一种真菌多糖类抗性诱导剂及其应用的制作方法

技术领域：

本发明属于真菌多糖类抗性诱导剂领域，涉及一种真菌多糖类抗性诱导剂及其应用，特别涉及一种马勃多糖的获得，以及其对烟草幼苗生长的影响及对烟草花叶病毒的抑制作用。

背景技术：
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真菌多糖是一类天然高分子化合物，它由醛糖或酮糖通过糖苷键连接在一起的多聚物构成，是生命的四大基本物质之一，广泛存在于真菌特别是大型真菌的细胞壁中，因其具有抗肿瘤、抗病毒和免疫调节等作用而被医药界广泛关注。真菌多糖有螺旋状的三维立体结构，其构型近似于dna，是一种β型的多糖。常见的有几丁聚糖、氨基寡糖素、菇类蛋白多糖等，

烟草病毒病是烟叶生产中最重要的病害之一，被称为植物“癌症”，由于迄今为止尚无有效的防治措施，其造成的经济损失已大大超过了烟草真菌病害和细菌病害，成为威胁烟草生产的最大的一类灾害。

植物抗病诱导剂因其环境友好性、系统性、广谱性等优点已经被广泛研究和应用，潜力巨大。国内外已报道有大量的抗病诱导剂研制并成功应用。许多研究表明，许多大型真菌多糖不仅具有抑杀真菌和病毒的作用，而且能够调节作物生长，诱导植物产生抗性。作为天然化合物，真菌多糖还具有无毒、易被降解、对环境无污染等特性，使其有可能作为一种新型植物抗病诱导剂在农业生产中发挥作用。

而马勃是常用的药用真菌，其药用成分包括马勃多糖、甾体类化合物等，在抗肿瘤、抗炎、止血和抑菌等方面有广泛的应用价值，但在诱导植物抗病性和促生等方面尚未见相关研究和报道。

技术实现要素：

针对现有技术存在的诸多不足之处，本发明首先提供了一种大型真菌，命名为马勃(calvatiasp.)dbm，并于2016年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.12505；利用该真菌获得的马勃(calvatiasp.)dbm多糖处理烟草幼苗后，烟草幼苗的鲜重、最大叶面积、叶绿素含量及净光合速率等与对照相比均明显提高。dbm多糖处理烟草叶片后，对烟草花叶病毒有较好的抑制效果。

本发明是通过如下技术方案实现的：

本发明首先提供了一种大型真菌马勃，马勃样品由发明人于2015年8月采自山东泰山，并分离获得菌种，菌种现保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

获得上述真菌后，发明人对其进行了生物保藏，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.12505；

在上述真菌的基础上，发明人进一步给出了利用其制备马勃多糖的方法如下：

用5mm打孔器从dbm菌落边缘打取直径5mm的菌落圆片，挑取一片接种于pda培养基中央，放置于28℃恒温箱中培养7d后，采用相同的方法在菌落边缘打取直径5mm的菌落圆片4-5片转接于装有100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28℃，220rpm培养7d，5000rpm离心10min收集菌丝体，无菌水充分洗涤；

其中所述的dbm菌落为保藏编号为cgmccno.12505的马勃真菌菌落；

所述发酵培养基组成按重量百分比计为：

冷榨豆饼粉，1％；酵母粉，0.2％；蔗糖，3％；硫酸镁，0.05％；磷酸二氢钾，0.1％；维生素b1，0.01％，余量为无菌去离子水；

菌丝体于65℃烘箱烘至恒重，干菌丝在研钵中研细，过80目筛子制成干粉；菌丝体干粉加40倍体积水80℃水浴浸提2h，重复两次，合并两次提取液，浓缩至原体积的1/15，向浓缩液中缓慢加入3倍体积的95％乙醇，4℃静置过夜后8000rpm离心10min留取沉淀，沉淀分别以95％乙醇洗涤一次、丙酮洗涤两次，真空干燥得到多糖粗提物。

