一种可生物降解的核交联含钆配合物的聚合物及其制备方法和用途与流程

本发明涉及一种可生物降解的核交联含钆配合物的聚合物及其制备方法和用途。

背景技术：

在临床实践中，影像学检查在大多数疾病的定性和定位诊断中发挥着非常重要的作用。在这些影像学检查手段中，磁共振成像作为非侵入性诊断工具具有高分辨率成像和三维软组织成像等优势，其中，对比增强磁共振成像通过对比剂可进一步增强正常组织和疾病组织之间的对比，获得清晰准确的图像。目前，dtpa-gd、dtpa-gd和其他钆螯合物对比剂正广泛应用于磁共振增强成像，但是这些对比剂的效果、敏感度和循环系统弛豫时间具有诸多限制，比如，这些对比剂会很快被清除而不能获得长时间的体内循环。因此，为了达到更好的效果不得不重复注射和高剂量注射，但是这种方式会导致一些不良效应。理想的对比剂，应当具有高弛豫率，还应当具有生物安全性。针对肿瘤诊断的对比剂还要求其在肿瘤部位有高聚集，实现肿瘤高靶向性等。

随着最近材料化学和纳米技术的发展，研究者们尝试将dtpa-gd等小分子偶联或包埋到大分子系统中形成具有纳米尺寸的大分子磁共振对比剂。这些纳米尺寸的载体包括脂质体、胶束和其他聚合物，它们通过增强渗透滞留效应(epr效应)增加弛豫效率和肿瘤聚集度。在这些材料中，纳米尺寸的聚合物能够有效克服传统对比剂的缺点，并且拥有很好的临床前景。

水解聚马来酸酐hpma无毒，无免疫原性，能够在血液中有良好的循环。现有报道的hpma共聚物拥有良好的生物相容性、无致免疫性、中性电荷和良好的水溶性能，通常作为肿瘤载体使用，但是其存在无法有效降解的问题，若携带钆等物质，对人体的副作用较大，可能会导致肾系统性纤维化等疾病。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种可生物降解的含钆配合物的聚合物及其制备方法和用途。

本发明首先提供了一种可生物降解的线性hpma聚合物，它的结构式如下式(ⅰ)：

其中，m＝57～170，n＝380～1150。

优选地，所述聚合物的结构式中，m＝100，n＝672。

优选地，所述聚合物的质量平均分子量为10～40kda，优选为28kda。

优选地，所述聚合物中gd的重量百分比为4～10％，优选为6.6％。

优选地，所述聚合物的pdi<2.5，优选为1.09。

本发明还提供了一种可生物降解核交联的含钆配合物的聚合物，它的结构式如下式(ⅱ)：

其中，m＝57～170，n＝380～1150，p＝16～50，q＝16～50；

代表如下结构(ⅲ)(含钆配合物的phpma的一条单链)：

优选地，所述聚合物的结构式中，m＝100，n＝672，p＝28，q＝28。

优选地，所述聚合物的质量平均分子量为100～300kda，优选为181kda。

优选地，所述聚合物中gd的重量百分比为4～10％，优选为6.1％。

优选地，所述聚合物的pdi<2.5，优选为1.95。

本发明前述线性聚合物可以按照如下方法制备，步骤如下：

(1)线性共聚物phpma-dota的合成：取hpma、4-cta、ma-dota和va044，加入水/甲醇溶液，反应，经液氮冷却后在丙酮中沉淀出聚合物，得到粉红色固体，透析后冻干，得含二硫代苯甲酸酯基团的hpma共聚物；将含二硫代苯甲酸酯基团的hpma共聚物与v501溶于甲醇，加热，反应，透析后冻干，即得phpma-dota；

(2)线性含钆hpma共聚物的合成：将phpma-dota和gdcl3·6h2o溶解在水中，然后调节ph至5.2-5.4，反应，透析后冻干，即得phpma-dota-gd。

步骤(1)中，所述hpma、4-cta、ma-dota和va044的摩尔比为：9.75mmol：79μmol：6.5mmol：26.3μmol；所述水/甲醇溶液中，水与甲醇的体积比为5：1；每9.75mmolhpma，加入22ml水/甲醇溶液；所述反应是在0℃下溶液充满氩气40分钟，然后44℃下旋转8h；所述透析的时间是12h。

步骤(1)中，白色固体与v501的反应是在室温下旋转24小时；透析的时间是24h。

步骤(2)中，所述phpma-dota和gdcl3·6h2o的质量比为800：928mg，每800mg的phpma-dota使用的水为25ml；透析的时间是24h。

