一种亚油酸异构酶突变体及其应用的制作方法

本发明涉及一种亚油酸异构酶突变体及其应用。

(二)

背景技术：

共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是具有共轭双键的十八碳二烯酸的统称，具有抗癌、抗氧化、抗心血管疾病及减轻体重的作用。美国FDA于2008年、欧洲国家2012年批准CLA作为食品添加剂使用，我国2009年批准CLA为新资源食品，市场需求巨大。

反刍动物肉、奶及其制品是CLA的天然食物来源，但含量较低。CLA也可以以亚油酸(linoleic acid；LA)为底物，通过碱催化异构化反应化学生成，但产物是c-9,t-11CLA和t-10,c-12CLA的两种异构体的混合物，分离、纯化困难，且产物中混有对食用具有安全隐患的脂肪酸环化副产物。自然界中某些微生物含有亚油酸异构酶(Linoleate Isomerase,PAI)，来源于痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的PAI是目前唯一已知晶体结构的亚油酸异构酶，能催化LA为t-10,c-12CLA。目前已经有一些研究借助基因工程技术构建具有产PAI活力的工程菌株，但酶活力均不够理想，达不到工业应用的水平。基于对蛋白质晶体结构认识基础上的酶蛋白质定向进化技术在酶工程领域已有大量的研究和应用，通过对酶蛋白活性中心相应氨基酸残基的突变，再进行筛选，可以获得催化活性显著提高的突变酶，因此，可以利用该基因改造技术提高PAI的催化活性。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种亚油酸异构酶突变体及其应用，该亚油酸异构酶突变体具有很好的催化亚油酸合成共轭亚油酸的活力，具有良好的工业应用前景。

野生型亚油酸异构酶(PAI；Gene Bank号为AX062088)来源于痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)，但野生型亚油酸异构酶催化亚油酸获得反-10,顺-12共轭亚油酸(trans-10,cis-12conjugated linoleic acid；t-10,c-12 CLA)的活性较弱，目前还不具备实际工业应用价值。如果能够通过基因工程改造，提高其酶活性，则其具备相应的工业应用价值。

本发明采用的技术方案是：

通过对野生型亚油酸异构酶活性区域进行理性设计并定点突变，对多个位点进行饱和定点突变，再表达纯化后进行酶活力进行检测，本发明提供一种亚油酸异构酶突变体，所述突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示的亚油酸异构酶第62位蛋氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸，和/或第295位丝氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸得到。

进一步，所述突变体是将第62位蛋氨酸突变为丙氨酸或甘氨酸，同时第295位丝氨酸突变为丙氨酸、亮氨酸或缬氨酸。组合后产生的6种双突变酶，经检测酶活力能够提高10倍左右，具有良好的工业应用前景。

为了方便本发明亚油酸异构酶突变体表达后的纯化，优选的，所述的亚油酸异构酶突变体的N端或C端连接有用于蛋白纯化的标签。更优选的，所述标签为组氨酸标签。组氨酸标签本身较小，一般常用6个组氨酸，且纯化步骤方便。

本发明还提供一种所述亚油酸异构酶突变体的编码基因，由所述编码基因构建的重组载体，以及由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。

此外，本发明还提供一种所述亚油酸异构酶突变体在催化亚油酸制备共轭亚油酸中的应用，具体所述的应用为：以含亚油酸异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的培养液超声破碎后提取的纯酶为催化剂，以亚油酸为底物，以吐温-80为助剂，于pH6.7、25mM磷酸缓冲液中，40℃水浴搅拌反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得(10E,12Z)-共轭亚油酸。所述催化剂用量以缓冲液体积计为250～4000U/ml(优选314U/ml)，所述底物用量以缓冲液体积计为50～150g/L(优选125g/L)，所述助剂体积用量以缓冲液体积计为5-15％(优选12.5％)。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：

