一种鉴定人类Mur血型基因的多重PCR方法与流程

本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种鉴定人类Mur血型基因的多重PCR方法。

背景技术：

1927年，Landsteiner和Levine使用人类血液免疫家兔并获得特异性抗体，从而发现了M和N抗原。在随后的研究中，MNS血型系统的抗原被不断发现，到目前为止已发现46种抗原，其复杂程度仅次于Rh血型系统。MNS血型系统中许多是高频或低频抗原，低频抗原多由单个氨基酸的改变或由GPA/GPB分子融合引起。

GPA及GPB由紧密的同源基因(GYPA/GYPB)控制编码，GYPA基因控制GPA的编码，GYPB基因控制GPB的编码。GYPA、GYPB基因具有高度同源性，可达95％以上。MNS血型系统抗原多态性与复杂性是GYP基因变异的结果，GYP基因变异包括单核苷酸或多核苷酸突变、交叉融合、基因转换、基因缺失、基因杂合等。Miltenberger亚系统中的许多低频抗原由杂合基因控制编码，如GP.Mur(GYPB.Mi.III)、GP.Hop(GYPB.Mi.IV)、GP.Bun(GYPB.Mi.VI)和GP.HF(GYPB.Mi.X)由GYP(B-A-B)杂合基因控制编码，其产物是B-A-B杂合糖蛋白[GP(B-A-B)]。基因杂合在MNS血型系统中出现频率较高。高度同源的GYPA、GYPB基因序列增加了基因杂合导致交换重组的机率，但这种交换是不对等的。不对等交换发生在减数分裂期，可产生两种新的单倍型：一种单倍型是由GYPA和GYPB基因组成的融合基因，而无单独的GYPA和GYPB基因。另一种单倍型被称为反-Lepore型(anti-lepore type)，不仅有GYPA和GYPB基因的融合基因，而且在其两侧还有正常的GYPA和GYPB基因，Miltenberger亚系统中的Mur基因型GYP(B-A-B)Mur，即GP.Mur(GYPB.Mi.III)属于此类型。

Mur血型抗原是因GYPA和GYPB基因杂交而导致本不应该表达的GPB假外显子3表达后所产生，作为临床最为重要的稀有血型之一，目前正日益受到国内临床输血界的重视。Mur阳性血型在白种人中相当少见，但在亚洲人群中却有着相当高的阳性频率，特别是东南亚地区，约10％的泰国献血者为Mur抗原阳性。Mur血型在我国不同人群中分布频率有很大差异，香港和台湾地区Mur血型的平均频率分别为6.28％和7.3％，在台湾阿美山人中，Mur抗原阳性频率甚至可达88％；2014年有文献报导Mur抗原阳性在安徽省汉族人群中的分布频率为0.9％，而广州地区无偿献血者中Mur抗原阳性的频率为6.59％；广西侗族、壮族分布频率分别为15.4％和11.29％。Mur抗原可刺激机体产生抗-Mur，在香港抗-Mur在患者和孕妇中出现的频率分别为0.34％和0.46％，是常见的同种不规则抗体。抗-Mur可以导致急性和迟发性溶血性输血反应，以及严重的新生儿溶血病。因此鉴定Mur血型抗原对于了解人群分布频率，鉴定抗-Mur抗体，筛查和提供相合的血液，提高临床输血安全性都具有重要的应用价值。

目前检测Mur血型抗原仍十分困难，虽然可以用相应的抗-Mur检测出Mur抗原，但抗Mur的抗体没有市售商品，国内外只有少数免疫血清学实验室有筛查自人源的血清抗体，仅用于科研，无法大量用于临床，也更无法大规模推广应用。鉴于基因和表达蛋白的高度相关性，应用分子生物学的方法可以有效解决血型学方法抗体来源限制，导致难以推广的难题。

另外，目前市面已有Mur的基因分型试剂盒，但存在以下缺点：

1、价格昂贵：进口的Mur基因检测试剂虽然可靠性好，但每人份约需300～600人民币元，非常昂贵；国产试剂较便宜，每人份仍需100人民币元以上，可靠性较差，而且这个价格仍然是大规模检测难以承受的；

