本发明属于抗炎药物制备技术领域，涉及一种快速获得绿原酸粗提物的方法。
背景技术：
乌苏里瓦韦[Lepisorus ussuriensis(Regel et Maack)Ching]为蕨类水龙骨科瓦韦属植物，别名石茶、树茶、还阳草、大石韦等。在中国分布于安徽、河南、山东、河北、辽宁、吉林、黑龙江。资料记载，乌苏里瓦韦主要活性成分为绿原酸，具有清热解毒、利尿、止咳、止血等功效，可用于治疗小便不利、小便淋痛、肺热咳嗽、哮喘、咽喉肿痛、疮疡肿毒、风湿疼痛、刀伤出血。乌苏里瓦韦生于海拔800m左右的山地树干或岩石上，且植株较矮小(高10余厘米)。该植物目前仅在产地山区民间应用，来治疗各种炎症疼痛，且疗效甚好。但由于其分布区域较狭窄，生长环境要求严格，植株矮小且产量不大，因此采用组织培养的方法快速获取其有效成分以保障其开发利用研究尤为重要。
技术实现要素：
为实现上述目的，本发明提供一种快速获得绿原酸粗提物的方法，可以快速提取乌苏里瓦韦活性成分，解决了开发资源量不足的问题。
本发明所采用的技术方案是，一种快速获得绿原酸粗提物的方法，具体按照以下步骤进行：
步骤1，配置培养基与培养基的灭菌；
步骤2，消毒处理乌苏里瓦韦根茎；
步骤3，外植体的接种；
步骤4，根茎愈伤组织培养；
a.根茎愈伤组织的诱导；
以1/2MS为基本培养基，分别添加6-BA 0.3mg·L-1、2,4-D 3mg·L-1、IBA 1mg·L-1作为培养基生长调节剂，培养基琼脂含量为7.0gL-1，蔗糖含量为30.0g·L-1，pH为5.8；将切成1cm的根茎小块接种于培养基上，置于恒温培养箱，在25±2℃下暗培养，培养30天；
b.根茎愈伤组织的增值；
以MS为基本培养基，添加6-BA 0.3mg·L-1、2,4-D 3mg·L-1、IBA 1mg·L-1作为培养基生长调节剂，培养基琼脂含量为7.0g·L-1，蔗糖含量为30.0g·L-1，pH值为5.8；将愈伤组织切成0.5cm×0.5cm的小块接种于培养基上，置于恒温培养箱，在25±2℃下暗培养，增殖时间为25天；
步骤5，乌苏里瓦韦愈伤组织中有效成分的提取；
取乌苏里瓦韦根茎愈伤组织研碎后，加70％乙醇超声提取1h，其中料液比1:20，浓缩，再用正丁醇萃取，然后浓缩成浸膏，即得。
进一步的，所述步骤1按照以下步骤进行：
以1/2MS为基本培养基，附加6-BA 0.5mg·L-1、2,4-D 3mg·L-1、IBA 1mg·L-1作为培养基生长调节剂，培养基琼脂含量为7.0g·L-1，蔗糖含量为30.0g·L-1，加入双蒸水使其溶解，用NaOH和HCl溶液将培养基pH值调至5.8±0.2，放入加热套中加热并用玻璃棒不断搅拌使培养基完全溶解；用封口膜封住瓶口，放入立式压力蒸汽灭菌器中，于101kpa下灭菌20min，然后断开电源打开放气阀，待气压降至标准大气压后，取出培养基，将灭菌后的培养基放在无菌操作台中；培养基倒入培养皿中要趁热，防止培养基凝固，倒入培养皿中的培养基厚度为1.5cm，待培养皿中的培养基凝固冷却以备用。
进一步的，无菌操作台在使用前需用紫外灯照射30min，使无菌操作台处于无菌状态。
进一步的，所述步骤2按照以下步骤进行：
取乌苏里瓦韦根茎自来水冲刷10min后，放入烧杯中带入无菌接种室备用，倒入浓度75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗1次，用0.1％HgCl2溶液对根茎进行浸泡消毒5min，再用无菌水冲洗5～6次，将消毒完全的外植体置于铺有无菌的滤纸中，吸干外植体表面的水分，将根茎则切成1cm的小段，即可用于无菌接种。
进一步的，所述步骤3按照以下步骤进行：
将所有要用到的工具进行酒精灯消毒处理，将根茎外植体充分接触到培养基上后，用盖子盖好，并用封口膜封严，将接种外植体的培养皿放在25±2℃环境下培养，静等观察。
本发明的有益效果是传统的该药材使用方法就是采摘其地上部分，泡茶或泡酒饮用。由于其生长环境的限制每年只能采摘一次，采摘费时费力且产量低。采用本方法可以不受地理位置、时间等的限制，且可以减少人力物力等。药理实验也表明，一定剂量的乌苏里瓦韦愈伤组织活性成分粗提物与野生乌苏里瓦韦的抗炎药理作用无明显差别。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是绿原酸标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种快速获得绿原酸粗提物的方法，具体按照以下步骤进行：
步骤1，培养基的配置与灭菌