(1)将含亚油酸异构酶突变体编码基因的重组基因工程菌接种于LB固体平板，37℃培养18小时，挑取重组转化子并接种于LB固体培养基，37℃培养18小时，获得重组转化子；所述LB液体培养基质量组成为：1％蛋白胨、0.5％酵母浸出粉、1％氯化钠，溶剂为水，pH值自然；LB固体培养基即在LB液体培养基的基础上添加质量浓度1.5％琼脂粉；

(2)将重组转化子接种于含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，置于37℃、200rpm摇床中震荡培养，至OD600达到0.4～0.5，获得种子液；

(3)将种子液以体积百分浓度1％的接种量接种于自诱导培养基中，25℃培养48小时，将培养液超声波破碎至镜检无细胞，离心后获得上清，即为粗酶液；

自诱导培养基组成为：阿拉伯糖3g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸盐6.8g/L，硫酸盐1.2g/L，NH₄Cl 2.65g/L，MgSO₄ 0.98g/L，CaCl₂ 0.1g/L，溶剂为水，pH值自然；

(4)以缓冲液A先平衡蛋白质Ni⁺柱后，加入步骤(3)制备的粗酶液，充分摇荡30min，放掉废液，以缓冲液A冲洗三次后，加入缓冲液B充分摇荡均匀20min，后收集流出液，流出液中加入过量硫酸铵至无法溶解，离心3000rpm，10min，收集沉淀，沉淀中加入质量浓度15％甘油水溶液溶解，获得蛋白溶液；蛋白溶液过以g25为填料的层析柱脱盐，检测流出液的A280吸收值，收集A280吸收值大于0.1的部分，获得纯酶；

缓冲液A：NaCl 140mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄ 1.8mmol/L，以5M NaOH调节pH值至8.0，溶剂为水；

缓冲液B：NaH₂PO₄·2H₂O 50mM，NaCl 300mM，咪唑(imidazole)500mM，以5M盐酸溶液调节pH值至8.0，溶剂为水。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明亚油酸异构酶突变体与野生型酶相比，催化亚油酸获得反-10,顺-12共轭亚油酸的酶活力得到了大大的提高，特别是双突变时，如M62A/S295L，M62A/S295A，M62A/S295V，M62G/S295L，M62G/S295A，M62G/S295V，能够提高10倍左右，具备良好的工业应用前景。

(四)附图说明

图1为亚油酸异构酶催化亚油酸获得反-10,顺-12共轭亚油酸的示意图。

图2为纯化后亚油酸异构酶SDS-PAGE图谱。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1

野生型亚油酸异构酶(PAI；Gene Bank号为AX062088)，但野生型亚油酸异构酶的酶活力较低，不能很好地满足工业应用的要求。

野生型亚油酸异构酶氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，以含有该野生型亚油酸异构酶基因(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)的PET28a重组质粒(带有组氨酸标签)为模板，在M62，S295位点进行饱和突变。因此利用oligo7软件设计平末端引物，后进行PCR定点突变，引物如表1所示，其中M62-R和S295-R为反向引物，其余均为正向引物，其中每个位点的反向引物相同，正向引物中前三个碱基为突变位点。本次PCR突变采用KOD-Plus-Neo DNA聚合酶试剂盒(购买来自东洋纺科技有限公司，上海)。

表1引物序列

反应体系如下：

PCR循环过程：

将PCR产物回收，50μl的体系里加入DpnⅠ(1μl)，保持37℃，1.5h，用以消化模板DNA，然后以琼脂糖(1％)凝胶电泳检测其是否定点突变完成。在保证琼脂糖凝胶上跑出明显条带后，PCR cleaning试剂盒(购买于捷瑞生物工程有限公司，上海)清洗后进行PNK连接。

PNK激酶(捷瑞生物工程有限公司，上海)连接体系为：

连接缓冲液 5μl

PNK 1μl

PCR cleaning 10μl，

混合均匀，16℃孵育1.5h后，可完成连接。连接产物转化大肠杆菌，平板培养后，挑选长出的单克隆进行测序，验证序列正确，得到了表1所述突变体质粒。

实施例2

1、亚油酸异构酶及其突变体的表达

(1)将含野生型亚油酸异构酶基因的质粒及实施例1得到的突变体质粒分别转化到大肠杆菌JM109(DE3)感受态细胞中，然后涂布于LB固体平板37℃培养10h后观察菌生长状况，挑取重组转化子接种于LB培养基，37℃培养18小时，获得重组转化子。

