一种高效防治多种作物枯萎病的生防复合菌剂LAS的制作方法

本发明涉及一种高效防治多种作物枯萎病的生防复合菌剂LAS，属于农业生物防治技术领域。

背景技术：

西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜在全球范围内的农业作物产量中占有举足轻重的地位，其中枯萎病害是影响上诉4种农业作物产量和品质的主要病害之一。枯萎病是由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum f.sp.)引起一种毁灭性的土传性病害，俗称萎凋病、死秧病等，在世界范围内均有发生。随着种植面积的扩大和连茬种植更加重了枯萎病的发生。

目前，枯萎病害防治主要的措施还是使用化学药剂。虽然化学药剂可以在一定程度上防治枯萎病，但是与此同时，土壤中许多有益的微生物也会受到不同程度的伤害。有些化学药剂的使用会造成土壤污染和化学农药残留等严重的问题。除此之外，选育抗病品种和加强田间管理措施对防治病害也有一定的作用。但是抗病品种的选育周期长，且枯萎病菌致病力变异大，抗性极易消失养。

农业措施中比较有效的是轮作倒茬，尤其是水旱轮作，能够有效的降低土壤中菌量，减少病害发生，但在实际应用中存在一定困难。一是西瓜、黄瓜、南瓜和甜瓜属于高经济值作物；二是由于枯萎菌菌能够在土壤中存活十几到几十年，短期轮作达不到预期目的；三是种植大多数非寄主植物不能减少微菌核在土壤中的数量，而且非寄主的根分泌物仍能为微菌核存活提供营养。

在这种发展情况下，不少目光开始转移到生物防治手段。生物防治与其他方法相比，具有安全、有效、持久的特点，特别是避免了化学防治带来的一系列问题。生防制剂对病害防治效果好，对人畜无毒，不污染环境，无残留；对病虫害的杀伤特异性强，不伤害天敌，有益生物，能保持生态平衡；生产原料和有效成分为天然产物易降解，可回归大自然，保证可持续发展；可用生物技术和基因工程的方法对微生物进行改；多种因素和成分发挥作用，病原菌难以产生抗药性。据报道，枯萎病的生防真菌主要有木霉菌、粘帚霉，但上述生防菌防治效果不够理想，主要原因是这些生防菌在寄主根际定殖能力差。枯萎病生防细菌中比较有前途的种类是芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、荧光假单胞菌、芽孢杆菌等。一般说来，多种生防菌混合使用其效果比单一生防菌要好。另外，将生防菌剂和农业栽培措施结合起来使用，可为生防菌提供一个良好的栖境，使其能尽量发挥其本身的防治潜能。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种高效防治多种作物枯萎病的微生物组合物及由其制备的微生物复合菌剂。

本发明的另一目的是提供该微生物组合物及由其制备的微生物复合菌剂的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种高效防治多种作物枯萎病的微生物组合物，由以下3种细菌组成,分别是：芽胞杆菌JC65(Bacillus sp.)，于2010年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.4475；蜡状芽孢杆菌CH01(Bacillus cereuse),于2015年11月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.11677；枯草芽胞杆菌SM16为(Bacillus subtilis)，于2009年06月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.3127。

本发明所述的微生物组合物在防治枯萎病和促进作物生长方面的应用。

优选将所述的三种菌株JC65、CH01和SM16发酵后的湿菌与本实验室的菌体保藏液(属本实验室已授权专利，专利号ZL02112559.7，公开专利号CN1358838，公开日：2002年7月17日)按1：40(g/ml)配成菌剂，可室温保存2～3年。该复合菌剂可以稀释后于西瓜苗移栽时浇灌施用。

本发明所述的微生物组合物在制备防治枯萎病和促进作物生长的微生物复合菌剂中的应用。

本发明所述的微生物组合物制备的微生物复合菌剂。

本发明所述的微生物复合菌剂,优选通过以下方法制备得到：将所述的菌株JC65、CH01和SM16分别接种到LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有5mL的LB培养液的试管中，置于28℃，200r/min的摇床中培养，制成种子液；以1％的接种量将种子液接种于装有500mL的LB培养液的三角瓶里，置于28℃，200r/min的摇床中培养48h，将3种菌液浓度稀释到5×10⁷CFU/mL后按照1:1:1的比例混合均匀，即为所述的微生物复合菌剂。

本发明所述的微生物复合菌剂的制备方法，包括：将所述的菌株JC65、CH01和SM16分别接种到LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有5mL的LB培养液的试管中，置于28℃，200r/min的摇床中培养，制成种子液；以1％的接种量将种子液接种于装有500mL的LB培养液的三角瓶里，置于28℃，200r/min的摇床中培养48h，将3种菌液浓度稀释到5×10⁷CFU/mL后按照1:1:1的比例混合均匀。

