生产米尔贝霉素的重组链霉菌及其制备方法和应用与流程

文档序号:12411248阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种重组链霉菌,相对于相应的野生型链霉菌或者产生该重组链霉菌的起始链霉菌,所述重组链霉菌选自如下的任一个、任两个、任三个或全部四个基因是失活的,例如是被敲除的:

(i)编码SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的氨基酸序列的基因mpca2;

(ii)编码SEQ ID NO:9所示氨基酸序列或与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的氨基酸序列的基因mpca3;

(iii)编码SEQ ID NO:10所示氨基酸序列或与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的氨基酸序列的基因mpca4;

(iv)编码SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的氨基酸序列的基因mpca5。

2.权利要求1的重组链霉菌,其选自重组米尔贝霉素链霉菌(Streptomyces milbemycinicus)、重组冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)、重组吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)例如重组吸水链霉菌金泪亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus)和重组灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)。

3.权利要求1或2的重组链霉菌,其是以保藏号CGMCC No.7677保藏在CGMCC的米尔贝霉素链霉菌的重组菌株,其中相对于CGMCC No.7677链霉菌,所述重组菌株中的基因mpca2、基因mpca3、基因mpca4和基因mpca5的任一个、任两个、任三个或全部四个是失活的。

4.权利要求1-3任一项的重组链霉菌,其中所述重组链霉菌的基因组中选自如下的一个或多个核苷酸序列是缺失或敲除的:

(i)SEQ ID NO:7所示的974-2452位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的核苷酸序列的片段,例如SEQ ID NO:7所示的x-y位核苷酸,其中x是974至1581的任一整数,y是1834至2452的任一整数,如SEQ ID NO:7所示的1581-1834位核苷酸,

(ii)SEQ ID NO:7所示的2449-3606位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的核苷酸序列的片段,例如SEQ ID NO:7所示的x-y位核苷酸,其中x是2449至2894的任一整数,y是3305至3606的任一整数,如SEQ ID NO:7所示的2894-3305位核苷酸,;

(iii)SEQ ID NO:7所示的3828-4892位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的核苷酸序列的片段,例如SEQ ID NO:7所示的x-y位核苷酸,其中x是3828至3889的任一整数,y是4495至4892的任一整数,如SEQ ID NO:7所示的3889-4495位核苷酸,

(iv)SEQ ID NO:7所示的620-892位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的核苷酸序列的片段。

5.一种产生重组链霉菌的方法,包括失活例如敲除链霉菌中选自如下的任一个、任两个、任三个或全部四个基因:

(i)编码SEQ ID NO:8所示氨基酸序列或与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的氨基酸序列的基因mpca2;

(ii)编码SEQ ID NO:9所示氨基酸序列或与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的氨基酸序列的基因mpca3;

(iii)编码SEQ ID NO:10所示氨基酸序列或与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的氨基酸序列的基因mpca4;

(iv)编码SEQ ID NO:11所示氨基酸序列或与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的氨基酸序列的基因mpca5。

6.权利要求5的方法,其中所述链霉菌选自米尔贝霉素链霉菌例如以保藏号CGMCC No.7677保藏在CGMCC的米尔贝霉素链霉菌、冰城链霉菌、吸水链霉菌如吸水链霉菌金泪亚种和灰产色链霉菌。

7.权利要求5或6的方法,其中缺失或敲除链霉菌的基因组中选自如下的一个或多个核苷酸序列:

(i)SEQ ID NO:7所示的974-2452位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的核苷酸序列的片段,例如SEQ ID NO:7所示的x-y位核苷酸,其中x是974至1581的任一整数,y是1834至2452的任一整数,如SEQ ID NO:7所示的1581-1834位核苷酸,

(ii)SEQ ID NO:7所示的2449-3606位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的核苷酸序列的片段,例如SEQ ID NO:7所示的x-y位核苷酸,其中x是2449至2894的任一整数,y是3305至3606的任一整数,如SEQ ID NO:7所示的2894-3305位核苷酸,

(iii)SEQ ID NO:7所示的3828-4892位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的核苷酸序列的片段,例如SEQ ID NO:7所示的x-y位核苷酸,其中x是3828至3889的任一整数,y是4495至4892的任一整数,如SEQ ID NO:7所示的3889-4495位核苷酸,

(iv)SEQ ID NO:7所示的620-892位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的核苷酸序列的片段。

8.一种生产米尔贝霉素的方法,包括在适于米尔贝霉素产生的条件下培养权利要求1-4任一项的重组链霉菌或根据权利要求5-7任一项的方法获得的重组链霉菌,任选包括回收、分离和/或纯化产生的米尔贝霉素。

9.选自如下的物质在生产米尔贝霉素中的应用:

(1)权利要求1-4任一项的重组链霉菌,

(2)权利要求5-7任一项的方法获得的重组链霉菌,

(3)包含选自SEQ ID NO:8-11的任一氨基酸序列的多肽,

(4)编码选自SEQ ID NO:8-11的任一氨基酸序列及与其具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相同性的氨基酸序列的核酸。

10.多肽,包含选自SEQ ID NO:8-11任一的氨基酸序列。

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