(2)将重组转化子接种于装有5ml含卡那霉素(50μg/ml)的LB液体培养基中，置于37℃、200rpm摇床中震荡培养，至OD600达到0.4～0.5左右，获得种子液。

(3)将种子液以体积百分浓度1％的接种量接种于自诱导培养基中，25℃培养48小时。将菌液以超声波破碎至镜检无细胞，离心后获得上清，即为粗酶液。

自诱导培养基配方为：阿拉伯糖3g/L，葡萄糖0.5g/L，甘油5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸盐6.8g/L，硫酸盐1.2g/L，NH₄Cl 2.65g/L，MgSO₄ 0.98g/L，CaCl₂ 0.1g/L，溶剂为水，pH值自然。

2、亚油酸异构酶及其突变体的纯化

蛋白质Ni⁺柱纯化：取1ml的带Ni⁺琼脂糖以缓冲液A先平衡10min后，加入适量粗酶液进样，充分摇荡30min(使蛋白与带Ni+琼脂糖充分结合)，放掉废液，以缓冲液A冲洗三次后，适量缓冲液B充分摇荡均匀20min，洗脱蛋白，收集流出液保存于-20℃或进行下一步盐析。SDS-PAGE检测蛋白纯化后的效果，野生型亚油酸异构酶纯化结果如图1所示，其余突变体的纯化结果与野生型相似。

盐析：上一步所得流出液中加入过量的硫酸铵，盐析出蛋白质。离心3000rpm，10min，倒去上清，加入1ml质量浓度15％甘油水溶液溶解，获得蛋白溶液，进行下一步脱盐处理。

脱盐：上步处理所得蛋白溶液，以g25为填料的脱盐柱脱去盐，记录流出液的A280吸收值，收集具有高吸收值的流出液即得纯化酶蛋白样品。使用公知的考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒检测蛋白质含量。缓冲液A：NaCl 140mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄ 1.8mmol/L，以5M NaOH调节pH值至8.0，溶剂为水；

缓冲液B：NaH₂PO₄·2H₂O 50mM，NaCl 300mM，咪唑(imidazole)500mM，以5M盐酸溶液调节pH值至8.0，溶剂为水。

实施例3亚油酸异构酶及其突变体的酶活力检测

对实施例2方法纯化获得的亚油酸异构酶及其突变体蛋白进行酶活力测定。

亚油酸异构酶活力定义：每1min催化转化生成1umol(10E,12Z)-CLA所用的酶量。

酶活力(U/mg)＝CLA生成量(mg)/CLA相对分子质量(0.280mg/umol)*酶量(mg)。

反应体系：0.05mg纯化蛋白；pH6.7、25mM的磷酸缓冲液900μl；亚油酸3mg；在40℃震荡反应20min后；加入2ml异丙醇终止反应；2ml正己烷萃取反应体系，取上清，加入等体积盐酸饱和甲醇，60℃甲酯化3小时，GC-MS检测共轭亚油酸含量，计算活力，结果见表2。

GC-MS方法：HP-5MS(AgilentTechnologies，30m，0.250um)，SPL1进样口温度300℃；FID1检测器温度280℃，柱温：初始温度70℃，保持3min；20℃/min的速度上升至300℃，在300℃下保持5min。

表2单突变体筛选

注n.d.表示无活力。

实施例4

在第一轮单点突变筛选的基础上，进一步优化组合双突变，使获得更有效的突变体。

将M62A、M62G分别与S295L、S295V、S295A组成双突变(点突变方法同实施例1)，构建双突变体文库，转化到大肠杆菌JM109(DE3)中培养，挑菌，活化，表达蛋白，纯化，盐析，脱盐，进行使用实适例3所述方法测定活力。

