裂解形式的构建体(B)和成熟22ntmiR-451(具有包括在一部分环区在内的5’靶向部分的后核酸外切酶活性)(C)。为了比较，还测试了具有3’突出端(D)的标准21ntdsRNAsiRNA。外泌体富集结果显示于(E)中；图10显示了Ago2，在某种程度上，抑制了基于前-mIR-451结构模拟物的含siRNA构建体至外泌体中的包装。在这些实验中，将包含整合在前-miR-451结构模拟物中的靶向GFP或TetR的siRNA序列的质粒转染至细胞中，并且2至3天后通过qRT-PCR测量外泌体相对于细胞中的GFP或TetRsiRNA的水平(相对于外泌体中的let-7a和miR-16/细胞)。在外泌体中将miR-451来源的序列的富集对野生型外泌体归一化至1。X轴显示了测试的细胞类型(MEF[小鼠胚胎成纤维细胞]，Ago2敲除MEF，WTR[用野生型Ago2拯救的Ago2敲除MEF]和CDR(用催化死亡的Ago2拯救的Ago2敲除MEF)；图11显示了用负载有使用前-miR-451结构模拟物产生的SOD1沉默RNA的外泌体在小鼠脑中进行基因沉默。将NSC-34小鼠运动神经元细胞系用表达掺入前-miR-451主链中的SOD1沉默RNA的慢病毒载体转导。将5μg外泌体注射至人G93ASOD1转基因小鼠的脑室内间隙中，并且两天后将小鼠安乐死。将组织快速冷冻并加工用于RT-qPCR和FISH。(A)使用Taqman探针的RT-qPCR分析量化了皮质和小脑中的相对于对照(β-肌动蛋白和TBP)的SOD1。(B)加工来自小鼠的皮质组织以用于FISH分析SOD1siRNA(Exiqon微RNAISH，GADPHmRNA(Stellaris探针Quasar670)，人SOD1mRNA(Stellaris探针Quasar570)。显示了代表性落射荧光图像。(C)经来自用包装有靶向SOD1的沉默RNA的外泌体注射的小鼠的皮质的4-8幅图像，SOD1mRNA信号强度相对于GAPDH信号强度的量化；图12显示了其中负载有使用前-mIR-451结构模拟物产生的GFP-靶向siRNA的外泌体减少的选定靶细胞中的GFP表达的数据。将来自用表达掺入前-miR-451结构模拟物中的GFPsiRNA的构建体转染或转导的外泌体-产生供体细胞的外泌体用表达GFP的外泌体靶细胞(HeLa、NSC-34或Neuro2a[N2A])孵育48小时，并通过流式细胞术分析GFP表达。从多个不同外泌体供体细胞产生的含有GFPsiRNA的外泌体在HeLa细胞中降低GFP表达；和图13提供了本文所述的选定核酸的核酸序列。应理解，上述附图是为了意在用于本领域技术人员的说明目的而提供的，并不意味着以任何方式进行限制。具体实施方式本文描述了化合物、组合物、核酸构建体、核酸主链、标签、核酸结构模拟物及用于包装目标核酸(诸如(但不限于)基因沉默核酸)至外泌体中的方法。作为非限制性实例，本发明提供了用于包装基因沉默核酸(例如，但不限于siRNA、miRNA、shRNA及其它)至用作递送媒介物的外泌体中的方法、核酸-包装的外泌体及包含所述包装的外泌体的组合物。在某些实施方案中，提供了核酸构建体，其用于通过掺入目标核酸至所述核酸构建体中来实现包装目标核酸在外泌体中。应理解，实施方案和实施例是为了意在用于本领域技术人员的说明目的而提供的，并不意味着以任何方式进行限制。在某些实施方案中，本文提供了用于产生或制备富集有或包含基因沉默核酸、目标核酸或其前体的外泌体的方法，所述方法包括：-引入核酸构建体至外泌体-产生细胞中或在外泌体-产生细胞中表达核酸构建体，所述核酸构建体包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸、目标核酸或其前体；和-从细胞产生外泌体。在某些实施方案中，以上方法可以任选地包括收集或富集所产生的外泌体或外泌体-样囊泡的另外步骤。如将会理解的那样，可参照本文提供的教导通过本领域技术人员已知的几种适合方法中的任一种来纯化外泌体或外泌体-样囊泡。例如，可以通过其中在高达10至20000g的初步离心步骤中消除细胞和较大的囊泡或碎片的差速离心来纯化外泌体，并且可随后通过在70000g或更高下在SW28或SW32转子(或其它转子类型中的等效物)中离心1h从所得上清液中富集外泌体。也可以通过使用诸如SystemsBiosciencesExoquick、ExiqonmiRCURY外泌体分离试剂盒或来自Thermofisher的总(Total)外泌体分离试剂盒或类似技术的试剂沉淀来纯化外泌体。也可以使用真空泵、切向流过滤或离心过滤使用基于尺寸的过滤来富集外泌体。在此类方法中，可以通过滤过具有大于100nm且通常为0.22um的孔的过滤器来消除细胞和较大的囊泡或碎片。然后可通过切向流过滤或其它过滤方法使用孔小于100nm的过滤器浓缩外泌体。也可以通过亲和纯化来纯化外泌体。在此类方法中，结合至外泌体的抗体或其它配体可以偶联至珠粒或其它固定支撑物，以允许从液体中捕获、纯化和浓缩外泌体。参照本文的教导，本领域技术人员将能够选择适合于特定应用的适合的收集或富集技术。应理解，在某些实施方案中，核酸构建体可以指任何适合的RNA-基(或部分RNA-基)核酸序列，或其适合的DNA修饰和/或化学修饰的类似物，其包含掺入前-miR-451结构模拟物序列中的基因沉默核酸、目标核酸或其前体，使得至少一部分的核酸构建体采用包含基因沉默核酸/目标核酸/其前体并且基本上在结构上模拟前-miR-451的二级结构。应理解，在某些非限制性实施方案中，如本文所述的核酸构建体可以在结构上类似于前-miR-451或原-miR-451二级结构。在另外的非限制性实施方案中，适合的核酸构建体可以包括作为在结构上模拟前-miR-451二级结构的核酸的前体(即可经酶促加工以产生前-miR-451二级结构模拟物的核酸)的核酸构建体。经预测由前-miR-451采用的二级结构是如下的茎-环结构：(序列表中序列1，即SEQIDNO:1)该预测的二级结构是为了非限制性说明的目的而提供的。应理解，其它类似的二级结构可能是可能的。作为非限制性实例，Yang和Lai,RNA,2012预测了2nt的环(Yang,Maurin,Lai,RNA,18,945,2012)，而Cifuentes等,Science,2010预测了4nt的环部分。这些参考文献中的每一个都通过引用整体并入本文。通过引用整体并入本文的Ohno等,DevelopmentofNovelSmallHairpinRNAsthatdonotRequireProcessingbyDicerorAgo2,MolecularTherapy,doi:10.1038/mt.2016.81进一步描述了允许加工成miRNA的前-miR-451结构的修饰，并且描述了在保持环的同时将茎缩短至约14-15nt，而miR-451加工途径仍然有效。前-miR-451结构模拟物可以是包含采用基本上在结构上和/或功能上类似于如上文所示或如本文进一步详细描述的前-miR-451的二级结构的序列的任何适合的核酸。在某些实施方案中，前-miR-451结构模拟物可以是包含具有12-21nt长的茎和2-12nt长的环的茎环结构的核酸。在一个实施方案中，茎-环可以包括长度为12、13、14、15、16、17、18、19、20或21nt的茎，与长度为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12nt的环的任何单独组合。前-miR-451结构模拟物没有必要包括任何前-miR-451一级序列，尽管这在非限制性实施方案中可以是可能的。在某些实施方案中，前-miR-451结构模拟物可包含茎-环二级结构。在某些另外的实施方案中，茎-环二级结构可例如具有平末端、5’突出端、3’突出端或5’和3’松散端。在某些非限制性实施方案中，突出端可能是茎环的一个臂超过另一个臂的延伸部分。在某些非限制性实施方案中，突出端可能例如长达约3nt。在某些实施方案中，前-miR-451结构模拟物可以包含总长为约25-54个核苷酸(nt)的茎-环二级结构。在某些实施方案中，茎环二级结构可以具有约40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或52个核苷酸(NT)的总长。在某些实施方案中，前-miR-451结构模拟物可以包含具有约4、5、6、7或8个核苷酸的总环长的茎环二级结构。在某些实施方案中，前-miR-451结构模拟物可包含在茎中有一个或多个碱基对错配的茎环二级结构。在某些实施方案中，前-miR-451结构模拟物可以包含具有位于前-miR-451Drosha裂解位点相邻的前3个碱基对内的一个或多个碱基对错配的茎环二级结构。如将在下面进一步讨论的，在某些实施方案中，前-miR-451结构模拟物序列的茎-环结构可以包含基因沉默核酸/目标核酸/其前体、或其至少大体部分、或由其衍生的适合的核酸序列。作为非限制性实例，siRNA可以如下掺入前-miR-451结构模拟物中：前-miR-451结构模拟物的5’茎部分(以及任选地，至少一部分环区和/或一部分3’茎)可以被来自siRNA或来源于siRNA的引导链替代，并且为了保持前-miR-451的结构模拟物，前-miR-451结构模拟物的3’茎部分可以相应地被至少基本上是5’茎部分的反向互补序列的序列替代，从而产生其中掺入了基因沉默核酸的前-miR-451结构模拟物。尽管前-miR-451结构模拟物的一级序列可能不像前-miR-451的一级序列，前-miR-451的二级结构维持了如上所述的茎-环结构。在某些非限制性实施方案中，适合的核酸构建体可具有约40-65nt的序列长度(大约对应于前-miR-451的长度，取决于所制备的变体)或高达300nt或更高的序列长度(大约对应于原-miR-451的长度)。可将这些核酸构体或其裂解片段(诸如但不限于长度为18-35nt的酶促裂解片段)包装在外泌体中，并且在涉及例如siRNA/miRNA包装的某些实施方案中，在包装外泌体之前、期间或之后或随后在靶细胞中加工成成熟的siRNA/miRNA。在另外的非限制性实施方案中，可掺入前-miR-451结构模拟物中的核酸的实例可包括具有约12-32nt长度的那些核酸，诸如12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32nt长的核酸。除了上面和下面描述的目标核酸之外，在某些实施方案中，目标核酸还可以包括可以容纳在前-miR-451结构模拟物内的具有约12-32nt长度的激活RNA(如启动子-相关的)、影响剪接的RNA、影响表观遗传状态的RNA或其它适合的RNA、DNA或经化学修饰的目标核酸。应理解，如本文所述的前-miR-451结构模拟物可能相对于内源性前-miR-451具有显著的序列变化，只要前-miR-451茎-环二级结构基本保持和/或者只要前-miR-451功能基本保持。作为非限制性实例，适合的结构模拟物前-miR-451可包含长度与前-miR-451的长度类似并且茎-环型结构与前-miR-451主链类似的茎-环序列，其中茎为约12-21nt长且环为约4-12nt长。在某些非限制性实例中，较小的环是有可能的，诸如2-3nt环。前-miR-451结构模拟物还可以包括在结构上模拟前-miR-451突变体和变体的核酸，其基本保留前-miR-451的内源性质/功能(诸如酶促裂解特征和/或外泌体包装特征)。适合的前-miR-451模拟物的实例可以包括，例如，如美国专利8,273,871中所述的适合的前-miR-451结构模拟物，其通过引用整体并入本文。前-miR-451结构模拟物还可以包括，在某些非限制性实施方案中，在结构上或功能上模拟前-miR-451或前-miR-451前体或前-miR-451的部分加工的中间体的核酸。在某些实施方案中，前-miR-451结构模拟物可以包括由下游前-miR-451加工产生的核酸的模拟物，包括Drosha裂解、Ago2裂解和/或3’核酸外切酶裂解产物。在某些实施方案中，前-miR-451结构模拟物可以包含具有延伸至Ago2裂解位置或在Ago2裂解位置之前的3’末端的茎环二级结构，使得前-miR-451结构模拟物包括5’突出端部分和3’碱基对部分。在某些其它实施方案中，前-miR-451结构模拟物可以包含包括3’部分在内的单链结构，其任选地为模拟成熟miR-451的环-衍生的序列。举例来说，此类前-miR-451结构模拟物可包含长度为约22-35nt的单链核酸，诸如长度为约23-24nt的单链核酸。应理解，在某些非限制性实施方案中，前-miR-451模拟物可以是具有模拟miR-451前体的序列/结构的任何适合的核酸序列。作为非限制性实例，前-miR-451模拟物可以是以与前-miR-451类似的非Dicer-依赖性、AGO-2依赖性方式加工并且/或者保留前-miR-451的内源性质/功能(诸如外泌体包装特征)的核酸序列。在一个非限制性实施方案中，具有目标核酸诸如基因沉默核酸掺入其中的前-miR-451结构模拟物可以为任何适合的核酸序列，所述核酸序列以与前-miR-451的方式类似的非Dicer-依赖性、AGO-2依赖性方式加工，以便产生目标核酸或其前体。在某些实施方案中，适合的前-miR-451结构模拟物的非限制性实例可以包括具有适合的序列和/或结构改变或变种的那些，其被AGO2耐受且不损害前-miR-451-型酶促加工。并非所有细胞类型产生/释放外泌体。也应理解，外泌体-产生细胞可以指产生/释放外泌体或外泌体-样囊泡的任何细胞。在某些实施方案中，外泌体-产生细胞可以是与其它外泌体-产生细胞相比天然富集了miR-451或前-miR-451的外泌体-产生细胞，或其中与其它外泌体-产生细胞相比缺乏Ago2的外泌体-产生细胞。