基于35U.S.C.§119(e)，本申请要求2015年9月18日提交的美国临时申请号62/220,857；2016年3月3日提交的62/303,367；和2016年3月3日提交的62/303,364的优先权权益；其每一个都通过引用整体结合于此。
发明背景
在原核生物和真核生物中发生应答于特定刺激的细胞运动。这些生物体中观察到的细胞运动已被分为三种类型：趋化性(chemotaxis)，或细胞沿着化学品浓度增加的梯度运动；负趋化性(negative chemotaxis)，其被定义为沿着化学刺激的梯度下降的运动；和化动性(chemokinesis)，或由化学试剂诱导的细胞随机运动的增加。
应答于称为趋化因子的一类蛋白质，已经在哺乳动物细胞中观察到趋化性和化动性。另外，在哺乳动物细胞中已经观察到化学排斥物(chemorepellent)或趋除性(fugetactic)活性。例如，一些肿瘤细胞分泌足以从肿瘤部位排斥免疫细胞的趋化因子浓度，从而降低免疫系统靶向和根除肿瘤的能力。转移癌细胞可以使用类似的机制来逃避免疫系统。例如从表达高水平CXCL12或白细胞介素8(IL-8)的肿瘤排斥免疫细胞(诸如肿瘤抗原特异性T细胞)允许肿瘤细胞逃避免疫控制。
CXCR4是在人类中由CXCR4基因编码的蛋白质。CXCR4由多种正常细胞表达以及在肿瘤上表达。CXCR4是基质衍生因子-1(stromal-derived-factor-1，SDF-1，也称为CXCL12)的α-趋化因子受体，所述趋化因子赋有对淋巴细胞有效的趋化活性。多达85％的实体瘤和白血病以足以具有趋除效应(例如，从肿瘤排斥免疫细胞)的水平表达CXCL12。经常以这种水平表达CXCL12的癌症包括但不限于前列腺癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、食道癌和白血病。
抗趋除剂(anti-fugetactic agent)抑制肿瘤细胞的趋除活性并允许患者的免疫系统靶向肿瘤。抗趋除剂和抗趋除剂的全身递送是本领域中已知的(参见，例如，美国专利申请公开号2008/0300165，其通过引用整体结合于此)。然而，迄今为止所描述的抗趋除剂的递送将可能导致一部分抗趋除剂与肿瘤或其它部位上的CXCR4受体结合，从而使得与免疫细胞结合的抗趋除剂的有效浓度变得不可预测。
此外，免疫细胞疗法(即，向患者输注自体、同种异体或永生化免疫细胞)已经显示输注的免疫细胞可能“卡住”在特定组织中，导致输注的免疫细胞在其能够到达目标癌细胞之前即被消除。特别地，输注的天然杀伤(NK)细胞可以优先聚集于肺、脾和/或肝。
因此，仍然需要靶向肿瘤的治疗和组合物以有效力且有效率地杀死肿瘤和/或转移癌细胞。
发明概述
抗趋除剂(诸如AMD3100)与天然杀伤(NK)细胞缔合或结合，从而阻断与NK细胞相关的趋化因子的趋除活性并且允许NK细胞靶向肿瘤或癌细胞。所述缔合或结合可以是任何合适的机制，包括例如经由结合NK细胞上的CXCR4受体。令人惊讶的是，已经发现这些抗趋除剂的抗趋除是浓度依赖性的。特别地，已经发现当免疫细胞遇到过高浓度的抗趋除剂时，抗趋除效应消失。因此，将阻止免疫细胞有效地穿透肿瘤或在转移性癌细胞中归巢。
CXCR4受体存在于多种组织以及肿瘤中。特别地，已知T细胞表达CXCR4，并且人体内的T细胞群接近或超过一万亿个细胞。尽管不受理论束缚，但是预期靶向细胞表面受体(例如CXCR4)的抗趋除剂的全身递送导致整个身体中该药剂与受体的无差别结合。这种结合稀释了所述药剂，使得体内修饰足够的免疫细胞以具有抗趋除性并且有效力且有效率地根除患者中的肿瘤和/或癌细胞的效率较低。
至少部分地基于上述发现，已经发现抗趋除剂与NK细胞的离体结合提供了改善的控制抗趋除剂与NK细胞(例如经由CXCR4或结合抗趋除剂的其它细胞表面受体)的缔合量的能力，以提供修饰的NK细胞群，该群在施用至患者时总体上保持所需的抗趋除特性。换言之，修饰的NK细胞群能够克服肿瘤或癌细胞的抗趋除效应，以有效地靶向肿瘤或细胞。
与施用前不接触趋除剂的NK细胞相比，具有与细胞表面上的CXCR4受体结合的抗趋除剂的NK细胞预期具有改善的肿瘤穿透。另外，预期如本文描述的修饰的NK细胞更好地靶向和穿透肿瘤和癌细胞，并且避免“卡住”在非癌组织/非靶标组织中。
在施用修饰的NK细胞之前或同时用未结合的抗趋除剂治疗患者提供了NK细胞的抗趋除应答和肿瘤靶向的进一步改善。特别地，预期用未结合的抗趋除剂治疗将导致对结合输注的免疫细胞上的CXCR4的抗趋除剂的竞争更少。换言之，输注的细胞所遇到的内源性CXCR4受体的至少一部分将被抗趋除剂占据，并且因此将不可用于竞争掉与输注的细胞缔合的抗趋除剂。
根据本发明，这种修饰的NK细胞群可以通过任何合适的方法施用。在一些实施方案中，将修饰的NK细胞群局部施用至肿瘤或肿瘤部位或癌细胞，或者施用至邻近于肿瘤或肿瘤部位或癌细胞。备选地，可以全身施用修饰的NK细胞群，例如通过静脉内输注。
类似地，可以通过任何合适的方法(包括局部或全身地)施用未结合的抗趋除剂。
在一个方面，本发明涉及包含修饰的人NK细胞的离体NK细胞群，所述NK细胞群具有与个体NK细胞结合的抗趋除剂。在一个实施方案中，抗趋除剂通过细胞表面上的受体与细胞结合。在一个实施方案中，受体是CXCR4。在一个实施方案中，不同量的抗趋除剂与个体NK细胞结合。在一个实施方案中，每个细胞上的至少一部分的受体被所述药剂占据。在一个实施方案中，抗趋除剂与个体NK细胞结合。
在一个实施方案中，当体内递送至患者时，NK细胞群展现出与癌症相关的整体抗趋除特性。在一个实施方案中，当递送至患者时，NK细胞群能够在体内穿透肿瘤(具有增强的在体内穿透肿瘤的能力)。在一个实施方案中，当递送至患者时，NK细胞具有改善的在体内靶向肿瘤或癌细胞的能力。
在一个方面，本发明涉及包含修饰的NK细胞群的组合物，所述NK细胞群包含修饰的人NK细胞，所述NK细胞群具有与个体NK细胞结合的抗趋除剂。在一个实施方案中，抗趋除剂通过细胞表面上的一个或多个CXCR4受体与细胞结合。在一个实施方案中，不同量的抗趋除剂与个体NK细胞结合。在一个实施方案中，当体内递送至患者时，NK细胞群展现出与癌症相关的整体抗趋除特性。在一个实施方案中，当递送至患者时，NK细胞群能够在体内穿透肿瘤(具有增强的在体内穿透肿瘤的能力)。在一个实施方案中，当递送至患者时，NK细胞具有改善的在体内靶向肿瘤或癌细胞的能力。
在优选的实施方案中，NK细胞是同种异体NK细胞、自体NK细胞或永生化NK细胞。在一个实施方案中，NK细胞是NK-92细胞。在一个实施方案中，NK细胞还被修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)。
在一个实施方案中，抗趋除剂选自由以下组成的组：AMD3100(mozobil/普乐沙福(plerixafor))或其衍生物、KRH-1636、T-20、T-22、T-140、TE-14011、T-14012、TN14003、TAK-779、AK602、SCH-351125、丹宁酸、NSC 651016、沙利度胺、GF 109230X、针对CXCR4的抗体和干扰趋除性趋化因子受体二聚化的抗体。在优选的实施方案中，抗趋除剂结合CXCR4。优选地，抗趋除剂是AMD3100。
在一个实施方案中，组合物还包含药用赋形剂。
在一个实施方案中，组合物还包含不与免疫细胞结合/缔合的抗趋除剂。
在一个实施方案中，从患有癌症患者获得NK细胞。在一个实施方案中，NK细胞是同种异体NK细胞。在一个实施方案中，NK细胞是NK细胞系，例如NK-92。
在一个方面，本发明涉及增强患者中NK细胞的肿瘤穿透的方法，所述方法包括向患者施用有效量的本文描述的细胞群或组合物。
在一个方面，本发明涉及治疗患有癌症的患者的方法，所述方法包括：
a)提供NK细胞；
b)通过使NK细胞与抗趋除剂接触来修饰NK细胞以提供本文描述的修饰的NK细胞；和
c)将修饰的NK细胞施用至患者以治疗癌症。
在一个实施方案中，步骤a)包括从患者提取自体NK细胞。
在一些实施方案中，将治疗有效量的抗趋除剂全身施用至患者。在一个实施方案中，在施用修饰的NK细胞之前施用治疗有效量的抗趋除剂。在一个实施方案中，在施用修饰的NK细胞同时施用治疗有效量的抗趋除剂。
在一些实施方案中，所述方法还包括基因修饰NK细胞以表达对癌症具有特异性的嵌合抗原受体。优选地，在使NK细胞与抗趋除剂接触之前对细胞进行基因修饰。
