本发明涉及一种裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法，具体的涉及一种基于裂盖马鞍菌生物学特性、通过子实体的原产地采集及单次生子囊孢子菌株的分离与鉴定、低能离子束注入及透明圈和营养缺陷型选择性筛选、总RNA的提取及检测、cDNA的合成及文库构建、原始文库重组率的滴度测定、EST序列分析的方法。
背景技术：
裂盖马鞍菌(Helvella leucopus Pers.) 俗名巴楚蘑菇、地木耳，属子囊菌亚门(Ascomycotina)、盘菌目(Pizizales)、马鞍菌科(Helvellaceae)、马鞍菌属(Helvella)，原产于新疆巴楚县原始胡杨林场，是叶尔羌河水、千年胡杨树、干旱少雨的大漠气候条件经大自然融合孕育出的一种绿色珍稀食用菌，素以纯天然、质嫩味美、营养丰富而著称，它不但具有较高的营养价值，还有提高人体免疫力、促进大脑发育、防止脑动脉硬化、促进副肾皮质激素分泌、增强人体应激能力、溶血栓、降血压、降低胆固醇等多种保健作用，市场上干品价格居高不下仍供不应求。
近年来，由于对裂盖马鞍菌人为过渡采收加之其生长环境不断恶化等原因其产量逐年下降，而人工驯化和栽培至今尚未获实质性突破，急需对裂盖马鞍菌进行区域普查、育种技术及栽培技术进行深入研究。但国内外对裂盖马鞍菌的研究甚少，近年来只有国内学者朱铭莪、孟庆玲、胡建伟等对裂盖马鞍菌的营养成分、免疫功能、抗氧化及抗肿瘤活性、孢子萌发及环境适应性进行了初步研究。因此，为了更好的保护野生裂盖马鞍菌种群及生物遗传多样性和可持续开发利用，急需对离子注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法进行深入研究。
离子束诱变技术是上世纪80年代中期由我国科学家开创的新兴研究领域，是育种方法学的重要创新并从国内走向世界。在离子注入生物效应的研究中，呈现出一些独特性，它主要包括能量沉积、动量传递、质量沉积和电荷交换这4个原初过程，这4个过程在很短的时间内同时发生，很难区分各自的独立作用。离子注入产生的生物效应的因素与辐射不同，离子注入除了具有能量沉积引起机体损伤的特征外，还具有动量传递产生的级联损伤，表现为遗传物质的原子移位、重排或基因缺失，还有沉积离子、移位原子和本底元素复合反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造成的损伤。注入的荷能离子的电信号和所形成的微电场影响着生物体生命过程中的基因表达和调控、细胞内外的能量交换、物质运输、信息传递，并刺激损伤DNA 的修复、生物体的生长和发育。因此，离子束诱变技术已成为拥有我国自主知识产权的定向遗传育种的新方法、新途径。
人类对于基因组进化的兴趣最早可以追溯到20世纪70-80年代选择学说和中性学说的逐渐形成和争论。虽然至今还没有完全弄清基因进化的具体过程和机制，但目前已经普遍认为广泛存在的点突变和插入/缺失突变是基因组进化的重要驱动力。自1927年Muller发现X射线能诱发果蝇产生大量多种类型突变和20世纪40年代初Fresjeben和Lein利用诱变剂在植物上获得有益突变以来，突变被广泛应用于生物的遗传育种及定向进化研究。随着DNA高精度高通量快速测序技术的发展和完善，测序成本大幅度降低，促进了全基因组突变技术和方法的发展和应用(Nature Genetics, publish online, 20 june 2007)。较早用于全基因组突变技术TILLING，是将诱发产生高频率点突变的化学诱变方法与PCR筛选技术和Li-Cor公司生产的4300DNA遗传分析系统的双色红外荧光高通量检测技术有效结合，快速有效的从化学诱变剂（EMS）诱变产生的突变群体中鉴定出点突变。
本申请的发明人经过近年来深入裂盖马鞍菌发生地对当地物候条件、发生基质、发生方式的野外实地考察结合在实验室对其生物学特性、离子束诱变育种方法深入细致的研究，设计了一种离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法，实验业已证实该方法是一种简便实用的裂盖马鞍菌的离子束诱变育种方法。
技术实现要素：
本发明提供了一种离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法，该方法包括子实体的原产地采集及单次生子囊孢子菌株的分离与鉴定、低能离子束注入及透明圈和营养缺陷型选择性筛选、总RNA的提取及检测、cDNA的合成及文库构建、原始文库重组率的滴度测定、EST序列分析等步骤。优选地，在离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的步骤中还包括离子束注入组合参数的优化、选择性筛选方法的设计和全基因组测序及分析的步骤，经过上述处理可获得裂盖马鞍菌创新突变菌株并揭示全基因组突变及定向进化的分子机制。
鉴于裂盖马鞍菌种群及生物遗传多样性保护和绿色开发的现实需要，以原产地采集的裂盖马鞍菌子实体为出发菌种，将单次生子囊孢子菌株分离与鉴定、离子束注入诱变、透明圈和营养缺陷型筛选方法与全基因组测序及分析相融合筛选裂盖马鞍菌创新突变菌株，为裂盖马鞍菌的原产地保护和人工栽培提供育种方法和种质保证。