在另外的实施方案中，外泌体-产生细胞可以是天然产生富集了内源性miR-451的外泌体或外泌体-样囊泡的细胞，诸如但不限于人胚胎干细胞H9或H1细胞、间充质干细胞、原代树突细胞、MDA-MB-231细胞、浆细胞(Cheng,2014,Journalofextracellularvesicles,3)、血清细胞(Cheng,2014,Journalofextracellularvesicles,3)、肥大细胞(Valadi,2007,NatCellBiol,9:654)、成胶质细胞瘤细胞、B细胞、心脏祖细胞或MSC细胞(Collino,2010,PLosOne,5:e11803)。在又另外的实施方案中，外泌体-产生细胞可为但不限于胚胎干细胞、间充质干细胞或前两种干细胞的任何分化形式、树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、T或B细胞、成纤维细胞或细胞系诸如但不限于HeLa、293T或MDA-MB-231细胞系。在某些实施方案中，外泌体-产生细胞可能是天然产生富集有miR-451的外泌体的细胞。在某些另外的实施方案中，该细胞可为原代人间充质干细胞、原代小鼠巨噬细胞、人乳腺癌细胞系诸如MDA-MB-231、小鼠或人神经元细胞系诸如Neuro2a或SHSY、小鼠星形胶质细胞系诸如C8Da或SIM、小鼠小神经胶质细胞系诸如BV2、小鼠运动神经元细胞系诸如NSC-34或MN-1、HeLa、小鼠胚胎成纤维细胞或小鼠树突细胞诸如JAWSII。举例来说，该细胞可能是MEF或JAWSII细胞。另外的实施方案中，外泌体-产生细胞可以是胚胎干细胞(ESC)克隆H1或H9细胞、间充质干细胞(MSC)或具有低Ago2表达或活性水平的细胞，或其中Ago2被敲除或稳定沉默的细胞。举例来说，具有低Ago2表达或活性水平的细胞可包括黑素瘤细胞系、HepG2细胞系、MCF-7细胞系、用来那度胺处理的细胞或使用诸如Crispr、TALEN锌指或技术人员已知的其它方法的技术衍生的具有Ago2遗传缺失的细胞。关于具有低Ago2表达或活性水平的细胞的进一步讨论可见于Voller等,ArgonauteFamilyProteinExpressioninNormalTissueandCancerEntities,PLOSOne,2016,11(8):e0161165；和Xu等,Expressionofcereblonbindingproteinargonaute2playsanimportantroleformultiplemyelomacellgrowthandsurvival,BMCCancer,2016,16:297，其各自通过引用整体并入本文。在某些实施方案中，Ago2可以使用例如BCI-137或另一种适合的Ago2抑制剂抑制(进一步描述于，例如Masciarelli等,Asmall-moleculetargetingthemicroRNAbindingdomainofArgonaute2improvestheretinoicaciddifferentiationresponseoftheacutepromyelocyticleukemiacelllineNB4,ACSChemicalBiology,2014,9(8),1674-1679；和Schmidt等,MicroRNA-specificargonaute2proteininhibitors,ACSChemBio,2013,8(10),2122-2126；和Xia等,Small-moleculeregulatorsofmicroRNAsinBiomedicine,DrugDevelopmentResearch,2015,76(7),375-381；其每一篇通过引用整体并入本文)。应理解，在某些非限制性实施方案中，可能可以使用基因沉默剂诸如siRNA或基因表达载体来改善外泌体-产生细胞或由外泌体产生细胞产生的外泌体的特征。作为非限制性实例，可能可以使用siRNA剂来增加细胞外泌体产生，或者使外泌体-产生细胞或由其产生的外泌体的特征形成，以例如减少免疫原性、致癌性、毒性或其它不期望的性质。在某些非限制性实施方案中，可能可以使用包括原-miR-144和原-miR-451(或如本文所述的其结构模拟物)在内的转录物，其中将影响细胞或外泌体特征的可替代的siRNA插入至原-miR-144序列中。外泌体-产生细胞的实例可以以在标准细胞培养条件下外泌体产生从最少至最多的大致顺序包括(但不限于)：-成胶质细胞瘤细胞系U251-MG；-上皮细胞和成纤维细胞细胞如HeLa、MDA-MB-231和HCT-116细胞(产生中等量的外泌体)；和-神经元、免疫和血细胞(包括树突细胞、巨噬细胞、T细胞、B细胞、网织红细胞)、间充质干细胞和胚胎干细胞(产生丰富的外泌体)。在某些非限制性实施方案中，外泌体-产生细胞可能是人类细胞。当引入人类患者中时，与来自小鼠细胞的外泌体相比，由人类细胞产生的外泌体可能具有降低的免疫原性，这可能是由于组织相容性复合物的差异减少(Bach,1987,NEnglJMed,317:489)。在另一个非限制性实施方案中，外泌体-产生细胞可为胚胎干细胞(ESC)克隆H1或H9细胞，或间充质干细胞(MSC)。在另一个非限制性实施方案中，外泌体-产生细胞可能是经诱导的多能干细胞，诸如源自待治疗患者的经诱导的多能干细胞。在某些非限制性实施方案中，可将外泌体-产生细胞在无血清培养基中，或在经处理或加工以去除或减少外泌体含量的血清培养基(即外泌体-排除的血清培养基)中培养，同时产生外泌体或外泌体-样囊泡，以防止或减少所产生的外泌体的污染，其中外泌体通常存在于典型的含血清培养基中。在涉及需要含血清培养基用于生长的细胞的某些非限制性实施方案中，在释放至无血清培养基中的所产生的外泌体的产生/收集期间，去除血清培养基并暂时在无血清培养基中培养细胞也是可能的。然而，在某些情况下，突然去除血清培养基可能降低某些细胞的外泌体产生。一般来说，外泌体通常是由多种细胞类型释放的40-150nm囊泡。外泌体可由脂质双层和含有多种蛋白质、RNA和源自外泌体-产生细胞胞质的其它分子的腔空间组成。外泌体的膜和腔内含物两者可以选择性地富集了来自外泌体-产生细胞的脂质、蛋白质和RNA的亚群。外泌体膜通常但不必然富集了包括胆固醇和鞘磷脂在内的脂质且含有较少的磷脂酰胆碱。外泌体膜可能富集了来源于细胞质膜的特定蛋白质诸如四次跨膜蛋白(如CD63、CD81、CD9)、PrP和MHCI、II类。外泌体腔可能富集了诸如Flotillin1和2、膜联蛋白1和2、热休克蛋白、Alix和Tsg101的蛋白质。外泌体经常富集了miR-451或前-miR-451。应理解，如本文所述的外泌体可以，在某些非限制性实施方案中，也涵盖外泌体-样囊泡。本领域技术人员将认识到，本文中对外泌体的提及可包括其它适合的外泌体-样囊泡，其可能与典型的外泌体有所不同，但仍在功能上和/或结构上相似或相关。还应理解，如本文所述的外泌体-产生细胞可以，在某些非限制性实施方案中，也涵盖外泌体-样囊泡-产生细胞。本领域技术人员将认识到，本文对外泌体-产生细胞的提及可包括产生外泌体-样囊泡的其它适合的外泌体-样囊泡-产生细胞，其可能与典型的外泌体有所不同但在功能上和/或结构上相似或相关。如本领域技术人员将理解，如本文所述的外泌体还可以包括，在某些非限制性实施方案中，在50-150nm之间的其它适合的外泌体-样囊泡(其含有外泌体标记)和/或100-600nm的更大的外泌体-样囊泡。应理解，基因沉默核酸可以是减少、防止或沉默靶基因表达的任何核酸。不希望受限制，适合的基因沉默核酸可以包括siRNA、反义寡核苷酸(AON)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)或其它RNA干扰(RNAi)或反义寡核苷酸(AON)基因沉默促发剂等。例如，基因沉默核酸可以包含与靶mRNA完全、基本上或部分互补的siRNA反义链或反义寡核苷酸。作为非限制性实例，siRNA/miRNA可以与通过触发RISC来沉默非基因表达的mRNA序列的区域完全、基本上或部分互补(即在核苷酸2-7处具有种子-区互补性)。还应理解，基因沉默核酸可以是影响基因表达的转录速率或表观遗传控制的核酸。基因沉默核酸可包括，作为非限制性实例，具有基因表达调控性质的小RNA。作为另外的非限制性实例，基因沉默核酸可以包含CRISPR核酸，例如CRISPR引导RNA。当回顾本文概述的各种实施例和/或实施方案时，本领域技术人员将认识到基因沉默核酸可以是导致细胞内特定基因的表达被减少、防止或“沉默”的任何核酸。作为非限制性实例，基因沉默核酸可以是或可以来源于siRNA(小干扰RNA)、反义寡核苷酸(AON)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)或另一种RNA干扰(RNAi)或反义基因沉默触发剂等(参见，例如，Gaynor等,RNAinterference:achemist’sperspective.Chem.Soc.Rev.(2010)39,4196-4184；Bennett等,RNATargetingTherapeutics:MolecularMechanismsofAntisenseOligonucleotidesasaTherapeuticPlatform,AnnualReviewofPharmacologyandToxicology,50,259-293)。基因沉默核酸可以通过任何机制降低基因表达，例如但不限于如本领域已知的转录前或转录后基因沉默技术。鉴于特定的基因序列，本领域技术人员将能够设计能够靶向所述基因序列的基因沉默核酸，从而减少该基因的表达(转录、翻译或两者)。各种基于软件的工具可用于设计用于靶向特定基因的siRNA或AON，包括可从WhiteheadInstitute(http://sirna.wi.mit.edu/)获得的那些，或可从siRNA和AON的商业提供者获得的那些。基因沉默核酸可以如例如由Wiley出版的CurrentProtocolsinNucleicAcidsChemistry中所述制备。应理解，在某些非限制性实施方案中，miRNA可以包括天然表达的miRNA序列，以及还有具有miRNA-样作用机制但具有与天然表达的miRNA序列不匹配的核酸序列的核酸。还应理解，在某些非限制性实施方案中，如本文所述的核酸可以包含如本领域技术人员已知的对核酸主链、糖或核碱基的一种或多种化学修饰。作为非限制性实施例，如本文所述的核酸可以是经修饰的核酸，其包含增加靶结合亲和力、特异性、稳定性、负载至Ago蛋白质中和/或对核酸酶降解的耐受性和/或减少脱靶效应的一种或多种化学修饰。对核酸进行的化学修饰的实例在本领域中是熟知的，其实例描述于例如Gaynor等,RNAinterference:achemist’sperspective.Chem.Soc.Rev.(2010)39,4196-4184和Bennett等,RNATargetingTherapeutics:MolecularMechanismsofAntisenseOligonucleotidesasaTherapeuticPlatform,AnnualReviewofPharmacologyandToxicology,50,259-293中。在某些非限制性实施方案中，可使用基因沉默核酸，诸如短发夹RNA(shRNA)-或siRNA-型核酸或者另一种miRNA或RNAi-型核酸或者源自其的适合的核酸。基因沉默核酸可以具有与mRNA或RNA靶标的完全序列互补性、部分序列互补性或种子区互补性。序列可以具有，作为非限制性实例，连续定位或者遍布于核酸序列长度的15nt-、16nt-、17nt-、18nt-、19nt-、20nt-、21nt-、22nt-、23nt-或24nt-序列互补性，或定义为跨越这些值中的任两个的任何范围，或定义为跨越这些值中的任两个并且排除这些值中的一个或多个的任何范围。作为非限制性实例，序列可能具有完全互补性，诸如24nt完全互补性或17-19nt互补性。在另外的非限制性实施方案中，基因沉默核酸(诸如shRNA或siRNA)与mRNA或RNA靶标之间的序列非互补性或序列错配可以发生在一个或多个位点，诸如，例如，从成熟基因沉默核酸的5’末端算起的位置3、4、5、6、7、8、9、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23中的一个或多个，或定义为跨越这些值中的任两个的任何范围，或定义为跨越这些值中的任两个并且排除这些值中的一个或多个的任何范围。还应理解，基因沉默核酸的前体可为能够提供基因沉默核酸给细胞的任何核酸序列。作为非限制性实例，前-miRNA可以被认为是基因沉默核酸的前体，因为前-miRNA被细胞酶促加工以产生成熟的miRNA。类似地，更长的dsRNA可以被细胞加工以产生siRNA。在某些非限制性实施方案中，基因沉默核酸的前体可以是或可以包含掺入如下文进一步详细描述的前-miR-451核苷酸主链序列中的miRNA或siRNA，或其酶促裂解产物。原-miR-451核酸序列显示在图2A中，并且在本文中称为SEQIDNO:2。如图2A所示，原-miR-451由DROSHA加工以产生前-miR-451(其序列在下面的SEQIDNO:2中加下划线，并且在SEQIDNO:3中提供)。然后前-miR-451被Ago2裂解以产生SEQIDNO:4。然后将该RNA在其3’末端修整以产生逐步更短(processivelyshorter)的RNA，最常见的是SEQIDNO:5(Cifuentes,Science,2010)。SEQIDNO:2：5’–CUUGGGAAUGGCAAGGAAACCGUUACCAUUACUGAGUUUAGUAAUGGUAAUGGUUCUCUUGCUAUACCCAGA–3’(前-miR-451miRNA区加下划线)SEQIDNO:3：5’–AAACCGUUACCAUUACUGAGUUUAGUAAUGGUAAUGGUUCUC–3’(环区加下划线)SEQIDNO:4：5’–AAACCGUUACCAUUACUGAGUUUAGUAAUGG–3’SEQIDNO:5：5’–AAACCGUUACCAUUACUGAGUUU–3’在某些非限制性实施方案中，可以基于以上概述的miR-451酶促加工途径的知识来设计掺入目标核酸诸如基因沉默核酸的前-miR-451的结构模拟物。