辣椒碱及其制备方法与流程

本发明涉及天然色素分离技术领域，具体地，涉及辣椒碱及其制备方法。

背景技术：

从天然辣椒中提取辣椒碱的方法较多，主要是根据辣椒碱性质和溶解性特点进行萃取和分离。目前，常用的提取方法有溶剂法、酶提取法、超临界二氧化碳法、超声强化提取法等。

辣椒碱的纯化方法，包括层析法，例如，刘可春等人将辣椒油脂初品按1/2比例加入无水乙醇至60℃下溶解，再按1/3的比例加入中性氧化铝，搅拌均匀以后在40℃下真空干燥。然后将干燥后的氧化铝装入层析柱，用复合溶剂洗脱，洗脱液减压蒸馏回收溶剂，剩余物加乙醚溶解，-5℃下结晶，再用乙醚重结晶，即可得白色针状辣椒碱晶体，纯度可达98％以上。

裘立群等人利用刚活化的活性炭进行辣椒碱粗提物纯化，以90％乙醇作为洗脱液，每1mL提取液加入2g活性炭，在55℃水浴中加热并搅拌5min，再用10mL洗脱液分两次进行洗脱。

曾仕廉用丙酮、石油醚、95％乙醉提取出辣椒油树脂，再以乙醚作为结晶溶剂，得到粗辣椒碱类化合物的晶体，再经硅胶柱层析纯化后结晶，得到辣椒碱类化合物纯品，纯度为91.3％。李绪文等人以干辣椒为原料，用丙酮浸提后，再用硅胶柱层析分离纯化辣椒碱类化合物，证明柱层析可以有效地进行辣椒碱类化合物的分离与纯化。高蓝等人也用硅胶柱层析的方法从含辣味物质2.4％的黑红色辣椒精中分离得到含辣味物质22.2％的淡褐色辣椒精，从淡褐色辣椒精中分离得到辣味物质的白色晶体。

上述几种辣椒碱的制取方法各有利弊，或对设备的要求高，在生产实际中难以推广，或对辣椒碱品质有较大的影响，或对辣椒碱分离纯化过程带来较大困难等。

技术实现要素：

解决上述问题所采用的技术方案是辣椒碱及其制备方法。

本发明提供的一种辣椒碱的制备方法，包括以下步骤：

提取辣椒油脂的步骤：将干红辣椒粉经丙酮在80℃水浴加热条件下提取，提取时间为5h，得到辣椒油脂；

第一次硅胶柱层析的步骤：采用丙酮和石油醚为洗脱剂进行洗脱，按颜色的不同分别收集洗脱液，获得前期洗脱液、中期洗脱液、后期洗脱液；

第二次硅胶柱层析的步骤；将前期洗脱液、中期洗脱液、后期洗脱液分别采用洗脱剂进行二次洗脱，获得不同颜色的洗脱液。

优选的，所述的洗脱剂为丙酮和石油醚的混合物，其中，两者的体积比V丙酮:V石油醚＝1:5。

优选的，所述前期洗脱液在第二次层析洗脱时按颜色的不同分别收集洗脱液，获得2段收集洗脱液。

优选的，所述中期洗脱液在第二次层析洗脱时按颜色的不同分别收集洗脱液，获得7段收集洗脱液。

优选的，所述后期洗脱液在第二次层析洗脱时按颜色的不同分别收集洗脱液，获得5段收集洗脱液。

优选的，收集洗脱液采用薄层层析法进行分析，其中，展开剂为丙酮和石油醚的混合物，其中，两者的体积比V丙酮:V石油醚＝1:5。

本发明的另一个目的在于提供一种辣椒碱，所述的辣椒碱是采用上所述辣椒碱的制备方法制备的。

本发明提供的一种辣椒碱及其制备方法，通过丙酮提取获得了辣椒油脂，并选择合适洗脱剂和展开剂对辣椒油脂进行分离和分析；通过两次柱层析获得了纯品辣椒碱。初步实现了辣椒碱的规模化分离。

