一种重组马立克氏病病毒meq和vIL‑8双基因缺失株的构建及其应用的制作方法

本发明涉及一种重组马立克氏病病毒meq和vIL-8双基因缺失株的构建及其应用，属于动物病毒学领域。
背景技术：
：马立克氏病(Marek’sdisease,MD)，是由马立克氏病病毒(Marek’sdiseasevirus,MDV)引起鸡的一种最常见的淋巴细胞增生性疾病，以外周神经、虹膜、皮肤、肌肉和各内脏器官的淋巴样细胞浸润、增生和肿瘤形成为特征。本病早在1907年由匈牙利的兽医病理学家马立克首先发现，并在1961年命名为马立克氏病。现在世界各主要养鸡国家和地区均有流行，在我国也是经济意义上最重要的禽病之一，对我国养鸡生产造成严重威胁和巨大的经济损失。马立克氏病病毒基因组的Meq基因N末端含有一个碱基亮氨酸拉链(bZIP)结构域，该结构域与jun/fos致癌基因家族相似，C末端富含脯氨酸的重复区域与WT-1肿瘤抑制基因相似。Meq基因在淋巴瘤细胞和肿瘤细胞系中恒有表达，在MDV转化的淋巴细胞系MSB-1细胞中表达的Meq反义RNA可以减少软琼脂上细胞集落的形成，在转染的大鼠细胞中Meq过量表达导致细胞凋亡抑制，上述结果均显示Meq基因与致肿瘤的密切相关性。2008年美国利用传染性克隆技术成功的将马立克氏病病毒(MDV)超强毒株Md5中主要的致肿瘤基因meq基因敲除掉，获得的meq基因缺失株-rMd5Δmeq完全丧失致病性，而且能诱导比CVI988/Rispens更好的免疫保护效果，甚至能完全抵御MDV特超强毒648A的攻击。2010年，国内实验室利用同源重组技术敲除掉MDVGX0101的meq基因，构建的GX0101Δmeq证实完全丧失致瘤性，并且能诱导比商品化疫苗CVI988/Rispens更好的免疫保护效果。敲除Meq基因虽然能够使MDV强毒的致瘤性丧失，但Meq缺失株仍能引起轻微的免疫抑制。MDV编码一种病毒类白细胞介素8(vIL-8)，与哺乳动物白细胞介素8(IL-8)及其他IL-8同源类似物，均能引起细胞趋化、细胞迁移和炎症反应。致肿瘤毒株(RB1B、Md5)的vIL-8基因的缺失证实vIL-8并不影响MDV的转化和潜伏期，但是v-IL8基因缺失突变株能显著降低感染鸡的肿瘤率，并且不再引起鸡体胸腺法氏囊的萎缩，说明v-IL8基因与MDV导致鸡群的免疫抑制性密切相关。目前应用于MDV研究的同源重组技术主要是RedET同源重组技术(ZhangY,BuchholzF,MuyrersJP,StewartAF:AnewlogicforDNAengineeringusingrecombinationinEscherichiacoli.Naturegenetics1998,20(2):123-128.)。RedET重组系统不但具有很高的同源重组效率，而且一般仅需要长50bp的同源臂。通过PCR技术将需要修饰的MDV基因的同源臂直接加在打靶基因的两侧。将PCR产物电转进含有MDVBAC感染性克隆的细菌中，经同源重组酶介导同源重组，两端带有同源臂的目的基因片段就能直接插入到MDVBACDNA的同源区部位。利用RedET重组系统在MDVBAC的感染性克隆基础上可以对MDV任意基因任意长度的进行插入或者删除等修饰。目前已经有RedET重组系统的商品化试剂盒：Counter-SelectionBACModificationKit(德国GeneBridges公司)，可以对MDV基因组中的基因进行敲除，该技术在敲除的同时没有往MDV基因组中带来任何的多余序列。技术实现要素：本发明的目的是提供了一种重组血清Ⅰ型马立克氏病病毒(BZ-1株)，本研究基于MDV强毒株BJ07的BAC(Bacterialartificialchromosome，BAC)感染性克隆，利用RedET重组系统，构建的MDVBJ07株meq、vIL-8基因的缺失株(BZ-1株)不仅丧失对鸡的致病性和致肿瘤性，而且由于同时敲除了vIL-8基因，使其免疫抑制性也丧失，因而具有相对更高的安全性。本发明的技术方案1.