对粗提物的理化性质进行初步鉴定发现，该粗提物为白色粉末，溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚和正丁醇。粗提物溶于水后为透明溶液，在较高浓度时呈粘稠状。molish反应中，在粗提物溶液和浓硫酸的液面交界处形成紫环，表明粗提物中含有多糖成分。粗提物溶液与fehling试剂反应均显阴性，没有砖红色沉淀产生，表明不含有还原性糖。

通过用苯酚-硫酸法测定得知上述获得的dbm多糖粗提物中的总糖含量为84.9％。

发明人进一步对上述获得的多糖粗提物进行了功能研究，结果如下：

将上述多糖粗提物溶解后可获得不同浓度的多糖溶液，选择1000mg/l和2000mg/l两个浓度的多糖溶液喷雾处理烟苗，结果发现：

处理后的烟苗地上部鲜重、地下部鲜重和最大叶面积与对照相比均有显著提高，分别比对照增加53.6％、233.3％和36.6％，总叶绿素含量和光合速率分别比对照增加37.5％和97.1％，表明多糖处理明显促进烟苗的生长。

同时发明人利用半叶枯法测定了上述多糖粗提物对tmv的钝化、治疗和预防作用，结果发现，经多糖处理后，烟苗对tmv预防效果最好，经1000mg/l和2000mg/l两种浓度处理后枯斑数分别比对照减少8.2个和12.8个，预防效果分别为60％和74％；多糖对tmv的钝化效果次之，两种浓度处理后的钝化效果分别为18.2％和17.7％；烟苗对tmv的治疗效果：两种浓度处理后其治疗效果均低于40％，与其他两种处理方式相比，相对较差但依然有一定的效果。差异显著性分析表明，两种多糖浓度处理后，对tmv的抑制效果差异不显著。

综上所述，本发明提供了一种新的马勃真菌，并对其进行了生物保藏，而利用该真菌获得的马勃(calvatiasp.)dbm多糖处理烟草幼苗后，烟草幼苗的鲜重、最大叶面积、叶绿素含量及净光合速率等与对照相比均明显提高。dbm多糖处理烟草叶片后，对烟草花叶病毒有较好的抑制效果。

发明人对本发明所公开的大型真菌，命名为马勃calvatiasp.，并对其进行了生物保藏，具体保藏信息如下：

保藏信息

保藏时间：2016年5月27日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心cgmcc

保藏编号：cgmccno.12505

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所

分类命名:马勃calvatiasp.

附图说明

图1为实施例1中三种不同培养基对dbm菌丝生长的影响示意图；

从图中可以看出3种液体培养基中以c配比效果最好；

图2为实施例3中葡萄糖浓度标准曲线；

从图中可以看出该标准曲线线性良好，可以用于计算粗提物的总糖含量；

图3为dbm多糖对烟草幼苗生长的影响结果灰度示意图；

从图中可以看出经两种浓度的多糖处理后，烟苗叶色浓绿，根系较发达，说明多糖溶液对烟草幼苗的生长具有较好的促进效果；

图4为dbm多糖处理对tmv的钝化效果灰度示意图；

图5为dbm多糖处理对tmv的预防效果灰度示意图；

图6为dbm多糖处理对tmv的治疗效果灰度示意图；

由图4、图5及图6可见，经两种浓度的多糖溶液处理后，枯斑数明显比对照减少，表明多糖处理增强了烟草对tmv的抗性。

具体实施方式

实施例1培养基的筛选

dbm母种接种于pda固体培养基上，放置于28℃恒温箱中培养，培养6～7d后挑取一环于液体培养基中，28℃，220rpm培养，7d后将培养液5000rpm离心10min，回收菌丝体并洗涤。菌丝体于65℃烘箱烘至恒重，称重后比较差异。

三种不同液体培养基配方:

