一株具有强抗氧化性的草酸青霉菌SY‑15及其应用的制作方法

本发明涉及一株具有强抗氧化性的草酸青霉菌及其应用，主要应用于抗氧化剂的研究。

背景技术：

抗氧化(anti-oxidant)是对抗氧化自由基的简称，而且自由基学说也很好地解释了抗氧化作用，自由基学说指出自由基是具有高度的化学的活性，如果生物体内自由基过多，就会导致组织器官和细胞的损伤，从而诱发各种疾病、加速机体衰老，最终会导致疾病的发生。

抗氧化剂可以阻止人体自由基从细胞或者其他组织夺取氧原子，可以防止自由基对正常的细胞组织的破坏，它具有抑制炎症的发生、促进生长、抗衰老、减少癌症和心血管疾病等风险的作用。有研究证明，人体的抗氧化系统是一个可以与免疫系统相比的、具有完善和复杂功能的系统，机体的抗氧化的能力越强，就会越健康，生命也就会越长。而且抗氧化剂还可以应用于很多领域，比如食品保鲜，化妆品行业等，特别是生物抗氧化剂副作用少，污染小。

多酚类物质的生物学活性具有广谱性。近年来的研究表明，多酚类物质具有很明显的调节糖脂代谢、抗菌、抗氧化、抗癌、抗病毒、治疗口腔溃疡与牙周疾病、抑制心血管疾病等活性，这一切的根源可能是因为它是一类良好的天然的抗氧化剂。多酚类化合物中含有的酚性羟基是良好的中子或氢的给与体，这对生物组织膜由于发生氧化作用而生成的会引起结构、功能损伤的羟自由基(·oh)、过氧自由基(·ooh)等自由基具有良好的清除作用，因此能够阻止人体自由基从细胞或者其他组织中夺取氧原子，同时也防止自由基对正常细胞、组织造成伤害，从而抑制了炎症的发生、促进生长发育、延缓衰老、减少心血管疾病的发生和降低癌症的风险。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15菌株，该草酸青霉菌具有很强的抗氧化作用，而且其发酵液酚酸含量也比较高，可用于制备抗氧化剂，为开发新的抗氧化剂提供了新选择。

所述草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15是从疏花水柏枝(myricarialaxiflora)的叶中获得的内生真菌，于2017年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为，cctccm：2017025。保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

本发明草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15在马铃薯葡萄糖培养基上具有以下微生物学特性：刚开始有白色菌丝，逐渐的白色菌丝产绿色孢子，最后基本都是绿色的孢子，看不到菌丝，孢子表面较干燥。

本发明目的是提供一种用于抗氧化剂的研究，其活性成分为草酸青霉菌sy-15。抗氧化试验表明，dpph自由基清除率为86.48％，总抗氧化为11.64单位/ml，发酵液中多酚类物质的含量为10.75mg/ml。因而，本发明还包括含有所述菌株或者其发酵液的生物农药，以及含有所述菌株的微生物菌剂。

本发明以草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15菌株为模板，使用通用上游引物its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和通用下游引物its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′进行pcr扩增获得750bp的18srdna部分序列。通过blast与genbank收录的序列进行比对，发现sy-15与草酸青霉菌的同源性为99％。用mega4.1进化树(图4)，鉴定菌株(sy-15)与一株草酸青霉菌(penicilliumoxalicumkf768466)的同源性达99％。

附图说明

图1为本发明的草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15的菌落形态，左图为正面、右图为背面。

图2为本发明的草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15的显微形态。

图3为本发明中不同浓度h2o2下大肠杆菌细胞的存活率。

图4为四种提取物对大肠杆菌的氧化损伤保护作用。

图5为没食子酸标准曲线。

图6为本发明的草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15菌株的18srdna系统发育树。

具体实施方式

实施例一：草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15的分离和保存

2012年在三峡流域湖北宜昌境内胭脂坝采集疏花水柏枝叶片，消毒后直接进行分离纯化即可获得；

分离纯化：将处理好的样品接种到pda(新鲜土豆200g/l，蔗糖20g/l，琼脂20g/l，其余为水，ph7.2-7.5，121℃灭菌20min)固体培养基(加浓度为25μg/ml的青霉素抑制细菌和放线菌生长)上，置于28℃恒温培养箱中培养，当样品周围明显长出菌丝时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌株，转入到pda固体培养基中，连续接代3-5次，得到纯化菌株。

培养：取纯化好的菌株，接种到pda固体平板培养基上，恒温箱内28℃培养，7天即可长满平板。

采用石蜡保藏法，在灭菌的试管中倒入pda固体培养基制成斜面，接种菌落单一的sy-15，恒温箱内28℃培养，待斜面长满后，加入灭菌的石蜡使之淹没斜面的高度即可，于4℃冰箱保存。

将该菌株草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)进行保藏，保藏名称为sy-15；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为中国，武汉，武汉大学；保藏日期：2017.1.11；保藏编号为，cctccm：2017025。

实施例二：草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15鉴定

18srdna序列分析：采用通用引物进行pcr扩增18srdna序列。上游引物its1：5′-tccgtaggtgaacctgcgg-3′和通用下游引物its4：5′-tcctccgcttattgatatgc-3′。反应体系如下：

反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，55-58℃退火30s，72℃延伸1.5min，33个循环，最后72℃延伸10min。pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，挑取750bp左右的条带进行凝胶回收，送上海生工测序。

将测得的序列提交至genbank，并获得登录号kx822145。将此序列在genbank中进行blast比对，并选取同源性较高的菌株的序列用mega4.1软件构建18srdna系统发育树。