2、操作繁琐：上述试剂盒需4～8个反应管，样本DNA和耗材的消耗量很大，而且加样繁琐，容易出错，同时判读困难，不适于大规模的检测工作；

3、内对照均为人类生长激素基因，但我们实际使用中发现有因待检基因质量不好，造成内对照有扩增条带，但检测带无扩增产物，即假阴性的结果。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种经济、简便和直观的鉴定人类Mur血型基因的多重PCR方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种鉴定人类Mur血型基因的引物组，包括Mur上游引物和Mur下游引物，Mur上游引物序列如SEQ ID NO1所示：ACCCTCCAGAAGAGGAAACCGG；Mur下游引物序列如SEQ ID NO2所示：ACAGTGAAACGATGGACAAGTTGTC。

进一步地，该Mur上游引物位于GYPA基因与GYPB基因的杂交区域，Mur下游引物位于GYPA基因与GYPB基因杂交区域外的GYPB基因区域。

进一步地，还包括上游内对照引物和下游内对照引物，上游内对照引物序列如SEQ ID NO3所示：GAACATATCCGATGTTATACA；下游内对照引物序列如SEQ ID NO4所示：AGATGTGTCCAGCATCTGGCTA。

进一步地，该上游内对照引物位于GYPA基因与GYPB基因杂交区域外的GYPA基因的第一外显因子上；下游内对照引物位于GYPA基因与GYPB基因杂交区域外的GYPB基因的第一外显因子上。

进一步地，该Mur上游引物、Mur下游引物、上游内对照引物、下游内对照引物的体积比为：(0.5～3)：(0.5～3)：1：1。

进一步地，该Mur上游引物、Mur下游引物、上游内对照引物、下游内对照引物的体积比为：2：2：1：1。

进一步地，该Mur上游引物和Mur下游引物的PCR产物的长度均为988bp；上游内对照引物和下游内对照引物的PCR产物的长度均为592bp。

本发明还公开了一种用于鉴定人类Mur血型基因的试剂盒，包括上述的鉴定人类Mur血型基因的引物组。

进一步地，还包括如下：2.0μl 10倍缓冲溶液，2.0μl浓度为2.5mM的dNTP混合物，0.1μl浓度为5U/μl的Taq DNA聚合酶，1.0μl浓度为25mM的MgCl₂溶液和13.7μl的双蒸水，Mur上游引物、Mur下游引物、上游内对照引物和下游内对照引物的总体积为2μl。

本发明还公开了一种鉴定人类Mur血型基因的多重PCR方法，该方法包括如下：将模板DNA与上述引物组或者试剂盒中的试剂混合，进行PCR扩增反应，再将PCR产物进行电泳得到结果。

本发明一种鉴定人类Mur血型基因的多重PCR方法具有如下优点：1.依据GenBank数据库中GYP(B-A-B)Mur相应序列(GenBank No:AF090739)、GYPA相应序列(GenBank No:NG_007470)和GYPB相应序列(GenBank No:NG_007483.2)，根据GYP(B-A-B)Mur与GYPA/GYPB的差异位点，以保证扩增产物的特异性和鉴定的准确性。2.内对照设计在GYPA/GYPB的第1外显子上，为GYPA/GYPB共有序列，与待检基因位置接近，能够准确反映出待检基因的质量是否适于扩增，从而保证扩增实验能够准确，避免假阴性。3.Mur基因型为反-Lepore型，不仅有GYP(B-A-B)融合基因，还有正常的GYPA或GYPB基因，内对照引物设计于GYPA/GYPB上，当扩增出特异条带，也进一步验证了Mur基因型的反-Lepore型，提高了检出准确性。

附图说明

图1是本发明中GYP(B-A-B)Mur基因扩增结果；

其中：M：Marker，Takara，DL2000。1、2、3、5、6、7、8为阴性对照，4为GYP(B-A-B)Mur基因阳性样本；退火温度为57℃；

图2是本发明中GYP(B-A-B)Mur基因不同退火温度扩增结果；

其中：M：Marker，Takara，DL2000。1、2为阴性对照；3、4为GYP(B-A-B)Mur基因阳性样本，退火温度为57℃；5、6为GYP(B-A-B)Mur基因阳性样本，退火温度为58℃；7、8为GYP(B-A-B)Mur基因阳性样本，退火温度为59℃；