本发明前述核交联的含钆配合物的聚合物可以按照如下方法制备，步骤如下：

1)线性hpma共聚物phpma-dota的合成：取hpma、4-cta、ma-dota和va044，加入水/甲醇溶液，反应，经液氮冷却后在丙酮中沉淀出聚合物，得到得到粉红色固体，为含二硫代苯甲酸酯基团的hpma共聚物；

2)吡啶二硫代基团修饰的phpma-dota共聚物的合成:取含二硫代苯甲酸酯基团的聚合物(phpma-dotawithdithiobenzoategroup)和ptema，加入水/甲醇溶液和va044，反应，经液氮冷却后在丙酮中沉淀出聚合物，得到粉红色固体；将粉红色固体与v501溶于甲醇，加热反应，透析后冻干，得到产物吡啶二硫代基团修饰hpma共聚物；

3)核交联phpma-dota聚合物的合成：氮气保护下，吡啶二硫代基团修饰的phpma-dota溶解在去离子水/甲醇溶液中，充分搅拌后,乙酸乙酯/丙酮溶解的三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)缓慢逐滴加入然后继续搅拌；丙酮脱去杂质,然后通过sec仪器的系统进一步纯化；收集有用成分、透析、冻干后得到白色产物核交联phpma-dota聚合物；

4)核交联phpma-dota-gd聚合物的合成：将核交联phpma-dota聚合物和gdcl3·6h2o溶解在水中，然后调节ph至5.2-5.4，反应，透析后冻干，即得核交联phpma-dota-gd聚合物。

步骤1)中，所述hpma、4-cta、ma-dota和va044的摩尔比为：9.75mmol：79μmol：6.5mmol：26.3μmol；所述水/甲醇溶液中，水与甲醇的体积比为5：1；每9.75mmolhpma，加入22ml水/甲醇溶液；所述反应是在0℃下溶液充满氩气40分钟，然后44℃下旋转8h；所述透析的时间是12h。

步骤2)中，所述含二硫代苯甲酸酯基团的聚合物(phpma-dotawithdithiobenzoategroup)与ptema的质量比为6:1；反应时加入的水/甲醇溶液中，水与甲醇的体积比为3：1；每1.2gphpma-dota，加入1.8ml水/甲醇溶液和3.2mgva044；所述反应是0℃下溶液充满氩气40分钟，然后44℃下旋转8小时；将白色固体溶解在水/甲醇溶液中时，所述水/甲醇溶液中的水与甲醇的体积比为4：1，以反应的起始物聚合物phpma-dota为1.2g计，水/甲醇溶液的用量为8ml；

步骤2)中，所述粉红色固体，与10倍量的v501在70℃反应3小时。

步骤3)中，每900mg氮吡啶二硫代基团修饰的phpma-dota溶解在20ml水/甲醇溶液中；所述水/甲醇溶液中，水与甲醇的体积比为6：1；所述乙酸乙酯/丙酮中，二者体积比为1:1；三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)每20mg加入1ml的乙酸乙酯/丙酮中；所述三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)每20mg的滴加时间为1小时；反应为搅拌反应6小时；所述纯化时采用sec仪器的系统纯化。

步骤4)中，所述phpma-dota和gdcl3·6h2o的质量比为800：928mg，每800mg的phpma-dota使用的水为25ml；透析的时间是24h。

本发明还提供了前述聚合物在制备磁共振成像的对比增强剂中的用途。

本发明的优势在于：

1.本发明的制备方法设计并通过可逆加成-断裂链转移(raft)聚合和“点击”化学构建了功能化的线性含钆配合物的聚合物phpma-dota-gd，以及可降解的核交联的聚合物core-crosslinkedphpma-dota-gd。首先通过可逆加成-断裂链转移(raft)聚合，制备的分子量基本可控、分子量多分散系数(pdi)低的聚合物；并通过与gd(iii)偶联，合成线性化的hpma-dota-gd。在此基础之上，合成了核交联的聚合物，将肿瘤微环境特意响应可降解的二硫键引入内核中，使其具有支化分子的分子结构特征，大大提高弛豫效能。与临床上在用的二乙基三胺五乙酸-gd(dtpa-gd)磁共振成像探针相比，纵向弛豫效能(t1)是前者的三倍以上(10.49mm^-1·s^-1/gd)。同时，交联的聚合物量与线性聚合物以及临床试剂比较，可以延长在血液中的循环时间，增加epr被动靶向的能力，提高磁共振成像探针在肿瘤部位的聚集度，从而增加肿瘤部位的成像效果及治疗效果。