在一个方面，本发明涉及用于制备修饰的NK细胞组合物的方法，所述方法包括(a)提供具有与抗趋除剂结合的受体(例如CXCR4)的NK细胞，和(b)使NK细胞群与抗趋除剂接触以提供本文描述的修饰的NK细胞群。
在一个实施方案中，提供NK细胞包括从患有癌症的患者中提取自体NK细胞以提供NK细胞群。
在一个实施方案中，使NK细胞与所述抗趋除剂接触，并且将其储存用于后续施用至患者。在一个实施方案中，在将修饰的NK细胞群施用至患者之前立即将修饰的NK细胞与抗趋除剂接触。
本发明的一个实施方案涉及用于制备具有整体抗趋除特性的修饰的自体NK细胞组合物的离体方法，所述方法通过：(a)从患者中提取具有CXCR4受体的自体NK细胞以提供NK细胞群，和(b)使NK细胞群与抗趋除剂接触以提供具有抗趋除特性的修饰的NK细胞群，用于有效力且有效率地治疗肿瘤或癌症。
本发明的一个实施方案涉及用于制备具有整体抗趋除特性的修饰的自体NK细胞组合物的离体方法，所述方法通过：(a)从患者中提取自体NK细胞以提供NK细胞群，和(b)使NK细胞群与抗趋除剂接触以提供具有抗趋除特性的修饰的NK细胞群，用于有效力且有效率地治疗肿瘤或癌症。
本发明的一个实施方案涉及通过将本文描述的修饰的NK细胞组合物全身施用至有需要的患者来治疗肿瘤或癌症的方法。
本发明的一个实施方案涉及通过将本文描述的修饰的NK细胞组合物局部施用至患者中的肿瘤或部位或癌细胞，或者施用至邻近于患者中的肿瘤或部位或癌细胞，来治疗肿瘤或癌症的方法。
在一个实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一个实施方案中，肿瘤是非实体瘤。在一个实施方案中，肿瘤是白血病。
附图简述
图1表示增加量的AMD3100对人T细胞的双峰趋化效应。
图2表示增加量的AMD3100对人T细胞的双峰趋除效应。
发明详述
在阅读本说明书之后，对于本领域技术人员，如何在各种替代实施方案和替代应用中实现本发明将变得显而易见。然而，在本文中并非描述了本发明的所有实施方案。应当理解本文呈现的实施方案仅通过实例的方式而不是限制的方式来呈现。因此，各种替代实施方案的这种详细描述不应被解释为限制如下所述的本发明的范围或广度。
在公开和描述本发明之前，应当理解，下面描述的方面不限于具体的组合物，同样地，制备这种组合物的方法或其用途当然可以变化。还应当理解，本文中使用的术语仅用于描述特定方面的目的，并且不旨在是限制性的。
定义
除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
在本说明书和随后的权利要求书中，将提及许多术语，所述术语应被定义为具有以下含义：
本文中使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并且不旨在限制本发明。如本文中使用的，除非另有明确指明，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”还旨在包括复数形式。
视情况而定，所有数字格式，例如pH、温度、时间、浓度、量和分子量(包括范围)都是近似值，其可以改变(+)或(-)10％、1％或0.1％。应当理解，尽管并不总是明确指出，但是所有数字格式之前可以存在术语“约”。还应当理解，尽管并不总是明确指出，但是本文描述的试剂仅是实例，并且它们的等价物是本领域已知的。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况能够发生或者不能够发生，并且该描述包括事件或情况发生的情形和其不发生的情形。
术语“包含”或“包括”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但是不排除其它要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”应意指排除对组合存在任何本质影响的其它要素。例如，基本上由本文定义的要素组成的组合物将不排除不会实质上影响要求保护的本发明的基本和新颖特征的其它要素。“由...组成”应意指排除痕量的其它成分和所记载的实质方法步骤以外的要素。由这些转换术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换地使用，并且是指任何动物或其体外或原位的细胞，其可接受本文描述的方法。在优选的实施方案中，患者、受试者或个体是哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是小鼠、大鼠、豚鼠、非人灵长类动物、狗、猫或驯养动物(例如马、牛、猪、山羊、羊)。在特别优选的实施方案中，患者、受试者或个体是人。
术语“癌症”是指由身体的一个或多个部分中的异常细胞的不受控分裂所引起的疾病。术语“肿瘤”是指质量异常的组织。肿瘤可以是良性或恶性的(癌性的)。
术语“治疗”涵盖了治疗受试者(诸如人)中的本文所述的疾病或病症，并且包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或病症，即导致病症消退；(iii)减缓病症的进展；和/或(iv)抑制、缓解疾病或病症的一种或多种症状或减缓其进展。例如，治疗癌症或肿瘤包括，但不限于，减小肿瘤大小，消除肿瘤和/或其转移，缓解癌症，抑制肿瘤转移，减少或消除癌症的至少一种症状等。
术语向受试者“施用”药剂、药物或天然杀伤细胞包括向受试者引入或递送化合物以执行其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径进行施用，包括经口、鼻内、肠胃外(静脉内、肌内、腹膜内或皮下)或局部施用。施用包括自我施用和通过另一者施用。优选地，施用是通过静脉内施用或直接注射(例如，至肿瘤，肿瘤附近，或者至身体的特定区域)。例如，施用修饰的NK细胞和/或抗趋除剂可以通过直接注射至肿瘤。备选地，修饰的NK细胞和/或抗趋除剂可以在肿瘤部位的近端施用，或者修饰的NK细胞和/或抗趋除剂可以直接施用至于肿瘤有关的血管中(例如，经由微导管注射到肿瘤中、肿瘤附近或供给至肿瘤的血管中)。
还应理解，所描述的治疗或预防医学疾病和病症的各种模式旨在表示“实质性的”，其包括总体治疗或预防，但也包括少于总体治疗或预防，并且其中得到一些生物学或医学上相关的结果。
术语“同时”施用是指通过相同或不同的途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
术语“分开”施用是指通过不同途径同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
术语“顺序”施用是指在不同时间施用至少两种活性成分，其中施用途径相同或不同。更特别地，顺序使用是指在开始施用另一种或其它活性成分之前施用活性成分中的一种的整体施用。因此，可以在施用其它活性成分或多种活性成分之前的数分钟、数小时或数天内施用活性成分中的一种。在这种情况下不存在同时治疗。
术语“同时”治疗用途是指通过相同途径并且同时或基本上同时施用至少两种活性成分。
如本文所使用的术语“治疗”是指治疗和/或预防。治疗效果通过抑制、缓解或根除疾病状态获得。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指当施用时足以引起所需效果的药剂的量。例如，有效量的抗趋除剂可以是足以对癌细胞或肿瘤具有抗趋除效果的量(例如减弱来自肿瘤或癌细胞的趋除效应)。药剂的治疗有效量将根据待治疗的癌症类型及其严重程度以及待治疗的患者的年龄、体重等而变化。技术人员将能够根据这些和其它因素确定合适的剂量。组合物还可以与一种或多种另外的治疗性化合物组合施用。在本文描述的方法中，治疗性化合物可以施用至具有疾病或病症的一种或多种体征或症状的受试者。
涉及细胞/细胞群的术语“杀死”涉及包括将导致该细胞/细胞群死亡的任何类型的操作。
如本文所使用的“抗体”包括根据常规方法制备的多克隆抗体、单克隆抗体、单链抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
“细胞因子”是非抗体可溶性蛋白质的总称，其从一个细胞亚群中释放并且充当细胞间介质，例如在产生或调解免疫应答中充当细胞间介质。参见Human Cytokines：Handbook for Basic&Clinical Research(Agrawal等人编著，Blackwell Scientific，Boston，Mass.1991)(其通过引用整体结合于此用于全部目的)。
