一种苏云金芽孢杆菌及其应用的制作方法
本申请涉及苏云金芽孢杆菌，其对植物的真菌病害具有预防和/或减轻的效果。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis,bt)是一种广泛分布于自然界的革兰氏阳性菌。现有技术中对其的研究主要集中在杀虫功能上。
然而，苏云金芽孢杆菌对微生物，例如真菌或细菌的抑菌报道较少；通过其诱导植物产生抗病性的报道也鲜见。
技术实现要素：
申请人在筛选细菌杀虫功能的情况下，意外的发现了一株能够高效诱导植物产生抗病性的新菌株，该菌株被定名为ippbiotsr045。经过常规的形态学鉴定以及多位点序列分型和进一步的系统发育分析，确定该菌株在分类学上属于苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)。
由于苏云金芽孢杆菌对人畜安全无毒、对环境友好等优点，其为生物预防和/或减轻植物病害的发生提供了一种有效的方法。本申请的苏云金芽孢杆菌菌株ippbiotsr045应用于生产，可以达到成本低、有效预防和/或减轻植物病害的目的。同时，由于ippbiotsr045为野生菌株，相比于工程菌株，其作为药剂开发省去了环境安全性评价等环节，因此，较通过工程菌和/或转基因植物来预防和/或减轻植物病害具有不言而喻的优势。虽然本申请的野生菌株ippbiotsr045并不在于否定工程菌菌株的可应用性，然而在转基因倍受部分群体质疑的当下，野生菌更容易获得公众在安全性方面的认可，因而作为野生型菌株的ippbiotsr045在这方面具有独特的优势。
因此，本申请之一提供了一种苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)，该菌株被定名为ippbiotsr045，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13302。
对ippbiotsr045遗传改良后得到的工程菌可以赋予其更优和/或更多的性能，例如可以结合菌株自身的特性，根据实际应用增加和/或拓宽其诱导植物的抗病性能，使其兼具抗菌的性能，使其具有杀虫和/或抗虫的性能。即通过对ippbiotsr045遗传改良，使其兼具如上性能中的至少一种。由于该工程菌株以苏云金芽孢杆菌ippbiotsr045为改造对象(即)，向其中转入和/或敲除特定的基因和/或序列等，因此，该菌株仍然为苏云金芽孢杆菌。因此，本申请之二提供了一种对本申请之一所述的苏云金芽孢杆菌进行遗传改良后得到的工程菌。如上所述，虽然转基因倍受部分群体质疑，然而将苏云金芽孢杆菌进行遗传改良后得到的工程菌并不直接供人类或动物食用。而且在将其投放市场进行商业化之前，需要首先通过国家有关部门的安全性评价，以避免产生安全性问题。根据工程菌的安全性结论以及国家有关部门的批准，然后对其合理使用。
本申请之三提供了一种组合物，所述组合物包含如本申请之一所述的苏云金芽孢杆菌和/或如本申请之二所述的工程菌。
在一个具体实施方式中，所述组合物可以为固态形式，也可以为液态形式。所述组合物还可以包含与本申请的苏云金芽孢杆菌具有增效作用的其他物质。例如该物质可以是微生物来源诱导植物能够产生抗病的物质，也可以是诱导植物能够产生抗病的化合物，还可以是诱导植物能够产生抗病的其他微生物等等；再如该物质可以是微生物来源抑菌物质，也可以是抑菌化合物，还可以是具有抑菌作用的其他微生物等等。所述组合物进一步可以包括与本申请的苏云金芽孢杆菌相配合的辅剂、增稠剂、分散剂和/或能使所述芽孢杆菌增殖的营养组分，例如所述辅剂可以选自棉子油、蓖麻油、桐油、液体石蜡、豆油、a1、a2、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等中的至少一种；增稠剂有膨润土、硬脂酸铝、qh凝胶、龙胶粉、f1、黄原胶等中的至少一种：分散剂有拉开粉、nno、lfs、b1、碳黑等中的至少一种。
本申请之四提供了一种农药制剂，所述农药制剂包含如本申请之一所述的苏云金芽孢杆菌、本申请之二所述的工程菌和本申请之三所述的组合物中的至少一种。在一个具体实施方式中，所述农药制剂可以为固态形式，也可以为液态形式。所述农药制剂还可以包含与本申请的苏云金芽孢杆菌具有增效作用的其他物质。例如该物质可以是微生物来源诱导植物能够产生抗病的物质，也可以是诱导植物能够产生抗病的化合物，还可以是诱导植物能够产生抗病的其他微生物等等；再如该物质可以是微生物来源抑菌物质，也可以是抑菌化合物，还可以是具有抑菌作用的其他微生物等等。所述农药制剂进一步可以包括与本申请的苏云金芽孢杆菌相配合的辅剂、增稠剂和分散剂中的至少一种，例如所述辅剂可以选自棉子油、蓖麻油、桐油、液体石蜡、豆油、a1、a2、邻苯二甲酸二甲酯、邻苯二甲酸二丁酯等中的至少一种；增稠剂有膨润土、硬脂酸铝、qh凝胶、龙胶粉、f1、黄原胶等中的至少一种：分散剂有拉开粉、nno、lfs、b1、碳黑等中的至少一种。