表3双突变体筛选

实验结果所示，双突变体酶M62A/S295L、M62A/S295A、M62A/S295V、M62A/S295L、M62A/S295A、M62A/S295V的催化能力高于野生型约10倍，具有实际应用价值。

实施例5

使用实施例2所述方法，获得野生型亚油酸异构酶蛋白85mg，酶活力为212U/mg。

在250ml圆底烧瓶中加入80ml磷酸缓冲液(25mM、pH6.7)，10g LA，10ml吐温-80，40摄氏度水浴高速搅拌乳化1小时，停止乳化，加入野生型亚油酸异构酶蛋白10mg，继续40摄氏度水浴搅拌，每隔2小时取样，使用实施例4中所述方法测定样品中(10E,12Z)-CLA含量，反应28小时后(10E,12Z)-CLA含量达到最高，此时反应体系中含有(10E,12Z)-CLA 2838mg，LA 5715mg，转化率42.8％，得率28.3％。

实施例6

使用实施例2所述方法，获得M62G/S295A突变酶蛋白76mg，酶活力为2515U/mg。

在250ml圆底烧瓶中加入80ml磷酸缓冲液(25mM、pH6.7)，10gLA，10ml吐温-80，40摄氏度水浴高速搅拌乳化1小时，停止乳化，加入纯化M62G/S295A突变酶蛋白10mg，继续40摄氏度水浴搅拌，每隔2小时取样，使用实施例4中所述方法测定样品中(10E,12Z)-CLA含量，反应10小时后(10E,12Z)-CLA含量达到最高，此时反应体系中含有(10E,12Z)-CLA 6542mg，LA 2876mg，转化率71.3％，得率65.4％。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州师范大学

