一株施氏假单胞菌及其应用的制作方法

本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株施氏假单胞菌及其应用。

背景技术：

水体中的氮主要以有机氮、氨氮和硝酸盐氮等形式存在，是导致水体富营养化、危害人体健康和破坏水体生态环境最为常见的污染物之一。农业氮肥、工业废水及城镇污水等的排放是水体中氮素的主要来源。如何经济、高效地去除水体中氮素污染己成为水污染控制领域的研究重点和热点。微生物具有来源广、繁殖快和适应环境能力强等特征，因此生物脱氮被认为是最为经济有效的方法。

传统的生物脱氮包括硝化和反硝化两个过程。硝化过程是硝化细菌在好氧条件下将氨转化为硝酸盐，反硝化过程是反硝化细菌在缺氧或厌氧条件下将硝酸盐还原的过程。目前为止，尽管传统生物脱氮是多数污水处理工艺的主要承担者，但仍存在着工艺复杂、基建费用高等缺点。近年来，越来越多的研究证明反硝化在好氧条件下也能实现。好氧反硝化技术的出现，可实现硝化与反硝化在同一构筑物中进行，基建和操作成本大幅下降。好氧反硝化的提出突破了传统物脱氮的定式思维，得到研究者的广泛关注，具有广阔的应用前景。

近年来，国内外专家学者们已相继分离出多种高效的好氧反硝化菌株，这为好氧反硝化菌株的广泛应用奠定了理论基础。专利CN201310680417.2 公开了一株具有好氧反硝化能力的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）在污水处理中的应用，该菌株可用于处理高硝酸盐废水，其对NO₃^--N最高去除率可达99.6%，且无NO₂^--N的累积，并可同时去除有机废水中的COD，去除率可达60%~80%。潘玉瑾等（好氧反硝化菌P. chengduensis ZPQ2的筛选及其反硝化条件优化，水污染防治，2015，07）从SBR反应器活性污泥中筛选出一株假单胞菌ZPQ2，经48 h培养，菌株ZPQ2对NO₃^--N和COD去除率分别达到93.4％和98.1％。杨先基等（一株好氧反硝化细菌的分离鉴定及反硝化能力，环境科学学报，2008，07）从活性污泥中分离出一株施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）G3，该菌在氧气充足的情况下，24 h内对NO₂^--N积累量为12.03 mg/l，对NO₃^--N的去除率为91.09％。由此可见，很多不同种属的假单胞菌株都具有高效的反硝化能力，在含氮废水处理领域有极大的应用潜力。

此外，目前几乎没有关于好氧反硝化细菌的自动聚集沉降性能方面的报道，因此，还亟待从环境中筛选此类细菌，并将其应用于含氮废水处理领域中，以期获得高效脱氮的同时实现高效的泥水分离效果。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一株具有自动聚集沉降能力的施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）XL-2。该菌株在好氧条件下实现好氧反硝化及快速泥水分离，适用于含硝态氮有机废水的处理。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一株施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）XL-2，于2016年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 13252。本发明施氏假单胞菌XL-2的16SrDNA基因序列见序列表，序列长度为1282bp，在GenBank中基因序列登录号为KY435925。

所述的施氏假单胞菌XL-2为直或稍弯的革兰氏阴性杆菌，无核，不形成芽孢，细菌大小为0.45×（1.2-2.3）μm；菌落为浅黄绿色，边缘不规则，表面有褶皱、湿润、半透明。

所述的施氏假单胞菌XL-2在好氧条件下，能以CH₃COONa为碳源、NO₃^--N为氮源进行好氧反硝化脱氮，且最终无中间产物NO₂^--N的积累；该菌株还具有自动聚集沉降能力，在高浓度含氮废水处理领域有很大的应用前景。

施氏假单胞菌XL-2在高浓度含氮废水处理领域时，所述废水COD/TN为13~53，较优条件为21~40。

施氏假单胞菌XL-2在高浓度含氮废水处理领域时，所述废水pH为5~10，较优条件为7~9。

施氏假单胞菌XL-2在高浓度含氮废水处理领域时，所述废水温度为20~40 ℃，较优条件为25~35 ℃。

施氏假单胞菌XL-2在高浓度含氮废水处理领域时，所述废水最优处理条件为废水COD/TN为21~40，pH值7~9，温度25~35 ℃。

施氏假单胞菌XL-2在高浓度含氮废水处理领域时所述菌株XL-2在5 min内的自动聚集沉降率为22.6%，在150 min内的最大自动聚集沉降度为60.2%，能快速实现泥水分离。

与现有的技术相比，本发明具有如下有益效果：

1、在好氧条件下，施氏假单胞菌株XL-2能利用高浓度的NO₃^--N进行好氧反硝化，20 h内对NO₃^--N去除率高达95.5%，TN去除率84.8%，COD去除率为74.5%，且最终无中间产物NO₂^--N的积累。该菌株能实现废水中氮素和碳素的高效同时去除，在含氮废水处理领域有广泛应用前景。