图3是本发明中GYP(B-A-B)Mur基因扩增产物测序结果；

图4是本发明中扩增产物在Genbank比对结果；

其中：Query为比对序列，Sbjct为目标参考序列GP.Mur(GYPB.Mi.III)；

图5是本发明中GYP(B-A-B)Mur基因扩增结果；

其中：M：Marker，Takara，DL2000。1、2、3、5、6、7为阴性对照，4为GYP(B-A-B)Mur基因阳性样本；

图6是本发明中GYP(B-A-B)Mur基因扩增结果；

其中：M：Marker，Takara，DL2000。1、2为GYP(B-A-B)Mur基因阳性样本，3、4为阴性对照；

图7是48例样本中Mur基因检测结果；

其中：图中箭头所示为检测阳性结果。

具体实施方式

本发明一种鉴定人类Mur血型基因的引物组，一种鉴定人类Mur血型基因的引物组，包括Mur上游引物和Mur下游引物，Mur上游引物序列如SEQ ID NO1所示：ACCCTCCAGAAGAGGAAACCGG；Mur下游引物序列如SEQ ID NO2所示：ACAGTGAAACGATGGACAAGTTGTC。

该Mur上游引物位于GYPA基因与GYPB基因的杂交区域，Mur下游引物位于GYPA基因与GYPB基因杂交区域外的GYPB基因区域。

还包括上游内对照引物和下游内对照引物，上游内对照引物序列如SEQ ID NO3所示：GAACATATCCGATGTTATACA；下游内对照引物序列如SEQ ID NO4所示：AGATGTGTCCAGCATCTGGCTA。

该上游内对照引物位于GYPA基因与GYPB基因杂交区域外的GYPA基因的第一外显因子上；下游内对照引物位于GYPA基因与GYPB基因杂交区域外的GYPB基因的第一外显因子上。

该Mur上游引物、Mur下游引物、上游内对照引物、下游内对照引物的体积比为：(0.5～3)：(0.5～3)：1：1。

该Mur上游引物、Mur下游引物、上游内对照引物、下游内对照引物的体积比为：2：2：1：1。

该Mur上游引物和Mur下游引物的PCR产物的长度均为988bp；上游内对照引物和下游内对照引物的PCR产物的长度均为592bp。

本发明还公开了一种用于鉴定人类Mur血型基因的试剂盒，包括上述的鉴定人类Mur血型基因的引物组。

进一步地，还包括如下：2.0μl 10倍缓冲溶液，2.0μl浓度为2.5mM的dNTP混合物，0.1μl浓度为5U/μl的Taq DNA聚合酶，1.0μl浓度为25mM的MgCl₂溶液和13.7μl的双蒸水，Mur上游引物、Mur下游引物、上游内对照引物和下游内对照引物的总体积为2μl。

本发明公开了一种鉴定人类Mur血型基因的多重PCR方法，该方法包括如下：将模板DNA与上述的引物组或者试剂盒中的试剂混合，进行PCR扩增反应，再将PCR产物进行电泳得到结果。

本发明的方法是利用人类Mur血型基因的特异性序列改变，设计2对引物，进行聚合酶链反应(PCR)来完成的。因此，本发明可被视为是基于PCR-SSP(Sequence specific primer，序列特异性引物)的原理而建立的。利用针对不同位点而设计出序列特异性引物，然后通过优化序列特异性引物的混合比例和PCR反应条件，从而达到准确检测出人类Mur血型基因型的目的，避免假阳性和假阴性出现。在本文中，术语“多重PCR”是指通过在同一个反应中同时完成多个基因的扩增的筛选检测方法。研究表明，对于成功进行多重PCR尤为重要的因素是：引物的特异性、引物混合比例和反应条件。

实施例1

本实施例中，验证了扩增Mur基因的引物的特异性，引物按照终浓度10μM稀释，阳性对照为上海血液中心提供的已确认为Mur抗原阳性的样本，提取全血基因组DNA作为阳性基因对照，该方法包括步骤：

(1)在0.5mL的Ependoff管内加入2.0μl的10倍缓冲溶液、2.0μl引物混合物、2.0μl浓度为2.5mM的dNTP混合物、0.1μl浓度为5U/μl的Taq DNA聚合酶、1.0μl浓度为25mM的MgCl₂溶液、1.0μl模板DNA和13.7μl双蒸水，充分混合；