2.本发明的内核交联的含钆配合物的聚合物能够结合多个小分子量gd(iii)共轭物(dota)，分子量获得提高(mw>180kda)，其可以降解为低于肾脏阈值的低分子量产物(<50kda)，且具有无免疫性、无毒性、水溶性及良好的生物相容性。

本发明还提供了前述聚合物在制备增强磁共振成像的对比剂中的用途。

本发明可生物降解核交联的含钆配合物的聚合物core-crosslinkedphpma-dota-gd具有高的弛豫率，用于体内成像的效果优良，同时无毒，生物相容性好，可降解，作为磁共振成像的对比剂使用的效果优良，临床应用前景优良。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1合成线路图

图2聚合物核磁谱图。

图3phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和dtpa-gd水溶液在3.0t磁共振中的t1-加权扫描图像(a)和纵向弛豫率(1/t1)vs.gd(iii)(b)。

图4phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和dtpa-gd水溶液在1.5t磁共振中的t1-加权扫描图像(a)和纵向弛豫率(1/t1)vs.gd(iii)(b)。

图5注射浓度为0.08mmolgd(iii)/kg的phpma-dota-gd、core-crosslinked-phpma-dota-gd和dtpa-gd的小鼠在不同时间点下扫描图像(a).小鼠体内肿瘤部位信号相对增强百分比(b),每组5只小鼠。

图6注射浓度为0.08mmolgd(iii)/kg的phpma-dota-gd、core-crosslinked-phpma-dota-gd和dtpa-gd的小鼠在不同时间点下扫描图像(a).小鼠体内膀胱部位信号相对增强百分比(b),每组5只小鼠。

图7注射浓度为0.08mmolgd(iii)/kg的phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd24小时后体内重要器官的残余量；每组5只小鼠。

图8phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和dtpa-gd在4t1(a)和lo2(b)细胞系中的细胞毒性实验。

图9红细胞在不同条件下的溶血实验:phpma-dota-gd溶液中(a)和core-crosslinkedphpma-dota-gd溶液中(b)；红细胞在不同浓度的phpma-dota-gd溶液中和core-crosslinkedphpma-dota-gd溶液中的(c)

图10不同浓度(2mg/mland5mg/ml)phpma-dota-gd(a)和core-crosslinkedphpma-dota-gd(b)溶液对于正常人鲜血aptt和pt的影响，pbs为对照组。

图11通过sem观察phpma-dota-gd(3mg/ml,a)、core-crosslinkedphpma-dota-gd(3mg/ml,b)和pbs溶液(c)对于红细胞形态和聚集度的影响。

图12正常balb/c小鼠注射0.08mmolgd(iii)/kg的dtpa-gd、phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和生理盐水。21天内小鼠体重变化(a)，注射20天后小鼠重要器官钆的残余量(b)；每组5只小鼠。

图13正常balb/c小鼠注射0.08mmolgd(iii)/kg的dtpa-gd、phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和生理盐水。注射20天后小鼠血常规检测结果；每组7只小鼠。

图14正常balb/c小鼠注射0.08mmolgd(iii)/kg的dtpa-gd、phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和生理盐水。注射20天后小鼠生化检测结果；每组7只小鼠。

图15注射core-crosslinkedphpma-dota-gd、phpma-dota-gd和生理盐水20天后体内重要器官的组织he染色切片。

具体实施方式

实施例1本发明可生物降解核交联支化大分子钆聚合物的制备

1、制备方法

偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐(va044)，环偶氮脒类引发剂v501，4-氰基戊酸二硫代苯甲酸(4-cta)和三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)购买自sigma-adrich公司。

单体hpma(eur.polym.j.,1973,9,7-14)、ma-dota(acsappl.mater.interfaces,2016,8,10499-10512)、ptema(bioconjug.chem.,1998,9,749-757)均按已有文献制备。

hpma、ptema和ma-dota的制备方法如下：

hpma：其结构式为按照j,h.poly[n-(2-hydroxypropyl)methacrylamide]—i.radicalpolymerizationandcopolymerization.eurpolymj.1973；9:7–14公开的hpma制备方法制备。

ma-dota：其结构式为按照lingsunetal.,stimuli-responsivebiodegradablehyperbranchedpolymer-gadoliniumconjugatesasefficientandbiocompatiblenanoscalemagneticresonanceimagingcontrastagents，acsappl.mater.interfaces,2016,8(16),pp10499–10512的附件部分公开的ma-dota方法制备。

ptema：其结构式为按照wang,l.,j.kristensen,andd.e.ruffner,deliveryofantisenseoligonucleotidesusinghpmapolymer:synthesisofathiolpolymeranditsconjugationtowater-solublemolecules.，《bioconjugatechemistry》,1998,9(6):749-757方法部分公开的方法制备。