“CXCR4/CXCL12拮抗剂”是指拮抗CXCL12结合CXCR4或以其它方式降低CXCL12的趋除效应的化合物。
“趋除活性”或“趋除效应”意指药剂排斥(或化学排斥)具有迁移能力的真核细胞(即可以远离排斥刺激的细胞)的能力。该术语也指由细胞(例如肿瘤细胞)分泌的趋化因子的化学排斥物效应。通常，趋除效应存在于细胞周围的区域中，其中趋化因子的浓度足以提供趋除效应。一些趋化因子(包括白细胞介素8和CXCL12)在高浓度(例如超过约100nM)可以发挥趋除活性，而较低浓度不表现出趋除效应，并且甚至可能是化学引诱物。
因此，具有趋除活性的药剂是“趋除剂”。这种活性可以使用本领域熟知的多种系统中的任何一种进行检测(参见例如美国专利号5,514,555和美国专利申请公开号2008/0300165，其中每一个都通过引用整体结合于此)。美国专利6,448,054中描述了用于本文的优选系统，其通过引用整体结合于此。
术语“抗趋除效应”是指抗趋除剂减弱或消除趋化因子的趋除效应的效应。
如本文所使用的术语“免疫细胞”是参与抗原的特异性识别的造血源细胞。免疫细胞包括抗原呈递细胞(APC)，诸如树突细胞或巨噬细胞、B细胞、T细胞等。优选地，本文中的术语“免疫细胞”是指天然杀伤细胞。
如本文所使用的术语“自体”或“自体细胞”是指从同一患者获得并随后施用至同一患者的NK细胞。
如本文所使用的术语“同种异体”或“同种异体细胞”是指从除向其施用NK细胞的患者以外的受试者中获得的NK细胞。术语“同种异体”和“同种异体的”在本文中是可互换的。
如本文所使用的术语“永生化”或“永生化细胞”是指已经在体外永生化的NK细胞。换言之，它们能够在体外细胞培养物中生长和增殖。实例包括NK-92细胞。
如本文所使用的术语“抗癌疗法”或“抗癌剂”是指传统癌症治疗，包括化学疗法和放射疗法，以及免疫疗法、检查点抑制剂和疫苗疗法。
如本文所使用的，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指由抗原识别部分和T细胞激活结构域组成的融合蛋白。Eshhar等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.，90(2)：720-724。CAR是人工构建的杂合蛋白或多肽，其含有与T细胞信号传导或T细胞激活结构域连接的抗体的抗原结合结构域(例如，单链可变片段(scFv))。CAR能够以非MHC限制性方式将细胞特异性和反应性重定向至选择的靶标(即肿瘤细胞)，利用单克隆抗体的抗原结合特性。非MHC限制性抗原识别使得表达CAR的细胞具有识别独立于抗原加工的抗原的能力，从而绕过肿瘤逃逸的主要机制。
抗趋除剂
抗趋除剂可以是本领域已知的任何此种药剂。在一个实施方案中，抗趋除剂是如美国专利申请公开号2008/0300165中描述的抗趋除剂，其全部内容通过引用结合于此。在优选的实施方案中，抗趋除剂选自由以下组成的组：AMD3100(mozobil/普乐沙福；1，1′-[1，4-亚苯基双(亚甲基)]双[1，4，8，11-四氮杂环十四烷])或其衍生物、KRH-1636、T-20、T-22、T-140、TE-14011、T-14012、TN14003、TAK-779、AK602、SCH-351125、丹宁酸、NSC 651016、沙利度胺(thalidomide)、GF 109230X、针对CXCR4的抗体、和干扰趋除性趋化因子受体二聚化的抗体。例如，抗体可以抑制CXCL12、IL-8、CXCR3或CXCR4的二聚化。在一个实施方案中，抗趋除剂是干扰趋化因子结合其受体的抗体。
在优选的实施方案中，抗趋除剂是CXCR4拮抗剂。在特别优选的实施方案中，抗趋除剂是AMD3100。
在一个实施方案中，抗趋除剂是AMD3100衍生物。AMD3100衍生物包括但不限于美国专利号7,935,692和5,583,131(USRE42152)中发现的那些，其中每一个都通过引用整体结合于此。
抗趋除剂包括特异性抑制趋化因子和/或趋化因子受体二聚化的任何药剂，由此阻断对趋除剂的化学排斥物应答。某些趋化因子，包括IL-8和CXCL12，还能够充当高浓度(例如高于100nM)(其中许多趋化因子作为二聚体存在)下的化学排斥物。趋化因子的二聚化在细胞中引发不同的应答，导致趋化因子受体的二聚化，这是被解释为化学排斥物信号的活性。阻断肿瘤分泌的高浓度趋化因子的化学排斥物效应可以例如通过抑制趋化因子二聚体形成或趋化因子受体二聚体形成的抗趋除剂完成。例如，靶向和阻断趋化因子受体二聚化的抗体(例如，通过干扰二聚化结构域或配体结合)可以是抗趋除剂。通过其它作用机制起作用的抗趋除剂，例如减少由细胞分泌的趋除性细胞因子的量、抑制二聚化和/或抑制趋化因子结合靶受体的抗趋除剂，也涵盖在本发明中。在需要时，可以在不抑制单体趋化因子的趋化作用的情况下实现这种效果。
在其它实施方案中，抗趋除剂是CXCR4拮抗剂、CXCR3拮抗剂、CXCR4/CXCL12拮抗剂或选择性PKC抑制剂。
CXCR4拮抗剂可以是但不限于AMD3100或其衍生物、KRH-1636、T-20、T-22、T-140、TE-14011、T-14012或TN14003、针对CXCR4的抗体或干扰CXCR4二聚化的抗体。另外的CXCR4拮抗剂描述于例如美国专利公开号2014/0219952和Debnath等人7heranostics，2013；3(1)：47-75中(其中每一个都通过引用整体结合于此)，并且包括TG-0054(布利沙福(burixafor))、AMD3465、NIBR1816、AMD070及其衍生物。
CXCR3拮抗剂可以是但不限于TAK-779、AK602或SCH-351125，或干扰CXCR3二聚化的抗体。
CXCR4/CXCL12拮抗剂可以是但不限于丹宁酸、NSC 651016或干扰CXCR4和/或CXCL12二聚化的抗体。
选择性PKC抑制剂可以是但不限于沙利度胺或GF 109230X。
在优选的实施方案中，抗趋除剂是AMD3100(普乐沙福)。美国专利号5,583,131中描述了AMD3100，其通过引用整体结合于此。
在一个实施方案中，抗趋除剂与允许靶向肿瘤或癌症的分子偶联。在一个实施方案中，抗趋除剂与对待靶向的肿瘤具有特异性的抗体偶联(例如，结合)。在一个实施方案中，抗趋除剂与允许靶向肿瘤或癌症的分子偶联。
天然杀伤(NK)细胞
天然杀伤(NK)细胞是一类淋巴细胞，其通常包含人体中大约10％的淋巴细胞。Nk细胞提供针对肿瘤和感染的(靶)细胞的先天细胞免疫应答。特征在于具有CD3-/CD56+表型的NK细胞展现多种激活性和抑制性细胞表面受体。NK细胞抑制性受体主要与正常细胞表面上的主要组织相容性复合物I类(“MHC-1”)蛋白结合以防止NK细胞激活。MHC-I分子将细胞定义为“属于”特定个体。据认为，只有通过这些“自我”MHC-I分子缺失或缺陷的细胞(诸如对于肿瘤或病毒感染的细胞通常是这种情况)才可以激活NK细胞。
在激活的NK细胞受体与靶细胞上的相应配体结合或连接时，触发NK细胞直接针对靶细胞发挥细胞毒性作用。细胞毒效应通过NK细胞分泌各种细胞因子介导，其反过来刺激并募集其它免疫系统因子以对抗靶标。激活的NK细胞还经由分泌酶(穿孔素和粒酶)、刺激凋亡启动受体和其它机制来裂解靶细胞。
NK细胞已被评价为治疗某些癌症中的免疫治疗剂。用于此目的的NK细胞可以是自体的或非自体的(即，来自供体)。
在一个实施方案中，本文的组合物和方法中使用的NK细胞是自体NK细胞。在一个实施方案中，本文的组合物和方法中使用的NK细胞是非自体NK细胞。
在一个实施方案中，本文的组合物和方法中使用的NK细胞是基因修饰的NK细胞。NK细胞可以通过将基因或RNA插入细胞中进行基因修饰，使得细胞表达一种或多种不被野生型NK细胞表达的蛋白质。在一个实施方案中，NK细胞被基因修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)。在优选的实施方案中，CAR对于所述方法或组合物靶向的癌症具有特异性。
修饰的NK细胞的非限制性实例可以见于例如Glienke等人2015，Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells，Frontiers in Pharmacol.6，第21章；PCT专利公开号WO 2013154760和WO 2014055668中；其中每一个通过引用整体结合于此。