如果为了沉默靶基因的表达而将例如siRNA或miRNA引导链包装在外泌体中以递送至靶细胞，那么用于该应用的前-miR-451结构模拟物可以，作为非限制性说明性实例，如下设计：●鉴定目标siRNA或miRNA引导链序列；●使用siRNA或miRNA引导链序列形成前-miR-451模拟物的5’茎部分，并且任选地形成前-miR-451模拟物环区的全部或一部分，并且任选地部分延伸至5’侧的3’茎部分中；●鉴定与存在于前-miR-451模拟物的5’茎部分中的经鉴定的siRNA或miRNA目标引导链序列的一部分互补或基本上互补的序列；●使用经鉴定的互补序列形成前-miR-451模拟物的3’茎部分；和●任选地，确认设计的前-miR-451模拟物以与前-miR-451类似的非Dicer-依赖性、AGO-2依赖性方式进行加工，任选地使用适合的方法，诸如例如Yang等,PNAS,2010,107(34):15163-15168中描述的那些方法。“重新编辑”miR-451模拟物以靶向其它基因的另外实例可见于Yang等，PNAS,2010,107(34):15163-15168和美国专利No.8,273,871，这两篇文献通过引用整体并入本文。应理解，可以使用例如固相合成或本领域已知的其它方法化学合成如本文所述的核酸构建体。如本领域已知的，也可以通过从适合的表达载体进行细胞表达或体外表达来制备核酸构建体。如本文所述的核酸构建体的变体、经化学修饰的类似物和结构模拟物也是可能的。举例来说，在美国专利No.8,273,871中描述了原-和/或前-miR-451的一些变体和结构模拟物，其通过引用整体并入本文。应理解，可以使用许多众所周知的方法中的任一种将核酸构建体引入细胞中、在细胞中表达或者导致其由细胞产生。将核酸构建体引入细胞中可以包括使用如本文所述的方法或使用本领域已知的适合方法在细胞内表达核酸构建体，和/或可以包括经由例如转染将核酸构建体直接引入细胞中。(病毒、质粒或其它)表达载体可以被转染、电穿孔或以其它方式引入细胞中，所述细胞然后可以表达一种或多种核酸构建体。可替代地，可以例如经由转染或电穿孔(即使用诸如但不限于LipofectamineTM、Oligofectamine或本领域已知的任何其它适合的递送试剂的转染试剂)或经由本领域已知的靶向基因或核酸递送媒介物将核酸构建体本身直接引入细胞中。许多递送媒介物和/或试剂在本领域中是众所周知的，其中有几种是可商购获得的。核酸的递送策略描述于，例如Yuan等,ExpertOpin.DrugDeliv.(2011)8:521-536；Juliano等,(2012)Acc.Chem.Res.45:1067-1076；和Rettig等Mol.Ther.(2012)20:483-512。转染方法的实例描述于例如Ausubel等(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork中。表达载体实例描述于例如CloningVectors:ALaboratoryManual(Pouwels等,1985,增刊1987)中。其它实例在下面的实施例11中讨论。应理解，将核酸构建体引入细胞中可指细胞内由基因(诸如已被引入细胞中的外源基因)产生核酸(即转录)。更通常地，就沉默基因表达而言，应理解，基因表达可以包括转录和翻译过程，因此基因表达可以指产生核酸序列诸如mRNA(即转录)、产生蛋白质(即翻译)或两者。将基因或转录序列引入细胞中可以使用本领域已知的几种方法中的任一种来完成。举例来说，包含各自由适合的启动子驱动序列(例如，组成型或诱导型启动子)驱动的一个或多个拷贝的特定基因的(病毒、质粒或其它)载体可以经由转染、电穿孔或病毒感染或本领域已知的另一种适合的方法引入细胞中。用于过表达或引入特定基因至细胞中的适合的表达载体技术在本领域是已知的(参见，例如，MolecularCloning:ALaboratoryManual(第4版),2012,ColdSpringHarborLaboratoryPress)。在将核酸序列插入细胞的背景下，引入基因(或转录的序列/区域)是指"转染"、"转化"或"转导"，并且包括将核酸序列掺入或引入真核细胞中，其中核酸序列可以任选地掺入细胞的基因组中或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。应理解，化合物和/或组合物，可以使用包含如本文所述的一种或多种核酸和/或外泌体或由如本文所述的一种或多种核酸和/或外泌体组成。组合物可以另外地包含一种或多种药学上可接受的稀释剂、载体、赋形剂或缓冲剂。如本文所参考的，关于特定序列或其指定部分的同一性百分比(％)或序列同一性％可以定义为候选序列中的与主题序列(或其指定部分)中的核苷酸或氨基酸相同的核苷酸或氨基酸的百分比，如果有必要在比对序列和引入缺口后以实现如程序WU-BLAST-2.0产生的最大序列同一性百分比，其中检索参数设置为默认值(Altschul等,J.Mol.Biol.(1990)215:403-410；网站blast.wustl.edu/blast/README.html)。举例来说，同一性值％可以由匹配的相同核苷酸或氨基酸的数量除以报道的同一性百分比的序列长度来确定。氨基酸序列相似性百分比(％)可以通过与用于测定氨基酸序列同一性％的相同的计算来确定，但是除了计算中的相同氨基酸之外，还可以包括保守氨基酸取代。寡核苷酸比对算法诸如，例如BLAST(GenBank；使用默认参数)可用于计算序列同一性％。两条核酸序列可能基本上相同的可替代指示是两条序列在中等严格条件或优选严格条件下彼此杂交。例如，可以根据Ausubel,等(编辑),1989,CurrentProtocolsinMolecularBiology,第1卷,GreenPublishingAssociates,Inc.,和JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,p.2.10.3进行在中等严格条件下的与筛选-限制序列的杂交。可替代地，在严格条件下与过滤器-结合序列的杂交可以例如根据Ausubel,等(编辑),1989，同上进行。杂交条件可根据已知方法根据目标序列进行修饰(参见，例如，Tijssen,1993,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicAcidProbes,PartI,Chapter2"Overviewofprinciplesofhybridizationandthestrategyofnucleicacidprobeassays",Elsevier,NewYork。通常，作为非限制性实例，严格条件可能比特定序列在确定的离子强度和pH下的热熔点低约5℃。如本领域技术人员所知，用于表达特定基因或转录序列/区域的核苷酸序列可以编码或包括如“GenesVII”,Lewin,B.OxfordUniversityPress(2000)或“MolecularCloning:ALaboratoryManual”,Sambrook等,ColdSpringHarborLaboratory,第3版(2001)所述的特征物。编码特定核酸构建体的核苷酸序列可以掺入适合的载体诸如可商购获得的载体中。也可以使用例如如概述在Sambrook等(ColdSpringHarborLaboratory,第3版(2001))中的标准分子生物学技术单独构建或修饰载体。本领域技术人员将认识到载体可以包括编码所需元件的核苷酸序列，其可以可操作地连接至编码核酸构建体的核苷酸序列。编码所需元件的此类核苷酸序列可包括转录启动子、转录增强子、转录终止子和/或复制起点。选择适合的载体可以取决于几个因素，包括但不限于待掺入载体中的核酸的大小、所需的转录和翻译控制元件的类型、所需的表达水平、所需的拷贝数、染色体整合是否为所需的、所需的选择过程的类型或者意在转化的宿主细胞或宿主范围。应理解，本文考虑了包含具有以下特征的序列的核酸：a)编码如本文所定义的核酸或其片段；b)作为编码如本文所定义的核酸的序列的互补序列，或其片段；c)能够在严格杂交条件下与本文所定义的核酸或其片段杂交；或d)表现出与a)或b)定义的核酸或如本文所述的或另一条核酸序列具有大于或等于约70％，或大于或等于约85％的序列同一性，例如但不限于86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。核酸还可以用一系列同一性，例如上文概述的任何两个百分比来表征。杂交的严格性可以通过杂交和洗涤过程中温度、离子强度、pH以及变性剂诸如甲酰胺的存在来控制。常规使用的条件对于本领域技术人员来说是众所周知的(参见，例如CurrentProtocolinMolecularBiology,第I卷,第2.10章,JohnWiley&Sons,Publishers(1994))。本领域技术人员将理解，本文所述的生物分子和/或化合物可以与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起，和/或与作为药物组合或药物组合物的一部分的一种或多种单独的活性剂或药物一起提供于药物组合物中。在某些实施方案中，生物分子、化合物和/或药物组合物可以与其它药物或药物组合物同时、依序或组合分开或作为合并的组合物或组合以治疗方案施用。如本文所述的生物分子、化合物和/或组合物可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂和/或载体。药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂可以包括本领域技术人员已知的任何适合的载体、稀释剂或赋形剂。药学上可接受的赋形剂的实例可以包括但不限于纤维素衍生物、蔗糖和淀粉。本领域技术人员将认识到，药学上可接受的赋形剂可以包括本领域已知的适合的填充剂、粘合剂、润滑剂、缓冲剂、助流剂和崩解剂(参见，例如，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(2006))。药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂的实例可见于例如Remington’sPharmaceuticalSciences(2000–第20版)和1999年出版的UnitedStatesPharmacopeia:TheNationalFormulary(USP24NF19)中。在如本文所述的方法的某些实施方案中，该方法还可包括用溶酶体抑制剂或自噬抑制剂处理外泌体-产生细胞的步骤。举例来说，外泌体-产生细胞可用溶酶体酸化或V1V0ATP酶的抑制剂处理2至72小时以增加外泌体的产生。此类抑制剂的实例可以包括巴佛洛霉素A1、刀豆素和/或氯喹。考虑到对溶酶体具有类似作用(即影响pH或Ca2+平衡)的其它化合物可具有类似的作用，诸如例如NAADP。在如本文所述的方法的某些另外的实施方案中，该方法还可以包括抑制Ago2在外泌体-产生细胞中的表达或活性的步骤。例如，如上文已经描述的，可以减少或抑制Ago2。在某些实施方案中，例如，可以使用siRNA、反义寡核苷酸或其它基因沉默核酸来抑制Ago2。在另一个实施方案中，本文提供了用于提高由外泌体-产生细胞产生的外泌体内(或另外与其相关的)基因沉默核酸或其前体的水平的方法，所述方法包括：-引入核酸构建体至细胞中或在细胞中表达核酸构建体，所述核酸构建体包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸；和-使细胞产生外泌体。应理解，对富集或增加外泌体内的基因沉默核酸或其前体的水平的提及可指由细胞产生的外泌体内存在的基因沉默核酸(其可能或可能不掺入更大的序列中)的量相较于相应的未处理的细胞或对照细胞中存在的基因沉默核酸的水平的任何增加。在又另一个实施方案中，本文提供了用于将基因沉默核酸或其前体包装至外泌体中或用外泌体包装的方法，所述方法包括：-引入包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸的核酸构建体至外泌体-产生细胞中；和-使细胞产生外泌体。在另外的实施方案中，如上所述的方法中使用的细胞可以是胚胎干细胞(ESC)克隆H1或H9细胞或间充质干细胞(MSC)。在又另一个实施方案中，该细胞可以是胚胎干细胞(ESC)克隆H1细胞。在又另一个实施方案中，该细胞可以是胚胎干细胞(ESC)克隆H9细胞。上文已经描述了细胞的另外实例，并且在下面的实施例8中进一步讨论。下面进一步详细描述的结果表明此类细胞可能能够产生大量的外泌体。在又另一个实施方案中，如上所述的方法中使用的细胞可以是在无血清培养基中培养的细胞，或者是在之前经处理或加工以除去或减少外泌体含量的血清培养基中培养的细胞，同时产生外泌体，以避免或减少典型含血清培养基中存在的外泌体的污染或者促进产生的外泌体的纯化。的确，外泌体在用于培养大多数细胞的胎牛血清中是高度丰富的，因此在某些实施方案中，在无血清培养基或之前经处理或加工以去除或减少外泌体含量的血清培养基中生长细胞可能是有益的。尽管可能在使用通过超速离心或其它方法耗竭了外泌体的胎牛血清的培养基中生长细胞，但在某些实施方案和实例中，使用在无血清培养基中生长的细胞可能是有利的，以避免剩余外泌体的污染。此外，在某些实施方案中，可以有利的是使用不需要其它细胞生长的细胞(例如饲养层)和/或不依赖于细胞培养表面(如Matrigel)的涂层而生长的细胞，其在某些条件下可能会污染外泌体制剂。一般来说，包括H1和H9人胚胎干细胞在内的干细胞在无血清培养基中产生丰富的外泌体。在又另一个实施方案中，上述方法可以任选地进一步包括纯化或浓缩由细胞产生的外泌体的步骤。