ATP核酸适配体、利用纳米金显色检测ATP的方法及试剂盒与流程

本发明涉及生物检测技术领域，更具体地，涉及atp核酸适配体、利用纳米金显色检测atp的方法及试剂盒。

背景技术：

atp作为所有生物体生存和繁殖的细胞合成中必不可少的普遍能量来源，在机体代谢过程中扮演着非常重要的角色。研究表明atp可以作为细胞存活率和细胞损伤的指示剂。atp在细胞中的异常浓度和许多疾病，比如肿瘤，心血管疾病，帕金森综合征等有着密切的联系。因此，对atp快速准确的检测在临床应用上有着重大的意义。

目前已有的atp的检测方法主要包括hplc法、荧光素/荧光素酶法以及电泳法。这些方法的灵敏度和特异性都很好，但是需要昂贵的仪器和繁琐的操作步骤，并且耗时耗力。

核酸适配体(aptamer)是一段dna，rna或者是xna序列。通常是利用体外筛选技术-指数富集的配体系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段。核酸适配体能与多种目标物质高特异性、高选择性地结合，因此被广泛应用于生物传感器领域。相对于传统的抗原-抗体反应，核酸适配体更容易合成，更稳定，成本更低，而且拥有与抗原-抗体反应相匹敌的特异性和灵敏度。这些优势使核酸适配体成为了各种化学分子探测的有力武器。基于核酸适配体的生物传感器受到了人们越来越多的关注和研究应用。这些生物传感器主要分为：荧光法、电化学法、化学发光法以及比色法。其中比色法相对于其它方法有许多优势，比如成本低，操作简单，结果容易读取等。在未来的分析检测领域甚至临床应用方面有着很好的前景。

纳米金是指金的微小颗粒，其直径在1-100nm，其颜色依直径大小而呈红色至紫色。由于其特殊的物理化学性质，比如高消光系数、强大的距离相关的光学性质、低成本等，使其在比色法的检测手段中作为信号显示剂非常具有竞争力。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种操作简单、灵敏度高、特异性好、成本低的atp检测方法。

根据本发明的第一方面，本发明提供一种atp核酸适配体(或称dna探针)，该atp核酸适配体具有如seqidno：1所示碱基序列。5’-accttcctgggggagtattgcggaggaaggt-3’(seqidno：1)。

通过对atp核酸适配体序列的优化，能够提高检测的特异性和灵敏度。

根据本发明的第二方面，本发明提供一种利用纳米金显色检测atp的方法，该方法包括以下步骤：

(1)使含有atp的待测溶液与含有上述的atp核酸适配体的检测溶液混合；

(2)将步骤(1)得到的混合液与纳米金溶液混合，然后加入盐溶液并混匀；

(3)仪器检测或观测步骤(2)得到的混合溶液。

优选地，步骤(1)中，含有atp的待测溶液中的atp与含有atp核酸适配体的检测溶液中的atp核酸适配体的摩尔比为1：1-1000，优选为1：50-200。

优选地，步骤(1)中，含有atp核酸适配体的检测溶液中atp核酸适配体的浓度为0.1μm-10μm，含有atp适配子的检测溶液优选为tris-hcl缓冲液。

优选地，步骤(2)中，步骤(1)得到的混合液中的atp核酸适配体与纳米金溶液中的纳米金颗粒的摩尔比为1：0.001-0.01。

优选地，步骤(2)中，所述盐溶液的加入量使得步骤(2)得到的混合溶液中盐的终浓度为10-100mm；所述盐溶液优选为无机盐溶液，进一步优选为氯化钠溶液。

上述优选范围内的各组分用量能够进一步提高检测的灵敏度。

步骤(1)中混合后可适当放置1-5分钟，以使结合更充分。步骤(2)中加入盐溶液后优选迅速混匀。

根据本发明，所述纳米金溶液中纳米金颗粒的粒径优选为10-20nm，最优选为14nm。

根据本发明的第三方面，本发明提供一种利用纳米金显色检测atp的试剂盒，该试剂盒包括以下组成：

1)含有上述的atp核酸适配体的检测溶液；

2)盐溶液；

3)纳米金溶液。

优选地，含有atp核酸适配体的检测溶液中atp核酸适配体的浓度为0.1μm-10μm，含有atp适配子的检测溶液优选为tris-hcl缓冲液。

优选地，所述盐溶液为氯化无机盐溶液，进一步优选为氯化钠溶液；所述盐溶液的浓度优选为1-2m。

优选地，所述纳米金溶液中纳米金颗粒的粒径优选为10-20nm，最优选为14nm，所述纳米金溶液中纳米金颗粒的浓度优选为0.5-5nm。

根据本发明，所述纳米金溶液可以通过本领域常规的方法制备得到，该方法已为本领域技术人员公知。例如柠檬酸钠还原法：将5ml柠檬酸钠溶液(1wt％)加入到正在沸腾的金氯酸溶液中，迅速混匀，反应液的颜色变为红色以后，再回流20分钟。然后将上述反应液置于冰上冷却，最后置于4度保存。所述纳米金溶液通常为纳米金颗粒的柠檬酸钠缓冲溶液。