附图说明

图1是实施例1辣椒油油脂的薄层层析图；

图2是实施例1辣椒油油脂经不同配比的洗脱剂洗脱的色谱柱颜色分布；

图3是实施例1V_丙酮:V_石油醚＝1:5洗脱后对应的薄层板显色图样和辣椒油油脂的薄层样板；

图4是实施例1V_丙酮:V_石油醚＝1:1洗脱后对应的薄层板显色图样和辣椒油油脂的薄层样板

图5是实施例1前期洗脱液的二级分离图样；

图6是实施例1前期洗脱液经二级分离后的收集液；

图7是实施例1前期洗脱液经二级分离后(1)(2)号洗脱液对应的薄层板显色图样和一级分离的前期洗脱液的薄层层析样板；

图8是实施例1中期洗脱液的二级分离图样；

图9是实施例1中期洗脱液经二级分离的收集液；

图10是实施例1中期洗脱液二级分离后收集液的(1)-(7)号洗脱液对应的薄层板显色图样；

图11是实施例1后期洗脱液的柱层析图样；

图12是实施例1后期洗脱液经二级分离后的收集液；

图13是实施例1后期洗脱液二级分离后收集液的(1)-(5)号洗脱液对应的薄层板显色图样和一级分离的后期洗脱液的薄层层析样板。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。

实验准备

1展开剂的配制

由于之前我们在做薄层层析探究过辣椒红素和辣椒碱类物质分离最适展开剂为V_丙酮:V_石油醚＝1:5，所以我们现在配制展开剂时也按照此种比例配制。

2洗脱剂的配制

由展开剂V_丙酮:V_石油醚＝1:5来配制洗脱剂得到相同比例的展开剂，检测该比例是否适合柱层析，而且在此基础上加一组对照组：实验组V_丙酮:V_石油醚＝1:5、对照组V_丙酮:V_石油醚＝1:1。

3显色剂的配制

层析完而未处理的硅胶板上，只显示辣椒红素类物质的颜色，辣椒碱类物质是不显颜色的，显色剂的作用是使辣椒碱类物质遇显色剂变为其它颜色，为便于区分辣椒红素和辣椒碱。显色剂选用改良碘化铋钾试剂。，辣椒碱类物质遇改良碘化铋钾试剂显示不同程度的绿色。改良碘化铋钾试剂的配制方法如下：

溶液1：0.85g碱式硝酸铋溶于10mL冰醋酸和40mL水。

溶液2：8.00g碘化钾溶于20mL水。

储存液溶液1和溶液2等量混合(置棕色瓶中可长期保存)。

显色时将1ml储存液与2ml冰醋酸和10ml水混合，用前配制。

4.薄层层析方法

制硅胶板：取硅胶G(薄层层析用)9.00g于研钵中，加20mL水搅匀并调成稀糊状，用洁净的长吸管将稀糊吸至已烘干的洁净载玻片(25.40mm×76.20mm)上，手晃摇匀，使薄层均匀且无气泡，厚度约0.25-1mm，晾干，再置于烘箱中110℃活化0.5h，冷却后于干净密封袋中密封备用。

点样：将样品用毛细管分别点在玻璃板一端距边沿1cm处位置，点样间隔1-1.5cm，斑点扩散成1-2mm为宜。点样时使毛细管液体轻轻接触薄层即可，切勿点样过重致使薄层破坏。

展开：在层析缸内加入展开剂V_丙酮:V_石油醚＝1:5，将薄层板点有样点的一端放入，距展开剂液面上方约0.5cm，使样点展开。

记录色素分离情况：待展开剂前沿距薄层板上端约1cm时，取出用铅笔画出前沿位置，晾干，拍照并记录辣椒色素斑点离底线的距离及其颜色差异情况。计算各色素斑点的Rf值。

显色：向薄层板轻喷显色剂，防止薄层被吹起脱落玻璃板。放置几分钟后即可显出绿色斑点，拍照并记录绿色斑点离底线的距离及其颜色差别。计算各色素斑点的Rf值。

5.柱层析方法

制硅胶柱：本实验采用湿法装柱。一级分离和二级分离的柱层析制柱方法除了选用的硅胶目数有差异外，其余步骤和方法相同。一级分离柱层析选用的硅胶为100-200目，二级分离选用的硅胶为200-300目。具体步骤如下：取硅胶20.00g于烧杯中，加约25ml洗脱剂(洗脱剂用量为完全浸没硅胶以上)搅拌约2min，待硅胶与洗脱剂混合完全后；关闭玻璃层析柱下端活塞，将滤斗放置在玻璃层析柱上端，将混合溶液沿着滤斗慢慢倾倒入柱内，边倒边用玻璃棒搅拌，使得硅胶更多的进入柱内，并用少量洗脱剂润洗；打开活塞，让洗脱液留下，用干净锥形瓶收集洗脱液；在此过程中，可用橡胶管轻轻敲打柱壁，使硅胶沉降加快，并可赶走柱内少量气泡；最后用玻璃棒检测沉降是否完全。