一种重组马立克氏病(Marek’sdiseasevirus,MDV)病毒meq和vIL-8双基因缺失株的构建，其特征在于该株病毒是在强毒MDVBJ07株(CGMCCNo.13598)的基因组中同时缺失了马立克氏病病毒致病性相关vIL-8基因和meq基因，其vIL-8基因序列如SeqIDNo:1所示，Meq基因序列如SeqIDNo:2所示；该重组毒株为血清Ⅰ型，被命名马立克氏病病毒为BZ-1株，已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.13395；该BZ-1株对鸡无致瘤致病性，不引起鸡群免疫抑制。2.本发明所述的重组马立克氏病病毒meq和vIL-8双基因缺失株的应用，其特征在于该CGMCCNo.株重组病毒在禽类宿主中诱导抗鸡马立克氏病保护性免疫的应用。3.本发明所述的重组马立克氏病病毒meq和vIL-8双基因缺失株的应用，其特征在于该CGMCCNo.13395株血清Ⅰ型的重组病毒在作为马立克氏病疫苗生产毒株的应用。4.本发明所述的重组马立克氏病病毒meq和vIL-8双基因缺失株的应用，其特征在于该CGMCCNo.13395株血清Ⅰ型的重组病毒在作为载体构建病毒活载体疫苗中的应用。本发明具体实施方法1.病毒构建敲除掉meq、vIL-8基因，构建完全丧失致瘤性的MDV基因缺失病毒株，该重组毒株为血清Ⅰ型，被命名马立克氏病病毒为BZ-1株，已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.13395；该重组病毒的DNA序列模式图如附图1所示。注:Meq和vIL-8基因基因均为两个拷贝(分别位于MDV基因组的TRL和IRL区域)，两个拷贝在基因组中的序列反向互补，本发明中，BZ-1株Meq和vIL-8基因两个拷贝均进行了缺失见图2和图3。2.重组病毒MDVBZ-1株的验证：制备了特异的针对MDVmeq和vIL-8基因基因的小鼠多价血清，进行间接免疫荧光实验，证实BZ-1病毒的meq基因和vIL-8基因不表达，其meq基因和vIL8基因已经被完全敲除掉。PCR技术可以同样应用于meq、vIL-8基因的检测。3.重组病毒MDVBZ-1株的对SPF鸡的致病性BZ-1株以5000PFU剂量感染25只1日龄SPF鸡，感染13周后，无MD特异性死亡与病变，无肿瘤形成；其体重及中枢性免疫器官胸腺和法氏囊与体重的比都与空白对照鸡无显著差异，不会引起鸡群的免疫抑制。4.重组病毒MDVBZ-1株对SPF鸡的免疫效力重组病毒BZ-1株应用于SPF鸡的免疫实验中，具体步骤如下：100只1日龄SPF鸡，随机分成4组。第一组接种BZ-1株，免疫剂量为2000PFU/只。第二组接种CVI988/Rispens，免疫剂量为2000PFU/只。第三组为攻毒对照组，第四组为空白对照组。7日龄进行MDV超强毒Md5攻击，攻击后观察记录鸡只死亡，90天后剖杀进行肉眼病理观察并取脏器用10％甲醛固定以作组织病理学观察。结果表明，在用超强毒vvMd5攻击时，BZ-1株(保护指数为100)可以提供比CVI988/Rispens(保护指数为88)更好的保护。5.重组病毒MDVBZ-1株疫苗制备将BZ-1株重组病毒接种鸡胚成纤维细胞制备成种子病毒，转瓶接种密度为每1cm2面积接种1000PFU的重组病毒，在接种后约50小时，有70％以上单层细胞出现典型的细胞病变(CPE)时，倒去培养液，加入适量胰酶消化液，在室温下消化10min左右，细胞单层出现疏松拉网接近脱离瓶壁现象时，立即加入与消化液等量的含10％牛血清的营养液，停止消化。轻轻摇动转瓶，使细胞全部脱离瓶壁，离心收集的细胞用超声波裂解后加入适量SPGA稳定剂，摇匀后分装冻干。综上所述，本发明提供了一种重组鸡马立克氏病病毒(BZ-1株)，该毒株缺失了致病性相关基因(meq和vIL-8基因)，在MDV强毒感染时，作为疫苗可以比CVI988/Rispens株起到更好的免疫保护作用。附图说明图1为Meq和vIL-8基因在MDV基因组中的示意图图中显示了BZ-1株重组病毒的基因组序列模式图和Meq、vIL-8基因位置示意图；图2为vIL-8基因序列敲除示意图；图中删除线部分为vIL-8基因，余下部分为MDV基因组序列。图3为Meq基因序列敲除示意图；图中删除线部分为Meq基因，余下部分为MDV基因组序列。