在一些实施方案中，NK细胞是NK细胞系。NK细胞系包括但不限于NK-92、NK-YS、KHYG-1、NKL、NKG、SNK-6和IMC-1。参见Klingemann等人Front Immunol.2016；7：91，其通过引用整体结合于此。
NK-92细胞
在患有非霍奇金淋巴瘤的受试者的血液中发现了NK-92细胞系。NK-92细胞缺少正常NK细胞展现的主要抑制性受体，但是保留了大部分激活性受体。与NK细胞相比，NK-92细胞对显著更广谱的肿瘤和感染细胞类型具有细胞毒性，并且通常对这些靶标展现出更高水平的细胞毒性。然而，NK-92细胞既不攻击正常细胞，也不引发免疫排斥反应。另外，NK-92细胞可以容易且稳定地生长并保持连续的细胞培养，并且因此可以在符合c-GMP的质量控制下大量制备。这种特征组合已经导致NK-92进入目前正在进行的用于治疗多种类型癌症的临床试验。
本文描述的组合物和方法中使用的NK-92细胞可以是野生型(即未经基因修饰的)NK-92细胞或基因修饰的NK-92细胞。NK-92细胞可以通过将基因或RNA插入细胞中进行基因修饰，使得细胞表达一种或多种不被野生型NK-92细胞表达的蛋白质。在一个实施方案中，NK-92细胞被基因修饰以在细胞表面上表达嵌合抗原受体(CAR)。在优选的实施方案中，CAR对于所述方法或组合物靶向的癌症具有特异性。在一个实施方案中，NK-92细胞被基因修饰以在细胞表面上表达Fc受体。在优选的实施方案中，表达Fc受体的NK-92细胞可以介导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。在一个实施方案中，Fc受体是CD16。在一个实施方案中，NK-92细胞被基因修饰以表达细胞因子(例如IL-2)。
在一个实施方案中，修饰的NK-92细胞与对待治疗的癌症具有特异性的抗体组合施用。在优选的实施方案中，与抗体组合施用的修饰的NK-92细胞有能力介导ADCC。NK-92细胞的实例可作为ATCC CRL-2407获自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection(ATCC))。
修饰的NK-92细胞的非限制性实例描述于例如美国专利号7,618,817和8,034,332；和美国专利公开号2002/0068044和2008/0247990中，其中每一个都通过引用整体结合于此。修饰的NK-92细胞的实例可获自ATCC，其为ATCC CRL-2408、ATCC CRL-2409、PTA-6670、PTA-6967、PTA-8837和PTA-8836。CAR-修饰的NK-92细胞的非限制性实例可以见于例如Glienke等人2015，Advantages and applications of CAR-expressing natural killer cells，FrontiersinPharmacol.6，第21章；其通过引用整体结合于此。
嵌合抗原受体
本领域技术人员目前或将来已知的任何CAR包含在本发明中。在一个实施方案中，CAR对肿瘤特异性抗原具有特异性。肿瘤特异性抗原也可以称为癌症特异性抗原。在一个实施方案中，CAR对肿瘤相关抗原具有特异性。肿瘤相关抗原也可以称为癌症相关抗原。肿瘤特异性抗原是癌细胞特有的蛋白质或其它分子，而肿瘤相关抗原是与某些肿瘤细胞高度相关并且通常在肿瘤细胞上以较高水平(相比于正常细胞)存在的抗原。通过非限制性实例的方式，肿瘤特异性抗原描述于美国专利号8,399,645、美国专利号7,098,008；WO 1999/024566；WO 2000/020460；和WO 2011/163401中，其每一个通过引用结合于此。
一些已知CAR的实例公开于表2中。在一个实施方案中，CAR靶向肿瘤相关抗原，诸如但不限于α-叶酸受体、CAIX、CD19、CD20、CD30、CD33、CEA、EGP-2、erb-B2、erb-B 2、3、4、FBP、GD2、GD3、Her2/neu、IL-13R-a2、k-轻链、LeY、MAGE-A1、间皮素或PSMA。
在一些实施方案中，CAR识别与特定癌症类型相关的抗原，所述癌症类型例如但不限于卵巢癌、肾细胞癌、B细胞恶性肿瘤、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、B细胞恶性肿瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、无痛性B细胞淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、宫颈癌、乳腺癌(包括炎性乳腺癌)、结肠直肠癌、前列腺癌、神经母细胞瘤、黑素瘤、横纹肌肉瘤、成神经管细胞瘤、腺癌或肿瘤新生血管。在一些实施方案中，CAR识别表2中列出的抗原。
表2：嵌合抗原受体
免疫细胞能够通过本领域已知的任何方法进行基因修饰以表达所需CAR。含有编码所需CAR的多核苷酸的载体能够通过物理、化学或生物手段来容易地引入到免疫细胞中。用于将多核苷酸引入免疫细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源性核酸的修饰的细胞的方法是本领域中公知的。参见例如Sambrook等人(2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)。用于将目标多核苷酸引入免疫细胞的生物方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为将基因插入哺乳动物(例如人细胞)的最广泛使用的方法。其它病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等。参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。用于将多核苷酸引入免疫细胞的化学手段包括胶体分散体系，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球体、珠，以及基于脂质的体系，包括水包油乳液、胶束、混合胶束和脂质体。
修饰的NK细胞组合物
根据本发明，修饰的NK细胞组合物通过本文描述的方法离体(即，在受试者的身体的外面)制备。
在一个方面，本发明涉及包含修饰的人NK细胞的离体NK细胞群，所述NK细胞群具有与个体NK细胞结合的抗趋除剂。在一个实施方案中，抗趋除剂通过细胞表面上的受体与细胞结合。在一个实施方案中，受体是CXCR4。在一个实施方案中，不同量的抗趋除剂与个体NK细胞结合。在一个实施方案中，每个细胞上的至少一部分的受体被所述药剂占据。在一个实施方案中，抗趋除剂与个体NK细胞结合。
在一个实施方案中，“至少一部分的受体”是指至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的特定类型的受体(例如，CXCR4受体)被药剂占据。
在一些实施方案中，根据本领域已知的方法，从患有癌瘤或其它癌症的患者的血液、骨髓或其它含有免疫细胞的器官中提取或以其它方式分离用于制备本文描述的组合物的自体NK细胞。
在一些实施方案中，从除患有待治疗的癌症的患者以外的受试者的血液、骨髓或其它含有免疫细胞的器官中提取或以其它方式分离自体NK细胞。
在一些实施方案中，提供NK细胞系。在一些实施方案中，NK细胞系是NK-92细胞系或基因修饰的NK-92细胞系。在一些实施方案中，细胞系是NK-YS、KHYG-1、NKL、NKG、SNK-6或IMC-1，或者由其衍生的基因修饰的细胞系。
然后，在使得NK细胞群具有整体抗趋除特性的条件下，NK细胞与预定量的本文描述的抗趋除剂(优选AMD3100)接触、混合或以其它方式组合。例如，所述条件可以允许抗趋除剂与群中的个体免疫细胞表面上的CXCR4受体的至少一个子集结合。如本领域技术人员将理解的，例如，可以如美国专利申请公开号2008/0300165中所描述的确定抗趋除剂的量，该文献通过引用整体结合于此。
NK细胞与抗趋除剂接触以形成具有抗趋除特性(例如，具有改善的靶向和/或穿透肿瘤的能力)的修饰的NK细胞群或组合物，然后可以将其在本领域已知的用于血液制品的条件下储存，用于后续施用至患有癌症的患者。在一个实施方案中，NK细胞可以在本领域已知的用于血液制品的条件下储存(并且任选地提取)，然后在将修饰的NK细胞群或组合物施用至患者之前立即与抗趋除剂接触。在另一个实施方案中，在将修饰的NK细胞群或组合物施用至患者之前立即将NK细胞与抗趋除剂接触(并且任选地提取)。