上样：确定硅胶柱很结实后，取样品，由于样品呈稠装液体，需用少量洗脱剂溶解均匀；在加样前保证洗脱剂液面略高于硅胶柱面，用胶头滴管取2ml辣椒油油脂溶液，沿着柱的内壁旋转加入样品，保证样品在柱内分布均匀；这样使得样品在同一水平面上向下洗脱，并用少量洗脱剂清洗柱壁。

洗脱：待柱内的样品基本进入硅胶柱内后，可开始大量加入洗脱剂，保持洗脱剂液面始终高于硅胶柱面约5cm，保证层析柱下端流速一定，便于后面收集。加入洗脱剂的原则是用胶头滴管沿柱内壁慢慢加入，勿过快而破坏硅胶柱表面。

收集：待层析柱下端有有色液体出来开始用玻璃刻度离心管收集，按照色谱柱的颜色顺序先后分别收集洗脱液，并测量各种洗脱液体积，待洗脱液基本呈无色停止收集，并将收集液分别编号。

检测：由于所收集的洗脱液浓度太低，在做薄层层析检测时会带来困难，所以在检测之前需要对样品进行浓缩。将收集好的洗脱液置于90℃水浴锅上水浴加热浓缩，并在已经做好了的薄层硅胶板上点样，同样用V_丙酮:V_石油醚＝1:5作为展开剂进行薄层层析，通过比较Rf值大小及差值检测样品的分离效果。

实施例1

1.辣椒油脂的提取

将辣椒粉、组装脂肪测定仪提取瓶、提取筒、称量用品等放进80℃烘箱中烘干。冷却后分别称重。重复以上过程，直至恒重。

称取辣椒粉约20.00g用脱脂纱布包成圆柱状，直径略小于提取筒的直径，并用一小段脱脂棉线扎紧，贮于密封袋中备用，向提取瓶中加入丙酮20ml。连接好装置并打开冷凝水开关，润洗装置。

润洗完后，将提取瓶中的液体倒掉，并把准备好的辣椒粉样品包装入提取筒，向提取瓶中加丙酮240ml，连接好装置。水浴温度设为80℃，提取5h。然后装置回流0.5h，回收有机溶剂。提取瓶，样品渣称重后放入烘箱烘干。冷却后称重，重复操作，直至恒重，计算辣椒油脂得率。提取瓶烘至恒重后所剩物质为辣椒油油脂，用石油醚将其溶解，然后倒入广口瓶中。广口瓶放进通风橱中将溶剂石油醚挥发，剩余为辣椒油油脂，储存备用。

2.薄层层析

将提取出来的辣椒油油脂进行薄层层析，薄层板上出现3个有色斑点，从上到下依次为深红色、红色和橙红色，这些斑点为辣椒红素斑点；经显色后薄层板的颜色结果显示(见图1)

图1可见，薄层板经辣椒碱显色剂显色后，又出现了3个绿色斑点，并与辣椒红素斑点呈现交替分布，通过本实验的薄层层析方法可以分析出辣椒油油脂的6种成分，其中辣椒红素有3种成分，辣椒碱类物质有3种成分；分别计算各斑点的Rf值，其结果显示(见表1)。

表1 辣椒油油脂各斑点的Rf值

由表1数据分析可知，辣椒红素斑点与辣椒碱类物质的Rf值之差在0.05-0.56范围内，分离效果较好，而且不同辣椒红素之间的Rf值之差在0.13-0.31范围内，分离效果很好；通过Rf值得比较可知用V_丙酮:V_石油醚＝1:5作展开剂做薄层层析分离效果好，但由于辣椒红素和辣椒碱在分离时呈交替分布，而且成分较为复杂，这样给分离纯化带来困难。

3.第一次柱层析

将相同量的辣椒油油脂在洗脱剂为V_丙酮:V_石油醚＝1:5和V_丙酮:V_石油醚＝1:1的分别洗脱，硅胶柱的颜色结果显示(见图2)

图2可见，洗脱剂V_丙酮:V_石油醚1:5在洗脱时能够在硅胶柱内呈现颜色分明的条带，自下而上颜色依次为黄色、深红色、红色、浅红色、橙色、黄色，条带清晰。具体见图2左侧色谱柱。