2、施氏假单胞菌株XL-2在生长过程中能自发聚集沉降，5 min内的自动聚集沉降率为22.6%，150 min内最大自动聚集沉降度为60.2%，能实现泥水快速分离。

附图说明

图1为施氏假单胞菌XL-2自沉聚集体扫描电镜图；

图2为施氏假单胞菌XL-2以NO₃^--N为氮源、CH₃COONa为碳源时的生长曲线及COD降解图；

图3为施氏假单胞菌XL-2以NO₃^--N为氮源、CH₃COONa为碳源时的TN、NO₃^--N、NO₂^--N变化曲线；

图4为施氏假单胞菌XL-2自动聚集沉降能力随沉降时间变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

本发明菌株XL-2从重庆市鸡冠石污水厂A²/O二沉池的活性污泥中分离并通过稀释平板划线方法纯化所得，具有高效好氧反硝化脱氮性能。

实施例一：细菌的分离及鉴定

1、细菌的分离及纯化

细菌的选择性筛选：将取回的活性污泥5 ml，接种于装有100 ml无菌水的锥形瓶中，并在其中加入一定量的玻璃珠以起到分散活性污泥的作用。然后，将锥形瓶置于120 rpm恒温振荡摇床振荡1 h，得到分散均匀的细菌悬浮液。再吸取1 ml细菌悬浮液到100 ml的硝酸盐液体培养基中，120 rpm、30 ℃恒温驯化48 h。然后再取培养后的细菌悬浮液（1 ml）转移到含有100 mg/l的硝酸盐液体培养基中进行二次选择驯化，120 rpm、30 ℃恒温驯化48 h。经过三次选择培养后，将细菌培养液接种到LB培养基中富集培养12~24 h。

细菌的分离和纯化：将富集培养后的细菌培养液用无菌水进行梯度稀释成10^-1~10^-6，然后将稀释倍数为10^-3~10^-6的细菌培养液分别涂布于含硝酸盐固体培养基的平板上，倒置培养2~3 d；然后用接种环小心挑取平板中菌落颜色、大小、形状不同的单个菌落分别接种于硝酸盐液体培养基中，培养48 h后测定硝酸盐液体培养基中NO₃^--N和TN的去除效果；选取NO₃^--N和TN的去除效果较好的培养液，再稀释一定梯度后平板划线于硝酸盐固体培养基上，倒置培养2~3 d；再用接种环挑取硝酸盐固体培养基上的单个菌落接种于硝酸盐液体培养基，培养48 h后测定硝酸盐液体培养基中NO₃^--N和TN的去除效果；此后经过反复平板划线，再检验NO₃^--N和TN的去除效果，直至NO₃^--N和TN的去除效果达到稳定为止。

将NO₃^--N和TN去除效果最好的单一菌株进行16S rDNA基因测序鉴定，将测序结果与GenBank中已有细菌的序列进行比对，比对结果与Pseudomonas stutzeri相似度最高，故该菌株命名为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）XL-2。

上述涉及的培养基为：

LB培养基：蛋白胨10 g/l、酵母浸出粉5 g/l、NaCl 5 g/l、NaH₂PO₄·2H₂O和Na₂HPO₄·12H₂O调节pH至7~8。

硝酸盐固体培养基：KNO₃ 0.722 g/l、CH₃COONa 3.418 g/l、NaCl 4 g/l、琼脂粉15-20 g/l、微量元素3 ml/L、NaH₂PO₄·2H₂O和Na₂HPO₄·12H₂O调节pH至7~8。

硝酸盐液体培养基：KNO₃ 0.722 g/l、CH₃COONa 3.418 g/l、NaCl 4 g/l、微量元素3 ml/l、NaH₂PO₄·2H₂O和Na₂HPO₄·12H₂O调节pH至7~8。

所述微量元素溶液为：MgSO₄·7H₂O 3 g/l、MnSO₄·H₂O 3.36 g/l、H₃BO₃ 1.12 g/l、ZnSO₄·7H₂O 3 g/l、FeSO₄·7H2O 0.3 g/l和CaCl₂ 0.6 g/l。

上述液体培养条件为恒温30 ℃、摇床转速为120 rpm；固体平板培养条件为恒温30 ℃。

2、细菌的鉴定：

本发明中施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）XL-2为直或稍弯的革兰氏阴性杆菌，无核，不形成芽孢，细菌大小为0.45×（1.2-2.3）μm；菌落为浅黄绿色，边缘不规则，表面有褶皱、湿润、半透明。

该菌的16S rDNA基因序列见序列表，序列长度为1282bp，在GenBank中基因序列登录号为KY435925。序列结果与GenBank中已有细菌的序列进行比对，比对结果与Pseudomonas stutzeri相似度高达99%，故该菌命名为施氏假单胞菌（Pseudomonas stutzeri）XL-2。于2016年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 13252。