合成材料的平均分子量(mw)以及多分散性均采用体积排阻色谱法(sec)进行检测(ge公司，系统)，使用含30％甲醇的乙酸钠溶液作为流动相。

本发明的合成线路图如图1所示。

线性hpma共聚物(phpma-dota)的合成：hpma(1.4g,9.75mmol)、4-cta(12mg，79μmol)、ma-dota(3.34g,6.5mmol)和va044(8.5mg,26.3μmol)投入反应瓶，加入去离子水/甲醇溶液(5：1，22ml)。0℃下溶液充满氩气40分钟，然后44℃下旋转8小时。溶液经液氮冷却后在丙酮中沉淀出聚合物，得到粉红色固体。透析12小时后冻干，得到粉红色产物二硫代苯甲酸酯基团聚合物(phpma-dotawithdithiobenzoategroup，45％产率，2.15g)。该聚合物的¹hnmr波谱图见图2a,其二硫代苯甲酸酯基团的氢质子峰为7.51-7.80ppm。二硫代苯甲酸酯基团聚合物(phpma-dotawithdithiobenzoategroup，1.2g)与v501(10倍量)溶于50ml甲醇，在70℃冷凝回流反应3小时，透析出去副产物，经过冷冻干燥可获得聚合物(phpma-dota)，产率90％,1.08g。phpma-dota的1hnmr波谱图见图2b,其二硫代苯甲酸酯基团被取代,7.51-7.80ppmde氢质子峰消失。

线性含钆hpma共聚物(phpma-dota-gd)的合成：phpma-dota(800mg)和gdcl3·6h2o(928mg,2.5mmol)溶解在25ml去离子水中，然后用0.1mnaoh溶液调节ph至5.2-5.4，然后室温下旋转24小时。透析24小时后冻干得到终产物(phpma-dota-gd,810mg)，通过icp-ms测得载gd(iii)量为6.6％，分子量和分布见表1。

吡啶二硫代基团修饰的phpma-dota共聚物的合成:二硫代苯甲酸酯基团聚合物(phpma-dotawithdithiobenzoategroup，1.2g)和ptema(200mg,0.79mmol)投入反应瓶,然后加入去离子水/甲醇溶液(3:1,8ml)和va044(3.2mg,10μmol)，0℃下溶液充满氩气40分钟，然后44℃下旋转8小时。溶液经液氮冷却后在丙酮中沉淀出聚合物，干燥得到粉红色固体(产率75％y，1.05g)。同时含二硫代苯甲酸酯基团和吡啶二硫代基团的聚合物(1.0g)与v501(10倍量)溶于50ml甲醇，在70℃冷凝回流反应3小时，透析去出副产物，经过冷冻干燥可获得吡啶二硫代基团的聚合物(pyridinedisulfidemodifiedphpma-dota),产率91％，0.91g。

核交联的聚合物(core-corsslinkedphpma-dota)的合成：氮气保护下，吡啶二硫代基团的聚合物(pyridinedisulfidemodifiedphpma-dota，900mg)溶解在去离子水/甲醇溶液(6:1,20ml)中，充分搅拌后，乙酸乙酯/丙酮(1:1,1ml)溶解的三羟甲基丙烷三(3-巯基丙酸酯)(20mg)缓慢逐滴加入(1小时)然后继续搅拌6小时。200ml丙酮沉淀除去杂质,然后通过sec仪器的系统进一步纯化、透析、冻干后得到白色产物核交联聚合物(core-crosslinkedphpma-dota,810mg)。

核交联含钆聚合物(core-corsslinkedphpma-dota-gd)的合成:核交联聚合物(core-crosslinkedphpma-dota,800mg)和gdcl3·6h2o(928mg,2.5mmol)反应生成核交联聚合物core-crosslinkedphpma-dota-gd，合成步骤与phpma-dota-gd合成步骤相同。通过icp-ms测得核交联phpma-dota-gd聚合物(core-crosslinkedphpma-dota-gd)钆离子的含量为6.1％(重量百分含量)。核交联phpma-dota-gd(core-crosslinkedphpma-dota-gd)的1hnmr波谱图见图2c，分子量表征见表1。