抗癌疗法
在一些实施方案中，至少一种另外的抗癌疗法与修饰的NK细胞组合施用。抗癌疗法可以是用于治疗癌症的任何治疗，包括但不限于化学疗法、放射(例如，质子束疗法、近距离放射疗法、外部束疗法等)、免疫疗法、疫苗疗法等。
在一些实施方案中，在施用修饰的NK细胞之前施用抗癌疗法。在一些实施方案中，在施用修饰的NK细胞之后施用抗癌疗法。在一些实施方案中，在施用修饰的NK细胞同时施用抗癌疗法。
在一些实施方案中，在与修饰的NK细胞相同的组合物中施用抗癌疗法。在一些实施方案中，抗癌疗法与修饰的NK细胞在不同的组合物中施用。
在一些实施方案中，抗癌疗法和修饰的NK细胞的施用是交替的，直至达到所需治疗结果。
剂量和施用
如本文所描述的，修饰的NK细胞组合物以有效量在体内施用至患者。有效量将取决于施用模式、待治疗的特定病症和所需结果。它还将取决于病症的阶段、受试者的年龄和身体状况、并行疗法的本质(如果存在的话)以及医师熟知的类似因素。对于治疗性应用，其量足以实现医学上需要的结果。
特别地，待施用至患者的修饰的NK细胞组合物的量将取决于所使用的NK细胞的类型。自体、同种异体和/或永生化NK细胞的剂量是本领域已知的，并且可以通过合格的医生确定。在一些实施方案中，与未如本文所描述的进行修饰的NK细胞的标准剂量相比，可以使用减少量的细胞。不受理论束缚，预期细胞对肿瘤的改善的靶向/穿透将导致治疗需要更少的总细胞。
通常，本发明的修饰的NK细胞组合物的剂量为每天约5mg/kg体重至每天约50mg/kg的抗趋除剂，其间的所有值和范围(包括端点)包含在内。在一个实施方案中，剂量为每天约10mg/kg至每天约50mg/kg。在一个实施方案中，剂量为每天约10mg/kg至每天约40mg/kg。在一个实施方案中，剂量为每天约10mg/kg至每天约30mg/kg。在优选的实施方案中，剂量为每天约10mg/kg至每天约20mg/kg。在一个实施方案中，剂量不超过约50mg/kg/天。
在抗趋除剂与免疫细胞组合施用的情况下，抗趋除剂的剂量可以是每天约5mg/kg体重至每天约50mg/kg的抗趋除剂，其间的所有值和范围(包括端点)包含在内。在一个实施方案中，剂量为每天约10mg/kg至每天约50mg/kg。在一个实施方案中，剂量为每天约10mg/kg至每天约40mg/kg。在一个实施方案中，剂量为每天约10mg/kg至每天约30mg/kg。在优选的实施方案中，剂量为每天约10mg/kg至每天约20mg/kg。在一个实施方案中，剂量不超过约50mg/kg/天。
在一个实施方案中，修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂的剂量为每周约50mg/kg至每周约350mg/kg的抗趋除剂，其间的所有值和范围(包括端点)包含在内。在一个实施方案中，剂量为约50mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约60mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约70mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约80mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约90mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约100mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约110mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约120mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约130mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约140mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约150mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约160mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约170mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约180mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约190mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约200mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约210mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约220mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约230mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约240mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约250mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约260mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约270mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约280mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约290mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约300mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约310mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约320mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约330mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约340mg/kg/周。在一个实施方案中，剂量为约350mg/kg/周。
在本发明的一个方面，使修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂的施用脉动足以具有抗趋除效应(例如，减弱肿瘤细胞的趋除效应)的时间段。在一个实施方案中，每1小时至每24小时，例如每1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时施用一定量的修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂。在一个实施方案中，每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天施用一定量的修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂。
各种施用途径是可用的。一般而言，本发明的方法可以使用医学上可接受的任何施用模式来实施，其意指产生有效水平的活性化合物而不导致临床上不可接受的副作用的任何方式。
修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂可以与至少一种抗癌疗法/药剂组合施用。“组合”是指任何组合，包括顺序或同时施用。在一个实施方案中，修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂与抗癌疗法/药剂分开施用。在一个实施方案中，修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂与抗癌剂以单一组合物施用。