其中，出发菌种的优劣是影响离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的首要因素，而原产地采集的时间和地点、采集和保存方式以及单次生子囊孢子菌株的分离与鉴定等环节都对出发菌种的品质有影响。基于文献资料报道结合对裂盖马鞍菌主要发生地南疆叶尔羌流域的巴楚县和塔里木河流域的轮台县的物候条件、发生基质、发生方式的野外实地考察，每年4月下旬-5月中旬为新疆裂盖马鞍菌的菌丝体扭结、子实体发育成熟适宜采集的季节，可以利用五一长假期间赶赴巴楚县或轮台县胡杨林场寻找、观察、采集裂盖马鞍菌子实体，并通过就地的酒精表层无菌处理及低温保鲜处理后快速运返实验室，从中分别选取几片成熟耳片经1.0KGy的γ射线辐照处理后置于无菌培养皿中收集弹射子囊孢子，然后用无菌水分别洗脱、收集弹射子囊孢子，经荧光标记、计数、稀释后分别取 0.2mL子囊孢子悬液一一对应涂布在无菌空白培养皿和水琼脂分离培养基平板上，涂菌的空白培养皿自然风干以备后续离子束注入诱变之用。
低能离子束注入的组合参数是影响离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的关键因素。以分离鉴定的裂盖马鞍菌单次生子囊孢子为靶材，经不同能量、剂量、脉冲时间及正交组合的N+注入后，用含有多态性DNA的缓冲液对离子注入的涂菌培养皿进行洗脱、复活和培养，并与未经离子束注入的对照对比，考察不同注入能量、剂量、脉冲时间对细胞存活率的影响，并以Loewer等人的“突变累计”方法计算突变率，获得低能离子注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的最佳N+注入参数。
选择性筛选方法也是影响离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的关键因素。低能离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变是随机的，而选择性筛选方法却是定向的。挑取经离子束注入后PDA平板培养基上长出的单菌落初生菌丝体分别转接到CMC平板培养基和氨基酸缺陷型平板培养基上25℃恒温培养，通过透明圈和营养缺陷型选择性筛选方法筛选突变菌株。
全基因组测序和分析是影响离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的重要因素。采用Solexa高通量测序技术对构建的野生型和突变菌株文库进行测序，利用生物信息学方法可获得裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的分子机制。
该方法已在实验室得到成功实践，结果表明该方法是一种简便实用的裂盖马鞍菌的离子束诱变育种方法。
具体实施方式
实施例 离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法
离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法包括子实体的原产地采集及单次生子囊孢子菌株的分离与鉴定、低能离子束注入及透明圈和营养缺陷型选择性筛选、总RNA的提取及检测、cDNA的合成及文库构建、原始文库重组率的滴度测定、EST序列分析几个阶段。选择裂盖马鞍菌大量发生的季节，深入裂盖马鞍菌原产地采集发育成熟的子实体，通过单次生子囊孢子菌株的分离与鉴定、低能离子束注入及透明圈和营养缺陷型选择性筛选以及全基因组测序和分析可获得裂盖马鞍菌创新突变菌株及其全基因组突变和定向进化的分子机制。
（1）子实体的原产地采集及单次生子囊孢子菌株的分离与鉴定
五一期间分赴裂盖马鞍菌发生地叶尔羌流域的巴楚县和塔里木河流域的轮台县林区采集裂盖马鞍菌子实体，并通过就地的酒精表层无菌处理及低温保鲜处理后快速运返实验室，从中分别取几片裂盖马鞍菌子实体成熟耳片经1.0KGy的γ射线辐照处理后置于无菌培养皿中收集弹射子囊孢子，然后用无菌水分别洗脱收集的弹射子囊孢子经荧光标记、计数、稀释后分别取 0.2mL子囊孢子悬液一一对应涂布在无菌空白培养皿和水琼脂分离培养基平板上，涂菌的空白培养皿自然风干以备后续离子束注入诱变之用，涂菌的水琼脂分离培养基25℃恒温培养，并镜检水琼脂分离培养基平板上单次生子囊孢子的动态萌发过程，待平板上出现单菌落之后挑取初生菌丝体到 PDA平板培养基上25℃恒温培养，镜检菌丝体的微观形态并动态观察其生长过程。
（2）低能离子束注入及透明圈和营养缺陷型选择性筛选