在一个具体实施方式中，所述农药制剂的剂型为悬浮剂、油悬剂、粉剂、可湿性粉剂和颗粒剂中的至少一种。
本申请之五提供了如本申请之一所述的苏云金芽孢杆菌、如本申请之二所述的工程菌、如本申请之三所述的组合物以及如本申请之四所述的农药制剂中的至少一种的应用。
在一个具体实施方式中，所述苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种用于预防和/或减轻植物的真菌病害。
本领域的技术人员公知，核盘菌属(sclerotinia)真菌是危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌，其能够引起植物的菌核病、软腐病、湿腐病、猝倒病和白杆等至少60种病害。核盘菌属(sclerotinia)的真菌可以广泛地侵染很多单子叶和双子叶植物，例如包括单子叶植物中的洋葱和郁金香等。核盘菌属(sclerotinia)中最为典型的病原菌当属核盘菌(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)。核盘菌(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)能够侵染包括野生植物和农作物在内的75科278属408种或亚种植物。核盘菌(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)的寄主包括单子叶和双子叶植物，其中，例如包括双子叶植物中的油料作物(如油菜、向日葵、大豆和花生等)、叶类和蔬菜作物(如小白菜、烟草、萬苣、番琉、前子、豌豆和扁豆等)、观赏植物(如一品红等)以及水果类植物(如梨、蓝蕃和草蕃等)。目前对核盘菌属(sclerotinia)引起的病害防治主要依靠化学农药，然而化学防治不仅成本高、污染环境，而且防效也不理想；同时，食品的安全性也受到严重影响。为了克服化学农药的缺陷，可以用所述苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种来预防和/或减轻由核盘菌属(sclerotinia)真菌引起的植物病害。
因此，在一个具体实施方式中，所述真菌病害为菌核病、软腐病、湿腐病、猝倒病和白杆中的至少一种。
在一个优选地具体实施方式中，所述真菌病害为菌核病。
在一个具体实施方式中，所述真菌病害的病原菌为核盘菌属(sclerotinia)真菌中的至少一种。
在一个优选地具体实施方式中，所述真菌病害的病原菌为核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)。
在一个具体实施方式中，所述苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种用于预防和/或减轻具有bnhel基因的植物上发生的真菌病害。
在一个具体实施方式中，所述苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种用于预防和/或减轻单子叶植物和/或双子叶植物上发生的真菌病害。例如，所述单子叶植物为具有bnhel基因的单子叶植物；所述双子叶植物为具有bnhel基因的双子叶植物。
在一个具体实施方式中，所述苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种用于预防和/或减轻草本植物上发生的真菌病害。例如，所述草本植物为具有bnhel基因的草本植物。
在一个具体实施方式中，所述苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种用于预防和/或减轻十字花科植物上发生的真菌病害。
在一个优选地具体实施方式中，所述十字花科植物选自芸薹属(brassica)植物和萝卜属(raphanus)植物中的至少一种。
在一个更优选地具体实施方式中，所述芸薹属植物选自油菜(brassicacampestris)、大白菜(brassicarapa)、小白菜(brassicachinensis)和甘蓝(brassicaoleracea)中的至少一种。其中甘蓝(brassicaoleracea)可以包括结球甘蓝(brassicaoleraceal.var.capitatal)、羽衣甘蓝(brassicaoleraceavar.acephalaf.tricolor)、抱子甘蓝(brassicaoleraceavar.gemmifera)、芥蓝(brassicaoleraceavar.albiflorakuntze)、花椰菜(brassicaoleraceal.var.botrytisl.)、青花菜(brassicaoleraceal.var.italicplanch)中的至少一个变种。