在一个实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和/或抗癌剂静脉内、皮下、经口或腹膜内施用。在一个实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和/或抗癌剂在肿瘤的近端(例如，接近肿瘤或在与其相同的体腔内)施用。在一个实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和/或抗癌剂直接施用至肿瘤或供给肿瘤的血管中。在一个实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和/或抗癌剂全身施用。在另外的实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和/或抗癌剂通过微导管或植入装置和植入剂型施用。
在一个实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂肠胃外施用。在一个实施方案中，修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂通过微导管施用至肿瘤近端的血管中。在一个实施方案中，修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂通过微导管施用至肿瘤内的血管中。在一个实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂皮下施用。在一个实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂皮内施用。
在一个实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂以连续方式施用限定的时间段。在另一个实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂以脉动方式施用。例如，修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂可以在一段时间内间歇施用。
另外，本发明的重要实施方案(特别是关于施用未结合的抗趋除剂)包括基于泵的硬件递送系统，其中一些适用于植入。这种可植入泵包括控释微芯片。优选的控释微芯片描述于Santini，J T Jr.等人，Nature，1999，397：335-338，其内容通过引用明确结合于此。
在一个实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和/或至少一种另外的抗癌剂直接施用至肿瘤部位。在一个实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和/或至少一种另外的抗癌剂通过直接注射施用至肿瘤中。在一个实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和/或至少一种另外的抗癌剂施用至肿瘤部位的近端。在优选的实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和/或至少一种另外的抗癌剂直接施用至与肿瘤相关的血管中(例如，通过微导管注射到位于、接近或供给到肿瘤的血管中)。
应当理解，用有效量的根据本发明的修饰的NK细胞组合物(在施用或不施用未结合的抗趋除剂的情况下)治疗肿瘤或癌症达足以减弱趋化因子的趋除效应的时间段会恢复针对肿瘤的免疫防御，并且还可以允许抗癌剂(例如，化学治疗剂、放射治疗剂、免疫疗法等)更好地接近肿瘤或癌症以减少或根除肿瘤或癌症。不受理论束缚，据信如本文描述的修饰的NK细胞组合物和抗癌剂的共同施用将导致患有肿瘤或癌症的患者中的协同反应，使得患者具有比单独的任何一种治疗都更好的结果。抗癌剂包括但不限于已知的癌症治疗，例如，化学疗法、放射疗法、免疫疗法和/或疫苗疗法。
抗癌剂可以通过任何适合的方法施用。抗癌剂(包括化学治疗剂、放射治疗剂和抗癌疫苗)的剂量、治疗方案和施用途径是本领域已知的和/或在熟练的临床医师基于治疗类型、癌症类型等进行确定的能力范围内。
在本发明的一个方面，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和/或抗癌剂顺序施用。换言之，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂施用足以允许修饰的NK细胞靶向和/或穿透肿瘤或癌细胞的时间段，并且随后施用抗癌剂。
在本发明的一个方面，抗癌剂在施用修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂的一段时间之后施用。在一个实施方案中，抗癌剂在其中癌细胞/肿瘤的趋除效应被修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂减弱的一段时间内施用。抗癌剂的施用时长和模式将根据所使用的抗癌剂、所治疗的肿瘤类型、患者的状况等变化。这些参数的确定在熟练的临床医生的能力范围内。
在一个实施方案中，修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和抗癌剂的施用是交替的。在优选的实施方案中，修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和抗癌剂的施用交替进行直至患者的状况得到改善。改善包括但不限于减小肿瘤和/或其转移的大小，消除肿瘤和/或其转移，缓解癌症，和/或减弱至少一种癌症症状。
在一个实施方案中，将修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和抗癌剂顺序施用。例如，修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂可以施用足以减少或减弱肿瘤的趋除效应的时间段，例如使得修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂具有抗趋除效应；然后可以将抗癌剂施用一段时间，在此期间肿瘤的趋除效应降低或减弱。在一个实施方案中，修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和抗癌剂以交替方式顺序施用，至少直至患者的状况得以改善。患者的状况的改善包括但不限于减小肿瘤大小，减轻癌症的至少一种症状，消除肿瘤和/或其转移，增加患者的存活等。
化学治疗剂
在本发明的一个方面，修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂与化学治疗剂组合施用。化学治疗剂可以是对一种或多种类型的癌症具有治疗效果的任何药剂。本领域目前已知许多化学治疗剂。作为非限制性实例，化学治疗药物的类型包括烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、有丝分裂抑制剂、皮质类固醇等。
化学治疗药物的非限制性实例包括：氮芥类，诸如二氯甲二乙胺(氮芥)、苯丁酸氮芥、环磷酰胺异环磷酰胺和美法仑(melphalan)；亚硝基脲类，诸如链佐星(streptozocin)、卡莫司汀(carmustine)(BCNU)和洛莫司汀(lomustine)；烷基磺酸盐，诸如白消安(busulfan)；三嗪类，诸如达卡巴嗪(dacarbazine)(DTIC)和替莫唑胺(temozolomide)乙烯亚胺类，诸如噻替派(thiotepa)和六甲蜜胺(altretamine)(六甲基蜜胺)；铂类药物，诸如顺铂、卡铂和奥沙利铂(oxalaplatin)；5-氟尿嘧啶(5-FU)；6-巯基嘌呤(6-MP)；卡培他滨(Capecitabine)阿糖胞苷(Cytarabine)氟尿苷；氟达拉滨(Fludarabine)；吉西他滨(Gemcitabine)羟基脲；甲氨蝶呤(Methotrexate)；培美曲塞(Pemetrexed)蒽环类，诸如柔红霉素(Daunorubicin)、多柔比星(Doxorubicin)表柔比星(Epirubicin)、伊达比星(Idarubicin)；放线菌素-D；博来霉素(Bleomycin)；丝裂霉素-C；米托蒽醌(Mitoxantrone)；拓扑替康(Topotecan)；伊立替康(Irinotecan)(CPT-11)；依托泊苷(Etoposide)(VP-16)；替尼泊苷(Teniposide)；米托蒽醌；紫杉烷类：紫杉醇和多西他赛埃博霉素类(Epothilones)：伊沙匹隆(ixabepilone)长春花生物碱类：长春花碱长春新碱(vincristine)和长春瑞滨(vinorelbine)雌氮芥(Estramustine)泼尼松；甲泼尼龙(Methylprednisolone)地塞米松(Dexamethasone)L-天冬酰胺酶；硼替佐米(bortezomib)另外的化学治疗剂列于例如美国专利申请公开号2008/0300165中，其通过引用整体结合于此。