(2)将Ependoff管放入PCR扩增仪中，95℃变性5分钟，然后进行33个循环的PCR反应，即95℃下持续30秒，57℃下持续30秒和72℃下持续30秒，随后72℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃；

(3)取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照，如图1所示。根据引物设计的扩增目的基因长度为988bp，图中4号样本有扩增产物，其扩增长度在与Marker相对照，略少于1000bp，符合扩增产物长度的设计；8个样本中，只有4号为GYP(B-A-B)Mur基因阳性样本，其它为阴性对照样本，从本发明设计的引物扩增结果可见，扩增结果符合样本设置预期，说明本发明所设计的引物具有很好的特异性。

在本实施方式中，所述引物混合物包含Mur上游引物和Mur下游引物，分别为特异性扩增GYP(B-A-B)Mur基因的上下游引物，扩增产物长度为988bp。Mur上游引物序列如SEQ ID NO1所示：ACCCTCCAGAAGAGGAAACCGG；Mur下游引物序列如SEQ ID NO2所示：ACAGTGAAACGATGGACAAGTTGTC。Mur上游引物位于GYPA基因与GYPB基因的杂交区域，Mur下游引物位于GYPA基因与GYPB基因杂交区域外的GYPB基因区域。扩增条件可选退火温度包括57℃、58℃和59℃，如图2所示，由图中可知，3个不同的退火温度条件下，57℃退火温度条件下的扩增产物电泳后观察条带清晰明亮，无杂带，说明扩增产物量大且特异性好；随着退火温度升高为58℃和59℃，扩增产物电泳后观察条带亮度减弱，也无杂带，显示随着退火温度升高，扩增产物量减少；说明在57℃退火温度条件下，扩增产物量大，利于电泳后观察结果，并且没有非特性的扩增产物，说明57℃是本发明的适宜退火温度。

还提供了扩增后的产物进行测序的结果，将扩增产物测序，测序引物为扩增引物。测序结果在Genbank上比对测序和比对结果见图3和图4所示。由图3可知，测序图中各碱基测序峰清晰，无杂合套叠峰，无错位峰；测序图底部为背景峰，峰值很低，显示扩增产物特异性高。测定的序列结果可以从图中直接读出，经比对，测序结果为GYP(B-A-B)Mur基因的序列，说明本发明建立的检测方法具有很好的特异性，能够特异性地扩增出GYP(B-A-B)Mur基因的序列。

由图4可知，扩增产物的测序结果与GP.Mur目标参考序列有很好的吻合度，说明本发明建立的检测方法具有很好的特异性，能够特异性地扩增出GYP(B-A-B)Mur基因的序列。

实施例2

在该实施例中，提供了一种检测Mur血型基因型的多重PCR方法，该方法包括如下步骤：

⑴在0.5mL的Ependoff管内加入2.0μl的10倍缓冲液、2.0μl的引物混合物、2.0μl浓度为2.5mM的dNTP混合物、0.1μl浓度为5U/μl Taq DNA聚合酶1.0μl浓度为25mM的MgCl₂溶液、1.0μl模板DNA和13.7μl双蒸水，充分混合；

⑵将Ependoff管放入PCR扩增仪中，95℃变性5分钟，然后进行33个循环的PCR反应，即95℃下持续30秒，57℃下持续30秒和72℃下持续30秒，随后72℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃；

⑶取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照。

所述引物混合物包含Mur上游引物、Mur下游引物、上游内对照引物、和下游内对照引物，Mur上游引物和Mur下游引物分别为特异性扩增GYP(B-A-B)Mur基因的上下游引物；上游内对照引物、下游内对照引物分别为特异性扩增GYPA和GYPB基因。Mur上游引物序列如SEQ ID NO1所示：ACCCTCCAGAAGAGGAAACCGG；Mur下游引物序列如SEQ ID NO2所示：ACAGTGAAACGATGGACAAGTTGTC。Mur上游引物位于GYPA基因与GYPB基因的杂交区域，Mur下游引物位于GYPA基因与GYPB基因杂交区域外的GYPB基因区域。上游内对照引物序列如SEQ ID NO3所示：GAACATATCCGATGTTATACA；游内对照引物序列如SEQ ID NO4所示：AGATGTGTCCAGCATCTGGCTA。上游内对照引物位于GYPA基因与GYPB基因杂交区域外的GYPA基因的第一外显因子上；下游内对照引物位于GYPA基因与GYPB基因杂交区域外的GYPB基因的第一外显因子上。基因GYP(B-A-B)Mur特异性扩增产物长度为988bp，内对照扩增产物长度为592bp。在本实施方式中，Mur上游引物、Mur下游引物、上游内对照引物、下游内对照引物的体积比为：2：2：1：1。也可以选用其他的体积比。扩增条件为：95℃变性5分钟，然后进行33个循环的PCR反应，即95℃下持续30秒，57℃下持续30秒和72℃下持续30秒，随后72℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃。