2、性质检测

2.1检测方法

质量平均分子量(mw)和多分散性(pdi)是通过尺寸排阻色谱(sec)测得。聚合物的核磁谱图经高分辨超导核磁共振波谱仪(瑞士bruker公司，brukeravii-400mhz，brukeravii-600mhz)测得。钆离子含量经电感耦合等离子体质谱仪(icp-ms,elandrc-e,美国珀金埃尔默)测得。

同时检测phpma-dota和核交联phpma-dota-gd(core-crosslinkedphpma-dota-gd)的1hnmr波谱图。

2.2检测结果

含钆配合物的直链聚合物(phpma-dota-gd)和核交联的聚合物(core-crosslinkedphpma-dota-gd)的表征结果如表1：

表1.含钆配合的直链聚合物(phpma-dota-gd)和核交联的聚合物(core-crosslinkedphpma-dota-gd)的表征：

phpma-dota的1hnmr波谱图见图2b,其二硫代苯甲酸酯基团被取代,7.51-7.80ppmde氢质子峰消失。核交联phpma-dota-gd(core-crosslinkedphpma-dota-gd)的1hnmr波谱图见图2c，分子量表征见表1。

实验结果说明，本发明制备得到了线性phpma-dota-gd，其结构式为：

其中，m＝100，n＝672；

本发明还制备得到了核交联phpma-dota-gd(core-crosslinkedphpma-dota-gd)，其结构式如下式(ⅱ)：

其中，m＝100，n＝672，p＝28，q＝28；

代表如下结构(ⅲ)(含钆配合物的phpma的一条单链)：

以下用实验例的方式来证明本发明的生物学效果：

实验例1本发明可生物降解核交联的含钆配合物的聚合物的性质以及应用

取实施例1制备的核交联的含钆配合物的聚合物phpma-dota-gd，进行如下实验，以检测其性质：

1.1生物降解性研究

将core-crosslinkedphpma-dota-gd溶于含有含谷胱甘肽(gsh)的mcilvaine's缓冲液(4mg/ml，50mm柠檬酸盐/0.1m磷酸盐，2mmedta，4mm谷胱甘肽，ph＝5.4)，37℃孵育12小时，然后通过sec(系统，ge医疗)对样本的降解性进行检测，superose6hr10/30预装柱装载含30％甲醇(ph6.5)的乙酸钠溶液作为流动相(流动率：0.4ml/min)。

1.2体外t1水相弛豫实验

室温下ph7.4pbs溶解材料，材料浓度为对应gd(iii)溶度(0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5mm)，临床用gd-dtpa为对照组，1.5t磁共振扫描，t1加权磁共振扫描序列参数如下：te＝8.7ms,tr＝25,30,50,70,90,110,150,170,190,210,250,300,400,600,700,and800ms,fov＝200mm,slicethickness＝2.0mm,matrixdimensions＝256×256。弛豫效率值通过1/t1和gd(iii)离子线性关系的斜率得出。

1.3体内磁共振成像

通过体内磁共振成像实验，观察材料在肿瘤部位的聚集。利用4t1细胞小鼠背部皮下接种建立小鼠乳腺癌皮下模型。首先7×10⁵个4t1细胞准确接种到6-7周龄balb/c小鼠背部，肿瘤生长到约15mm³左右后将小鼠随机分为3组，每组包括5只小鼠。三组小鼠分别尾静脉注射phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和临床用dtpa-gd((0.08mmolgd(iii)/kg)。通过3.0t磁共振扫描仪获得不同时间点材料在肿瘤部位的聚集度。扫描前用苯巴比妥麻醉小鼠，然后将小鼠固定于定制线圈。t1加权扫描序列如下：tr＝450ms,te＝11ms,slices＝11,voxelsize＝0.2×0.2×1.5mm,fov＝51mm。注射前，注射后10、30、45、60、180分钟后分别扫描，获得肿瘤部位聚集图像，然后利用磁共振成像系统工具圈取肿瘤部位获得具体数值。信号相对增强比(δsnr)计算公式如下图：

si(tumor),si(bladder)andsi(water)分别为肿瘤、膀胱和水膜的信号强度。

1.4体内组织分布实验

15只皮下乳腺癌模型小鼠随机分为3组，分别通过尾静脉注射phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和dtpa-gd(0.08mmgd(iii)/kg),24小时后处死小鼠，取出重要脏器和组织(心、肝、脾、肺、肾、肿瘤)，4％甲醛溶液固定。器官和组织用pbs清洗一次，称重。用h2o2(1ml)和hno3(3ml)溶解器官，加热到120℃直到组织完全消化，然后用去离子水稀释到4ml。最终样品用电感耦合等离子体质谱(icp-ms)测量各器官或组织内剩余的gd的浓度。体内剩余gd的含量通过下面公式可计算出：