作为用于说明目的的非限制性实例，可通过多种方法纯化外泌体，包括Thery等Isolationandcharacterizationofexosomesfromcellculturesupernatantsandbiologicalfluids.CurrProtoc.CellBiol.2006(通过引用整体并入本文)中详述的那些方法。这些方法可以包括差速离心，其涉及从细胞以低速(如200-2000g)离心培养基以消除细胞和较大的碎片，回收上清液，以约10000g离心30分钟，回收上清液并以100000g离心1-2小时。可替代地，可使用0.45um或0.22um过滤器(或类似物)过滤上清液以替代第二或第一和第二离心步骤。纯化外泌体的替代方法可以包括沉淀方法，诸如SystemsBiosciencesExoquick试剂盒或由诸如LifeTechnologies或Qiagen的公司出售的类似试剂盒中使用的那些。也可以使用亲和纯化来纯化外泌体，诸如用外泌体的抗体识别元件涂覆的珠粒。也可以使用基于其不寻常密度的密度梯度(如蔗糖密度梯度)纯化外泌体(Thery等以上,Lamparski等J.ImmunologicalMethods2002；通过引用整体并入本文)。同样，可以通过色谱纯化外泌体，诸如通过如本领域技术人员已知的尺寸排阻色谱或场流分离法。在又一个实施方案中，本文提供了组合物，其包含：-外泌体或外泌体-样囊泡；和-包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸的核酸构建体，或其前体或酶促裂解片段；其中核酸构建体或其前体或酶促裂解片段包含在外泌体内，或者携带在外泌体外部上或其组合。应理解，在某些非限制性实施方案中，适合的前体可以包括原-miR-451结构模拟物，或者可以被酶促裂解以形成前-miR-451结构模拟物的另一条核酸序列。还应理解，在某些非限制性实施方案中，适合的酶促裂解产物可以包括成熟miR-451结构模拟物，或前-miR-451结构模拟物成熟过程中存在的插入序列。另外应该理解，在某些非限制性实施方案中，原-miR-451或前-miR-451结构模拟物可以在外泌体包装期间由外泌体-产生细胞完全或部分加工。因此，在某些非限制性实例中，经包装的外泌体可包含(在内部、在外部或其组合)核酸，所述核酸包括原-miR-451结构模拟物、前-miR-451结构模拟物、前-miR-451结构模拟物的成熟(即完全加工的)产物(即例如成熟miRNA)或其间在加工期间出现的插入中间序列。该组合物可以，在某些实施方案中，还包含在外泌体内的一种或多种另外的包含掺入前-miR-451结构模拟物中的另一种基因沉默核酸的核酸构建体，或其前体或酶促裂解片段，使得外泌体含有靶向多于一个基因或靶向相同基因的多于一个区域的基因沉默核酸。该组合物可以，在某些实施方案中，还包含一个或多个另外的含有另一种核酸构建体(所述核酸构建体包含掺入前-miR-451结构模拟物中的另一种基因沉默核酸)或其前体或酶促裂解片段的外泌体，使得该组合物包含含有靶向多于一个基因或相同基因的多于一个区域的基因沉默核酸的外泌体。该组合物可以，在又另一个实施方案中，还包含一个或多个外泌体-产生细胞。在又一个实施方案中，该组合物还可包含不包含血清的无血清培养基，或之前经处理或加工以去除或减少外泌体内含物的血清培养基。在又一个实施方案中，本文提供了包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸的核酸构建体用于包装基因沉默核酸(任选掺入更大的核酸内)或其前体至由细胞产生的外泌体中的用途，其中核酸构建体用于引入相同或不同的细胞中。在又另一个实施方案中，本文提供了包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸的核酸构建体用于包装基因沉默核酸或其前体至由细胞产生的外泌体中，其中核酸构建体用于引入细胞中或在细胞中表达。在另一个实施方案中，本文提供了用于制备富集有目标核酸序列或其前体的外泌体的方法，所述方法包括：-引入包含掺入前-miR-451结构模拟物中的目标核酸序列的核酸构建体至外泌体-产生细胞中；和-使细胞产生外泌体。应理解，目标核酸序列可以是任何适合的小核酸序列，例如但不限于，当递送至细胞中时产生益处的那些。实例可包括但不限于如本文先前所述的基因沉默核酸序列，或本领域已知的三链体-形成核酸或其它非编码RNA或目标小核酸。作为非限制性实例，目标核酸序列可以是影响转录速率或基因表达的表观遗传控制的适合的核酸，诸如在Zhang等,2014,Cell,158:607-619和Kiani等,2013,PLOSGenetics,9(5):e1003498中所述的那些。作为另外的非限制性实例，目标核酸序列可以包含适合的核酸，其是核糖开关、核酶、适体、CRISPR引导RNA或剪接切换核酸，或本领域已知的任何其它适合的目标核酸序列。在又另一个实施方案中，本文提供了核酸递送组合物，其包含：-外泌体或外泌体-样囊泡；和-包含并入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸的核酸构建体，或其前体或酶促裂解片段；其中核酸构建体包含在外泌体或外泌体-样囊泡内，或携带在外泌体或外泌体-样囊泡上或其组合。在核酸递送组合物的另一个实施方案中，外泌体可以是由胚胎干细胞(ESC)克隆H1或H9细胞或间充质干细胞(MSC)或如本文所述的另一细胞产生的外泌体。在核酸递送组合物的又另一个实施方案中，外泌体可以是由在无血清培养基中培养的细胞或由在之前已经处理或加工以去除或减少外泌体内含物的血清培养基中培养的细胞产生的外泌体。在又一个实施方案中，核酸递送组合物可用于沉默由基因沉默核酸靶向的基因的细胞表达。在又一个实施方案中，核酸递送组合物可以用于将沉默RNA递送至用于产生生物治疗剂的细胞中。作为非限制性实例，当细胞被用于生产抗体、疫苗或溶瘤病毒时，可以递送沉默RNA以提高来自细胞的产量或纯度，或者可以提供改善产物的安全性。在另一个实施方案中，本文提供了用于鉴定候选外泌体-产生细胞是否为适用于使用包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸、目标核酸或其前体的核酸构建体产生经富集的外泌体或外泌体-样囊泡的外泌体-产生细胞的方法，所述方法包括：量化由所述候选外泌体-产生细胞产生的外泌体的miR-451含量并确定miR-451是否为外泌体富集的；其中miR-451的外泌体富集指示候选外泌体-产生细胞适用于产生经富集的外泌体或外泌体-样囊泡。在另一个实施方案中，miR-451的外泌体富集可以通过比较miR-451外泌体水平与非miR-451的参考内源性表达的miRNA的外泌体水平来确定。在某些实施方案中，参考内源性表达的miRNA可以是miR-16或let-7a，或另一种适合的RNA或其它组分，其可以预期不依赖于前-miR-451结构模拟物包装至外泌体中。在某些实施方案中，本文还考虑了如本文所述的经包装的外泌体可以用于例如产生生物制品。例如，此类外泌体可用于将siRNA递送至用于产生重组生长因子、抗体或疫苗的细胞中，所述siRNA经设计以提高此类生物制品的产率或质量。例如，增加ER应激耐受性的siRNA可以提高抗体的产率或质量，或抑制细胞的抗病毒响应的siRNA可以例如提高疫苗的产率或质量。例如，如本文所述的此类外泌体可以，在某些实施方案中，用于细胞和/或动物模型中的药物发现和/或靶标验证研究。包装核酸在外泌体中用于细胞递送外泌体代表基因沉默核酸的特别有趣的递送选项。如果可以实现基因沉默核酸的有效体内递送，则可以获得各种疾病的治疗选择。同样，基因沉默核酸的体内有效递送可以促进药物发现过程中的治疗性靶标验证，因为目标基因的体内沉默可以用于确定表型结果而不需要开发小分子药物抑制剂。有证据表明，外泌体-介导的递送方法可以用于在有挑战性的组织如脑中存在得到证实的递送的细胞间通讯的内生系统，并改变其用途。同样，有证据表明，外泌体可以被修饰以靶向多种特定的细胞类型和组织，并且此外泌体具有最小的毒性和免疫原性。来自MSC和未成熟树突细胞的外泌体已经被靶向到肝、免疫系统、肺和心脏(Lai,2010,StemCellRes,4:214；Takahashi,2013,JBiotechnol,165:77；Wiklander,2015,Journalofextracellularvesicles,4:26316)。外泌体也可以靶向甲状腺或具有有窗孔的脉管系统的其它器官(Komarova,2010,AnnualReviewofPhysiology,72:463)。通常，来自不同细胞类型的外泌体在其表面上具有不同的受体(源自外泌体-产生细胞的质膜)。这可能导致它们在小鼠或人类中差异通行(trafficdistinctly)，并可能导致它们被不同范围的细胞类型所吸收。它们也可能含有不同的RNA和脂质货物的特征。在某些非限制性实施方案中，可能的是使用通过化学方法、共价或通过吸附添加至外泌体表面的靶向配体将外泌体靶向至某些细胞或组织。也可以通过添加特定的结构域至受体而添加受体至外泌体表面，从而使其在外泌体中富集。此类外泌体靶向的实例可见于，例如Ohno,Mol.Ther.,2013,21:185和Alvarez-Erviti,Nat.Biotech,2011,29:341-345，其通过引用并入本文。与生产它们的细胞相比，外泌体包装蛋白质和RNA的高度选择性子集。例如，许多miRNA在外泌体中几乎检测不到，尽管它们在细胞中丰富，并且相反(Valadi,2007,NatCellBiol,9:654；Cheng,2014,Journalofextracellularvesicles,3；Collino,2010,PLoSOne,5:e118093)。因此，使用外泌体用于核酸的药物递送的主要障碍是开发适用于以不会物理性地破坏外泌体的生物结构和活性的方式将基因沉默核酸包装至外泌体中的方法。已经进行许多尝试来鉴定在外泌体中富集miRNA或其它RNA的策略。我们之前发现了调控将mRNA包装至外泌体中的机制(Gibbings,2009,NatCellBiol,11:1143)，但这不适用于RNAi。生物信息学检索富集在外泌体中的序列基序，发现一些不充分富集的候选物(Batagov,2011,BMCGenomics,12(3):S18；Villarroya-Beltri,2013,NatCommun,4:2980)。最佳的序列基序仅在一种细胞类型中在外泌体中富集RNA2-5倍(Villarroya-Beltri,2013,NatCommun,4:2980)。还不清楚这种适度效应是否在其它细胞类型中得以维持。此外，将具有挑战性的是保留依赖于与其靶标的完美互补性的RNAi(21nt)的靶向和功效，同时还包括用于外泌体富集的6nt基序。电穿孔将RNAi治疗剂推定性地引入外泌体中(Alvarez-Erviti,2011,NatBiotechnol,29:341)。然而，随后的研究证明，当使用的相同技术进行电穿孔时，大部分RNAi治疗剂沉淀(Kooijmans,2013,JControlRelease,172:229)。此外，许多人怀疑在用于临床使用的外泌体的大量生产中，人们可以在100nm外泌体的膜中始终产生5-10nm(RNAi～5nm)的孔并始终保留其生物学功能。总之，以前尚未鉴定出广泛适用且稳健的机制。通过研究分析外泌体的RNA含量，本文中实现了来自包括以下的多种细胞类型和来源的外泌体的几项研究中，一种显著的miRNA强烈富集在外泌体中(10–10000-倍)：血浆和血清(Cheng,2014,Journalofextracellularvesicles,3)、肥大细胞(Valadi,2007,NatCellBiol,9:654)、成胶质细胞瘤细胞、B细胞、心脏祖细胞和MSC(Collino,2010,PLoSOne,5:e11803)。这种miRNA是miR-451。有吸引力的是，与所有其它miRNA相比，这种miR-451具有独特的生物发生机制(参见图2)。miR-451是唯一已知的没有被RNA酶III酶Dicer裂解而产生的miRNA。Dicer将所有其它前-miRNA的茎-环结构裂解成成熟的～22ntmiRNA。相比之下，前-miR-451在miRNA前体之间具有独特短茎-环(51nt相对于70-120nt)，并直接结合至无处不在的miRNA结合蛋白Ago2，而不是Dicer(Cheloufi,2010,Nature,465:584；Yang,2012,RNA,18:945)。Ago2自身裂解前-miR-451，随后通过其它无处不在的酶修整而产生成熟miR-451。不希望受理论束缚，它可能是提供其独特的生物发生的前-miR-451的茎环结构。研究表明，人们实际上可以将任何成熟的miRNA序列取代至前-miR-451茎环的主链中，并且将其以相同的方式加工(Yang等,2010,PNAS,107(34):15163-15168；Cheloufi,2010,Nature,465:584；Yang,2012,RNA,18:945)。美国专利no.8,273,871概述了前-miR-451主链中影响miR-451生物发生的核苷酸和二级结构的一些实例，以及Cheloufi,2010,Nature,465:584和Yang,2012,RNA,18:945，其公开内容通过引用整体并入本文。本文详细描述了适用于包装基因沉默核酸在外泌体中的核酸构建体的实例。此外，应理解可以使用如本文提供的方法来鉴定其它适用于包装基因沉默核酸至外泌体中的核酸构建体。举例来说，可以将构建体转染至MEF和/或另一种候选细胞中用于外泌体的临床产生。然后可以通过数字PCR测量细胞和外泌体中RNAi的绝对水平。可使基因沉默核酸的外泌体丰度发生显著变化的经测试的核酸构建体，可使用RNA印迹进一步测试以测试基因沉默核酸从核酸构建体切除和成熟的变化。