本发明涉及的生物材料资源信息本发明构建的重组马立克氏病病毒meq和vIL-8双基因缺失株，是该株病毒是在强毒MDVBJ07株的基因组中同时缺失了马立克氏病病毒致病性相关vIL-8基因和meq基因；该重组毒株被命名血清Ⅰ型马立克氏病病毒为BZ-1株，已于2017年01月11日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.13395；马立克氏病病毒(Marek’sdiseasevirus)BJ07株强毒，发明人2007年由北京市田间分离，病毒经纯化后进行了毒力鉴定，为MDV强毒株，已于2017年01月20日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.13598；马立克氏病病毒超强毒Md5株(ATCC，VR-987)购自美国菌种保藏中心(Americantypeculturecollection，ATCC)。本发明的积极意义本发明提供了一种重组血清Ⅰ型马立克氏病病毒(marek’sdiseasevirus,MDV)BZ-1株，其实际上是将分离的MDVBJ07株强毒的致病相关基因(meq和vIL-8基因)同时敲除，所构建的MDV基因缺失株(BZ-1株)没有致病性，不会诱发鸡的肿瘤，对鸡群也没有免疫抑制作用。将BZ-1株用作马立克氏病活疫苗的生产毒株所制备的疫苗，预防超强毒MDV诱发的鸡马立克氏病，其保护性免疫效果优越于目前国内外市场上应用最广泛的CVI988/Rispens株疫苗。实施例以下实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。实施例1——重组MDVBZ-1株的构建1.将标记基因rpsl-neo取代MDVBJ07株病毒中的meq基因根据参考文献(SchumacherD,TischerBK,FuchsW,OsterriederN:ReconstitutionofMarek'sdiseasevirusserotype1(MDV-1)fromDNAclonedasabacterialartificialchromosomeandcharacterizationofaglycoproteinB-negativeMDV-1mutant.Journalofvirology2000,74(23):11088-11098.)，构建MDVBJ07株(CGMCCNo.13598)强毒的BAC感染性克隆毒rBJ07。根据表1中序列所示，合成一对引物MDV-rpsl-neo-F/R(序列3和序列4)。引物中大写字母分别表示位于rBJ07中meq基因的上游和下游的MDV基因组的50bp序列，小写字母为标记基因Counter-SelectionBACModificationKit试剂盒的rpsL-neo的5′端和3′端序列。以rpsL-neotemplateDNA为模板进行PCR反应，由此扩增出长1419bp的PCR目的片段，含有完整的能表达的标记基因rpsl-neo及其两测的用于进行重组的MDV的同源臂序列。将含有四环素抗性基因的pRed/ET质粒(Guzmanetal.,1995)在1350V，10μF，600Ω电转化条件下，电转化进含有rBJ07的DH10B大肠杆菌。经氯霉素(Cmr,30μg/mL)和四环素(Tet,5μg/mL)双抗性的LB平板筛选。挑取单个菌落，接种到含有同样二种抗菌素的5mLLB培养液中，30℃振荡培养,待OD600达到0.3左右时，加入10％L-阿拉伯糖200uL(至终浓度约为0.4％)，37℃振荡培养60min(诱导pRed/ET表达Redα/Redβ/Redγ/RecA重组蛋白)。在相同电转化条件下，将上述含有同源臂的标记基因rpsL-neoPCR产物电转化进含有pRed/ET质粒和rBJ07的DH10B大肠杆菌中，37℃诱导重组，经氯霉素(Cmr,30μg/mL)、四环素(Tet,5μg/mL)和卡那霉素(Kan,15μg/mL)3种抗性的LB平板，由此筛选出对卡那霉素有抗性的标记基因rpsL-neo替代rBJ07基因组中meq的细菌克隆rBJ07-rpsL-neo。表1用于构建重组MDV的BZ-1的引物表2.筛选不具有链霉素抗性的rBJ07-rpsL-neo细菌克隆大肠杆菌DH10B携带突变型的rpsl基因，能够编码抵抗链霉素的(S12ribosomalprotein)蛋白，具有链霉素抗性。相对野生型的rpsl基因，突变型rpsl基因为隐性基因，因此当将表达显性的野生型rpsl基因的质粒转化进DH10B后，就不再具有链霉素抗性。