化学治疗药物的剂量和施用方案是本领域熟知的。熟练的临床医生可以基于包括所施用的化学治疗剂、所治疗的癌症类型、癌症的阶段、患者的年龄和状况、患者大小、肿瘤位置等因素，容易地确定待使用的合适的给药方案。
放射治疗剂
在本发明的一个方面，修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂与放射治疗剂组合施用。放射治疗剂可以是对一种或多种类型的癌症具有治疗效果的任何此种药剂。本领域目前已知许多放射治疗剂。作为非限制性实例，放射治疗药物的类型包括X射线、γ射线和带电粒子。在一个实施方案中，放射治疗剂由身体外部的机器递送(外粒子束放射疗法)。在优选的实施方案中，将放射治疗剂在肿瘤/癌细胞附近置于体内(近距离放射治疗)或者是系统性放射疗法。
外粒子束放射疗法可以通过任何手段施用。外粒子束放射疗法的非限制性实例包括线性加速器施用放射疗法，三维适形放射疗法(3D-CRT)，调强放射疗法(IMRT)，图像引导放射疗法(IGRT)，断层放疗，立体定向放射手术，光子疗法，立体定向放射疗法，质子束疗法，和电子束疗法。
内部放射疗法(近距离放射疗法)可以通过任何技术或药剂。内部放射疗法的非限制性实例包括可以置于肿瘤近端或肿瘤内的任何放射性药剂，诸如镭-226(Ra-226)、钴-60(Co-60)、铯-137(Cs-137)、铯-131、铱-192(Ir-192)、金-198(Au-198)、碘-125(I-125)、钯-103、钇-90等。这种药剂可以通过种、针或任何其它施用途径施用，而且可以是临时的或永久的。
系统性放射疗法可以通过任何技术或药剂。系统性放射疗法的非限制性实例包括放射性碘、替伊莫单抗泰泽坦(Ibritumomab tiuxetan)、托西莫单抗(Tositumomab)和碘I 131托西莫单抗钐-153-lexidronam、锶-89氯化物间碘苯甲胍、镥-177、钇-90、锶-89等。
在一个实施方案中，还将放射增敏剂施用至患者。放射增敏剂增加辐射对癌细胞的破坏作用。
放射治疗剂的剂量和施用方案是本领域熟知的。熟练的临床医生可以基于包括所施用的一种或多种药剂、所治疗的癌症类型、癌症的阶段、肿瘤的位置、患者的年龄和状况、患者大小等因素，容易地确定待使用的合适的给药方案。
免疫治疗剂
在本发明的一个方面，修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂与另外的免疫治疗剂组合施用。
T细胞
T细胞是在细胞表面具有T细胞受体的淋巴细胞。T细胞通过使身体的免疫应答适用于特定病原体而在细胞介导的免疫中发挥核心作用。T细胞(尤其是修饰的T细胞)已经在临床试验中显示出减少或消除肿瘤的希望。通常，这种T细胞被修饰和/或进行过继性细胞转移(ACT)。ACT及其变体是本领域熟知的。参见，例如，美国专利号8,383,099和8,034,334，其通过引用整体结合于此。
美国专利申请号2014/0065096和2012/0321666(其通过引用结合于此)描述了用于癌症的T细胞或NK细胞治疗的方法和组合物。通常可以使用例如美国专利号6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号2006/0121005(其中每一个都通过引用整体结合于此)中所描述的方法激活和扩增T细胞。
在一个实施方案中，本文的组合物和方法中使用的T细胞是自体T细胞(即，来源于患者)。在一个实施方案中，本文的组合物和方法中使用的NT细胞是非自体(异源的；例如，来自供体或细胞系)T细胞。在一个实施方案中，T细胞是来源于T细胞或者癌性/转化的T细胞的细胞系。
在优选的实施方案中，本文描述的方法和组合物中使用的T细胞是修饰的T细胞。在一个实施方案中，T细胞被修饰以在T细胞表面上表达CAR。在优选的实施方案中，CAR对于所述方法或组合物靶向的癌症具有特异性。在一个实施方案中，T细胞被修饰以表达细胞表面蛋白或细胞因子。修饰的T细胞的示例性非限制性实例描述于美国专利号8,906,682；PCT专利公开号WO 2013154760和WO 2014055668中；其中每一个通过引用整体结合于此。
在一个实施方案中，T细胞是T细胞系。示例性的T细胞系包括T-ALL细胞系，如美国专利号5,272,082中所描述的，其通过引用整体结合于此。
抗体
免疫疗法还指用抗肿瘤抗体进行治疗。换言之，可以将对特定类型的癌症(例如，由目标癌细胞表达的细胞表面蛋白)具有特异性的抗体施用至患有癌症的患者。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、抗体片段、人抗体、人源化抗体或非人抗体(例如，鼠、山羊、灵长类动物等)。治疗性抗体可以对任何肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原具有特异性。参见例如Scott等人，CancerImmunity 2012，12：14，其通过引用整体结合于此。
在一个实施方案中，免疫治疗剂是抗癌抗体。非限制性实例包括曲妥珠单抗(trastuzumab)贝伐单抗(bevacizumab)西妥昔单抗(cetuximab)帕尼单抗(panitumumab)伊匹单抗(ipilimumab)利妥昔单抗(rituximab)阿仑单抗(alemtuzumab)奥法木单抗(ofatumumab)吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)色瑞替尼单抗(brentuximab vedotin)90Y-替伊莫单抗泰泽坦(90Y-ibritumomab tiuxetan)和131I-托西莫单抗(131I-tositumomab)
另外的抗体在表1中提供。
表1.抗癌抗体
免疫检查点抑制剂
在一个实施方案中，免疫治疗剂是检查点抑制剂。免疫检查点蛋白由某些类型的免疫系统细胞(诸如T细胞)和一些癌细胞制成。可以阻止T细胞杀死癌细胞的这些蛋白被检查点抑制剂靶向。检查点抑制剂增加T细胞杀死癌细胞的能力。在T细胞或癌细胞上发现的检查点蛋白的实例包括PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/B7-2。
在一个实施方案中，检查点抑制剂是针对检查点蛋白(例如，PD-1、PDL-1或CTLA-4)的抗体。检查点抑制剂抗体包括但不限于BMS-936559、MPDL3280A、MedI-4736、Lambrolizumab、阿仑单抗、阿特珠单抗(Atezolizumab)、伊匹单抗、纳武单抗、奥法木单抗、派姆单抗和利妥昔单抗。
细胞因子
在一个实施方案中，免疫治疗剂是细胞因子。细胞因子刺激患者的免疫应答。细胞因子包括干扰素和白细胞介素。在一个实施方案中，细胞因子是白细胞介素-2。在一个实施方案中，细胞因子是干扰素-α。
抗癌疫苗
在本发明的一个方面，修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂与抗癌疫苗(也称为癌症疫苗)组合施用。抗癌疫苗是通过刺激免疫反应杀死癌细胞来治疗现有癌症或预防癌症发展的疫苗。在优选的实施方案中，抗癌疫苗治疗现有的癌症。
抗癌疫苗可以是对一种或多种类型的癌症具有治疗效果的任何此类疫苗。本领域目前已知许多抗癌疫苗。这种疫苗包括但不限于dasiprotimut-T、Sipuleucel-T、talimogene laherparepvec、HSPPC-96复合物(Vitespen)、L-BLP25、gp100黑素瘤疫苗以及在施用至患者时刺激免疫应答的任何其它疫苗。
癌症