这些研究可用于鉴定适用于包装siRNA/RNAi或其它基因沉默核酸或其它目标核酸序列的核酸构建体至外泌体中。在某些实施方案中，使用Crispr/Cas9进行研究，可以在候选细胞中将载体插入安全基因座中。应理解，外泌体可以在内部、在外部或两者携带核酸序列。例如，外泌体可经由外部附着或吸附在外部携带核酸。因此，本领域技术人员将理解，在某些非限制性实施方案中，本文中对富集有、包含或包装有特定核酸序列的外泌体的提及可指在内部、在外部或其组合携带核酸序列的外泌体。实施例1：用于基因沉默核酸的外泌体包装的核酸构建体在某些实施方案中，本文提供了包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸的核酸构建体。在附图中，miR-155、miR-106和miR-199已经被取代至此类核酸构建体中，从而允许包装基因沉默核酸在外泌体内。的确，本文提供的数据表明，将五种不同的miRNA中的任一种通过插入前-miR-451结构模拟物中可以在外泌体中富集高达1000倍。此外，这种富集发生在至少两种不同的细胞类型中，表明它可能适用于各种不同的细胞。纯化来自乳腺上皮细胞系(MDA-MB-231)或小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的外泌体，并使用多种技术来确认外泌体制剂的性质和纯度(参见图1A-D)。使用动态光散射和Nanosight颗粒追踪来确保经纯化的外泌体是高纯度的直径为100nm的颗粒群，如对外泌体所期望的。蛋白质印迹用已建立的外泌体标记来证明这些100nm囊泡的制剂的富集(参见图1D，E)。从这些外泌体和产生它们的细胞分离RNA，并使用RT-qPCR来表征miRNA的相对丰度。在乳腺上皮细胞(MDA-MB-231)中，四种不同的miRNA在外泌体中的富集程度变化了几个对数。与细胞相比，miR-451是外泌体中最高度富集的miRNA(参见图3A)。其它miRNA在外泌体中的富集要少得多(如let-7a少1/308，miR-106少1/114)。的确，与其它miRNA相比，miR-451在外泌体中的富集是其在细胞中的水平高达308倍(参见图3A)，证实miR-451在外泌体中高度富集。将表达前-miR-451或前-miR-451结构模拟物(包括其它miRNA的序列)的质粒转染至两种细胞类型中。在前-miR-451结构模拟物中表达miR-106或miR-155使它们在由MEF或乳腺癌细胞产生的外泌体中富集高达39倍(参见图3B，D)。在某些测试条件下，结果证明前-miR-451结构模拟物可将miRNA在外泌体中富集高达1000倍，从而在细胞中留下极少的额外miRNA(参见图4)。在MEF细胞中，内源性miR-451在细胞或外泌体中均不可检测(参见图3C)。尽管如此，从前-miR-451结构模拟物表达miR-106或miR-155导致它们在外泌体中的富集高达20倍。这些结果表明，前-miR-451结构模拟物可以用于将RNAi/siRNA或miRNA治疗剂稳健包装在来自不同细胞类型、不同物种并且甚至在缺乏内源性miR-451(MEF)的情况下的外泌体中。在这些实验中，制备并研究了包含miR-155、miR-106和miR-199的靶向序列的前-miR-451结构模拟物。包含miR-155靶向序列的前-miR-451结构模拟物具有如下的一级序列：(SEQIDNO:6；miR-155靶向序列以下划线显示；环以粗体显示)。包含miR-106靶向序列的前-miR-451结构模拟物具有如下的一级序列：(SEQIDNO:7；miR-106靶向序列以下划线显示；环以粗体显示)。包含miR-199靶向序列的前-miR-451结构模拟物具有如下的一级序列：(SEQIDNO:8；miR-199靶向序列以下划线显示；环以粗体显示)。该领域的其它出版物已经鉴定了6核苷酸基序，其可以在一种测试的细胞类型中适度地在外泌体中富集miRNA，或者如期望的那样过度表达miRNA提高了其在外泌体中的水平。在许多情况下，可能难以在21-22个核苷酸沉默RNA中包含特定的6核苷酸基序，并仍保留其特异性和活性。此外，这种基序对分拣至外泌体中的影响相对适度(2-8倍)。如本文详细地讨论，本文提供了特定的核苷酸二级结构，其导致了给定沉默RNA在外泌体中的强富集。此外，这项技术已在两种独立的细胞类型中得到证明，证明其可能更广泛适用。因此，本文提供了一种可能提供更大作用并且可能更适用于多种外泌体-产生细胞类型和沉默RNA的技术。实施例2：用于产生含有基因沉默核酸的外泌体的细胞系的鉴定本文中证实，在乳腺癌细胞和MEF中，插入前-miR-451结构模拟物中导致miRNA稳健地包装至外泌体中。这些结果表明，前-miR-451主链可用于将RNAi或miRNA治疗剂稳健地包装在来自不同细胞类型、不同物种并且甚至在不存在内源性miR-451(MEF)的情况下的外泌体中。对于可能需要大规模生产的外泌体的临床生产来说，使用特别适用于生产含有基因沉默核酸的外泌体的细胞系可能是有趣的。在这方面，相关的细胞系特征可以包括：(1)丰富的外泌体产生(2)免疫原性因子和致癌因子的最小风险，或有利的免疫原性因子，和(3)在无异源物种成分培养基(xeno-freemedia)中可再生的大量培养。来自几种细胞类型的外泌体可能符合这些标准，并且它们可能展现出不同的体内分布，从而允许治疗独特的疾病。此外，外泌体-产生细胞可以经稳定地遗传工程化以用于大量生产，而不是为每名患者重新生产，从而减少与其相关的固有变异性。如果例如使用原代树突细胞，这可能需要从不同的供体取血，并为每批新的外泌体分化细胞。使用ESC或MSC细胞，如果需要，可以可能连续使用相同的细胞并在高度控制的条件下培养它们以减少这种变异性。数据表明从前-miR-451结构模拟物类似地加工RNAi/siRNA和miRNA。因此，插入miR-451结构模拟物中的沉默RNA是否与其靶RNA完全互补似乎不会影响其用于该技术。人胚胎干细胞(ES)、间充质干细胞(MSC)和源自自体血液单核细胞的原代未成熟树突细胞被选作三种目标候选细胞类型。数据显示了特定的ES克隆和MSC而不是iPS细胞产生了丰富的外泌体(参见图5)。原代树突细胞之前用作用于临床试验的外泌体来源(Vlaud,2011,JImmunother,34:65)。图5显示了胚胎干细胞(ES)产生丰富的外泌体。根据文献，MSC比许多细胞类型产生更多的外泌体。ES细胞似乎释放大量的外泌体，表明它们也可用于治疗应用中的外泌体的大量生产。数据还显示来自ES细胞的外泌体还含有参与将前-miR-451加工成成熟miR-451的蛋白质Argonaute2(AGO2)。结果表明，ES细胞外泌体可作为使用前-miR-451结构模拟物将基因沉默核酸负载至外泌体中的感兴趣的候选物。图6显示了产生丰富外泌体的干细胞的选择。胚胎干细胞(ESC)克隆H9和四种遗传差异的诱导多能细胞(iP)中的一种产生可检测水平的外泌体。ESC克隆H1比克隆H9产生多10倍的外泌体，并且比MSC产生多数倍的外泌体，被广泛认为是产生大量外泌体。因此，临床生产外泌体的主要候选物可能包括ESC克隆H1、H9和MSC。在某些非限制性实施方案中，ESC克隆H9可能是优选的细胞系，因为它通常产生强烈富集了miR-451并且可能特别适合本文所述的技术的外泌体。图7进一步显示了miR-451在来自人胚胎干细胞(H9系)的外泌体中强烈富集。这表明使用前-miR-451结构模拟物，人胚胎干细胞且特别是这种细胞系，对于将siRNA包装至外泌体中也可能特别有趣。因此，在某些非限制性实施方案中，H9细胞系可能是优选用于某些应用。虽然H9细胞系在一些实例中可能产生比H1略少的外泌体，但可以获得已经验证用于GMP临床使用的H9形式。实施例3：负载有RNAi的外泌体在小鼠中的分布实现将RNAi递送至肝脏以外的任何组织可以使得能够治疗与此细胞类型或组织相关的几种疾病。因此，可以在静脉内或腹膜内注射后在小鼠中测试从候选细胞类型(例如，ES、MSC和树突细胞)产生的外泌体的分布。可以使用如在其它研究(Zhuang等,MolTher19,1769(2011)，Alvarez-Erviti等,NatBiotechnol29,341(2011))中使用的剂量测试由颗粒数量(Nanosight)或蛋白量确定的外泌体剂量。作为非限制性实例，可以产生稳定表达富集在外泌体(如用C1C2结构域或LAMP2b的细胞质结构域标记)中的萤火虫萤光素酶的细胞(Alvarez-Erviti等,NatBiotechnol29,341(2011)，Zeelenberg等,CancerRes68,1228(2008))。这可以使得能够使用IVIS技术以高灵敏度和最小本底对整个动物中外泌体分布的成像(萤光素酶的CycLuc1底物也允许在脑中成像)。作为非限制性实例，可以使用3只小鼠/组，并且可以预期在一些身体区域中luc增加约4倍(σ＝1，α＝0.05，功率＝0.99)。可以使用为此目的开发的具有在所有组织中由lac阻遏物抑制的有萤火虫萤光素酶的小鼠(Stevenson等,Moleculartherapy.Nucleicacids2,e133(2013))，可以进行以上概述的外泌体分布的可视化，以及整个小鼠中外泌体-递送的RNAi的活性的可视化。无论RNAi是否有活性，靶向lac阻遏物的RNAi都可用于获得基于荧光素酶出现的结果(Stevenson等,Moleculartherapy.Nucleicacids2,e133(2013))。可以例如研究稳定表达靶向lac阻遏物的掺入前-miR-451或前-miR-16(对照)或含非沉默RNAi的前-miR-451中的RNAi的细胞(例如ES、MSC和/或树突细胞)。作为另外的对照，在递送RNAi-负载的外泌体之前，可以用IVIS系统对小鼠成像(例如，4只小鼠/组，估计增加3倍，σ＝1，α＝0.05，功率＝0.99)。IVIS系统可以允许对小鼠成像几次，从而允许分析由外泌体递送的RNAi活性的药代动力学。RNAi分子在细胞中是长效的：经过5天，对其丰度的唯一可测量的影响是通过细胞分裂进行稀释(Gantier等,NucleicAcidsRes39,5692(2011))，并且防止核酸酶消化的化学修饰可能不会改变这种情况(Bartlett,Davis,Biotechnologyandbioengineering97,909(2007))。因此，如在脂质体-递送的RNAi的动物研究中，由外泌体递送的单剂量的RNAi的活性可能持续5天或更久，并且潜在地长达6-8周(Coelho等,NEnglJMed369,819(2013),Bartlett,Davis,Biotechnologyandbioengineering97,909(2007))。可以确定接受RNAi活性的细胞类型，并且可以量化RNAi诱导的mRNA损失。为了使得能够进行线性量化，可以在前-miR-451主链中使用靶向人SOD1的RNAi(在人野生型SOD1小鼠中泛中低表达)。可以注射外泌体，并且可以获得在来自lac-阻遏物荧光素酶小鼠和外泌体分布(上文)的数据指导的时间点的收获组织。在切片的福尔马林/石蜡组织中，可以使用定量RNAFISH来量化SOD1mRNA，并且可以基于细胞特异性标记的形态学和抗体来鉴定细胞类型。在某些实施方案中，可以确定外泌体可以被许多炎性疾病诸如关节炎和狼疮根源的免疫细胞摄取。因此，可以在血液T细胞(TCRα)、T调控细胞(CD25)、B细胞(CD19)、单核细胞(CD11b)、NK细胞和粒细胞(Gr-1/Ly6G)中分析SOD1mRNA(SmartFlares,Millipore)和蛋白质(抗体，CellSignalling)。可以在来自用SOD1RNAi或对照处理的5只动物的血液中分析SOD1水平(可以预期在一些细胞中SOD1减少2倍，σ＝1，α＝0.05，功率＝0.99)。在其中于细胞亚群中鉴定出RNAi活性的组织或血液中，可以使用对细胞特异性标记进行的流式细胞术分选来分离这些，以量化mRNA和蛋白质。这些实验可用于鉴定在哪些组织和细胞类型中外泌体有效递送RNAi并量化RNAi-介导的敲低。可以使用如本文所述的lac阻遏的-荧光素酶小鼠模型评估RNAi活性，其中lac阻遏物的RNAi裂解允许萤光素酶的表达。为了确保这种效应通过RNAi活性产生并量化由外泌体递送的RNAi活性，可以通过RT-qPCR以及使用定量RNAISH(在组织切片上)来测量靶mRNA(萤光素酶和SOD1相对于3种参考mRNA)的损失。作为小鼠结果中RNAi活性的进一步证明，也可以进行5’RACE以半定量鉴定RNAi-特异性裂解的mRNA。诸如上所述的那些的方法可用于确定基因沉默核酸-携带外源体的生物分布，从而提供关于制剂可能靶向哪些组织并因此可以在治疗上解决哪些疾病的信息。实施例4：测试经包装的外泌体的免疫原性和致癌性还可以评价用于临床使用的外泌体的毒性和免疫原性。例如，IlluminamRNA测序(聚A-选择的文库)和蛋白质组学可用于检测可能的致癌因子。外泌体可以用外周血单核细胞孵育并且可以使用Luminex29细胞因子/趋化因子组(Millipore)测定上清液。外泌体通常由身体产生。用外泌体进行的I期试验没有鉴定出毒性问题(Viaud等,JImmunother34,65(2011))。I期试验证明外泌体的最小免疫原性(当免疫原性为目标时)并且无致癌性(Viaud等,JImmunother34,65(2011))。因此，从ES和MSC来源产生的外泌体可能具有最小的免疫原性。如果注意到外泌体的有害作用，可以通过设计用于在源细胞(例如MHC)中表达的RNAi或通过在外泌体中包含另外的RNAi来消除这些。外泌体可能含有其它免疫抑制性或刺激性分子，并且从非自体来源产生的外泌体可能有被认为与MHC不相容的风险。为了解决潜在的免疫原性，外泌体可以，在某些实施方案中，来源于最具免疫耐受性细胞中的干细胞和避免MHC不相容性的自体患者来源的树突细胞。