本领域属于微生物及发酵工程技术领域，具体涉及一株发酵生产(3r)-乙偶姻的枯草芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
乙偶姻(acetoin)，又名3-羟基-2-丁酮(3-hydroxybutanone)，是一种重要的天然香料，在白酒、蜂蜜、草莓、黄油等物质中都存在。由于手性碳原子的存在，乙偶姻具有两种立体异构体，(3r)-乙偶姻和(3s)-乙偶姻。单一的乙偶姻异构体在不对称合成领域具有广泛用途，可作为药物合成的中间体，也可用于合成具有光学活性的α-羟基酮类衍生物。
乙偶姻的生产方法主要有化学合成法和微生物发酵法。根据国标的规定，化学法合成得到的乙偶姻为合成香料，微生物发酵法获得的乙偶姻属于天然香料，二者的市场价格存在巨大差距。而且，化学合成的乙偶姻为外消旋混合物，而微生物发酵法可以获得以某一异构体为主的产物，所以近年来微生物发酵法生产乙偶姻的研究颇受关注。
自然界可产乙偶姻的微生物很多，其中产量较高且生物安全的菌种主要有芽孢杆菌和多粘类芽孢杆菌。总所周知，天然菌株具有遗传性能稳定的特点，工业上用的菌种大部分都是天然菌种或是自然突变筛选得到的菌种。因此，近年来发酵法生产乙偶姻的研究主要集中于天然菌株的筛选及其改造，目标以提高乙偶姻总产量为主，而单一构型乙偶姻的生产研究较少。以葡萄糖为碳源，利用生物安全的天然菌株或基因工程改造菌株发酵乙偶姻时高产菌株的乙偶姻产量通常在70g/l以上。例如，b.amyloliquefaciense-11发酵可产71.5g/l乙偶姻，生产强度1.63g/(l·h)(processbiochem.2014,49：1223–1230)；2,3-丁二醇脱氢酶过表达的b.subtilisjna3-10发酵可产73.6g/l乙偶姻，生产强度为0.77g/(l·h)(plosone2014,9(3):e91187)。但是所述菌株生产的乙偶姻为两种构型的混合物，目前还没有能够发酵生产高纯度、高含量单一构型乙偶姻的天然菌株。
在单一构型乙偶姻的生产方面，已有一些基因改造菌或人工构建的大肠杆菌基因工程菌发酵的相关专利，例如cn101565685b、cn102296094b、cn103388009b。这些菌生产的单一构型的乙偶姻浓度不高，普遍低于40g/l。2015年xu等发文报道了一株人工构建的大肠杆菌基因工程菌，将来自serratiamarcescens的budrab基因和lactobacillusbrevis的nadh氧化酶基因导入大肠杆菌，(3r)-乙偶姻的最高浓度为60.3g/l，立体异构体纯度为97.3％(j.chem.technol.biotechnol.2015,90:93–100)，但这些菌株均为基因工程菌，存在遗传性不稳定的缺点。
综上所述，目前缺少产单一构型乙偶姻的天然菌株，获得产高浓度、高立体异构体纯度的乙偶姻的天然生物安全菌株对于工业化生产具有重要意义。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一株高产(3r)-乙偶姻的天然菌株。
本发明提供一株高产(3r)-乙偶姻的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)dl11-11，已于2016年10月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(中国科学院微生物研究所，邮编100101)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌株dl11-11的保藏号为cgmccno.13141。
本发明以来自大连海域的海泥为土样，从中筛选到一株产(3r)-乙偶姻的枯草芽孢杆菌，再经乙偶姻驯化，最终得到一株高产(3r)-乙偶姻的枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)dl11-11，利用该菌株发酵生产高纯度(3r)-乙偶姻，发酵液中(3r)-乙偶姻纯度高达96.5％，(3r)-乙偶姻生产强度达到1.1g/(l·h)，乙偶姻总浓度最高可达78.7g/l。
枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)dl11-11具有下述性质：
1、菌落形态学特征：在lb营养琼脂上，37℃培养24h出现直径为1.5～2.5mm的菌落，菌落呈圆形、光滑、透明；继续培养至48h，菌落直径增加至6～8mm，表面透明、光滑，边缘不整齐；继续培养，菌落逐渐变呈白色，表面变得粗糙、干燥，中央凸起有褶皱。
2、生理与生化特性：a.革兰氏染色阳性，产芽孢，好氧；b.耐较高浓度的葡萄糖和氯化钠；c.培养温度：25～39℃，最适温度为37℃；d.可在ph5.5～7.2范围内生长。
3、菌种16srdna鉴定：经过对该菌的16srdna序列的测定，通过与ncbi数据库比对，结果显示与已知芽孢杆菌属的同源性大于99％，结合生理生化特性鉴定该菌为枯草芽孢杆菌。
本发明还提供利用所述的枯草芽孢杆菌dl11-11发酵生产(3r)-乙偶姻的方法，其具体的步骤为：将菌株接种于种子培养基，37℃摇床培养12～20h，然后接种于含碳源、氮源和无机盐的发酵培养基中发酵生产(3r)-乙偶姻。其中，所述种子培养基含有20～40g/l葡萄糖、0.5～1.5g/l酵母粉、2～6g/l(nh4)2hpo4、2～8g/lk2hpo4、0.05～0.2g/lmgso4。发酵培养基的碳源为葡萄糖或糖蜜，其浓度为100～180g/l，优选120～140g/l；氮源包括有机氮源和无机氮源，其中的有机氮源为玉米浆干粉、酵母粉、蛋白胨中的一种或几种，其浓度为1～5g/l，优选1.5～3g/l，无机氮源为硫酸铵、磷酸氢二铵、尿素中的一种或几种，浓度为3～15g/l，优选5～10g/l；无机盐为磷酸盐和硫酸盐中任意一种或几种，其中磷酸盐的浓度为1～10g/l,优选2～8g/l；硫酸盐的浓度为0.05～5g/l，优选0.2～1g/l。
在上述利用菌株dl11-11发酵生产(3r)-乙偶姻的方法中，所述的发酵生产条件为：菌株种子培养液的接种量5～20％(v/v)，优选10～15％(v/v)；发酵初始ph为5.5～7.2，优选6.5～7.0；通气量0.15～0.35vvm，优选0.2～0.3vvm；发酵温度30～39℃，优选35～38℃；培养时间55～80h，优选58～72h。
本发明的有益效果：
1)本发明的菌株dl11-11为枯草芽孢杆菌，属于生物安全菌种，该菌从海泥中筛选得到，属于天然菌株，具有遗传稳定性高、不易丢失的优点，有利于工业化应用。
2)本发明筛选到的菌株dl11-11生产(3r)-乙偶姻时发酵液中(3r)-乙偶姻的立体异构体纯度达96.5％，(3r)-乙偶姻浓度达到63.8g/l，生产强度达到1.1g/(l·h)，目前还没有如此高立体异构体纯度、产物浓度和生产强度的产(3r)-乙偶姻的天然生物安全菌株。
3)本发明筛选到的菌株dl11-11也可用于生产乙偶姻，其浓度高于已知的天然菌株。
4)本发明筛选到的菌株dl11-11在发酵过程中所需的通气量为0.15～0.35vvm，远低于常规枯草芽孢杆菌1.0vvm左右的通气量，降低了设备需求，有利于工业化。
附图说明
图1为利用菌株dl11-11发酵生产(3r)-乙偶姻58小时时发酵液的气相色谱图。按照出峰先后顺序，图中的5个峰依次为：溶剂、内标、(3r)-乙偶姻(10.156min)、meso-2,3-丁二醇(11.278min)、(3s)-乙偶姻(12.421min)。
具体实施方式
下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述实施例中，如无特殊说明，所使用的实验方法均为常规方法，所用试剂等均可从化学或生物试剂公司购买。
以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施方式。
以下实施例中使用的分析方法如下：
乙偶姻采用agilent7890agc分析，gc条件为：氢火焰检测器220℃，进样口温度210℃，载气n2，程序升温。色谱柱：bgb-174,30m×0.25mmi.d.0.25μmdf(p/n:27430-025)。发酵液中葡萄糖浓度采用生物传感分析仪(sba-50，山东省科学院生物研究所)分析。
以下实施例中采用的种子培养基和发酵培养基如下：