洗脱剂V_丙酮:V_石油醚＝1:1在洗脱时在硅胶柱内则呈现出黄色、深红色、橙色、黄色的色谱条带。具体见图2右侧色谱柱。

单从颜色上右侧色谱柱的辣椒红素都集中在一起，辣椒红素与辣黄素分离开，但我们从上面的薄层层析图样可以看出几种辣椒红素的Rf值差别很大，因此不应该是同时被洗脱下来；另外分析V_丙酮:V_石油醚＝1:5洗脱中的辣椒红素的分布情况更加接近于薄层层析的图样。通过类似的比较和筛选实验，可以认为洗脱剂配比为V_丙酮:V_石油醚＝1:5的效果较好，更加适合于柱层析中辣椒红素的分离。

3.1.柱层析一级分离效果检测

先将洗脱剂为V_丙酮:V_石油醚＝1:5洗脱的洗脱液按先后顺序分别收集三次，依次为前期洗脱液(6ml)、中期洗脱液(10ml)和后期洗脱液(8ml)，并将洗脱液进行浓缩点样进行薄层层析检测，对应的薄层板依次为1、2、3，经显色后薄层层析结果显示(见图3)。

图3可见，1号薄层板自上而下依次呈现绿色条带和深红色斑点，其中深红色斑点有扩散现象；2号薄层板自上而下依次呈现绿色条带、深红色斑点、红色斑点和浅绿色斑点，其中深红色斑点有扩散现象，颜色也明显加深；3号薄层板自上而下依次呈现深红色斑点、红色斑点、浅绿色斑点、橙红色斑点和淡绿色斑点。分别与未被分离的辣椒油油脂薄层板4号对比发现：1号薄层板上只含有一种辣椒红素和一种辣椒碱，2号薄层板上含有两种辣椒红素和两种辣椒碱，3号薄层板上含有三种辣椒红素和两种辣椒碱；从所含成分推知，前期、中期、后期洗脱液中辣椒红素与辣椒碱类物质得到了一定的分离。分别计算各斑点的Rf值，其结果显示(见表2)。

表2 1-4号薄层板上各斑点的Rf值(4作对照)

由表中数据分析可知，深红色、红色和橙红色斑点为辣椒红素斑点，深绿色、浅绿色和淡绿色斑点为辣椒碱斑点；1号薄层板上辣椒红素与辣椒碱类物质的Rf值之差为0.22，2号薄层板上辣椒红素与辣椒碱类物质的Rf值之差在0.04-0.27范围内，3号薄层板上辣椒红素与辣椒碱类物质的Rf值之差在0.06-0.34范围内；由此看出辣椒红素与辣椒碱类物质有一定的分离效果。

再将洗脱剂为V_丙酮:V_石油醚＝1:1洗脱的洗脱液按先后顺序分别收集三次，依次为前期洗脱液、中期洗脱液和后期洗脱液，并将洗脱液进行浓缩点样做薄层层析，对应的薄层板依次为(1)、(2)、(3)，经显色后薄层层析结果显示(图4)

图4可见：(1)薄层板自上而下依次呈现绿色条带、深红色斑点和红色斑点，其中深红色斑点有扩散现象；(2)和(3)薄层板自上而下依次呈现绿色条带、深红色斑点、红色斑点、浅绿色斑点、橙红色斑点和绿色斑点。分别与未被分离的辣椒油油脂薄层板4号对比发现：(1)薄层板上含有两种辣椒红素和一种辣椒碱，(2)和(3)薄层板上含有三种辣椒红素和三种辣椒碱。除(1)薄层板中成分有分离外，(2)和(3)薄层板中所含成分与未分离前一样，基本未达到分离效果。

综合两次实验分离效果发现：洗脱剂为V_丙酮:V_石油醚＝1:5的洗脱效果明显优于洗脱剂为V_丙酮:V_石油醚＝1:1的效果。通过多种组成的洗脱剂组合及配比的比较实验，可以证实V_丙酮:V_石油醚＝1:5为最佳配比洗脱剂。此结果与薄层层析展开剂配比一致。但是由于洗脱剂为V_丙酮:V_石油＝1:5的洗脱液并没有得到纯度较高的辣椒红素，所以需要对其洗脱液进行柱层析二级分离。