其中，举例来说明防治油菜病害的重要性。油菜是中国主要的油料作物，油菜菌核病是油菜生产中的重要病害之一，常年株发病率高达10％至30％，严重的达80％以上；病株一般减产10％至70％。通过利用本申请的所述苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种可以有效预防和/或减轻油菜菌核病。
根据植物病害的流行病学及预测，一般可以确定真菌病害的流行性发生情况，包括真菌病害发生的作物、时间和地点。据此，可以在真菌病害发生之前进行对植物进行处理，以达到防病和/或减轻病害发生的目的。因此，在一个具体实施方式中，在所述植物发病之前，施用至少一次所述苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种。
在一个具体实施例中，苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种施用于准备种植所述植物的环境，或生长有所述植物的环境中。
随着现代农业的兴起，传统依赖于土地的种植方式受到了不同程度的挑战，植物的种植，特别是蔬菜的种植已经在向无土化栽培方向发展，但植物生长所赖以的养分等因素仍是必不可少的。因此，依据真菌病害中土传病害和种传病害的传播特性，苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种除了可以施向种植所述植物的传统的土壤，还可以施向无土栽培基质等用于维持所述植物用根汲取营养的基质。当然本领域的人员能够理解，依据真菌病害中气传病害和介体传病害等的传播特性，向生长的植物的叶、茎、花、果实、谷粒、种子、树干和根喷施苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种也能够达到一定的目的，因此，也可以向所述植物的叶片喷施苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种。
因此，在一个具体实施例中，准备种植植物的环境，或生长有所述植物的环境包括土壤、无土栽培基质和植物生长营养液中的至少一种。
在一个具体实施例中，苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种施用于所述植物的植株；其中所述植包括草本植物和/或木本植物；草本植物的植株包括根、茎、叶、花、果实和种子中的至少一部分；木本植物的植株包括根、主干、侧枝、叶、花、果实和种子中的至少一部分。
在一个具体实施例中，通过喷洒施用所述苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种。
在一个具体实施例中，通过喷洒，机械掺和，通过与肥料、强化剂混合或者作为预混剂而施用所述苏云金芽孢杆菌、所述工程菌、所述组合物和所述农药制剂中的至少一种于所述准备种植植物的环境，或生长有所述植物的环境。
在本申请中没有特殊说明的情况下，本申请中的术语均属于现有技术中所指的通用术语。
附图说明
图1为接入病原菌7天时，ippbiotsr045菌株与空白对照组处理后的油菜照相图片。其中，图中上面的一行油菜为空白对照组；下面的一行为ippbiotsr045菌株处理组。
图2为bnhel基因的相对转录水平。
图3为ippbiotsr045的mega软件构建系统发育树。
菌株保藏
本申请筛选的微生物被定名为ippbiotsr045(本申请中的编号)，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13302，保藏日期为2016年11月15日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本申请做以下详细说明。但这些实施例仅是范例性的，并不对本申请的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本申请的精神和范围下可以对本申请技术方案的细节和形式进行修改和替换，但这些修改和替换均落入本申请的保护范围内。
培养基：bt培养使用lb液体培养基(胰蛋白胨10.0g/l，酵母提取物5.0g/l，nacl10.0g/l，121℃灭菌20min)，lb固体培养基(lb液体培养基加琼脂15g/l)。病原真菌培养使用pda固体培养基，购自北京冰达生物科技有限公司。
实施例1
菌株的分离与鉴定
使用lb固体培养基对2015年5月在北京香山采集的土样进行芽孢杆菌筛选与分离。首先利用无菌水对土样进行梯度稀释，然后将系列稀释的样品置于70℃的水浴锅中10分钟，在无菌条件下取100微升的不同梯度下的稀释液涂布于lb固体平板上，并于30℃培养16-48小时，对菌落形态为无粘液、湿润、厚实且菌落外沿稍有扩散而不很整齐的菌落进行纯化，然后保藏纯化出的单菌落，以备用于后续的菌种鉴定和生物活性分析。