培养基a：冷榨豆饼粉，1％；蛋白胨，0.2％；葡萄糖，3％；硫酸镁，0.05％；磷酸二氢钾，0.1％；维生素b1，0.01％；

培养基b：葡萄糖，2％；磷酸二氢钾，0.3％；硫酸镁，0.15％；维生素b1，0.1％，马铃薯汁，20％；

培养基c：冷榨豆饼粉，1％；酵母粉，0.2％；蔗糖，3％；硫酸镁，0.05％；磷酸二氢钾，0.1％；维生素b1，0.01％。

按重量百分比分别称取上述试剂，加入对应量的去离子水搅拌均匀，每250ml三角瓶分装100ml后于121℃灭菌25min，制成液体培养基。

上述各原材料均从市场上直接购得；

结果如图1所示，可见3种液体培养基中以c配比效果最好，培养7d，dbm菌丝体干重为4.0g，比a培养基中的菌丝体干重增加108％，比b培养基中的菌丝体干重增加85.7％。

实施例2：dbm多糖的提取

用5mm打孔器从dbm菌落边缘打取直径5mm的菌落圆片，挑取一片接种于pda培养基中央，放置于28℃恒温箱中培养7d后，采用相同的方法在菌落边缘打取直径5mm的菌落圆片4-5片转接于装有100ml发酵培养基的250ml三角瓶中，28℃，220rpm培养7d，5000rpm离心10min收集菌丝体，无菌水充分洗涤；

菌丝体于65℃烘箱烘至恒重，干菌丝在研钵中研细，过80目筛子制成干粉；菌丝体干粉加40倍体积水80℃水浴浸提2h，重复两次，合并两次提取液，浓缩至原体积的1/15，向浓缩液中缓慢加入3倍体积的95％乙醇，4℃静置过夜后8000rpm离心10min留取沉淀，沉淀分别以95％乙醇洗涤一次、丙酮洗涤两次，真空干燥得到多糖粗提物粉末。

实施例3：多糖含量测定

(一)葡萄糖标准曲线的建立

准确称取葡萄糖100mg，用无菌水制成1mg/ml的标准液，备用。分别吸取葡萄糖标准液采用倍比稀释法配置成0.02，0.04，0.06，0.08，0.1，0.12，0.14mg/ml的葡萄糖溶液。取上述溶液各0.4ml，加入5％重蒸苯酚0.8ml，混匀，迅速加入4ml浓硫酸，沸水浴加热15min后，冷却至室温，于490nm处测定吸光度。以水代替葡萄糖液为空白对照。根据糖浓度及吸光度值绘制回归方程。

dbm多糖含量的测定

精密称取实施例2中获得的多糖粉末50mg，置于100ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按照上述方法，测定吸光度，平行测定3次，得到3个样品的多糖含量，计算平均值。

以糖浓度为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y)，做出葡萄糖标准曲线(图2)，可见该曲线基本为一条直线，经计算得回归方程为y＝3.7821x+0.0116，其中r²＝0.9904，由此可知，葡萄糖在0.02-0.14mg范围内，标准曲线线性良好，利用该方程计算出实施例2中获得的dbm多糖粗品中的多糖含量为84.9％。

实施例4：多糖处理多糖对烟苗生长及光合作用的影响

(一)多糖对烟苗生长及光合作用的影响

将dbm多糖粗品分别配制成浓度为1000mg/l和2000mg/l的多糖溶液(对应图中dbm1000和dbm2000)，选择长势一致的4-5叶期的烟草幼苗将上述多糖溶液均匀喷施于烟叶表面，连续处理3次，每次间隔7d，于最后一次处理7天后，检测叶片总叶绿素含量、叶片光合效率、最大叶面积、鲜重等，每处理10株烟苗。以清水同样处理为对照。