本发明的方法基于以下原理：如图1所示，本发明的检测体系中包含一个以atp核酸适配体(蓝色dna链)作为待检测物的识别器的发卡结构的dna探针，以及纳米金作为信号显示剂。在没有待检测物atp的时候，该dna探针不能吸附在纳米金上，因此，在溶液盐的浓度升高时，纳米金发生聚集，从红色变为蓝色。在atp存在的时候，atp与其核酸适配体相结合，暴露出一段dna单链(红色dna链)，此段单链可以通过静电作用与纳米金相结合，从而使纳米金在高浓度盐溶液里更加稳定，溶液颜色保持红色或者紫色的状态。根据此原理，溶液中atp的含量越高，溶液越趋近于红色。因此，通过肉眼观测溶液的颜色变化，可以对atp的含量进行定性检测。

此外，也可以利用紫外可见分光光度计，通过制作标准曲线的方式，实现对atp的定量检测。

利用本发明的方法对atp进行测定，不需要任何化学修饰，没有复杂的反应过程，也不需要昂贵的仪器，甚至可以通过肉眼观测，操作简便，成本低。该方法检测时间短(5分钟)，灵敏度高，特异性好。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述。

图1示出了本发明的检测原理。

图2示出了纳米金在不同溶液中的紫外吸收光谱和相对应的颜色状态。

图3a和图3b分别示出了纳米金在有无atp存在时不同的分散状态。

图4a示出了纳米金在不同浓度atp存在时的颜色变化。图4b示出了纳米金在不同浓度atp存在时的紫外吸收光谱。图4c示出了在不同浓度atp的存在下，纳米金的紫外吸收光谱峰的比值(a522/a656)，内插图为atp浓度在0-5μm时金的紫外吸收光谱峰的比值(a522/a656)的标准校准曲线。

图5示出了纳米金在atp以及其类似物(gtp、utp、ctp)存在下的紫外吸收光谱和相对应的溶液颜色。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本发明的优选实施方式。

实施例1

试剂盒组成

a)检测溶液：20mmtris-hcl缓冲液(100mmnacl,5mmmgcl2,ph7.4)(内含具有seqidno：1所示序列的dna探针：1μm)

b)nacl溶液(1.6m)

c)纳米金柠檬酸钠缓冲溶液(14nm，浓度为1nm)

含有atp的待测溶液

atp水溶液，其中atp浓度为10μm。

验证实验

图2示出了纳米金在不同溶液中的紫外吸收光谱和相对应的颜色状态，其中纳米金柠檬酸钠溶液的用量为190μl，含有atp的待测溶液的用量为5μl，nacl的用量为5μl，dna探针的用量为5μl。

其中，a：纳米金+nacl；b：纳米金+atp+nacl；c：纳米金+dna探针+nacl；d：纳米金+atp+dna探针+nacl。如图2所示，当纳米金溶液里只含有盐(a)、atp和盐(b)、dna探针和盐(c)的时候都不稳定，会发生聚集，从而在紫外吸收光谱中656nm处出现一个高的吸收峰，相应的溶液颜色呈现蓝色。当atp、dna探针、盐同时存在的时候，atp可以使dna探针的构型发生改变，进而吸附在纳米金上，使其在高盐状态下保持稳定的单分散状态。在紫外吸收光谱中522nm处出现一个高的吸收峰，相应的溶液呈现红色。这些实验现象和图1所示检测原理相符，有力地证明了本发明方法的可行性。

图3a和图3b分别示出了纳米金在有无atp存在时不同的分散状态。如图3a所示，纳米金在没有atp存在的检测液里，不能稳定分散而发生聚集。在有atp存在的检测液里，稳定的保持原有的单分散的状态(如图3b所示)。这一实验结果又进一步证明了该技术方案的可行性。

检测步骤

(1)将5μl含有atp的待测溶液与5μl检测溶液充分混匀；

(2)取10μl步骤(1)得到的反应液，加入到190μl纳米金溶液中，再加入5μlnacl溶液，迅速混匀；

(3)用紫外可见分光光度计读取结果，或者直接使用肉眼读取结果。

检测结果

图4a示出了纳米金在不同浓度atp存在时的颜色变化。图4b示出了纳米金在不同浓度atp存在时的紫外吸收光谱。图4c示出了在不同浓度atp的存在下，纳米金的紫外吸收光谱峰的比值(a522/a656)，内插图为atp浓度在0-5μm时金的紫外吸收光谱峰的比值(a522/a656)的标准校准曲线。

如图4a-图4c所示，纳米金随着atp浓度的升高逐渐从蓝色变为红色(a)，相应的紫外吸收光谱在656nm处的峰值逐渐降低，在522nm处的峰值逐渐升高(b)。纳米金的紫外吸收光谱峰的比值(a522/a656)随着atp浓度的升高而逐渐升高，最后达到平衡(c)。atp浓度在0-5μm时金的紫外吸收光谱峰的比值(a522/a656)可以画出标准校准曲线(c插图)，该线性回归方程为：a522/a656＝0.1239[catp]+0.8367(线性相关系数：0.9989)，通过计算得出该方法对atp的检测限为0.1μm，说明本发明方法的灵敏度极高。

图5示出了纳米金在atp以及其类似物(gtp、utp、ctp)存在下的紫外吸收光谱和相对应的溶液颜色。

如图5所示，纳米金在atp的类似物(gtp、utp、ctp)的存在下，紫外吸收光谱在656nm处有高峰值，相对应的溶液颜色为蓝色。只有在atp的存在下，紫外吸收光谱在522nm处有高峰值，溶液颜色为红色。这一实验现象证明了该技术方案具有很高的特异性。

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

sequencelisting

<110>深圳市坤健创新药物研究院

<120>atp核酸适配体、利用纳米金显色检测atp的方法及试剂盒

<130>a1700028

<160>1

<170>patentinversion3.3

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<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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