实施例二：施氏假单胞菌株XL-2对废水中NO₃^--N、TN、COD的去除效果

施氏假单胞菌株XL-2以NO₃^--N为唯一氮源、CH₃COONa为唯一碳源时，考察废水中NO₃^--N、TN、COD的降解情况及NO₂^--N的积累情况。初始COD浓度为2971 mg/l，初始TN为103 mg/l，初始NO₃^--N浓度为89 mg/l。在30 ℃、120 rpm摇床中连续培养72 h，并相隔一定时间取样。详细结果见图2及图3。前20 h，菌株处于对数生长期，生长迅速；20 h时，菌株OD₆₀₀（溶液在600 nm波长处的吸光值）为0.761；36 h后，细菌生长达到稳定期，OD₆₀₀稳定在0.9左右。20 h内菌株XL-2对NO₃^--N去除率高达95.5%，TN去除率为84.8%，COD去除率为74.5%，并且最终无中间产物NO₂^--N的积累。

实施三：施氏假单胞菌株XL-2自动聚集沉降效果分析

施氏假单胞菌株XL-2以NO₃^--N为唯一氮源、CH₃COONa为唯一碳源时，考察菌株在培养12 h时的自动聚集沉降能力。

菌株的自动聚集能力以百分比表示。其测定方法为：细菌经硝酸盐液体培养基适当培养后，调菌悬液OD₆₀₀至1.0，涡漩振荡2 min后，取4 ml振荡后的培养液测定其在600 nm处的吸光值作为整个细菌悬浮液吸光值，然后于30 ℃静止放置，分别在处理后的5 min，15 min，30 min，60 min，90 min，120 min，150 min和180 min取上层清液转移至另一洁净试管内，在600 nm处测定上层清液吸光值。每组取8个平行。

通过以下公式计算：

自动聚集能力(％)=(1-上层清液吸光值／整个细菌悬浮液吸光值)×100

菌株XL-2的自动聚集沉降率随沉降时间的变化如图4所示。结果表明菌株XL-2在5 min内的自动聚集沉降度为22.6%，在150 min内最大自动聚集沉降度为60.2%。同时，通过扫描电镜可观察到菌株XL-2的沉降聚集体（图1）。由此可见，菌株在培养过程中能快速实现菌水分离，在实际含氮废水处理领域中具有很大的应用潜力。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 重庆大学

<120> 一株施氏假单胞菌及其应用

<130> 说明书

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1282

<212> DNA

<213> Pseudomonas stutzeri XL-2

<400> 1

ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgtgaca ttctgattca cgattactag 60

cgattccgac ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc ggactacgat cggttttatg 120

ggattagctc cacctcgcgg cttggcaacc ctttgtaccg accattgtag cacgtgtgta 180

gcccaggccg taagggccat gatgacttga cgtcatcccc accttcctcc ggtttgtcac 240

cggcagtctc cttagagtgc ccaccttaac gtgctggtaa ctaaggacaa gggttgcgct 300

cgttacggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat gcagcacctg 360

tgtcagagtt cccgaaggca ccaatccatc tctggaaagt tctctgcatg tcaaggcctg 420

gtaaggttct tcgcgttgct tcgaattaaa ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc 480

gtcaattcat ttgagtttta accttgcggc cgtactcccc aggcggtcga cttaatgcgt 540

tagctgcgcc actaagatct caaggatccc aacggctagt cgacatcgtt tacggcgtgg 600

actaccaggg tatctaatcc tgtttgctcc ccacgctttc gcacctcagt gtcagtatta 660

gcccaggtgg tcgccttcgc cactggtgtt ccttcctata tctacgcatt tcaccgctac 720

acaggaaatt ccaccaccct ctgccatact ctagctcgcc agttttggat gcagttccca 780

ggttgagccc ggggctttca catccaactt aacgaaccac ctacgcgcgc tttacgccca 840

gtaattccga ttaacgcttg cacccttcgt attaccgcgg ctgctggcac gaagttagcc 900

ggtgcttatt ctgttggtaa cgtcaaaaca gcaaggtatt aacttactgc ccttcctccc 960

aacttaaagt gctttacaat ccgaagacct tcttcacaca cgcggcatgg ctggatcagg 1020

ctttcgccca ttgtccaata ttccccactg ctgcctcccg taggagtctg gaccgtgtct 1080

cagttccagt gtgactgatc atcctctcag accagttacg gatcgtcgcc ttggtgagcc 1140

tttacctcac caactagcta atccgaccta ggctcatctg atagcgtgag gtccgaagat 1200

cccccacttt ctcccgtagg acgtatgcgg tattagcgtt cctttcgaaa cgttgtcccc 1260

cactaccagg cagattccta gg 1282