含卡那霉素的LB板培养和筛选到的重组菌rBJ07-rpsL-neo虽然能够保证rpsl-neo基因的存在，但是由于经PCR扩增的标记基因rpsL-neo会有碱基突变，使得野生型rpsl基因不再发挥对链霉素敏感的功能，对进行下一步重组菌筛选造成干扰。为此，我们必须要筛选到不具有链霉素抗性的rBJ07-rpsL-neo细菌克隆。取少量rBJ07-rpsL-neo菌液划线接种于含有氯霉素(Cmr,30μg/mL)、卡那霉素(Kan,15μg/mL)和链霉素(Str,50μg/mL)抗性的平板上，30℃温箱中培养24h左右，选择不生长的rBJ07-rpsL-neo细菌克隆进行下一步重组。最后再用表中的检测引物MDV-F/R(序列7和序列8)进行PCR验证。3.将缺失meq基因的MDV片段替代重组克隆rBJ07-rpsL-neo中的标记基因rpsl-neo人工合成meq基因上下游各200bp的片段(南京金斯瑞生物科技有限公司)，相比MDV基因组，片段仅缺失meq基因，序列如序列9：将筛选的不具有链霉素抗性的rBJ07-rpsL-neo菌落，接种到含有氯霉素(Cm,30μg/mL)、四环素(Tet,5μg/mL)和卡那霉素(Kan,15μg/mL)3种抗性的5mLLB培养液中，30℃振荡培养,待OD600达到0.3左右时，加入10％L-阿拉伯糖200uL(至终浓度约为0.4％)，37℃振荡培养60min(诱导pRed/ET表达Redα/Redβ/Redγ/RecA重组蛋白)。在相同电转化条件下，将上述融合片段的PCR产物电转化进含有pRed/ET质粒和rBJ07-rpsL-neo质粒的DH10B大肠杆菌中，37℃诱导重组，再接种于含氯霉素(Cmr,30μg/mL)、四环素(Tet,5μg/mL)和链霉素(Str,50μg/mL)三种抗菌素的LB平板，选择阳性菌落。当目的基因取代标记基因rpsL-neo后，由于失去了野生型rpsl基因，相应的DH10B宿主菌又恢复链霉素抗性。由此得到了新的重组rBJ07Δ1meq及其相应的转化菌。再进一步用表中的检测引物MDV-F/R(序列7和序列8)进行PCR验证。4.按照上述相同的方法再次敲除另外一个meq基因，构建meq基因缺失株rBJ07Δmeq。5.构建缺失meq、vIL-8基因的BZ-1株MDV利用上述相同步骤继续敲除rBJ07Δmeq的vIL-8基因，构建meq与vIL-8双基因缺失株rBJ07ΔmeqΔvIL-8，在构建过程中使用了两组引物，其序列为序列5和序列6及序列10和序列11。人工合成vIL-8基因上下游各200bp的片段(南京金斯瑞生物科技有限公司)，相比MDV基因组，片段仅缺失vIL-8基因，序列如下序列12：6.参考Zhao等方法敲除rBJ07ΔmeqΔvIL-8的BAC序列(ZhaoY,PetherbridgeL,SmithLP,BaigentS,NairV.2008.Self-excisionoftheBACsequencesfromtherecombinantMarek'sdiseasevirusgenomeincreasesreplicationandpathogenicity.Virologyjournal5:19)。方法简述如下：通过电转化仪将rBJ07ΔmeqΔvIL-8质粒和线性化的含有同源臂的SV40-cre表达盒片段转化进EL250，RedET同源重组后，经含有卡纳霉素(50μg/ml)和氯霉素(30μg/ml)的LB平板32℃培养24-36小时，筛选具有两种抗性的单克隆菌落，最终通过US2基因和US7的引物(序列13和序列14)鉴定阳性的单克隆菌落。阳性菌落能够扩增出3.5kb的PCR产物，而没有重组的rBJ07ΔmeqΔvIL-8株MDV由于缺失US2基因，所以不能扩增出任何片段。鉴定重组进SV40-cre表达盒的阳性菌株经大量培养，提取纯化后的质粒，按照转染试剂Lipfectamine2000的说明转染CEF细胞，方法如下：转染前一天，胰酶消化细胞并计数，细胞铺板，使其在转染日密度为90％～95％。细胞铺板在2ml含血清，不含抗生素的正常生长的培养基中。对于每孔细胞，使用250μl无血清培养基稀释4.0μgDNA，轻轻混匀。使用前将Lipofectamine2000转染试剂轻轻混匀，用250ul无血清培养基稀释10ulLipofectamine2000转染试剂，轻轻混匀。