<120> 一种亚油酸异构酶突变体及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 424

<212> PRT

<213> Ppionibacterium acnes

<400> 1

Met Ser Ile Ser Lys Asp Ser Arg Ile Ala Ile Ile Gly Ala Gly Pro

1 5 10 15

Ala Gly Leu Ala Ala Gly Met Tyr Leu Glu Gln Ala Gly Phe His Asp

20 25 30

Tyr Thr Ile Leu Glu Arg Thr Asp His Val Gly Gly Lys Cys His Ser

35 40 45

Pro Asn Tyr His Gly Arg Arg Tyr Glu Met Gly Ala Ile Met Gly Val

50 55 60

Pro Ser Tyr Asp Thr Ile Gln Glu Ile Met Asp Arg Thr Gly Asp Lys

65 70 75 80

Val Asp Gly Pro Lys Leu Arg Arg Glu Phe Leu His Glu Asp Gly Glu

85 90 95

Ile Tyr Val Pro Glu Lys Asp Pro Val Arg Gly Pro Gln Val Met Ala

100 105 110

Ala Val Gln Lys Leu Gly Gln Leu Leu Ala Thr Lys Tyr Gln Gly Tyr

115 120 125

Asp Ala Asn Gly His Tyr Asn Lys Val His Glu Asp Leu Met Leu Pro

130 135 140

Phe Asp Glu Phe Leu Ala Leu Asn Gly Cys Glu Ala Ala Arg Asp Leu

145 150 155 160

Trp Ile Asn Pro Phe Thr Ala Phe Gly Tyr Gly His Phe Asp Asn Val

165 170 175

Pro Ala Ala Tyr Val Leu Lys Tyr Leu Asp Phe Val Thr Met Met Ser

180 185 190

Phe Ala Lys Gly Asp Leu Trp Thr Trp Ala Asp Gly Thr Gln Ala Met

195 200 205

Phe Glu His Leu Asn Ala Thr Leu Glu His Pro Ala Glu Arg Asn Val

210 215 220

Asp Ile Thr Arg Ile Thr Arg Glu Asp Gly Lys Val His Ile His Thr

225 230 235 240

Thr Asp Trp Asp Arg Glu Ser Asp Val Leu Val Leu Thr Val Pro Leu

245 250 255

Glu Lys Phe Leu Asp Tyr Ser Asp Ala Asp Asp Asp Glu Arg Glu Tyr

260 265 270

Phe Ser Lys Ile Ile His Gln Gln Tyr Met Val Asp Ala Cys Leu Val

275 280 285

Lys Glu Tyr Pro Thr Ile Ser Gly Tyr Val Pro Asp Asn Met Arg Pro

290 295 300

Glu Arg Leu Gly His Val Met Val Tyr Tyr His Arg Trp Ala Asp Asp

305 310 315 320

Pro His Gln Ile Ile Thr Thr Tyr Leu Leu Arg Asn His Pro Asp Tyr

325 330 335

Ala Asp Lys Thr Gln Glu Glu Cys Arg Gln Met Val Leu Asp Asp Met

340 345 350

Glu Thr Phe Gly His Pro Val Glu Lys Ile Ile Glu Glu Gln Thr Trp

355 360 365

Tyr Tyr Phe Pro His Val Ser Ser Glu Asp Tyr Lys Ala Gly Trp Tyr

370 375 380

Glu Lys Val Glu Gly Met Gln Gly Arg Arg Asn Thr Phe Tyr Ala Gly

385 390 395 400

Glu Ile Met Ser Phe Gly Asn Phe Asp Glu Val Cys His Tyr Ser Lys

405 410 415

Asp Leu Val Thr Arg Phe Phe Val

420

<210> 2

<211> 1275

<212> DNA

<213> Ppionibacterium acnes

<400> 2

atgtccatct cgaaggattc acgtatcgcc atcatcgggg ctggcccggc cgggctggct 60

gccggaatgt acctcgaaca ggccggattt cacgactaca cgatcctgga acgcaccgac 120

cacgtcggag gcaagtgcca ctcaccgaac taccacggcc gtcgttatga gatgggggcc 180

atcatgggcg tccccagtta cgacaccatc caggagatca tggatcgcac tggcgacaag 240

gtcgacgggc cgaaactgcg tcgcgagttc ctgcacgagg acggcgagat ctacgtcccg 300

gaaaaggatc cagtgcgtgg tccgcaggtc atggcagcag tgcagaagct gggccagttg 360

ctcgcgacga agtaccaggg atatgacgcc aacggccact acaacaaggt tcacgaggac 420

ctcatgctgc ccttcgacga gttcctcgcc ctcaacgggt gcgaggccgc ccgagacctg 480

tggatcaacc ccttcacggc cttcggctac gggcacttcg acaacgtccc ggccgcctac 540

gtgctgaagt acctcgactt cgtcaccatg atgtcctttg ccaagggaga tctgtggacg 600

tgggccgacg gcacccaggc gatgttcgag cacctcaacg ccaccctgga gcacccggcc 660

gaacgcaacg ttgacatcac tcgcatcacc cgcgaggacg gcaaggtcca cattcacacc 720

acggactggg atcgcgagtc cgacgtcctc gtcctcaccg tcccgctgga aaagttcctc 780

gactactccg acgcggacga tgacgagcgg gagtacttct cgaagatcat ccaccagcag 840

tacatggtgg atgcctgcct ggtgaaggag tacccgacca tctccgggta cgtccccgac 900

aacatgaggc ccgaacgtct cgggcacgtc atggtttact accaccgctg ggctgatgat 960

ccgcaccaga tcatcacgac ctacctgcta cgtaaccatc cggactacgc ggacaagact 1020

caggaggagt gccgccagat ggtcctcgac gacatggaga ccttcggtca tccggtcgag 1080

aagatcatcg aggagcagac ctggtactac ttcccgcacg ttagctcgga ggactacaag 1140

gccgggtggt acgagaaggt cgagggaatg cagggtcgtc gcaacacctt ctacgccgga 1200

gaaattatga gtttcggtaa tttcgacgag gtgtgccact actcgaagga cctggtgacg 1260

cggttcttcg tgtga 1275