对纯化的单菌落在30℃条件下lb培养，不同时间取样镜检观察菌落形态特征、晶体特征等。在lb培养基上培养不同阶段观察结果如下，营养体：呈杆状，两端钝圆，大小约1.0×0.5μm至1.5×0.5μm；单个或两个以上呈链状存在。芽孢：椭圆形，大小约1.0×0.5μm至1.3×0.5μm，为休眠体；对高温或者干燥等不良环境有较强的抵抗力。伴孢晶体：球形、菱形和方形等。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著，科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌形态特征基本一致，初步判断具有这种形态菌落的菌株属于苏云金芽孢杆菌。对分离的菌株进行编号。
实施例2
活性测定
病原真菌：核盘菌(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)由武汉科诺公司提供。
根据实施例1分离的164株bt野生菌株。
供试植物：白菜型油菜(brassicacampestrisl.)，品种为新四月蔓，栽培用土为营养土：蛭石＝2:1，光照时间14h(7,000lux)，黑暗时间10h种植时间约30天，种植地点在中国农业科学院植物保护研究所温室。
bt菌株抑菌活性的检测：以164株野生bt菌株和5株实验室常用菌株(bt185、g03、hd73、hd73-和hbf-18)为出发菌株，首先以核盘菌为指示菌，通过平板对峙实验排除其中能产生抑菌活性物质的菌株。通过该实验共排除了12株能产生抑菌活性物质菌株，随后对剩余的142菌株进行诱导活性的检测。
诱导活性bt菌株的筛选：对于经过bt抑菌活性分析后剩余的142株bt菌，分别取10μlbt甘油菌液加入1ml的lb液体培养基，于2ml离心管中，30℃，220r/min，震荡培养12h。上述活化后的菌液1％转接于20mllb液体培养基，30℃，220r/min，震荡培养24h。将上述菌液移入50ml离心管中，4℃、10000r/min，离心5min，弃上清，取10ml的无菌水将沉淀悬浮均匀形成菌悬液。
从每株菌的菌悬液中取100μl分别加入到900μl的无菌水中，混匀，依次稀释到10-7。取10-5、10-6、10-7三个稀释梯度的菌液各100μl涂板计数，三个重复，30℃培养箱培养过夜。菌落数在100-300之间视为有效梯度，本次实验有效梯度为10-6，根据平板计数法换算出各株菌的菌悬液浓度，且将各株菌的菌悬液浓度调节到1.0×1010cfu/ml后使用。最后确定本次实验将500μl的1.0×1010cfu/ml菌悬液稀释成10ml，喷于植物根部附近土壤表面，每株菌处理3株油菜，空白对照组喷等量的无菌水。诱导后五天，在每株油菜的叶片上接一个核盘菌菌饼，置于22℃培养箱中，24h内保持90％湿度，随后适当降低湿度。接入病原菌后2天、5天、7天统计病斑直径。
3次重复结果显示，检测的142株菌中的18株菌可以不同的程度的诱导油菜产生抗病性，其中编号为ippbiotsr045对油菜抗病效果较好，测得接入病原菌7天时的病斑直径为0.92±0.46cm；而空白对照组在接入病原菌7天时的病斑直径为5.23±0.45cm；另外没有诱导油菜产生抗病性的菌株中，编号菌株为ippbiotsr04a1的组别在接入病原菌7天时的病斑直径为5.72±0.80cm。lsd统计学分析显示，ippbiotsr045和空白对照组在α＝0.05水平上存在显著的差异；ippbiotsr045和ippbiotsr04a1在α＝0.05水平上存在显著的差异；而ippbiotsr04a1和空白对照组在α＝0.05水平上不存在显著的差异。ippbiotsr045菌株与空白对照组7天时的照片图见图1。
耐热活性分析：将有诱导活性的18株bt菌株活化后，1％转接，震荡培养24h，将菌液100℃，加热30min，同上述方法诱导油菜，每个处理设三个重复，同时用未加热菌液诱导，对照组用等量的无菌水处理。发现包括ippbiotsr045在内的6株仍有诱导活性，而其它12株丧失活性。综合耐热前的活性分析，ippbiotsr045菌株的活性最好。其中，在该耐热活性分析中，测得接入病原菌7天时，ippbiotsr045的病斑直径为1.12±0.85cm；接入病原菌7天时，与耐热分析平行处理的未加热的ippbiotsr045的病斑直径为1.01±0.11cm；而接入病原菌7天时，空白对照组的病斑直径为5.58±0.42cm。lsd统计学分析显示，ippbiotsr045的加热与未加热的处理在α＝0.05水平上不存在显著的差异，但两者均与空白对照在α＝0.05水平上存在显著的差异。可见，在ippbiotsr045菌株中，对油菜诱导抗病性的物质具有耐热特定，初步排除了不耐高温的环脂肽这一物质。另外，由于bt不产生脂多糖，因此对油菜诱导抗病性的物质也排除了脂多糖。