可以用本文描述的修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂和方法治疗的癌症或肿瘤包括但不限于：胆道癌；脑癌，包括成胶质细胞瘤和成神经管细胞瘤(medulloblastomas)；乳腺癌(包括炎性乳腺癌)；宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食管癌，胃癌；血液肿瘤，包括急性淋巴细胞性和骨髓性白血病；多发性骨髓瘤；AIDS相关白血病和成人T细胞白血病淋巴瘤；上皮内肿瘤，包括博温病(Bowen’s disease)和佩吉特病(Paget’s disease)；肝癌(肝癌)；肺癌；淋巴瘤，包括霍奇金病(Hodgkin’s disease)和淋巴细胞性淋巴瘤；神经母细胞瘤；口腔癌，包括鳞状细胞癌；卵巢癌，包括来自上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞的那些；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤，包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤，纤维肉瘤和骨肉瘤；皮肤癌，包括黑素瘤、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、基底细胞癌和鳞状细胞癌；睾丸癌，包括生殖细胞肿瘤(精原细胞瘤、非精原细胞瘤[畸胎瘤、绒毛膜癌])、间质瘤和生殖细胞瘤；甲状腺癌，包括甲状腺腺癌和髓样癌；和肾癌，包括腺癌和肾母细胞瘤(Wilms tumor)。在重要的实施方案中，逃避免疫识别的癌症或肿瘤包括胶质瘤、结肠癌、结肠直肠癌、淋巴样细胞衍生的白血病、绒毛膜癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和黑素瘤。
在优选的实施方案中，肿瘤是实体瘤。在一个实施方案中，肿瘤是白血病。在特别优选的实施方案中，肿瘤表达或过表达CXCL12。在一个实施方案中，可以在施用如本文描述的组合物之前评价CXCL12的肿瘤表达。例如，患有被确定为表达或过表达CXCL12的肿瘤的患者将使用本文描述的方法和/或组合物进行治疗。
在一个实施方案中，肿瘤是脑肿瘤。考虑可以用本文描述的组合物注射的脑肿瘤，例如不可手术的脑肿瘤。在一个实施方案中，抗趋除剂通过进入脑肿瘤内或近端的血管的导管直接施用至脑肿瘤。下面描述导管或微导管施用的进一步讨论。
药物组合物
本发明还提供药物组合物，所述药物组合物包含有效量的本发明的修饰的NK细胞组合物(具有或不具有未结合的抗趋除剂)和一种或多种药用赋形剂。为了制备含有本发明的修饰的NK细胞组合物的药物组合物，使用惰性和药用赋形剂或载体。液体药物组合物包括例如适用于皮内、皮下、肠胃外或静脉内施用的溶液、混悬剂和乳剂。修饰的NK细胞组合物的无菌水溶液或者修饰的NK细胞组合物在包括水、缓冲水、盐水、PBS、乙醇或丙二醇的溶剂中的无菌溶液是适用于肠胃外施用的液体组合物的实例。根据需要，组合物可以含有药用助剂以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂、除垢剂等。
可以施用含有修饰的NK细胞组合物的药物组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在治疗性应用中，将组合物以足以预防、治愈、逆转或至少部分减缓或阻止病症的症状及其并发症的量施用至患者，所述患者已经患有可以通过肿瘤或癌细胞的增殖而恶化的病症。足以实现这一点的量被定义为“治疗有效剂量”。对这种用途有效的量将取决于疾病或病症的严重程度以及患者的体重和一般状态。适合的剂量可以以每日、每周、每两周或每月的间隔施用。组合物的单次或多次施用可以由治疗医师选择的剂量水平和模式进行。在任何情况下，药物制剂应该提供一定量的本发明的修饰的NK细胞组合物，其足以在施用至患者时提供所需的抗趋除特性，并且为了治疗目的而有效地抑制患者中的肿瘤细胞生长、增殖或存活。
本发明的药物组合物适用于各种药物递送系统。适用于本发明的合适的制剂见于Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，Pa.，第17版(1985)。关于药物递送方法的简要综述参见Langer，Science 249：1527-1533(1990)。本发明的药物组合物可以通过各种途径施用，例如皮下、皮内、经皮、肌内、静脉内或腹膜内。
治疗方法
在本发明的一个方面提供了通过使用如本文描述的修饰的NK细胞组合物治疗有需要的患者的癌症的方法。在优选的实施方案中，修饰的NK细胞组合物与未结合的抗趋除剂组合施用。在一个实施方案中，还施用至少一种另外的抗癌剂。
在一个方面，本发明涉及用于杀死癌细胞的方法，所述癌细胞表达一定量的足以产生趋除效应的趋化因子，所述方法包括：a)使所述细胞与有效量的本文描述的修饰的NK细胞组合物接触足够的时间段以允许NK细胞克服所述趋除效应(例如以靶向癌细胞)。在一个实施方案中，所述方法还包括：b)使所述细胞与至少一种抗癌剂接触。在一个实施方案中，所述方法还包括：必要时重复a)和/或b)以杀死所述细胞。
在一个方面，本发明涉及用于治疗哺乳动物中的肿瘤的方法，所述肿瘤表达一定量的足以产生趋除效应的趋化因子，所述方法包括：a)向所述哺乳动物施用有效量的本文描述的修饰的NK细胞组合物接触足够的时间段以允许NK细胞克服所述趋除效应(例如以靶向和/或穿透肿瘤)。在一个实施方案中，所述方法还包括：a’)向所述哺乳动物施用有效量的未结合的抗趋除剂达一段时间以减弱所述趋除效应，其中a’)可以在a)之前、与a)一起或在a)之后进行。在一个实施方案中，所述方法还包括：b)向所述哺乳动物施用至少一种抗癌剂。在一个实施方案中，必要时重复步骤a)、a’)和/或b)以改善哺乳动物的状态。
在一个实施方案中，抗癌剂在施用修饰的NK细胞组合物和/或未结合的抗趋除剂的一段时间之后施用。在一个实施方案中，抗癌剂在趋除效应减弱的时间段内施用。
在一个实施方案中，趋化因子是CXCL12。在一个实施方案中，癌细胞是实体瘤细胞。在一个实施方案中，癌细胞是白血病细胞。在一个实施方案中，抗癌剂在完成细胞与抗趋除剂接触的约3天内施用。在一个实施方案中，抗癌剂在完成细胞与抗趋除剂接触的约1天内施用。
实施例
以下实施例仅用于说明性目的，并且不应被解释为限制要求保护的发明。存在本领域技术人员可获得的各种替代技术和程序，这些技术和程序将同样允许本领域技术人员成功地实施所需发明。
实施例1：确定AMD3100的抗趋除量比上趋除量
从健康供体外周血制备新鲜制备和纯化的人CD3+ T细胞。在对照、趋化性或趋除性设置(AMD3100浓度为0.1μM至10μM)中，将20,000个T细胞装载到Transwell的上部室中。在下部室中对迁移的细胞进行计数，并且如先前所描述的定量迁移。Vianello等人The Journal of Immunology，2006，176：2902-2914；Righi等人，Cancer Res.；71(16)；5522-34，其中每一个都整体结合于此。
观察到人CD3+T细胞对AMD3100的二元或双峰趋化性(图1；CI 2.3，于1μM)和趋除性(图2；CI＝1.6，于0.1μM)应答的明显证据(其中CI或趋化指数为1.0是对照)。所有孔一式三份地进行。
实施例2：确定AMD3100的局部抗趋除量
对于定量移行测定，将纯化的人CD3+T细胞(大约2×104个细胞)添加到每个孔中的插入物的上部室中，至总体积为150μl的Iscove’s改良培养基。将含有0.5％FCS的DMEM中的肿瘤细胞(从哺乳动物肿瘤中分离)添加到Transwell的下部室、上部室或者下部室和上部室两者中以产生细胞迁移的标准“棋盘格”分析，包括趋化性、趋除性和化动性。
为了确定AMD3100的抗趋除浓度，在添加至所述室之前，将T细胞与0.01μM至10mM AMD3100温育。
3小时后从下部室收获细胞，并且使用血细胞计数器进行细胞计数。
预计用一定浓度的AMD3100预温育的T细胞将表现出双峰效应，其中在较低浓度观察到抗趋除效应并且在较高浓度观察到趋除效应。
实施例3：用修饰的T细胞和抗趋除剂治疗肿瘤
从患有成胶质细胞瘤的65岁患者中分离T细胞，并且将其在体外扩增以提供T细胞群。然后将T细胞群与AMD3100混合并温育。通过直接输注至肿瘤中，患者接受1.6×107个修饰的T细胞/AMD3100组合物。考虑用修饰的T细胞和AMD3100进行治疗将具有协同效应，使得共同治疗导致肿瘤尺寸减小。