本发明所述的微生物复合菌剂在防治枯萎病和促进作物生长方面的应用。

所述的应用优选在作物移栽和播种的时候进行稀释灌根使用。

有益效果

本发明的优点和积极效果表现在：本发明是专门针对枯萎病病害开发的生防制剂。因其属于生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，利于西瓜、黄瓜、南瓜和甜瓜的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于这些作物的出口贸易。

温室试验表明，LAS合剂能有效控制枯萎病对西瓜的侵染，达到控制病情发生的效果，防病效果有86.7％，促生效果有33.3％；大田试验表明，LAS合剂一方面能控制病情发生，防效保持在75.0％，同时能够促进上诉4种作物的生长，增产增收，促生效果达66.6％；综合温室和大田促生试验发现，LAS合剂能促进上诉4种作物的生长，提高产量。

附图说明

图1不同生防菌与枯萎病菌的拮抗效果图

图2不同生防菌对枯萎病菌生长的抑制图

图3西瓜移栽后30天的促生效果图

生物材料保藏信息

JC65，芽胞杆菌Bacillus sp.，于 2010年 12月 15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号3号院，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No.4475。

CH01，蜡状芽孢杆菌Bacillus cereuse,于 2015年 11月 17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号3号院，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.11677。

SM16，枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis，于 2009年 06月 18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号3号院，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC No.3127。

具体实施方式

实施例1

1.菌株来源：JC65由黄瓜根围土壤中分离得到；SM16和CH01由番茄健株根部土壤中分离得到。

2.菌株分离方法：采用平板稀释法(参考中国科学院南京土壤所微生物室.土壤微生物研究法[M].北京：科学出版杜，1985.)。

3.菌株筛选依据：西瓜枯萎病病菌与生防菌的拮抗作用测定(对峙培养法，林福呈，李德堡.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对植物病原真菌的溶菌作用[J].植物病理学报，2003，33(2)：174～177.)，生防菌对西瓜枯萎病防治和促生作用温室、大田实验。

4.菌株鉴定方法：利用原核生物16S rRNA编码基因片段序列测序方法鉴定。鉴定结果见表1。

表1：测序比对结果

5.平板拮抗实验方法

方法一：将保存于4℃中的西瓜枯萎病菌接种到PDA平板上活化，待真菌长满平板后用灭菌的打孔器从菌落外边缘均匀的打成直径为8mm的圆形菌块。将菌丝块接种在新的PDA平板的中心，在其四周距中心等距离处分别接种一株生防菌，如图1所示。25℃培养，每隔两天观察真菌生长情况，记录抑菌圈的大小。每个处理三次重复。记录数据和处理组信息见表2和图1。

表2不同生防菌对枯萎病菌的抑制率

注：1.数值为平均值，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

2.抑制率(％)＝(R-r)/R*100％

方法二：取5.0×10⁷CFU/ml的生防菌1mL于99mL的PDA中混匀倒板为处理1，取5.0×10⁷CFU/ml的生防菌5mL于95mL的PDA中混匀倒板为处理2。以不加任何生防菌的PDA板为对照。将打好的菌碟至于平板中央。25℃培养，每隔两天观察真菌生长情况并记录真菌生长情况。每个处理重复三次。处理组信息见表3和图2。

表3不同生防菌对枯萎病菌生长的抑制

注：1.数值为平均值，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

2.抑制率(％)＝(R-r)/R*100％

实施例2

将菌株JC65、CH01和SM16分别接种到LB平板上划线，28℃生化培养箱中培养14-16h，待长出单菌落后，挑取单菌落接入含有5mL的LB培养液的试管中，置于28℃，200r/min的摇床中培养，制成种子液；以1％的接种量将种子液接种于装有500mL的LB培养液的三角瓶里，置于28℃，200r/min的摇床中培养48h，将3种菌液浓度稀释到5×10⁷CFU/mL后按照1:1:1的比例混合均匀，即为所述的微生物复合菌剂。

实施例3温室促生实验

在西瓜苗长到3-4叶期时挑选长势一致的西瓜苗移栽到含有营养土的盆钵中，每个处理移栽10棵西瓜苗。移栽完当天，用灌根法浇灌20mL的5×10⁷CFU/ml的相应生防菌，移栽后的30天再补浇一次生防菌。以清水为对照。每天观察各组促生情况。