4.第二次柱层析

第二次柱层析采用的硅胶为250目，应当理解的是200-300目的硅胶都是可行的。

4.1前期洗脱液的柱层析二级分离效果分析

将前期洗脱液进行二级分离，洗脱剂为V_丙酮:V_石油醚＝1:5，硅胶柱的颜色结果显示(见图5)。

图5可见，由于前期洗脱液颜色较浅，且收集液的量少，所以柱层析的色谱柱整体颜色较浅，但有分层现象，自上而下依次为浅黄色和黄色两种色谱；经洗脱液洗脱后，按色谱柱颜色分别收集了两次洗脱液，记为(1)、(2)号，颜色都为淡黄色，结果显示(见图6)

读取(1)号和(2)号洗脱液收集量，分别为6mL和12mL；再将(1)、(2)号洗脱液经浓缩后点样做薄层层析，经显色后，结果显示(见图7)。

图7可见，1-1薄层板只有上端有一淡绿色斑点，1-2薄层板上斑点自上而下的顺序依次为淡绿色斑点和淡红色斑点，与1薄层板对比发现，斑点的位置略有区别，但成分相同。分别计算各斑点的Rf值，其结果显示(见表3)：

表3 1-1、1-2薄层板上各斑点的Rf值(1作对比)

由表中数据可知：绿斑点为辣椒碱；淡红色斑点为辣椒红素；将各Rf值与1薄层板上斑点的Rf值对比发现，其结果基本一致，说明是由于实验误差引起斑点位置差异，1-2薄板中浅红色斑点与1薄板中深红色斑点是对应的。由薄层层析检测分析推知：前期洗脱液经二级分离后，(1)号洗脱液中全部为辣椒碱溶液，(2)号洗脱液为辣椒红素与辣椒碱的混合溶液。该二级分离达到了良好的分离效果。

4.2中期洗脱液的柱层析二级分离效果分析

将中期洗脱液进行二级分离，洗脱剂为V_丙酮:V_石油醚＝1:5，硅胶柱的颜色结果显示(见图8)

由于中期洗脱液的颜色较深，且收集液量较多，所以柱层析后整个柱子的颜色较深，并且色谱柱的颜色层次分明，自下而上依次为黄色、深红色、橙红色、橙色、红色、深黄色和浅黄色，按色素带顺序收集洗脱液，依次编号为(1)-(7)号，其结果显示(见图9)。

分别读取(1)-(7)号洗脱液的收集量，其结果显示(见表4)：

表4 (1)-(7)号洗脱液的收集量

将(1)-(7)号洗脱液浓缩后点样做薄层层析，经显色后，结果显示(见图10)；

图10可见，2-1薄层板上只有最上端的绿色斑点；2-2薄层板自上而下依次显示绿色斑点和深红色斑点，其中深红色斑点有向上扩散现象，绿色斑点较1-1中颜色加深；2-3薄层板的斑点与2-2中一样，但绿色斑点有较严重的拖尾现象，且颜色较2-2中要淡；2-4薄层板自上而下依次显示绿色斑点、深红色斑点和红色斑点，其中绿色斑点有拖尾现象，颜色较2-3中要淡；2-5薄层板自上而下依次显示深红色斑点、红色斑点和浅绿色斑点，对比2-4中少了绿色斑点，但多出浅绿色斑点；2-6薄层板自上而下依次显示红色斑点和浅绿色斑点，较2-5中少了深红色斑点；2-7薄层板上只有浅绿色斑点；并且与2薄层板对比发现各斑点的颜色和位置基本相同。分别计算各薄层板上斑点的Rf值，其结果显示(见表5)：

表5 2-1至2-7薄层板上各斑点的Rf值(2作对比)