培养基的配置：以1/2MS为基本培养基，附加6-BA 0.3mg·L-1、2,4-D 3mg·L-1、IBA1mg·L-1作为培养基生长调节剂，培养基琼脂含量为7.0g·L-1，蔗糖含量为30.0g·L-1，加入双蒸水使其溶解，用NaOH和HCl溶液将培养基pH值调至5.8±0.2，放入加热套中加热并用玻璃棒不断搅拌使培养基完全溶解。用封口膜封住瓶口，放入立式压力蒸汽灭菌器中，于101kpa下灭菌20min。20min后断开电源打开放气阀，待气压降至标准大气压后，取出培养基，将灭菌后的培养基放在无菌操作台中。无菌操作台在使用前需用紫外灯照射30min，使无菌操作台处于无菌状态。培养基倒入培养皿中要趁热，防止培养基凝固且倒入培养皿中的培养基厚度应为1.5cm左右，待培养皿中的培养基凝固冷却以备用。
步骤2，实验材料处理
取乌苏里瓦韦根茎自来水冲刷10min后，放入烧杯中带入无菌接种室备用，倒入75％酒精消毒30s，无菌水冲洗1次，用0.1％HgCl2溶液对根茎进行浸泡消毒5min，再用无菌水冲洗5～6次，将消毒完全的外植体置于铺有无菌的滤纸中，吸干外植体表面的水分，将根茎则切成1cm左右的小段，即可用于无菌接种。
步骤3，外植体的接种
将所有要用到的工具进行酒精灯消毒处理，将根茎外植体充分接触到培养基上后，用盖子盖好，并用封口膜封严，将接种外植体的培养皿放在25±2℃环境下培养，静等观察。以上操作都要时刻注意无菌操作，以防止培养过程中感染细菌，影响其生长。
步骤4，根茎愈伤组织培养
a.根茎愈伤组织的诱导
以1/2MS为基本培养基，分别添加6-BA 0.3mg·L-1、2,4-D 3mg·L-1、IBA 1mg·L-1作为培养基生长调节剂，培养基琼脂含量为7.0gL-1，蔗糖含量为30.0g·L-1，pH为5.8左右；将根茎切成1cm左右的小块接种于培养基上，置于恒温培养箱，在25±2℃下暗培养，培养30天。
b.根茎愈伤组织的增值
以MS为基本培养基，添加6-BA 0.3mg·L-1、2,4-D 3mg·L-1、IBA 1mg·L-1作为培养基生长调节剂，培养基琼脂含量为7.0g·L-1，蔗糖含量为30.0g·L-1，pH值为5.8；将愈伤组织切成0.5cm×0.5cm左右的小块接种于培养基上，置于恒温培养箱，在25±2℃下暗培养，增殖时间为25天。
步骤5，乌苏里瓦韦愈伤组织中有效成分的提取
取乌苏里瓦韦根茎愈伤组织研碎后，加70％乙醇(料液比1:20)超声提取1h，浓缩，再用正丁醇萃取，然后浓缩成浸膏，即为乌苏里瓦韦活性成分浓缩物。
采用组织培养的方法获得药用植物有效成分的技术已经有很多实例，实验技术已经很成熟。针对乌苏里瓦韦这种疗效甚好的抗炎药物进行愈伤组织培养，经过25天，外植体即可增加重量为原来的10倍以上，而且由于是离体培养，还不受季节的限制，解决了开发资源量不足的问题，对今后将乌苏里瓦韦开发成一种抗炎中药提供了资源保障。
采用紫外分光光度法对乌苏里瓦韦愈伤组织中的绿原酸含量进行了测定。测定方法及结果如下：
1.供试品溶液的制备
精密称取愈伤组织0.2g，置于研钵中研碎后，加蒸馏水超声提取1h，过滤浓缩后，用乙醇定容于25mL容量瓶中，备用。
2.对照品溶液的配置
取绿原酸对照品，精密称取4.77mg，加乙醇定容于10mL容量瓶中，即得0.477mg·mL-1的对照品溶液。
3.紫外分光光度法检测波长的确定
绿原酸含量测定波长的选择，通过全波长扫描得绿原酸标准溶液的吸收光度谱图，得到绿原酸在324nm处有较为平缓的最大吸收峰，故选324nm作为绿原酸的检测波长。
4.线性关系的考察
分别精密吸取3.2.2.2绿原酸标准溶液0.08、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mL置于10mL容量瓶中，配置成3.816μg·mL-1、4.77μg·mL-1、7.155μg·mL-1、9.54μg·mL-1、11.92μg·mL-1、14.31μg·mL-1标准溶液以备用，取水作为空白对照，于324nm处测定6种样品吸光值，并以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标绘制标准曲线。
5.愈伤组织中绿原酸的含量测定
a.线性关系的考察结果
以吸光度(A)为纵坐标，浓度(C)为横坐标绘制标准曲线，绘制得出的绿原酸标准曲线图，如图1，进行回归分析得y＝0.050x+0.011，R2＝0.993(n＝6)，说明绿原酸对照品在3.816～14.31μg·mL-1范围内线性关系良好。
b.供试品溶液中绿原酸含量测定结果
根据乌苏里瓦韦抑愈伤组织提取绿原酸含量正交最优实验条件进行愈伤组织培养，最终得绿原酸的含量为3.318mg g-1。
研究表明，野生乌苏里瓦韦中地上部分绿原酸含量为2.635mg g-1，其根茎愈伤组织中的绿原酸含量高于野生乌苏里瓦韦。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。