结果见表4和图3。

总(平均)鲜重＝地下部鲜重+地上部鲜重

促生效果＝[(处理平均鲜重-清水对照平均鲜重)/清水对照平均鲜重]×100％

表4复合菌剂LAS对西瓜的促生作用(移栽30d)

注：1.数值为平均值，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

2.生物量增加＝[(处理平均鲜重-清水对照平均鲜重)/清水对照平均鲜重]×100％

实施例4温室防病实验

在西瓜苗长到3-4叶期时，挑选长势一致的西瓜苗移栽到含有营养土的盆钵中，每个处理移栽10棵西瓜苗。移栽完当天，用灌根法对处理组的西瓜苗浇灌5×10⁷CFU/ml的相应生防菌，随即再用灌根法对处理组的西瓜苗浇灌5×10⁶个孢子/mL的孢子悬浮液20mL。以清水为对照。每天观察各组防病情况，以对照组发病率达95％以上后停止观察。防病信息见表5。

枯萎病病级标准：

0级：无病症；

1级：叶片黄化或萎蔫面积＜50％；

2级：叶片黄化或萎蔫面积＞50％；

3级：叶片萎蔫或枯死，仅生长点存活；

4级：整珠枯死。

病害严重度(％)＝100％×Σ(病植株数×病级数)/(总植株数×最高病级数)

防病效果(％)＝100％×(对照病害严重度-处理病害严重度)/对照病害严重度

表5复合菌剂LAS对西瓜的防病作用(移栽30d)

注：1.数值为平均值，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

2.防治效果％＝(对照病害严重度－处理病害严重度)/对照病害严重度×100

实施例5大田防病试验

大田实验在南农牌楼实验基地进行。西瓜品种为早佳(84-24)

实验处理为：生防复合菌剂LAS、清水对照。处理方法：移栽当天处理、15d、30d、75d分别以灌根的方式处理。

每个处理3个重复，每个小区面积24m²(6m*4m，)，行距为100cm，株距为40cm。每个小区60棵西瓜。具体信息见表6。

表6大田中复合菌剂LAS对西瓜的防病作用(移栽105d)

注：1.数值为平均值，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

2.防治效果＝[(处理平均鲜重-清水对照平均鲜重)/清水对照平均鲜重]×100％

黄瓜、甜瓜和南瓜的大田防病实验同西瓜大田防病实验，具体信息见表6、7、8。

表7大田中复合菌剂LAS对黄瓜的防病作用(移栽105d)

注：1.数值为平均值，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

2.防治效果＝[(处理平均鲜重-清水对照平均鲜重)/清水对照平均鲜重]×100％

表8大田中复合菌剂LA对甜瓜的防病作用(移栽105d)

注：1.数值为平均值，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

2.防治效果＝[(处理平均鲜重-清水对照平均鲜重)/清水对照平均鲜重]×100％

表9大田中复合菌剂LA对南瓜的防病作用(移栽105d)

注：1.数值为平均值，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

2.防治效果＝[(处理平均鲜重-清水对照平均鲜重)/清水对照平均鲜重]×100％

实施例7大田促生效果

大田实验在南农牌楼实验基地进行。西瓜品种为早佳(84-24)

实验处理为：生防复合菌剂LAS、清水对照。处理方法：移栽当天处理，15d、30d、75d分别以灌根的方式处理。

每个处理3个重复，每个小区面积24m²(6m*4m，)，行距为100cm，株距为40cm。每个小区60棵西瓜。具体信息见表10。

黄瓜、甜瓜和南瓜的大田促生实验同西瓜大田促生实验，具体信息见表11、12、13。

表10大田中复合菌剂LAS对西瓜的促生作用(移栽35d)

注：1.数值为平均值，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

2.生物量增加＝[(处理平均鲜重-清水对照平均鲜重)/清水对照平均鲜重]×100％

表11大田中复合菌剂LAS对黄瓜的促生作用(移栽35d)

注：1.数值为平均值，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

2.生物量增加＝[(处理平均鲜重-清水对照平均鲜重)/清水对照平均鲜重]×100％

表12大田中复合菌剂LAS对甜瓜的促生作用(移栽35d)

注：1.数值为平均值，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

2.生物量增加＝[(处理平均鲜重-清水对照平均鲜重)/清水对照平均鲜重]×100％

表13大田中复合菌剂LAS对南瓜的促生作用(移栽35d)

注：1.数值为平均值，不同字母表示处理间在P＝0.05的显著水平下，差异性显著。

2.生物量增加＝[(处理平均鲜重-清水对照平均鲜重)/清水对照平均鲜重]×100％。