尽管可以为每名患者制备经诱导的多能干细胞以产生自体外泌体，但是在某些实施例中，使用例如ES或MSC细胞产生一致大批次的外泌体的能力可能是优选的。来自MSC或未成熟树突细胞的外泌体在文献或患者中未显示出免疫响应。如果仍然检测到免疫原性响应，则可以在某些实施方案中添加靶向源细胞中关键免疫原性蛋白质的RNAi以限制或形成免疫原性响应。未转化的细胞可用于降低外泌体的致癌性质的风险。特别是来自ES和MSC的外泌体可能含有促进茎-样性质的因子，然而这些可能短暂地以比ES或MSC低得多的剂量存在于患者体内，因此其风险可能因此低得多。实施例5：靶向外泌体至特定组织外泌体有内源性靶向。例如Schwann和少突胶质细胞外泌体靶向神经元，神经元外泌体靶向星形胶质细胞，肥大细胞外泌体靶向肥大细胞，巨噬细胞外泌体靶向巨噬细胞和B细胞外泌体靶向T细胞。基于此，来自不同细胞类型的外泌体可以差异通行。分布可以通过例如使用替代的细胞类型、在纯化后将配体偶联至外泌体或通过将外泌体-靶向细胞质结构域(LAMP2b，C1C2，肉豆蔻酰化)以将蛋白质受体置于外泌体的表面上来改变。使用受体将外泌体靶向至新组织已经在小鼠中示出(Ohno,Mol.Ther.,2013,21:185；andAlvarez-Erviti,Nat.Biotech,2011,29:341-345，通过引用整体并入本文)。可以通过例如使用可导致外泌体靶向至脑的RVG肽来工程化经靶向的外泌体(Alvarez-Erviti等,NatBiotechnol29,341(2011))。RVD基序可以靶向免疫细胞。也可以测试模拟疾病状态(诸如脑局部缺血或心脏再灌注)的损伤后的外泌体分布，因为这些可能改变内皮逃逸和组织渗透性(Kanasty,Dorkin,Vegas,Anderson,Naturematerials12,967(2013))。在某些实施方案中，可能可以用不同的受体，诸如RVG肽、多巴胺(对帕金森氏病(Parkinson’sdisease)受影响的多巴胺能细胞)或肉毒毒素重链修饰外泌体的表面以靶向运动神经元。这些可被吸附至外泌体表面，或通过产生具有用于偶联至外泌体表面上的蛋白质的活性化学基团的形式共价附接。实施例6：针对基因沉默核酸的外泌体包装的另外的核酸构建体设计在某些实施方案中，本文提供了包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸或其它目的核酸序列的核酸构建体。如将理解，前-miR-451结构模拟物可以包括多种适合的核酸构建体中的任一种，它们可以关于序列、长度和/或二级结构或其它一种或多种特征与前-miR-451有差异，只要维持外泌体包装。在以下研究中，对前-miR-451结构模拟物设计的各个不同方面进行了研究。研究的参数包括总茎长、环长和茎中一个或多个错配核苷酸的存在。结果表明可以进行各种修改，同时仍提供外泌体富集。在以下实验中，前-miR-451构建体设计有测试前-miR-451主链的各种性质的10种突变/修饰。重要的是，这些研究表明，主链结构中的几个变化可被适应，同时仍然提供稳健的至外泌体中的包装。主链环长的扩大和茎-环部分总长的延伸都是可以接受的。尽管所测试的一些修饰在所用的实验条件下相较于WT前-miR-451构建体不太有效地包装，但外泌体富集倍数在许多情况下仍然在约200倍的范围内。在一些实施例中，观察到超过WT的富集倍数(图8)。图8中显示了测试的构建体和由其获得的外泌体富集倍数。图8(A)中描绘了WT构建体。茎总长(图8(B))：WT结构的茎部分延伸以提供46、50或52nt的总长(WT为40nt，茎和环组合)。如图8(E)所示，这些茎延伸构建体显示出与WTmiR-451构建体类似的插入siRNA的富集。在所测试的条件下，46和52nt茎延伸构建体比WT提供更少的富集，但仍产生稳健的外泌体富集。在测试条件下，50nt茎延伸构建体提供了比WT更好的外泌体富集。环长(图8(D)：WT构建体的环部分从WT中的4nt扩大达到8nt(即测试4nt、5nt、6nt、7nt和8nt环长)。如图8(E)所示，这些环延伸构建体显示出与WTmiR-451构建体类似的插入siRNA的富集。在所测试的条件下，5nt、6nt和8nt环延伸提供的富集比WT少一些的富集，但仍产生了稳健的外泌体富集。7nt环延伸结果表明，这种构建体在测试条件下提供了相对于WT相当的或可能更佳的外泌体富集。总之，这些结果表明，将环延伸达到至少8nt仍然导致优良的外泌体包装。在茎环中不匹配的核苷酸(图8(C))：WT构建体的茎环部分被修饰为在WTmiR-451构建体的茎部分中包含3个不同的碱基对错配。如所示，开发了三种不同的构建体，每种构建体在茎的成熟区域的前3个碱基对中的一个(标记为位置“1”、“2”和“3”)中包含单个bp错配。突变位于AGO2裂解后去除的一条链上，使得成熟的靶向序列不被设计改变。如图8(E)所示，这些错配构建体显示出与WTmiR-451构建体类似的插入siRNA富集。在所测试的条件下，“2”和“3”位置处的错配提供了相对于WT相当或可能更佳的外泌体富集，并且在测试条件下，“1”处的错配仍然提供了强烈富集。实施例7：用于外泌体包装的核酸构建体的另外结构修饰在某些实施方案中，本文提供了包含掺入前-miR-451结构模拟物中的基因沉默核酸或其它目标核酸序列的核酸构建体。如将理解，前-miR-451结构模拟物可以包括多种适合的核酸构建体中的任一种，它们可以关于序列、长度和/或二级结构或其它一种或多种特征与前-miR-451有差异，只要维持外泌体包装。不希望受理论束缚，据信成熟miR-451的形成涉及Drosha裂解、Ago2裂解和通过核酸外切酶从3’末端去除最后核苷酸的裂解。因此进行了实验以进一步研究模拟这些加工事件的各个阶段的构建体的外泌体包装，并且特别是确定外泌体富集是否依赖于AGO2结合和/或裂解。获得的结果表明外泌体富集可能不依赖于AGO2，因为它仍然可以在Ago2敲除细胞中观察到。因此设计了在各种加工阶段模拟WT前-miR-451并测试外泌体富集的构建体。图9中以图形方式描绘了测试的构建体。图9(A)显示了在Drosha加工后WT前-mIR-451构建体，图9(B)中显示了构建体的Ago2-裂解形式，并且图9(C)显示了成熟的22ntmiR-451(后核酸外切酶活性，具有包括一部分的环区域在内的5’靶向部分)。为了比较，还测试了具有3’突出端的标准21ntdsRNAsiRNA(图9(D))。图9(E)显示了外泌体富集结果。结果表明，在所测试的条件下，类似于成熟阶段的RNA核酸(图9(C))，其中环-衍生的序列保留在22nt的单链RNA上(在图8(E)中标记完全成熟的ss)，是最强列富集外泌体的构建体。值得注意的是，具有环的ssRNA的富集(图9(C)构建体)高于类似具有3’突出端的经典siRNA的dsRNA。这些结果表明单链RNA可能有利于包装至特别是具有稍长的长度的外泌体(即22-35nt相对于19-21nt，例如)中。此外，结果表明ssRNA的3’末端上存在碱基对可能有利于包装至外泌体中。不希望受理论束缚，3’末端上的此类碱基对可通过阻断互补RNA与靶向RNA序列的结合来促进包装值外泌体中。这种互补的核酸可以是靶mRNA，或任何其它互补核酸，诸如经典siRNA的信使链。实施例8：用于产生含有目标核酸的外泌体的另外的细胞系进行了研究以鉴定其中前-miR-451基构建体可用于提供富含有目标核酸的外泌体的细胞类型的另外实例。使用两种方法使用前-miR-451结构模拟物构建体测试细胞类型富集siRNA在外泌体中的能力。首先，将内源性表达的miR-451在外泌体的富集与其它内源性表达的微RNA(miR-16，let-7a)进行比较。在进行的所有测试中，鉴定为证明miR-451富集在外泌体中的细胞系也证实了携带目标核酸的前-miR-451结构模拟物构建体的外泌体富集。这些结果表明，产生miR-451富集的外泌体的细胞系可用作用于使用如本文所述的方法产生富含有目标核酸序列的外泌体或外泌体-样囊泡的目的的外泌体-产生细胞。其次，将外源siRNA(通常靶向GFP或SOD1)插入前-miR-451结构模拟物中，并测试在外泌体中富集的能力，并将其与插入相同siRNA的前-miR-16结构模拟物进行比较。结果表明各种原代细胞和细胞系使用如本文所述的方法富集siRNA在外泌体中。测试了外泌体中miR-451富集的细胞系包括：原代人间充质干细胞、原代小鼠巨噬细胞、人乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)、小鼠和人神经元细胞系(Neuro2a，SHSY)、小鼠星形胶质细胞细胞系(C8Da，SIM)、小鼠小神经胶质细胞细胞系(BV2)、小鼠运动神经元细胞系(NSC-34，MN-1)、HeLa、小鼠胚胎成纤维细胞和小鼠树突细胞(JAWSII)。在所测试的每个细胞系中，如果miR-451被内源性地富集在外泌体中，则插入到前-miR-451结构模拟物构体中的siRNA也导致外泌体富集。这些结果表明内源性miR-451在外泌体中的富集可能是使用如本文所述的方法有效富集siRNA在外泌体中的候选细胞系的诊断剂或指示物。除人胚胎干细胞外，所有测试的细胞类型都产生了强烈的外泌体富集。结果在下表1中提供。表1：各种细胞类型中miR-451的外泌体富集。纯化来自在外泌体-耗竭的培养基或无血清培养基中生长的指定细胞系的外泌体，并通过RT-qPCR在外泌体和外泌体-产生细胞中量化miR-451、miR-16和let-7a。实施例9：影响外泌体富集的细胞因子研究了使用如本文所述的方法可能影响外泌体中核酸构建体包装的各种细胞因子。具体而言，研究了突变型Ras、突变型Myc、野生型Ago2的过表达和转位蛋白(Translin)的siRNA耗尽的影响。在获得的结果中，这些因素都没有对构建体(在本实施例中，含有siRNA的构建体)在外泌体中的富集产生显著影响，表明该系统不依赖于致癌因子。还测试了几种药物的作用，诸如临床上使用的mTOR抑制剂和溶酶体/自噬抑制剂。结果表明，mTOR抑制剂对miR-451富集在外泌体中无影响，而溶酶体/自噬抑制剂增加了外泌体数目，表明此类抑制剂可用于增强用于药物递送的外泌体的生产。经测试的溶酶体/自噬抑制剂包括巴佛洛霉素A1、刀豆素和NAADP-AM。还使用如本文所述的前-miR-451结构模拟物对Ago2对含有siRNA的构建体在外泌体中的富集的影响进行了测试。结果表明，插入至前-miR-451结构模拟物中的靶向TetR的siRNA在Ago2敲除小鼠胚胎成纤维细胞中仍然富集在外泌体中(相较于野生型细胞，或用野生型Ago2或催化死亡的Ago2拯救的Ago2敲除细胞)。此外，结果表明，当Ago2耗竭或经催化失活时，构建体在外泌体中进一步富集。这些结果表明，如本文所述的外泌体包装方法可以通过抑制Ago2的表达或活性和/或通过利用具有较少或较少活性的Ago2的外泌体-产生细胞来增强。该测试的实验结果如图10所示。该数据表明，Ago2可以抑制包装基于前-mIR-451结构模拟物的含siRNA的构建体至外泌体中至一定程度。在这些实验中，将包含在前-miR-451结构模拟物中整合的靶向GFP或TetR的siRNA序列的质粒转染至细胞中，并且两至三天后通过qRT-PCR测量外泌体相对于细胞中的GFP或TetRsiRNA的水平(相对于外泌体中的let-7a和miR-16/细胞)。将miR-451来源的序列在外来中的富集对于野生型外泌体归一化至1。X轴显示了测试的细胞类型(MEF[小鼠胚胎成纤维细胞]、Ago2敲除MEF，WTR[用野生型Ago2拯救的Ago2敲除MEF]和CDR(用催化死亡的Ago2拯救的Ago2敲除MEF)。实施例10：多种不同的目标核酸序列的外泌体富集在本文描述的研究中，靶向GFP、SOD1和Tet阻遏物(各自具有与miR-451无关的不同序列)的各种不同siRNA已经掺入前-miR-451结构模拟物中，并使用如本文所述的方法随后富集于外泌体中。这些结果，除了之前使用掺入包括miR-106、miR-199-5p和miR-155(之前在上文中描述)在内的前-miR-451结构模拟物中的多个独立的微RNA的测试，证明了如本文所述的方法和构建体对序列变异具有高度耐受性，并且表明这些构建体和方法可以用于容纳各种目标核酸序列。实施例11：用于前-miR-451结构模拟物的表达载体本文提供的结果表明，前-miR-451结构模拟物构建体可以使用各种不同的技术递送至细胞或在细胞中表达，同时仍提供经富集的外泌体包装。在某些实例中，可以使用表达载体在细胞中表达前-miR-451结构模拟物构建体。在这方面，已经测试了各种不同的启动子和载体(即鸡β-肌动蛋白增强子-CMV[CAG]、CMV、U6、IRES、质粒或慢病毒构建体)。还进行了测试以研究在前-miR-451结构模拟物构建体作为RNA而不是DNA表达载体递送时(参见上文)，目标核酸序列(在本实施例中为siRNA)是否在外泌体中富集。此外，测试产生包含长RNA的前-miR-451的衍生物(包括长RNA，包括在3'末端具有少量碱基配对或茎结构或比正常siRNA(22-35nt)稍长的前-miR-451-样序列、Drosha加工的、Ago2加工的或成熟的miR-451-样序列)的RNA模拟物(以及推测的DNA表达构建体)，表明此类构建体在测试条件下全部稳健包装至外泌体中。这些发现表明，前-miR-451结构模拟物构建体或其衍生物可以在各种环境下表达或递送，同时仍然提供富集插入的目标核酸序列至外泌体中。实施例12：在小鼠脑中由负载有使用前-mIR-451结构模拟物产生的SOD1沉默RNA的外泌体进行的基因沉默负载有根据如本文所述的方法使用前-miR-451结构模拟物产生的SOD1沉默RNA的外泌体用于在体内小鼠系统中沉默SOD1的表达。在这些实验中，在测试条件下，如通过RT-qPCR或定量FISH所测量，观察到SOD1沉默RNA-负载的外泌体减少SOD1在小鼠脑中的表达约30-50％。这些研究的结果在图11中提供。将NSC-34小鼠运动神经元细胞系用表达掺入前-miR-451主链中的SOD1沉默RNA的慢病毒载体转导。