1.5材料细胞毒性实验

通过观察材料对肿瘤细胞和正常细胞的细胞活性的影响来评价其毒性。实验用到4t1细胞(乳腺癌细胞)和lo2细胞(正常肝脏细胞)，两种细胞分别接种到96孔板中(5×10³个/孔，100μldmem培养基在37℃，5％co2的培养箱中培养24h后，弃去96孔培养板中的培养基。然后加入含有不同浓度(25,50,100,200μg/ml)的phpma-dota-gd、core-crosslinkedphpma-dota-gd和dtpa-gd的培养基继续孵育24小时。24小时候用pbs洗三次细胞，然后每孔加入细胞毒性评价试剂盒cck-8(dojindo,japan)。孵育2小时后，用用酶标仪(thermofisherscientific)测450nm处的吸光度。为处理的细胞活性记作100％，根据横线和纵向比较评价其细胞毒性作用。

1.6红细胞溶血性实验

该实验用来评价材料对于红细胞是否有影响。用含有柠檬酸钠的抗凝管抽取正常短期内为服用任何药物的志愿者新鲜血液，1000g离心5min，pbs洗3次，弃去上层清液，取红细胞和pbs配成16％的红细胞悬液。然后向50ul细胞悬液中分别加入浓度分别为phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd至终浓度为1、3、5mg/ml，设立去离子水为对照组，37℃孵育12小时后1000g离心5min，取上层清液200μl转移至96孔板中，酶标仪测定样品在540nm的od值。每个浓度设立三个平行组进行测试。溶血百分率通过下面的公式来计算：

溶血率(％)＝(a-b)/(c-b)×100

a:纳米粒样品溶液测试的吸光度，b:pbs缓冲液样品测试的吸光度，c:水溶液样品测试的吸光度。

1.7活化部分凝血活酶时间(aptt)，凝血酶原时间(pt)

抽取健康人体新鲜血液(抗柠檬酸钠管子中)，1000g离心5min，取上层血浆。向1.5ml的ep管中，加入40μl的phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd材料溶液，然后加入360μl的血浆，设立同体积pbs为阴性对照组，在漩涡震荡仪上混合均匀。采用全自动凝血分析仪上进行测试，每个样品设立3个平行样。

1.8红细胞形貌和聚集

抽取健康人体新鲜血液(抗柠檬酸钠管子中)，加入pbs,1000g离心5min，弃去上层清液，重复两次，搜集红细胞。向1.5ml的ep管中，加入100μl的phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd材料pbs溶液，设立同体积pbs溶液为对照组，然后加入20μl的红细胞，吹打混匀。室温孵育15min，离心，弃去上清液，加入0.5ml4％的pbs多聚甲醛溶液，吹打，混匀，固定至少1h。将固定的红细胞重悬，吸取20μl悬浮液均匀涂在24孔板底部，5min后次用75％，85％，95％，100％的乙醇水溶液进行脱水。最后在25度恒温条件下自然晾干，sem扫描观察细胞形貌和聚集。

1.9体内毒性实验

28只正常雌性balb/c小鼠(20±2g)，随机分为4组，称重，标记(实验通过动物实验伦理委员会的审查)。其中三组小鼠分别尾静脉给予0.08mmolgd(iii)/kg浓度的dtpa-gd,phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd，另外一组给予相同体积的生理盐水作为阴性对照，每4天给药一次，共3次，给药后每2天小鼠称重一次并记录。20天后，小鼠眼球取血后送血常规和生化检测，其中5只处死后取出重要器官(心、肝、脾、肺、肾)，消化后用电感耦合等离子体质谱(icp-ms)测量各器官或组织内剩余的gd的浓度，并计算体内剩余gd的含量。剩余2只小鼠处死后取出重要器官(心、肝、脾、肺、肾)，用4％的多聚甲醛溶液固定48小时，石蜡包埋，he染色，作组织切片分析。