实施例3
油菜的诱导抗病性与茉莉酸信号途径关键基因bnhel表达的关系
诱导油菜产生抗病性的操作同实施例2。
提取ippbiotsr045菌株诱导前、诱导后2天、5天和7天油菜叶片的总rna，利用promegagoscripttmreversetranscriptionsystem反转录试剂盒反转录合成cdna，通过荧光定量pcr检测茉莉酸途径关键基因bnhel的相对转录水平，以actin基因为内参基因。其中，以上述cdna为模板，利用引物helf：gccatcaccatcggtatctatt(seqidno.1)，helr：ggtgaggaacacaaggactaat(seqidno.2)，tiangensuperrealpremixplus(sybrgreen)superreal荧光定量预混试剂增强版试剂盒进行荧光定量pcr；内参使用的引物为actinf：gtgccgatctacgaaggttatg(seqidno.3)；actinr：gtaccctctctcggtgagaat(seqidno.4)。ippbiotsr045菌株诱导前、诱导后2天、5天和7天的油菜叶中的bnhel基因的相对转录水平见图2，结果显示诱导后2天该基因的表达量显著上调，诱导后5天其表达量显著下调。可见，油菜的诱导抗病性与茉莉酸信号途径的关键基因bnhel显著相关。由于本领域的技术人员知道植物中广泛地存在茉莉酸信号途径，结合该实验结果可以合理地得出ippbiotsr045可以诱导植物的茉莉酸信号途径的关键基因bnhel的上调，因此，可以合理地得出ippbiotsr045可以诱导具有bnhel基因的植物对核盘菌属(sclerotinia)真菌，特别是核盘菌(sclerotiniasclerotiorum)的抗病性。
实施例4
活性菌株ippbiotsr045进一步的分类鉴定
1.多位点序列分型
多位点序列分型(multilocussequencetyping，mlst)是近年来发展很快的分子生物学分析方法，其具有很高的分辨能力，既适于分子流行病学研究，也可用于分子进化学的研究。通过分析多个450bp左右的管家基因(housekeepinggene)核心片段的核酸序列，从而对菌株的等位基因进行多样性的比较，不同的菌株对应不同的序列型(sequencetype)。所以mlst越来越多的被作进行国际间菌株比较的常用工具，以及建立一种更为准确的分型系统方法，并且将其应用于研究出现的不同的抗生素抵抗株、毒力或抗原的相关特殊基因型，及新的变异株引起的疾病流行等流行病学分析，进行生物进化和种群结构的研究。
1.1提取基因组
s1：5ml1mtris-hcl，1ml0.5medta，171.15g蔗糖，ph7.0，定容至500ml，115℃20min灭菌。
s2：10％sds4ml+ddh2o6ml，ph4.8-5.2。
s3：5m异硫氰酸胍，1mnaac。
te：10mmtris-hcl3ml，1mmedta600ul，ph8.0，定容至300ml。
提取ippbiotsr045菌株和已知的11株芽孢杆菌菌株(其中，苏云金芽孢杆菌3株，分别为hbf18、bt185和g03；蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)4株，分别为6a25、6a97、6a33和6a73；韦氏芽孢杆菌(bacillusweihenstephanensis)4株，分别为6a50、6a21、6a22和6a23)的基因组，具体方法如下：
(1)菌株在lb固体培养基上划线，30℃过夜培养，刮取100μg菌体到1.5mlep管中；
(2)加入150μls1(加溶菌酶和石英砂)悬浮，于振荡器上剧烈振荡，混匀，无需用枪头吹打；
(3)加200μls2，充分混匀；再加入400μl的s3，充分混匀，剧烈震荡；
(4)取上清，加等体积的异丙醇，混匀，-20℃静置20min；
(5)取出离心，12000rpm，10min，弃上清；
(6)加入70％的乙醇清洗，12000rpm，10min；
(7)倒掉乙醇，再次12000rpm，3min；
(8)用枪头吸干上清，室温晾干；
(9)再加入100μl的te或者质粒提取试剂盒中eluent(每毫升te或eluent中加10μl的rnasea)溶解沉淀；
(10)-20℃保存备用。
提取的基因组利用琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示提取的基因组效果良好。
1.2pcr引物的设计与合成
根据pubmlst(http://pubmlst.org/bcereus/info/primers.shtml)发布的bcgroup的七个管家基因引物序列进行合成。