将5μg外泌体注射至人G93ASOD1转基因小鼠的脑室内间隙中，并且两天后将小鼠安乐死。将组织快速冷冻并加工以用于RT-qPCR和FISH。图11(A)显示了使用Taqman探针的RT-qPCR分析以量化皮质和小脑中相对于对照(β-肌动蛋白和TBP)的SOD1。在皮层和小脑两者中，与对照外泌体相比，使用SOD1沉默RNA-负载的外泌体观察到SOD1mRNA水平的降低。在图11(B)中，加工来自小鼠的皮质组织以用于SOD1siRNA(Exiqon微RNAISH，GADPHmRNA(Stellaris探针Quasar670)，人SOD1mRNA(Stellaris探针Quasar570)的FISH分析。代表性落射荧光图像显示于如图11(B)中。第1列显示DAPI(蓝色)，第2列显示SOD1siRNA(绿色)，第3列显示GAPDHmRNA(紫色)，并且第4列显示SOD1mRNA(红色)显示。图11(C)提供了经来自用包装有靶向SOD1的沉默RNA的外泌体注射的小鼠的皮质的4-8幅图像，SOD1mRNA信号强度相对于GAPDH信号强度的量化。如所示，与对照外泌体相比，使用SOD1沉默RNA-负载的外泌体观察到SOD1mRNA水平的降低。靶向SOD1的前-miR-451结构模拟物的序列是：5’–CUUGGGAAUGGCAAGGUUCAGUCAGUCCUUUAAUGCUUUUUAAAGGACUGACUGACUCUUGCUAUACCCAGA–3’(SEQIDNO:17)这些序列包括前-mir-451的序列直到Drosha裂解位点。将它们插入GIPZ载体中，代替IRES下游的shRNA。GIPZ序列在图13中显示为SEQIDNO:18。pGIPZ序列是：>pGIPZtggaagggctaattcactcccaaagaagacaagatatccttgatctgtggatctaccacacacaaggctacttccctgattagcagaactacacaccagggccaggggtcagatatccactgacctttggatggtgctacaagctagtaccagttgagccagataaggtagaagaggccaataaaggagagaacaccagcttgttacaccctgtgagcctgcatgggatggatgacccggagagagaagtgttagagtggaggtttgacagccgcctagcatttcatcacgtggcccgagagctgcatccggagtacttcaagaactgctgatatcgagcttgctacaagggactttccgctggggactttccagggaggcgtggcctgggcgggactggggagtggcgagccctcagatcctgcatataagcagctgctttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccggccgct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ttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgcctggaattaattctgcagtcgagacctagaaaaacatggagcaatcacaagtagcaatacagcagctaccaatgctgattgtgcctggctagaagcacaagaggaggaggaggtgggttttccagtcacacctcaggtacctttaagaccaatgacttacaaggcagctgtagatcttagccactttttaaaagaaaagaggggactggaagggctaattcactcccaacgaagacaagatctgctttttgcttgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtagtagttcatgtcatcttattattcagtatttataacttgcaaagaaatgaatatcagagagtgagaggccttgacattgtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctggggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcagcacgtgatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtctccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagcacgtgctacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagaacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgacgtcgacggatcgggagatcaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatcaactggataactcaagctaaccaaaatcatcccaaacttcccaccccataccctattaccactgccaattacctgtggtttcatttactctaaacctgtgattcctctgaattattttcattttaaagaaattgtatttgttaaatatgtactacaaacttagtagt实施例13：由负载有使用前-mIR-451结构模拟物产生的GFP-靶向siRNA的外泌体进行在选定靶细胞培养物模型中的基因沉默负载有根据如本文所述的方法使用前-mIR-451结构模拟物产生的GFP-靶向siRNA的外泌体用于沉默选定靶细胞中的GFP基因表达。在这些实验中，在所测试的条件下，观察到由多种不同的外泌体-产生供体细胞产生的GFP-靶向siRNA-负载的外泌体减少GFP在HeLa细胞中的表达。这些研究的结果在图12中提供。将来自用表达掺入前-miR-451结构模拟物中的GFPsiRNA的构建体转染或转导的外泌体-产生供体细胞的外泌体生产供体细胞用表达GFP的外泌体靶细胞(HeLa细胞，蓝色，左列；NSC-34细胞，橙色，中间列；或Neuro2a[N2A]细胞，灰色，右列)孵育48小时，并通过流式细胞术分析GFP表达。如所示，通过含有由多种不同的外泌体供体细胞产生的GFP靶向siRNA的外泌体，HeLa细胞中的GFP表达降低。结果表明在这些实验中测试的某些外泌体对HeLa靶细胞至少是部分有选择性。靶向eGFP的前-miR-451结构模拟物的序列是：5’–CUUGGGAAUGGCAAGGAUGAACUUCAGGGUCAGCUUGCGCUGACCCUGAAGUUCAUUCUUGCUAUACCCAGA(SEQIDNO:19)靶向TetR的前-miR-451结构模拟物的序列是：5’–CUUGGGAAUGGCAAGGUCUUGAUCUUCCAAUACGCAACCGUAUUGGAAGAUCAAGAUCUUGCUAUACCCAGA(SEQIDNO:20)用于通过qPCR测量miRNA水平的引物(注意所有qPCR反应也使用miScript试剂盒(Qiagen)中的“通用”引物)：eGFP引物：5’–atgaacttcagggtcagcttgc(SEQIDNO:21)TetR引物：5’–tcttgatcttccaatacgcaac(SEQIDNO:22)SOD1引物：5’–ttcagtcagtcctttaatgctt(SEQIDNO:23)实验方法核酸设计掺入miR-155、miR-106或miR-199基因沉默引导链序列的前-miR-451结构模拟物用于本文所述的某些研究中。这些核酸由EricLai实验室制备，如Yang等,PNAS,2010,107(34):15163-15168中所公开的，其通过引用整体并入本文。在细胞中引入/表达前-miR-451结构模拟物根据制造商的说明书使用Lipofectamine2000用质粒转染细胞。4小时后，根据Thery等(2006)，将细胞在PBS中洗涤并用通过超速离心耗竭了外泌体的含有10％FBS的DMEM孵育。24小时后收集培养基并通过差速超速离心纯化外泌体。根据制造商的说明书，使用Trizol从外泌体和外泌体-产生细胞中纯化RNA。使用的质粒按照Yang等,PNAS,2010,107(34):15163-15168产生，其通过引用整体并入本文。外泌体富集如前所述(Thery,2006,CurrProtocCellBiol,Chapter3,Unit322)，通过差速离心富集外泌体。简而言之，在通过以100000g离心16h耗竭了外泌体的含有FBS的培养基中培养MEF或MDA-MB-231细胞(Thery,2006,CurrProtocCellBiol,第3章,Unit322)。为了纯化外泌体，将来自细胞培养物的上清液以400g(7min)、2000g(10min)和10000g(30min,SW32转子)离心。在每个步骤，回收上清液。在以100000g(1h10min,SW32转子)离心后，去除上清液并将沉淀重新悬浮。通过以100000g(20min,TLA100.3转子)进行的最终离心，将沉淀在PBS中洗涤。将外泌体-富集的沉淀重悬于PBS中用于进一步分析。动态光散射使用DynamicsV6软件通过在蛋白质溶液Dynapro仪器(ProteinSolutionsDynaproInstrument)上的动态光散射分析富集的外泌体的制剂。在4℃和10％激光功率下对每个样品每10秒获取数据一次，持续至少200秒。仪器自动生成强度(Cnt/s)和大小(nm)。Nanosight颗粒追踪分析使用具有纳米颗粒追踪分析(NanoparticleTrackingAnalysis)软件2.3版的NanosightLM10仪器分析经富集的外泌体的制剂。测量温度为22℃，并且时间设定为90秒。分析条件设定为：Blur3X3，检测阈值3，最小径迹长度9和最小预期尺寸30nm。自动生成含有粒度(nm)和浓度(颗粒/ml)的分析报告。电子显微术将外泌体制剂用含有2％戊二醛的0.1M卡可基酸盐缓冲液原位固定直至加工以用于包埋，在4℃下在于卡可基酸盐缓冲液中的1％四氧化锇(EMS,PA,USA)中后固定。如在(Luft,1961,TheJournalofBiophysicalandBiochemicalCytology,9:409)所述，在缓冲液中洗涤后，将外泌体在梯度乙醇中脱水、渗透并包埋在Epon812(MECALAB,Québec,Canada)中。将切片用醋酸铀酰染色，并用PhilipsCM100电子显微镜进行检查。RT-qPCR使用允许扩增在逆转录酶步骤中产生的DNA的引物，用MiScriptII逆转录酶系统(MiScriptIIReverseTranscriptasesystem，Qiagen)和GoTaqqPCR主混合物(GoTaqqPCRMasterMix，PromegaA6002)进行RT-qPCR。将结果归一化至无处不在的miRNAlet-7a和miR-16。所用的引物如下：miR-451：AAACCGTTACCATTACTGAGTT(SEQIDNO:9)；miR-155：ACCCCTATCACGATTAGCATTAA(SEQIDNO:10)；miR-199：TAACCAATGTGCAGACTACTGT(SEQIDNO:11)；miR-106a：CTACCTGCACTGTAAGCACTTTT(SEQIDNO:12)；let-7a：TGAGGTAGTAGGTTGTATAGTT(SEQIDNO:13)；和miR-16：tagcagcacgtaaatattggcg(SEQIDNO:24)。侧脑室内注射将通过差速离心从表达来自前-miR-451主链的人SOD1靶向性沉默RNA的NSC-34细胞纯化的10μg外泌体或对照外泌体以5μL的体积注射至人SOD1G93A(JacksonLabs)的转基因小鼠的侧脑室内间隙。48小时后处死小鼠，并且将脑快速冷冻并分割用于SOD1mRNA水平的荧光原位杂交(FISH)或RT-qPCR定量。荧光原位杂交从小鼠收集组织并将其置于4％PFA的PBS中48小时。用含30％蔗糖的PBS替代PFA，直到组织沉入底部。将组织置于OCT中并用液氮冷冻。将6μm的组织切片收集在载玻片上并置于-80℃下。染色前将载玻片加热至室温(RT)。将载玻片在室温下置于4％PFA的PBS中10min。将它们用PBS(RT)洗涤，并在37℃下在透化缓冲液(10μg/mL蛋白酶K，0.2％TritonX-100于PBS溶液中)中放置20min。将载玻片在PBS(RT)中洗涤并用1％BSA、100μg/mL鲑鱼精子DNA和250μg/mL酵母提取物RNA于PBS(RT)中封闭1h。将载玻片用PBS(RT)洗涤并用于水(RT)中的NaBH40.1％处理以进行自发荧光还原1h。用Stellaris洗涤A缓冲液(LGCBiosearchTechnologies,Petaluma,CA,USA)(RT)洗涤，并将Stellaris荧光mRNA探针(SOD1,GAPDH,β-肌动蛋白)和IDTDIG-偶联的siRNA探针(siSOD1,阴性对照siRNA,IntegratedDNATechnologies,Coralville,IA,USA)置于杂交缓冲液(90％Stellaris杂交缓冲液(90％StellarisHybridizationbuffer)，10％甲酰胺)中。将载玻片在黑暗中在37℃下用探针孵育过夜。将载玻片用洗涤A缓冲液(RT)洗涤并在室温下用1:100于封闭溶液中的羊抗-DIG(EnzoLifeSciences,Farmingdale,NY,USA)孵育1h。将载玻片用洗涤A缓冲液(RT)洗涤并在室温下用1:500于封闭溶液中的驴抗绵羊AlexaFluor488AlexaFluor488(LifeTechnologies,Waltham,MA,USA)孵育1h。