1.10数据分析

实验数据用均值±标准差、方差分析以及双尾t-检验分析，p<0.05被认为结果有显著差异。

2.结果和讨论

2.1核交联聚合物的降解

提高聚合物磁共振成像对比剂的弛豫效能及肿瘤部位的聚集的有效方法就是提高其分子量，同时将聚合物的分子结构调节到支化结构。核交联的含钆配合物的聚合物(core-crosslinkedphpma-dota-gd)的分子量较其直链的含钆配合物的聚合物(cphpma-dota-gd，mw＝28kda)的分子量得到显著提高，达到1-2倍。由于内核的交联，其分子结构调节为支化结构。此外，为了满足肾脏排泄的需要，肾阈值又要求分子量更低。因此，可生物降解的二硫键被引入到交联聚合物的内核中。在肿瘤细胞高表达的谷胱甘肽(gsh)存在的情况下，核交联的聚合物能够降解成低分子量的片段。与gsh共孵育8小时后，交联的聚合物已完全降解为低分子量产物(小于30kda)(表2)，而这一大小低于肾阈值(50kda)。这一降解性归因于gsh可以切开二硫键。研究结果表示这一核交联的聚合物一旦到达肿瘤部位完成作为磁共振对比剂的任务就会发生降解，从而保证他们的有效清除和生物相容性。表2.核交联的含钆配合物的聚合物(core-crosslinkedphpma-dota-gd)的分子量和pdi，以及其降解随时间变化的分析。

2.2体外磁共振成像

如图3所示，3t磁共振下t1加权mr成像显示在相同的gd浓度下，phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd在肿瘤部位信号强度明显高于临床用dtpa-gd，意味着两种聚合物在肿瘤部位的聚集度明显高于临床用dtpa-gd。同时定量r1弛豫率显示phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd的r1值分别为6.42和10.49mm^-1·s^-1，是临床用dtpa-gd[2.54mm^-1·s^-1,pergadolinium(iii)]的3-4倍。1.5t磁共振中也得到同样的结果(见图4)。并且，core-crosslinkedphpma-dota-gd与phpma-dota-gd相比较，前者有更好的磁共振增强效果。

2.3体内磁共振成像

基于体外t1成像效果，我们进一步探究了小鼠模型体内磁共振成像，观察材料在肿瘤部位的增强效果。如图5所示，通过体内磁共振成像图片可以明显看出注射临床用对比剂dtpa-gd后，小鼠肿瘤部位强度在10分钟到180分钟之前先升高后下降，而注射两种材料后，肿瘤部位信号强度明显增加，没有出现下降的趋势。

为了更加准确比较，我们对肿瘤部位强化做了定量分析，通过不同时间点的肿瘤部位的信号强度(si)来量化增强效果。如图6所示，尾静脉注射临床用dtpa-gd的小鼠，与水膜相比，10分钟后信号增强明显(约为220％)，但是30分钟后信号强度开始下降，180分钟后恢复到注射前水平。而应用phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd的小鼠肿瘤部位信号10分钟后增强，然后继续增加，180分钟后信号强度明显高于注射前(约为240-260％)。两者比较，不同时间点core-crosslinkedphpma-dota-gd的增强效果比phpma-dota-gd更加明显。实体肿瘤表现的epr效应各方面因素有关，core-crosslinkedphpma-dota-gd比phpma-dota-gd拥有更加适合的尺寸透过肿瘤新生血管间隙，聚集肿瘤部位达到增强的效果。

值得注意的是，小鼠模型的膀胱信号强度的变化正好与肿瘤部位相反，如图6所示。注射临床用dtpa-gd的小鼠在不同时间点均高于注射core-crosslinkedphpma-dota-gd和phpma-dota-gd的小鼠。这也从另一方面反映了两种材料在体内的循环时间要比临床用dtpa-gd长，可能也是由于分子量的原因。小鼠膀胱更加容易滤过小分子的dtpa-gd，而大分子药物在体内循环过后通过体内酶的作用降解后再排出体外。这样的特性也保证了材料的生物安全性，有利于未来的利用。

2.4材料的体内生物分布

影响信号强度的一个重要因素就是材料的体内分布。如图7所示，与临床用dtpa-gd相比，core-crosslinkedphpma-dota-gd和phpma-dota-gd24小时后肿瘤部位和其他重要器官钆的残余量显著增加。肿瘤部位的钆残余量也正好与磁共振信号强度相印证，再次证明了两种材料的增强效果。其次，其他器官的钆的残余量也明显增加，可能的原因是材料的分子量和尺寸较大，在体内循环时间较长，器官中血供丰富，导致钆的残余量增加。