由表中数据分析知：深红色斑点和红色斑为辣椒红素斑点，绿色斑点和浅绿色斑点为辣椒碱斑点；其中辣椒红素类物质的Rf值约为0.70和0.60，辣椒碱的Rf值约为0.95和0.56，辣椒红素与辣椒碱的Rf值之差为0.04-0.35范围内，分离效果明显。另外，由薄层层析推测(1)-(7)号洗脱液中所含成分知，(1)号洗脱液中为较纯的辣椒碱；(2)号洗脱液中有少许辣椒红素，但大部分都是辣椒碱；(3)号洗脱液中辣椒红素和辣椒碱都含有；(4)号洗脱液在中辣椒碱含量明显减少，辣椒红素含量增多；(5)号洗脱液中含有另一种辣椒碱，辣椒红素含量也相对较多；(6)号洗脱液中辣椒红素含量明显减少，辣椒碱含量增多；(7)号洗脱液中基本无辣椒红素，只含有辣椒碱。那么从洗脱顺序来看，黄色谱带中基本只含有辣椒碱；深红色谱带和橙红色谱带中辣椒红素的含量最多，也含有很少量的辣椒碱类物质，可以进一步探讨辣椒红素的含量比例；橙色谱带中多含有一种辣椒红素成分；红色谱带中也是辣椒红素与辣椒碱的混合物，但是所含辣椒碱的成分不同；深黄色谱带中则少一种辣椒红素成分。整体上从二级分离中期洗脱液的效果可以得出：辣椒红素与辣椒碱类物质得到了较好的分离，可以得到较纯的辣椒红素；虽然没有得到辣椒红素纯品，但对比一级分离的效果更加明显。

4.3后期洗脱液的柱层析二级分离效果分析

将后期洗脱液进行二级分离，洗脱剂为V_丙酮:V_石油醚＝1:5，硅胶柱的颜色结果显示(见图11)。后期洗脱液的颜色相对中期洗脱液较浅，柱层析后色谱柱的颜色也相对较浅，但层次分明，从下向上依次为淡黄色、深黄色、橙红色、黄色和浅黄色，按色谱带顺序分别收集，得到(1)-(5)号洗脱液，其结果显示(见图12)；

由于后期洗脱液在一级分离时最后被洗脱，洗脱时间较长，所以其二级分离时色素带洗脱液量较多，测量各洗脱液的量，其结果显示(见表6)；

表6(1)-(5)号洗脱液的收集量

将(1)-(5)号洗脱液分别浓缩做薄层层析，显色后的结果显示(见图13)

图13可见：3-1薄层板自上而下依次为浅绿色斑点和深红色斑点；3-2薄层板只有深红色斑点；3-3薄层板自上而下依次显示深红色斑点和红色斑点；3-4薄层板自上而下依次显示红色斑点、淡绿色斑点和橙红色斑点；3-5薄层板自上而下依次显示淡绿色斑点、橙红色斑点和绿色斑点，3-5薄层板斑点颜色明显较3-4薄层板要淡。与3薄层板对比发现各斑点的颜色和位置基本相同。分别计算薄层板各斑点的Rf值，其结果显示(见表8)。

表8 3-1至3-5薄层板上各斑点的Rf值(3作对比)

由表8数据可知：深红色斑点、红色斑点和橙红色斑点为辣椒红素斑点；深绿色斑点、淡绿色斑点和绿色斑点为辣椒碱斑点；辣椒红素类物质的Rf值约为0.72、0.59和0.40，辣椒碱的Rf值约为0.95、0.52和0.35，辣椒红素与辣椒碱的Rf值之差在0.05-0.55范围内，分离效果明显。从薄层层析板上的斑点分布情况，可推断并得出如下结论：(1)号洗脱液中含有辣椒红素和辣椒碱的量都很少；(2)号洗脱液中只含有辣椒红素，并且成分单一；(3)号洗脱液中也只含有辣椒红素，但是其成分为两种辣椒红素；(4)号洗脱液中含有两种辣椒红素和另一种辣椒碱；(5)号洗脱液中含有两种辣椒碱和一种辣椒红素，且含量相对更少。

从洗脱顺序和效果来看，一级柱层析分离收集的前期洗脱液和中期洗脱液再经过二级柱层析分离可以得到辣椒碱的单一成分(1-1和2-1洗脱液)。虽然一级柱层析分离收集的前期洗脱液和中期洗脱液再经过二级柱层析分离收集的其余部分洗脱液没有得到不含辣椒红素的辣椒碱，但已经取得了良好的分离效果，因为每种收集的洗脱液均只含有一种类型的辣椒碱，经薄层层析验证，且与辣椒红素不存在交叉分布现象，为三级柱层析分离获得单一辣椒碱成分提供了条件。需要说明的是，本方法的一级柱层析分离收集的后期洗脱液没有分离辣椒碱的价值，因为后期洗脱液中辣椒碱类物质含量少，且存在与辣椒红酥交叉分布现象。总之，通过本发明进行的二级柱层析能够得到辣椒碱纯品。

可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，如三级柱层析分离等，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。