实施例三：草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15菌株的制备

菌种活化：取保存4℃冰箱的草酸青霉菌sy-15，挑起少许菌株接种于pda固体平板培养基中，28℃下，培养约7天。

实施例四：草酸青霉菌(penicilliumoxalicum)sy-15菌株的抗氧化作用研究

1、体外抗氧化活性分析

sy-15菌株于150mlpda培养基中，37℃，100r/min的摇床培养1周后，通过真空抽滤装置过滤菌悬液，弃去菌体，把发酵液上清液用等体积的乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，将萃取液于40℃条件下减压浓缩获得浓缩液，之后将浓缩液冷冻干燥获得粗提取物。将该菌的发酵液粗提取物配成10mg/ml的溶液，分别用dpph(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)自由基清除法、t-aoc试剂盒和铁氰化钾(potassiumferricyanide，pf)还原力测定法测定其抗氧化能力，重复3次，以相同浓度的维生素c作为正对照。

2、大肠杆菌抗氧化保护分析(体内抗氧化活性分析)

将处于对数生长期的大肠杆菌接种于lb液体培养基，37℃、100r/min的摇床中培养12h后，加入不同浓度(200、400、600、800、1000μmol)的h2o2溶液，同时设空白对照组(只加入基础培养基，不加入h2o2溶液)，再继续培养12h，用平板稀释计数法测大肠杆菌的活菌数。平板稀释计数法：取1ml大肠杆菌菌液稀释到10^-6，之后取0.5ml进行平板涂布，培养12h之后进行计数。选取导致50％-60％大肠杆菌细胞死亡的h2o2浓度来建立氧化应激损伤模型。

在氧化损伤保护实验中，将培养12h的大肠杆菌加入浓度为10mg/ml的sy-15发酵液粗提物3ml，培养24小时之后，加入浓度为200μmol的h2o2溶液，继续培养12h后，平板菌落计数法测大肠杆菌的活菌数并计算存活率，重复3次。

3、多酚类物质的测定

采用folin-ciocalteu法测定样品中总多酚的含量，以没食子酸为标准溶液制作标准曲线。其原理在于：folin-ciocalteu试剂中含有钨钼酸，该物质能使多酚类化合物被氧化，而自身分子中的w6+被还原为w5+，生成蓝颜色的化合物，颜色的深浅与样品中的多酚含量呈正相关关系。

(1)没食子酸标准曲线制作

精密称取10mg的没食子酸标准品，用80％乙醇溶解并定容至100ml，配成终浓度为100μg/ml的没食子酸标准溶液。准确的吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0ml没食子酸标准溶液，分别定容于10ml容量瓶内，配成不同浓度的标准溶液。然后从不同浓度没食子酸溶液中吸取1ml到25ml比色管中，加入1.5mlfolin-ciocalteu试剂，8min后加入4.5ml10％na2co3溶液，用蒸馏水定容至25ml，在25℃下反应2h，蒸馏水作为空白对照，在765nm波长下测定吸光值。

(2)粗提物多酚含量测定

取1ml的发酵液粗提物稀释液，加入1.5mlfolin-ciocalteu试剂，8min后加入4.5ml10％na2co3溶液，用水定容至25ml，25℃水浴2h，765nm处测定吸光度值。利用没食子酸标准曲线计算得到粗提物中总多酚的含量。

结果

1、体外抗氧化活性分析

2、大肠杆菌抗氧化保护分析

(1)h2o2致大肠杆菌细胞损伤的保护模型的建立

向大肠杆菌的发酵培养基中加入不同浓度的h2o2，培养12h之后分别用平板稀释法来统计大肠杆菌数并计算存活率。结果表明，平板菌落计数法结果在200μmol的h2o2存在时，细胞致死率分别达到63.77％(如图3)。所以选择200μmol的h2o2建立大肠杆菌细胞氧化损伤的保护模型。

(2)粗提物对大肠杆菌氧化损伤保护作用

为进一步明确sy-15菌株在体内的抗氧化活性，将sy-15菌株的发酵液经过萃取、减压浓缩、冷冻干燥后，配制成10mg/ml的溶液，在200μmol的h2o2存在下分别验证其对大肠杆菌的氧化损伤保护作用。结果表明sy-15菌株对大肠杆菌的抗氧化损伤保护效果是vc的59.39％，其粗提物处理过的大肠杆菌存活率不仅高于处理组，还高于空白对照组(不加h2o2时的细胞存活数)，表现出一定的促进细胞增殖的作用(vc也有同样的效果)。

3、多酚类物质的测定

根据实验数据绘制标准曲线，纵坐标为吸光度值，横坐标为标准溶液的浓度。标准曲线如图所示，其线性关系为：y＝0.0158x+0.0131，相关系数达0.9961，呈显著正相关。利用没食子酸标准曲线计算得到sy-15菌株粗提物中总多酚的含量为：10.75mg/ml。

sequencelisting

<110>申请人三峡大学

<120>一株具有强抗氧化性的草酸青霉菌sy-15及其应用

<210>sy-15

<211>544

<212>dna

seqidno：1

aggagggtccacctcccacccgtgtttatcgtaccttgttgcttcggcgg

gcccgcctcacggccgccggggggcatccgcccccgggcccgcgcccgcc

gaagacacacaaacgaactcttgtctgaagattgcagtctgagtacttga

ctaaatcagttaaaactttcaacaacggatctcttggttccggcatcgat

gaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtga

atcatcgagtctttgaacgcacattgcgccccctggtattccggggggca

tgcctgtccgagcgtcattgctgccctcaagcacggcttgtgtgttgggc

tctcgccccccgcttccggggggcgggcccgaaaggcagcggcggcaccg

cgtccggtcctcgagcgtatggggcttcgtcacccgctctgtaggcccgg

ccggcgcccgccggcgaacaccatcaatcttaaccaggttgacctcggat

caggtagggatacccgctgaacttaagcatatcaataaggcgga