Lipofectamine2000稀释后，在5分钟内同稀释的DNA混合(<30min)。室温放置20min。将6孔板中的旧营养液吸出，用无血清培养基清洗两次。加入2ml无血清配养基。直接将复合物加入到每孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％CO2中保温12小时，12小时后更换成含有血清的培养基。待出现MDV特异的蚀斑后，经过单个蚀斑进行纯化，经PCR验证BAC序列已经完全被敲除掉的病毒，命名为MDVBZ-1株。Us2-F:5'-GGAATACATTCGAGCGCAA-3′18(序列13)Us7-R:5'-CTATAGACCAGATGCCTCGAA-3′21(序列14)实施例2——重组病毒MDVBZ-1株的验证以100PFU/孔的剂量将BZ-1接种于长成单层CEF的6孔细胞培养板上。同时设立BJ07病毒对照，培养3-5d，待出现MDV特异的噬斑后，将细胞培养液倒掉，用冷丙酮:乙醇(3:2)固定液室温固定8min，用PBS缓冲液洗1次，加500ul(工作浓度)抗体(抗meq基因血清)作为一抗，放37℃恒温箱反应45min后，用PBS洗3次，室温干燥后，加上500ul(工作浓度)FITC标记的荧光抗体作为二抗，37℃恒温箱反应45min，用PBS洗3次，将水分甩干，加入50％甘油(甘油：PBS＝1:1)覆盖，防止水分挥发，在倒置荧光显微镜下观察。结果显示在荧光显微镜下，BJ07株噬斑发出特异的亮绿色荧光，证实meq基因能够在BJ07感染的CEF细胞中表达；而BZ-1噬斑没有显示荧光，说明meq基因已经敲除。同样方法鉴定vIL-8基因。实施例3——BZ-1株病毒对鸡的致病性BZ-1以5000PFU剂量感染25只1日龄SPF鸡，感染13周后，无MD特异性死亡与病变，无肿瘤形成；其体重及中枢性免疫器官胸腺和法氏囊与体重的比都与空白对照鸡无显著差异，不会引起鸡群的免疫抑制。实施例4——BZ-1病毒对鸡的免疫保护效力SPF雏鸡100只，共分为四组，每组25只，第1组1日龄颈背皮下接种2000PFU的BZ-1，第2组1日龄颈背皮下接种2000PFU的CVI988疫苗，第3组为攻毒对照组，第4组为空白对照组。7日龄时，1、2、3组鸡只经腹腔分别接种1000PFU病毒量的鸡马立克氏病超强毒vvMd5株，四组鸡在70日龄时全部剖杀，攻毒前死亡的鸡只判定为非特异性死亡，不计入试验鸡数。对攻毒后死亡及试验结束存活的鸡只计数并逐一剖检，详细记录各试验组MD病变阳性鸡只数，对MD病变可疑鸡只采取病料进行病理学检查。MD阳性鸡是指由MD导致死亡鸡、具有眼观MD肿瘤病变鸡只以及眼观MD肿瘤病变可疑而组织病理学检验为MD病理变化的鸡只。试验疫苗的免疫效力用保护指数(PI)表示，其中：统计结果见表2。第2组(CVI988免疫组)出现12％的MD特异性病变，包括前期的MD特异性死亡；第3组(攻读对照组)出现100％的MD特异性病变；而BZ-1免疫组和空白对照组均没有出现MD特异性病变和死亡。表2BZ-1对SPF鸡的免疫保护效果组别攻毒毒株MD阳性率％PIBZ-1疫苗免疫组Md50/25(0)100CVI988/Rispens疫苗免疫组Md53/25(12)88攻毒对照组-Md525/25(100)-空白对照组--0/40(0)-实施例5——疫苗制备本疫苗接种鸡胚成纤维细胞，按每转瓶(生长面积680cm2)接种4×108个细胞分装细胞培养转瓶，转瓶旋转速度为9～11r/h，37℃培养18～20小时，每转瓶接种105～106PFU疫苗毒，继续培养50小时，病变细胞占细胞单层面积的70％后收获，加入保护液液氮冷冻保存。