七个管家基因分别是：glpf(甘油吸收有利蛋白，glyceroluptakefacilitatorprotein)、gmk(假定的鸟苷酸激酶，putativeguanylatekinase)、ilvd(二羟酸脱水酶，dihydroxy-aciddehydratase)、pta(磷酸转乙酰酶，phosphateacetyltransferase)、pur(phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide)、pyca(丙酮酸羧化酶，pyruvatecarboxylase)以及tpi(磷酸丙糖异构酶，triosephosphateisomerase)。所选取的七个管家基因名称，引物名称及序列(5’-3’)，扩增长度见下表1。
表1
1.3pcr扩增
将提取成功的每个菌株基因组dna分别稀释到10ng/μl左右作为pcr扩增模板，采用50μl反应体系，分别对7个目的管家基因进行pcr扩增。扩增体系包含有，taqpcrmastermix(25μl)，正反向引物(各1μl)、基因组dna(2μl)和ddh2o(21μl)。
对于pta基因的扩增，循环参数为：
其他六个管家基因除退火温度不同外。其他循环参数设定相同，其中glpf为59℃，gmk和pur均为56℃，pyca为57℃，ilvd和tpi均为58℃。
1.4扩增产物检测
待扩增反应结束后，取3μl的pcr产物加样于预先制备加有核酸染料的1％琼脂糖凝胶点样孔中进行电泳，电压140v，10min后取出，紫外分光光度计下拍照、保存。所有菌株均扩增成功。
1.5测序及整理序列
对上述芽孢杆菌的pcr产物进行测序。将每株菌的glpf、gmk、ilvd、pta、pur、pyca和tpi的测序序列分别提交到pubmlst网站中上述相应基因的基因库中，获得用于mlst分析的序列长度分别glpf：372bp；gmk：504bp；ilvd：393bp；pta：414bp；pur：348bp；pyca：363bp；tpi：435bp。其中ippbiotsr045的glpf序列如seqidno.19所示，ippbiotsr045的gmk序列如seqidno.20所示，ippbiotsr045的ilvd序列如seqidno.21所示，ippbiotsr045的pta序列如seqidno.22所示，ippbiotsr045的pur序列如seqidno.23所示，ippbiotsr045的pyca序列如seqidno.24所示，ippbiotsr045的tpi序列如seqidno.25所示。然后获得依次连接的“glpf-gmk-ilvd-pta-pur-pyca-tpi”序列。ippbiotsr045的“glpf-gmk-ilvd-pta-pur-pyca-tpi”序列如seqidno.26所示。
2.实验菌株的等位基因及st分型结果
采用mlst技术分析芽孢杆菌的7个持家基因位点的核苷酸多态性。在pubmlst网站进行序列分型的确定。该菌对应的“glpf-gmk-ilvd-pta-pur-pyca-tpi”这一组持家基因编号的组合称为等位基因图谱(allelicprofile)，并给这个等位基因谱分配一个唯一的编号作为该分离株的核酸型或序列型(sequencetype，sts)。经确认，ippbiotsr045的“glpf-gmk-ilvd-pta-pur-pyca-tpi”序列与已经公开的序列不同，存在一定的差异，其st分型属于st13，结合该菌株的形态学性状说明其为一株不同于现有菌株的新的苏云金芽孢杆菌菌株。
3.系统发育分析
采用mega6.0软件对ippbiotsr045和上述已知标准菌株的st型的联合基因序列(长度均为2829bp)构建nj聚类图，在核苷酸水平上对芽孢杆菌进行遗传聚类分析，见图3。结果ippbiotsr045菌株与苏云金芽孢杆菌聚合在一起，说明ippbiotsr045菌株在分类上属于苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)。
该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.13302，保藏日期为2016年11月15日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。其系统分类为苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)。
lha1760055核苷酸序列表
<110>中国农业科学院植物保护研究所
<120>一种苏云金芽孢杆菌及其应用
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