将载玻片用洗涤A缓冲液(RT)洗涤并在RT下用1:10000于PBS中的DAPI(LifeTechnologies)孵育5min。使用Stellaris洗涤B缓冲液进行在RT下的最后洗涤，并将载玻片用CitifluorAF3抗荧光衰退溶液(ElectronMicroscopySciences,Hatfield,PA,USA)固定并用指甲油密封。图像分析ImageJ分析软件(NIHImage,http://rsbweb.nih.gov/nih-image/)用于FISH图像分析。简而言之，通过落射荧光显微术(ZeissAxioImager.M2,CarlZeiss,Oberkochen,Germany)用63XPlan-Apochromat1.4油镜(1000倍放大)获取图像。采集后添加颜色(蓝色用于DAPI，绿色用于siRNASOD1，红色用于SOD1mRNA，紫色用于GAPDHmRNA)。将对比度和阈值在对照图像上调整，并对实验图像保持相同。用软件测量整个图像和目标区域的平均强度和共定位。使用Excel软件(Microsoft,Redmond,WA,USA)分析平均强度平均值和SEM。RT-qPCR使用引物，用(PromegaA6002)或QuantitectqPCR主混合物(Qiagen)进行RT-qPCR，从而允许使用以下引物mir-451:aaaccgttaccattactgagtt(SEQIDNO:14)、let-7a:tgaggtagtaggttgtatagtt(SEQIDNO:15)、mir-16:tagcagcacgtaaatattggcg(SEQIDNO:16)扩增在逆转录酶步骤中产生的DNA。质粒构建体和慢病毒载体从慢病毒pGIPZ载体表达整合至前-miR-451主链中的GFPsiRNA、SOD1siRNA或TetRsiRNA。插入至前-miR-16主链中的类似RNA用于一些实验中。通过用嘌呤霉素选择来产生稳定表达来自前-miR-451主链的GFPsiRNA或SOD1siRNA的包括NSC-34在内的细胞系。合成RNA通过IDT合成对应于具有插入的GFPsiRNA的42nt前-miR-451或直到Ago2裂解位点的相同构建体的RNA，或完全成熟形式的miR-451产生的GFPsiRNA(单链22ntRNA)，或具有2nt3’突出端的双链GFPsiRNA。将这些转染至野生型、Ago2遗传缺失、野生型Ago2稳定重新表达或催化死亡的突变型Ago2稳定重新表达(用RNAiMax(ThermoFisher))的小鼠胚胎成纤维细胞中。两天后，纯化外泌体并通过RT-qPCR量化外泌体中成熟GFPsiRNA的水平。Ago2加工的模拟物序列：augaacuucagggucagcuugcgcugaccc(SEQIDNO:25)Drosha加工的模拟物序列：AUGAACUUCAGGGUCAGCUUGCGCUGACCCUGAAGUUCAUUC(SEQIDNO:26)完全成熟的模拟物序列：AUGAACUUCAGGGUCAGCUUGC(SEQIDNO:27)产生完全成熟的模拟物双链的互补链序列：AAGCUGACCCUGAAGUUCAUUC(SEQIDNO:28)细胞培养模型中mIR-451来源的siRNA的外泌体-介导的递送通过差速离心纯化来自几种细胞类型(MSC、MEF、HeLa、N2A、C8-D1A、BV2和RAW267)的外泌体。向含有稳定表达GFP的HeLa、NSC-34或N2A细胞的6孔板的每个孔中加入1μg外泌体。48小时后收集细胞并通过流式细胞术量化GFP。将细胞在FSC和SSC上进行门控，并使用Kaluza软件获得GFP表达的几何平均值。用源自相同细胞的野生型外泌体处理的细胞中GFP水平的几何平均值设定为100％。已经通过非限制性实例描述了一个或多个说明性实施方案和实施例。本领域技术人员将理解，在不脱离如权利要求中限定的本发明的范围的情况下可以做出许多变化和修改。参考文献1.Kanasty,Dorkin,Vegas,Anderson,Naturematerials12,967(2013).2.Whitehead,Langer,Anderson,NatRevDrugDiscov8,129(2009).3.Coelhoetal.,NEnglJMed369,819(2013).4.Haussecker,Moleculartherapy.Nucleicacids1,e8(2012).5.Fabian,Sonenberg,NatStructMolBiol19,586(2012).6.Kasinski,Slack,Naturereviews.Cancer11,849(2011).7.Emde,Hornstein,EMBOJ33,1428(2014).8.Dahlmanetal.,Naturenanotechnology9,648(2014).9.Kanasty,Whitehead,Vegas,Anderson,MolTher20,513(2012).10.Kleinmanetal.,Nature452,591(2008).11.Raposo,Stoorvogel,JCellBiol200,373(2013).12.Valadietal.,NatCellBiol9,654(2007).13.Zhuangetal.,MolTher19,1769(2011).14.Alvarez-Ervitietal.,NatBiotechnol29,341(2011).15.S,Mager,Breakefield,Wood,NatRevDrugDiscov12,347(2013).16.Fangetal.,PLoSBiol5,e158(2007).17.Zeelenbergetal.,CancerRes68,1228(2008).18.Ohnoetal.,MolTher21,185(2013).19.Lamparskietal.,JImmunolMethods270,211(2002).20.Viaudetal.,JImmunother34,65(2011).21.Cheng,Sharples,Scicluna,Hill,Journalofextracellularvesicles3,(2014).22.Collinoetal.,PLoSOne5,e11803(2010).23.Gibbings,Ciaudo,Erhardt,Voinnet,NatCellBiol11,1143(2009).24.Batagov,Kuznetsov,Kurochkin,BMCGenomics12Suppl3,S18(2011).25.Villarroya-Beltrietal.,NatCommun4,2980(2013).26.Kooijmansetal.,JControlRelease172,229(2013).27.Cheloufi,DosSantos,Chong,Hannon,Nature465,584(2010).28.Yang,Maurin,Lai,RNA18,945(2012).29.Thery,Amigorena,Raposo,Clayton,CurrProtocCellBiolChapter3,Unit322(2006).30.Stevensonetal.,Moleculartherapy.Nucleicacids2,e133(2013).31.Gantieretal.,NucleicAcidsRes39,5692(2011).32.Bartlett,Davis,Biotechnologyandbioengineering97,909(2007).33.Fabian,M.R.,Sonenberg,N.&Filipowicz,W.RegulationofmRNAtranslationandstabilitybymicroRNAs.AnnuRevBiochem79,351-379,(2010).34.Pencheva,N.&Tavazoie,S.F.ControlofmetastaticprogressionbymicroRNAregulatorynetworks.NatCellBiol15,546-554,(2013).35.Croce,C.M.CausesandconsequencesofmicroRNAdysregulationincancer.NatRevGenet10,704-714,(2009).36.Abe,M.&Bonini,N.M.MicroRNAsandneurodegeneration:roleandimpact.TrendsCellBiol23,30-36,(2013).37.Coelho,T.etal.SafetyandefficacyofRNAitherapyfortransthyretinamyloidosis.NEnglJMed369,819-829,(2013).38.Kanasty,R.,Dorkin,J.R.,Vegas,A.&Anderson,D.DeliverymaterialsforsiRNAtherapeutics.Naturematerials12,967-977,(2013).39.Whitehead,K.A.,Langer,R.&Anderson,D.G.Knockingdownbarriers:advancesinsiRNAdelivery.NatRevDrugDiscov8,129-138,(2009).40.Zimmermann,T.S.etal.RNAi-mediatedgenesilencinginnon-humanprimates.Nature441,111-114,(2006).41.Haussecker,D.TheBusinessofRNAiTherapeuticsin2012.Moleculartherapy.Nucleicacids1,e8,(2012).42.Raposo,G.&Stoorvogel,W.Extracellularvesicles:exosomes,microvesicles,andfriends.JCellBiol200,373-383,(2013).43.Valadi,H.etal.Exosome-mediatedtransferofmRNAsandmicroRNAsisanovelmechanismofgeneticexchangebetweencells.NatCellBiol9,654-659,(2007).44.Zhuang,X.etal.Treatmentofbraininflammatorydiseasesbydeliveringexosomeencapsulatedanti-inflammatorydrugsfromthenasalregiontothebrain.MolTher19,1769-1779,(2011).45.Alvarez-Erviti,L.etal.DeliveryofsiRNAtothemousebrainbysystemicinjectionoftargetedexosomes.NatBiotechnol29,341-345,(2011).46.Colombo,M.,Raposo,G.&Thery,C.Biogenesis,secretion,andintercellularinteractionsofexosomesandotherextracellularvesicles.AnnuRevCellDevBiol30,255-289,(2014).47.Batagov,A.O.,Kuznetsov,V.A.&Kurochkin,I.V.IdentificationofnucleotidepatternsenrichedinsecretedRNAsasputativecis-actingelementstargetingthemtoexosomenano-vesicles.BMCGenomics12Suppl3,S18,(2011).48.Villarroya-Beltri,C.etal.SumoylatedhnRNPA2B1controlsthesortingofmiRNAsintoexosomesthroughbindingtospecificmotifs.NatCommun4,2980,(2013).49.Kooijmans,S.A.etal.Electroporation-inducedsiRNAprecipitationobscurestheefficiencyofsiRNAloadingintoextracellularvesicles.JControlRelease172,229-238,(2013).50.Cheng,L.,Sharples,R.A.,Scicluna,B.J.&Hill,A.F.ExosomesprovideaprotectiveandenrichedsourceofmiRNAforbiomarkerprofilingcomparedtointracellularandcell-freeblood.Journalofextracellularvesicles3,(2014).51.Collino,F.etal.MicrovesiclesderivedfromadulthumanbonemarrowandtissuespecificmesenchymalstemcellsshuttleselectedpatternofmiRNAs.PLoSOne5,e11803,(2010).52.Bach,F.H.&Sachs,D.H.Currentconcepts:immunology.Transplantationimmunology.NEnglJMed317,489-492,(1987).53.Lai,R.C.etal.ExosomesecretedbyMSCre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