序列表<110>北京邦卓生物科技有限公司<120>一种重组马立克氏病病毒meq和vIL-8双基因缺失株的构建及其应用<130><160>10<170>Patentinversion3.5<210>1<211>662<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：vIL-8基因序列<400>1ATGCAGGCGTCGTTGCTAGTATTGGTTCTATTCATAGTACAGATCTATTTGTTGCCTGGA060AATGGTAAGTAGGGGAAGAGAACTCTAGACTGGAGGTTGTGGAATACGCTATACTGATGT120AACCAGTACTCGTAAAAGCTGAGGGGTTTCGTCTCTGGCATGTGCAGCAATGGTGGTATA180AGGAAAGGTAGCACGGGGGATGGTGTTGTTCTGATAAATGCATGCTCCTAATAATGTAGG240CATATCACTGGAGAGTCTCGCTGTCGGCAAGAGGTGCAAGTGCGTGAAAGTCACTAATCG300GCCTACTGGCTTGGGGCCTATTATCGCTGTTGACGTGATACCACCGGGTATACACTGCAG360GAGGACTGAAATTATGTAAGTAAGCTCTATTACTTGGCCAAAATATGGGGTTGTCATCTT420AGGTGTAGTGTCTGGCTGTAAAGCTAATTTGGTTAAGGTTTTCCCTTTTGTAGCTTTGCT480CTCAAGAAGAACAGGAAGGTATGTGTGGACCCTGAGGCGCCTTGGGTACAGCAGTTTATT540AAAAAACTAGAACGACAGCATCGCACAAGGAAGGAAAATCTGATGGTTGGAGAAGATGGT600GGCAAATCGACCGTGGGACCGGTAAAAAACACAATTGAGCCCACACCTCCTACTATTGGT660TC662<210>2<211>1020<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：Meq基因序列<400>2ATGTCTCAGGAGCCAGAGCCGGGCGCTATGCCCTACAGTCCCGCTGACGATCCGTCCCCC060CTCGATCTTTCTCTCGGGTCGACTTCGAGACGGAAAAAAAGGAAAAGTCACGACATCCCC120AACAGCCCCTCCAAACACCCCTTCCCTGACGGCCTATCTGAGGAGGAGAAACAGAAGCTG180GAAAGGAGGAGAAAAAGGAATCGTGACGCCGCTCGGAGAAGACGCAGGGAGCAGACGTAC240TATGTAGACAAACTCCATGAAGCATGTGAAGAGCTGCAGAGGGCCAATGAACACCTACGT300AAGGAAATTCGAGATCTAAGGACTGAGTGCACGTCCCTGCGTGCACAGTTGGCTTGTCAT360GAGCCAGTTTGCCCTATGGCGGTACCCCTAACGGTGACCCTTGGACTGCTTACCGCCCCG420CACGATCCCGTTCCTGAACCTCCCATTTGCACTCCTCCACCTCCCTCACCGGATGAACCT480AACGCTCCACATTGCTCCGGTTCCCAACCTCCTATCTGTACCCCCCGTCCTCCCGATACG540GAGGAACTTTGCGCCCAGCTCTGCTCGACCCCACCACCTCCCATCTCTACTCCCCATATT600ATCTACGCTCCGGGGCCTTCCCCCCTCCAACCTCCTATCTGTACCCCCGCTCCTCCCGAT660GCGGAGGAGCTTTGCGCCCAGCTCTGCTCGACCCCACCACCTCCCATCTGTACTCCCCAT720TCCCTCTTCTGCCCTCCCCAGCCTCCATCTCCGGAGGGCATCTTCCCTGCATTGTGTCCT780GTTACCGAGCCGTGTACCCCTCCATCGCCGGGGACGGTTTACGCTCAGCTTTGTCCTGTT840GGCCAGGCTCCCCTTTTTACCCCATCTCCCCCACATCCGGCTCCGGAGCCGGAGAGGCTT900TATGCTCGTCTTACCGAGGATCCCGAACAGGATTCCTTGTATTCGGGCCAGATTTATATT960CAGTTTCCCTCGGATACTCAGTCTACGGTCTGGTGGTTTCCAGGTGACGGGAGACCCTGA1020<210>3<211>74<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：上游引物MDV-rpsL-neo-F<400>3AGAAACATGGGGCATAGACGATGTGCTGCTGAGAGTCACAATGCGGATCAggcctggtga60tgatggcgggatcg74<210>4<211>74<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：下游引物MDV-rpsL-neo-R<400>4CTTGCAGGTGTATACCAGGGAGAAGGCGGGCACGGTACAGGTGTAAAGAGtcagaagaac60tcgtcaagaaggcg74<210>5<211>74<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：上游引物MDV-vIL-8-F<400>5GATATATAATGCAGGGGGTGTGGGTTTGATGAGCAGTTGGGGCGGCAAAAggcctggtga60tgatggcgggatcg74<210>6<211>75<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：下游引物MDV-vIL-8-R<400>6GTGCCTTCTTTTAATTACAGGAGGTAGCAATTAATCAAAGACAGATATGGTtcagaagaa60ctcgtcaagaaggcg75<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：上游引物MDV-F<400>7TTCGGGTCTGTGGGTGTTGCTT22<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：下游引物MDV-R<400>8CATGGGGCATAGACGATGTGCT22<210>9<211>200<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：人工合成meq基因上下游各200bp的片段。<400>9Gctggaatgttaagaataaattccgcacactgattcctaggcaggcgtctcttgcaggtg060Tataccagggagaaggcgggcacggtacaggtgtaaagagtgatccgcattgtgactctc120Agcagcacatcgtctatgccccatgtttcttctcccctagttatatataatagttttcat180Agtttcgggaagatcaacat200<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：上游引物vIL-F<400>10TCACGGTCGTGGAATTTTAAGTTG24<210>11<211>24<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：下游引物vIL-R<400>11GTGCCTTCTTTTAATTACAGGAGG24<210>12<211>200<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：人工合成vIL-8基因上下游各200bp的片段<400>12agacccaataacagggaaatcgcccgaggcattacgggtacggttccatggatatataat060gcagggggtgtgggtttgatgagcagttggggcggcaaaaccatatctgtctttgattaa120ttgctacctcctgtaattaaaagaaggcacttttttttccgattttgactcctcgtacat180atatcgataatgtagctatt200<210>13<211>19<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：上游引物Us2-F<400>13GGAATACATTCGAGCGCAA19<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>对人工序列的描述：下游引物Us7-R<400>14CTATAGACCAGATGCCTCGAA213当前第1页1 2 3