种子培养基：葡萄糖40g/l；酵母粉1.5g/l；(nh4)2hpo46g/l；k2hpo48g/l；mgso40.2g/l；微量元素溶液3ml(feso40.4g/l；mncl2·4h2o5g/l；znso4·7h200.1g/l；h3bo30.8g/l；cuso4·5h2o0.04g/l；namoo4·2h2o0.04g/l；cocl2·6h2o0.06g/l；cacl20.75g/l)；ph7.0。
发酵培养基：葡萄糖120g/l；酵母粉1.5g/l；(nh4)2hpo49g/l；k2hpo48g/l；mgso40.2g/l；微量元素溶液3ml(组成同种子培养基)；ph7.0。
种子培养基与发酵培养基均在115℃高压灭菌锅中灭菌15min，且葡萄糖与无机盐分开灭菌。
实施例1菌株的筛选
从辽宁省大连市黑石礁、星海公园、金石滩等地区采集海泥样品。将上述样品分别加入到无菌水中，快速搅拌并自然沉降10min，然后取上清液接入上述种子培养基中进行富集培养，37℃、200rpm摇瓶培养72h。对培养液进行梯度稀释，涂布到添加琼脂的上述种子培养基平板上，在37℃培养24h。挑取单菌落，分别接种到上述发酵培养基中，在37℃摇瓶培养48h，气相色谱检测产物，得到一株产(3r)-乙偶姻的菌株。该菌株用含10g/l乙偶姻的发酵培养基进行驯化，37℃、200rpm摇瓶培养24h，然后梯度稀释涂布到添加琼脂的上述种子培养基平板上，在37℃培养24h。挑取单菌落，分别接种到上述发酵培养基中进行复筛，其中高产的菌株经多次划线分离纯化得到纯的菌株，命名为dl11-11。采用斜面传代法、低温甘油法等常规方法保存备用。
实施例2菌株的鉴定
将实施例1得到的菌株dl11-11生理生化检验结果如下：
1、菌落形态学特征：在lb营养琼脂上，37℃培养24h出现直径为1.5～2.5mm的菌落，菌落呈圆形、光滑、透明；继续培养至48h，菌落直径增加至6～8mm，表面透明、光滑，边缘不整齐；继续培养，菌落逐渐变呈白色，表面变得粗糙、干燥，中央凸起有褶皱。
2、生理与生化特性：a.革兰氏染色阳性，产芽孢，好氧；b.耐较高浓度的葡萄糖和氯化钠；c.培养温度：25～39℃，最适温度为37℃；d.可在ph5.5～7.2范围内生长。
3、菌种16srdna鉴定：经过对该菌的16srdna序列的测定，通过与ncbi数据库比对，结果显示与已知芽孢杆菌属的同源性大于99％，结合生理生化特性鉴定该菌为枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。
枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)dl11-11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmcc-no.13141。
实施例3利用菌株dl11-11发酵生产(3r)-乙偶姻
将保存于20％甘油的菌株dl11-11菌液按2.5％接种于lb培养基中进行活化培养，37℃、200rpm摇床培养12h。将活化菌种按2％接种于种子培养基中，37℃、200rpm摇床培养12h。将200ml液体种子接种于含1.8l发酵培养基的5l机械搅拌发酵罐中进行批式补料发酵，温度37℃，转速250rpm，通气0.2vvm，ph自动降至ph5.9后维持恒定，在34小时补葡萄糖200g，58h发酵结束。发酵液含2,3-丁二醇8.6g/l，(3r)-乙偶姻63.8g/l，(3s)-乙偶姻2.3g/l，(3r)-乙偶姻的立体异构体纯度为96.5％(气相色谱图见图1)，生产强度为1.1g/(l·h)。
实施例4利用菌株dl11-11发酵生产乙偶姻
将保存于20％甘油的菌株dl11-11菌液按2.5％接种于lb培养基中进行活化培养，37℃、200rpm摇床培养12h。将活化菌种按2％接种于种子培养基中，37℃、200rpm摇床培养12h。将200ml液体种子接种于含1.8l发酵培养基的5l机械搅拌发酵罐中进行批式补料发酵，温度37℃，转速250rpm，通气0.2vvm，ph自动降至ph5.9后维持恒定，在34h、58h分别补加葡萄糖200g和108g，72h发酵结束。发酵液含2,3-丁二醇12.4g/l，(3r)-乙偶姻为70.9g/l，乙偶姻总浓度为78.7g/l，生产强度为1.09g/(l·h)。