图3是经多糖处理后7d，烟苗的生长状况。可见，经两种浓度的多糖处理后，烟苗叶色浓绿，根系较发达。对烟草叶片最大叶面积、鲜重、总叶绿素含量等进行测定，发现，经浓度1000mg/l多糖处理后，烟苗最大叶面积平均为112.9cm²，2000mg/l多糖处理后的叶面积为110.5cm²，分别比对照增加36.6％和33.7％；地上部和根部鲜重经两个浓度处理后都比对照明显增加，分别增加53.6％、37.5％和233.3％、233.3％；与对照相比，烟草总叶绿素含量经多糖处理后也明显高于对照，分别增加37.5％和21.6％(如表1)。差异显著性分析表明，两种浓度处理在最大叶面积、鲜重、总叶绿素含量等方面与对照相比均达到极显著水平，但两个处理浓度间差异不显著。

表1多糖处理对烟草幼苗的促生作用

于处理后7天，利用ciras-3便携式植物光合作用测定仪对不同处理烟苗的光合速率、蒸腾速率、气孔导度及胞间co2浓度进行测定，结果如表2。由表2可见，经浓度1000mg/l多糖处理后，烟苗光合速率为6.7umol·m^-2·s^-1，2000mg/l多糖处理后的光合速率为5.1umol·m^-2·s^-1，分别比对照增加97.1％和50％；蒸腾速率及气孔导度经两个浓度处理后都比对照明显增加，分别增加108.3％、83.3％和189.7％、105.5％；与对照相比，细胞间co2浓度经多糖处理后明显低于对照，分别减少18.7％和19.6％，可见经dbm多糖处理后，叶片光合速率和蒸腾速率大大提升。经差异显著性分析，发现两种处理与对照相比，差异均达到极显著水平。

表2多糖处理对烟草光合作用的影响

注：pn为光合速率；e为蒸腾速率；gs为气孔导度；ci为胞间co2浓度。+表示增加；-表示减少。

实施例5：dbm多糖对tmv的抑制活性测定

三生烟烟苗温室内培养到5-6叶期，采用半叶法从3个方面分析多糖对烟草花叶病毒病的抗病效果。

多糖对tmv的预防作用：选取长势一致的烟苗，按实施例4中的浓度配置多糖溶液，分别喷施到待测叶片的右半叶，左半叶喷清水为对照，间隔7d再喷一次，于第二次喷雾后2d，采用摩擦接种法将20μl病毒汁液均匀涂抹到整个叶片，每株处理3片叶，每处理重复3次。

多糖对tmv的治疗作用：采用上述类似方法进行处理，所不同的是，在烟苗接种tmv后1d，再喷多糖溶液，以左半叶喷清水为对照。每株处理3片叶，每处理重复3次。

多糖对tmv的钝化作用：首先取上述配制好的多糖溶液与病毒汁液按1:1的体积比例混匀，室温下静置30min，将钝化处理的病毒汁液摩擦接种到三生烟右半叶，左半叶接种用清水处理的病毒汁液为对照。每株处理3片叶，每处理重复3次。

经上述处理过的烟苗，于25℃光12h/暗12h培养箱中培养2-3d，统计各处理的枯斑数，计算抑制效果。计算公式如下：

结果如表3，可见经多糖处理后，烟苗对tmv预防效果最好(图5)，1000mg/l和2000mg/l两种浓度处理后枯斑数分别比对照减少8.2个和12.8个，预防效果分别为60％和74％。多糖对tmv的钝化效果次之(图4)，两种浓度处理后的钝化效果分别为18.2％和17.7％。3种处理中，烟苗对tmv的治疗效果(图6)较差，两种浓度处理后其治疗效果均低于40％。差异显著性分析表明，两种多糖浓度处理后，对tmv的抑制效果差异不显著。

表3多糖处理对tmv的抑制效果

综上所述，dbm多糖处理对烟草幼苗的生长有明显的促进作用；dbm多糖处理可明显提高烟苗的光合作用，因此dbm多糖可以作为生长促进剂使用；dbm多糖处理对烟草花叶病毒有较好的钝化、预防和治疗效果；因此这类多糖不仅能够调节作物生长，而且可以诱导植物产生抗性，使其可以作为一种新型植物抗病诱导剂在农业生产中发挥重要的作用。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。