2.5材料的细胞毒性

通过cck-8实验，我们进一步探究了材料对肿瘤细胞和正常细胞的细胞毒性作用。如图8所示，与临床用dtpa-gd相比，材料在4t1肿瘤细胞的细胞活性更低而在lo2正常肝细胞的活性更高(从25μg/ml到200μg/ml)。应该主要归因于我们材料成分的生物相容性和表面带负电荷等因素。这也验证了材料的良好的生物安全性。

2.6血液相容性试验

材料对于红细胞溶血的影响：红细胞表面可以和某些抗体结合形成免疫复合物，激活补体导致红细胞溶血。材料进入人体内，首先与细胞膜相接触，可能导致补体激活，所以分析材料对红细胞溶血的影响是很有必要的。在我们的实验中，如图9所示，1.0、2.0、5.0mg/ml浓度的材料经过孵育12小时，没有发现溶血现象，最高溶血率还是低于1％。而美国材料试验学会标准指出可接受的溶血率应低于5％，所以两种材料具有很好的生物安全性。这个结果有可能是很多因素导致的，表面负电荷和可降解等特点可能发挥了重要作用。

aptt和pt:对于正常机体来说，某些内源性和/或外源性物质能够刺激血液中凝血因子的激活，血小板的聚集，纤维蛋白原的激活最终导致凝血，所以aptt和pt的检测反应血液凝血时间的实验尤为重要。如图10所示，与pbs阴性对照比较，在不同的浓度下aptt和pt的时间均在正常范围之内，说明材料对于血液凝血功能没有太大的影响。

2.7材料对于红细胞聚集和形态的影响

根据之前的文献报道，红细胞表面负电荷与带正电材料之间的电子间相互作用可能影响到红细胞的形态的聚集状态，同时材料中的部分疏水性结构也会对红细胞有所影响，因此观察红细胞的形态和聚集状态也是很有必要的。如图11所示，不同浓度的材料和pbs比较，红细胞的形态和聚集都没有明显的改变。在低倍下，经过材料孵育过的红细胞具有良好的分散性，没有出现异常的表现；高倍下，红细胞膜表面光滑完整，呈现正常的双凹圆盘状结构，和pbs对照组相比，没有明显的结构变化。因此，我们认为材料对红细胞的形貌和聚集状态没有明显的负面影响，血液安全性良好。

2.8材料对于正常小鼠的毒性作用

材料对于正常小鼠是否具有毒性作用能够综合反映出材料的生物安全性。尾静脉注射材料后，小鼠没有表现出脱水、运动失协调、肌肉萎缩、贫血等其他动物毒性相关特征。小鼠体重变化如图12所示，与生理盐水对照，材料组和dtpa-gd组的均没有太大的变化，处于正常生长范围之内。体重变化说明材料对于正常小鼠没有明显的毒副作用。血常规和生化检测能够反映出小鼠体内血液状态和肝肾功能。如图13所示，注射core-crosslinkedphpma-dota-gd和phpma-dota-gd的小鼠血常规指标：红细胞(rbc)、血红蛋白(hgb)、红细胞压积(hct)、血小板数(plt)、平均血小板体积(mpv)、白细胞数(wbcs)，所有指标与注射dtpa-gd组无明显差异。如图14所示，注射core-crosslinkedphpma-dota-gd和phpma-dota-gd的小鼠生化检查指标：谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)、碱性磷酸酶(alp)、谷氨酰转移酶(ggt)、尿素氮(bun)、肌酐(cre)，所有指标与注射dtpa-gd组无明显差异。为了进一步验证体内毒性，小鼠处死后器官组织切片分析没有发现组织损害、炎症等变化(图15)。

3.结论

综上所述，本发明phpma-dota-gd和core-crosslinkedphpma-dota-gd的弛豫率r1值分别为6.42和10.49mm^-1·s^-1，是临床用dtpa-gd[2.54mm^-1·s^-1,pergadolinium(iii)]的2.5-4.1倍，体内磁共振成像实验也进一步验证它们作为对比剂用于体内成像的效果非常良好，同时可降解，体内体外毒性试验表明材料具有良好的生物相容性和生物安全性。

综上，本发明可生物降解核交联支化大分子钆聚合物core-crosslinkedphpma-dota-gd具有高的弛豫率，用于体内成像的效果优良，同时可降解，无毒，生物相容性好，临床应用前景优良。