检测结果如图5和图6，由图5可知，由于不同引物对的扩增效率不同，故在Mur上游引物、Mur下游引物、上游内对照引物、下游内对照引物的体积比为：1:1:1:1的混合条件下，GYP(B-A-B)Mur基因的扩增产物比内对照的扩增产物少，不利于检测结果的判读，说明Mur上游引物、下游引物、上游内对照引物、下游内对照引物的体积比为：1:1:1:1的混合条件不是最佳混合比例。在上述体积比下均不会出现假阴性。

由图6可知，Mur上游引物、下游引物、上游内对照引物、下游内对照引物的体积比为：2：2：1：1，GYP(B-A-B)Mur基因的扩增产物清晰明确，内对照的扩增产物也能清晰显现，利于检测结果的判读，说明该混合条件下产物的量更为均衡，是最佳混合比例。

实施例3

本实施例中，检测了西安地区无偿献血人群中Mur基因的分布频率，检测方法为：

⑴在0.5mL的Ependoff管内加入2.0μl的10倍缓冲液、2.0μl的引物混合物、2.0μl浓度为2.5mM的dNTP混合物、0.1μl浓度为5U/μl Taq DNA聚合酶1.0μl浓度为25mM的MgCl₂溶液、1.0μl模板DNA和13.7μl双蒸水，充分混合；

⑵将Ependoff管放入PCR扩增仪中，95℃变性5分钟，然后进行33个循环的PCR反应，即95℃下持续30秒，57℃下持续30秒和72℃下持续30秒，，随后72℃延伸5分钟，然后将温度降低到4℃；

⑶取出PCR产物，4％琼脂糖凝胶电泳(200V，20分钟)，紫外灯下观察结果并拍照。

所述引物混合物包含Mur上游引物、Mur下游引物、上游内对照引物和下游内对照引物，Mur上游引物序列如SEQ ID NO1所示：ACCCTCCAGAAGAGGAAACCGG；Mur下游引物序列如SEQ ID NO2所示：ACAGTGAAACGATGGACAAGTTGTC。Mur上游引物位于GYPA基因与GYPB基因的杂交区域，Mur下游引物位于GYPA基因与GYPB基因杂交区域外的GYPB基因区域。上游内对照引物序列如SEQ ID NO3所示：GAACATATCCGATGTTATACA；游内对照引物序列如SEQ ID NO4所示：AGATGTGTCCAGCATCTGGCTA。上游内对照引物位于GYPA基因与GYPB基因杂交区域外的GYPA基因的第一外显因子上；下游内对照引物位于GYPA基因与GYPB基因杂交区域外的GYPB基因的第一外显因子上。Mur上游引物、Mur下游引物、上游内对照引物和下游内对照引物的体积比为：2：2：1：1。

检测结果如图7所示，图中显示的是48例样本的Mur基因检测结果，检出2例Mur基因阳性样本，这2例阳性样本在电泳图中显示有特异性的扩增条带(988bp)和内对照条带(592bp)；其它样本显示只有内对照条带(592bp)，说明PCR扩增反应成功，这些样本不具有Mur基因。在实际应用中，本方法稳定可靠，对于提取自不同个体的DNA均有良好的适应性，可以清晰明确地显示检测结果。

<110> 西安市中心血站

<120> 一种鉴定人类Mur血型基因的多重PCR方法

<130> 无

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> SEQ ID NO1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO1

ACCCTCCAGA AGAGGAAACC GG 22

<210> SEQ ID NO2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO2

ACAGTGAAAC GATGGACAAG TTGTC 25

<210> SEQ ID NO3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO3

GAACATATCC GATGTTATAC A 21

<210> SEQ ID NO4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> SEQ ID NO4

AGATGTGTCC AGCATCTGGC TA 22