以分离鉴定的裂盖马鞍菌单次生子囊孢子为靶材，经不同能量、剂量脉冲时间及正交组合的N+注入后，用含有多态性DNA的缓冲液对离子注入的涂菌培养皿进行洗脱、复活和培养，并与未经离子束注入的对照对比，考察不同注入能量、剂量、脉冲时间对细胞存活率的影响，并以Loewer等人的“突变累计”方法计算突变率，获得低能离子注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的最优N+注入参数为：注入能量15keV、注入剂量1.0×1016cm-2、真空度2.5×10-3Pa、脉冲时间5s/次。然后，挑取PDA平板培养基上单菌落初生菌丝体分别转接到CMC平板培养基和氨基酸及维生素缺陷型平板培养基上25℃恒温培养，通过测定透明圈直径和营养缺陷型选择性筛选方法筛选裂盖马鞍菌创新突变菌株。其中，营养缺陷型平板培养基是在质量百分比为1.0%玉米淀粉、2.0%葡萄糖、0.2%磷酸二氢钾、0.15%硫酸镁、2.0%琼脂、pH自然的基础平板培养基上分别添加0.2mL质量百分比为70ppm的天门冬氨酸Asp、70ppm亮氨酸 Leu、50ppm丝氨酸Ser、70ppm异亮氨酸Ile、90ppm谷氨酸Glu、90ppm酪氨酸Tyr、60ppm脯氨酸Pro、80ppm苯丙氨酸Phe、40ppm甘氨酸Gly、70ppm赖氨酸Lys、40ppm丙氨酸Ala、100ppm色氨酸Trp、80ppm组氨酸His、120ppm胱氨酸Cys、20ppm精氨酸Arg、60ppm缬氨酸Va、60ppm苏氨酸Thr、70ppm蛋氨酸Met、100ppm维生素B1、100ppm维生素B2、100ppm维生素B6溶液，本方法所用的多态性DNA片段包括12种单链小分子DNA及以其为模板经PCR扩增获得的双链小分子DNA，12种单链小分子DNA序列如下（N表示任意相同碱基）：
5、ATGCNNNNNNNNNNNNNNNN3、
5、ATCGNNNNNNNNNNNNNNNN3、
5、AGCTNNNNNNNNNNNNNNNN3、
5、AGTCNNNNNNNNNNNNNNNN3、
5、ACTGNNNNNNNNNNNNNNNN3、
5、ACGTNNNNNNNNNNNNNNNN3、
3、ATGCNNNNNNNNNNNNNNNN5、
3、ATCGNNNNNNNNNNNNNNNN5、
3、AGCTNNNNNNNNNNNNNNNN5、
3、AGTCNNNNNNNNNNNNNNNN5、
3、ACTGNNNNNNNNNNNNNNNN5、
3、ACGTNNNNNNNNNNNNNNNN5、。
（3）总RNA的提取及检测
将裂盖马鞍菌野生型和突变菌株菌丝体接种到 PDA 平板培养基上，置于 25℃培养箱中培养 10d，取适量初生菌丝体立即冻存于液氮中，在液氮中研细转至匀浆管中，加入1mL RNA-solv Reagent试剂，按北京华越洋生物科技有限公司RNA试剂盒说明书操作提取总RNA，然后，自然干燥后溶于0.1 mL无RNase的H2O中，用紫外分光光度计测量所提RNA的纯度(OD260／OD280)，用质量分数为1.2％的琼脂糖电泳检测所提RNA的完整性。
（4）cDNA的合成及文库构建
取2 µg mRNA在M-MLV反转录酶的作用下，42℃温浴l h，合成cDNA第一链；取2 µL单链cDNA通过LD-PCR法合成第二链，所用程序为95℃ l min预变性，95℃ 15s，24个循环，68℃延伸6 min；所有的第二链产物经过蛋白酶K及Sfi I限制性内切酶消化后用Chroma SPIN-400凝胶柱将cDNA片段按分子大小分布，收集大于500 bp的片段经乙醇沉淀后重新溶于7µL去离子水中；最后，将片段连入pDNR-LIB载体。其中，CDS III／3'-PCR引物：5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3'；SMART IV低聚核苷酸：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCTTACGGCCGGG-3'；第二链合成所用引物：5'-PCR引物：5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'，3'-PCR引物：5'-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3'。
（5）原始文库重组率的滴度测定
于氯霉素抗性培养基上任意挑取24个重组子，通过质粒酶切，电泳检测得到文库重组率，其中，重组率=(有插入片段的反应个数／反应总数)×100％。
（6）EST序列分析
利用Solexa高通量测序技术对不同文库进行测序，将所得序列去除大肠杆菌DNA序列、载体序列、接头序列和短于100 bp的序列，并将所得序列应用CAP3序列软件进行拼接，参数设定标准是2个片段至少100 bp范围内有大于95％的一致性序列。处理后的EST序列与本地化的GMGI(Glyeine Max Gene Index，Release 16)、AGI(Arabidopsis Gene Index，Release 12)和OGI(Oryza Sativa Gene Index，Release 16)基因数据库进行Blast N分析，E值设定为E-value<10-15。根据功能注释信息和GI号，采用国际标准基因分类体系(Gene Ontology，GO)进行分类，获得裂盖马鞍菌基因突变的位点并揭示其全基因组突变及定向进化的分子机制。
通过上述具体的实施例，更容易理解本发明。上述实施例只是举例性的描述，而不应当被理解为用来限制本发明的范围。