生产米尔贝霉素的重组链霉菌及其制备方法和应用与流程

本发明涉及分子生物学技术领域，尤其涉及制备生产抗生素、特别是米尔贝霉素的重组工程化链霉菌的方法和获得的重组链霉菌及其应用。

发明背景

米尔贝霉素是一种大环内酯类驱虫药物，日本三共株式会社于1967年发现，经过多年改良于1986年正式以商品名米尔贝肟(milbemycin oxime)上市。米尔贝肟是米尔贝霉素A3和米尔贝霉素A4的肟衍生物，米尔贝肟对控制和预防大部分常见寄生虫疾病都有很好的效果。通常用来预防恶丝虫病，控制线虫、钩虫引发的犬、猫疾病及犬的鞭虫病。由于米尔贝肟杀虫活性高、毒性小，LD50是临床推荐用量的2000倍以上，同时对阿维菌素类药物敏感的犬毒性较小，所以具有很好的市场前景。

目前能产米尔贝霉素的菌株有米尔贝霉素链霉菌(Streptomyces milbemycinicus)、冰城链霉菌(Streptomyces bingchenggensis)、吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)例如吸水链霉菌金泪亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.aureolacrimosus)和灰产色链霉菌(Streptomyces griseochromogenes)。它们除主要产生有效组分米尔贝霉素A3/A4外，还可产生近三十多种米尔贝霉素类似物，其中常见的有C5-O-甲基米尔贝霉素B2、B3、β1、β2、α9和α10(US4144352)。这些类似物的产生不仅会降低米尔贝霉素A3/A4的产量，而且会严重影响米尔贝霉素A3/A4后期的分离纯化。

向文胜等报道通过基因工程改造获得了去除米尔贝霉素B2、B3、β1和β2以及南昌霉素的重组冰城链霉菌(CN 103468625 B)。但是还有一类米尔贝霉素类似物α9和α10(图1)在米尔贝霉素提取纯化过程中很难彻底去除(Takiguchi Y et al.1980,Milbemycins,a new family of macrolide antibiotics:fermentation,isolation and physico-chemical properties.J Antibiot(Tokyo).1980Oct；33(10):1120-7)。目前本领域尚未鉴别链霉菌中关于米尔贝霉素类似物α9和α10的合成途径，因此没有关于通过改造相关途径而降低或去除米尔贝霉素类似物α9和α10的相关报道。本领域需要能够在生产米尔贝霉素例如米尔贝霉素A3/A4的同时减少或阻断杂质组分例如米尔贝霉素类似物α9和α10的方法和手段。

技术实现要素：

本发明人意外地发现失活链霉菌中的本发明所述基因mpca2、mpca3、mpca4和mpca5中的至少一个时，使用该链霉菌生产米尔贝霉素时能够去除杂质组分米尔贝霉素类似物α9和α10，而不影响或者有利于米尔贝霉素的生产，简化米尔贝霉素提取纯化工艺，降低生产成本。在某些情况中，使用本发明的重组链霉菌生产米尔贝霉素时不但能够去除杂质组分米尔贝霉素类似物α9和α10，还能够提高有效组分米尔贝霉素A3/A4的发酵单位。

本发明提供了一种重组链霉菌，使用该重组链霉菌生产米尔贝霉素时，相对于使用相应的野生型或起始链霉菌生产米尔贝霉素时，降低或完全去除米尔贝霉素类似物α9和α10杂质组分含量。

在一个实施方案中，本发明提供了一种重组链霉菌，其中相对于相应的野生型链霉菌或者产生该重组链霉菌的起始链霉菌，所述重组链霉菌选自如下的一个、两个、三个或全部四个基因是失活的：

(i)编码SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca2；

(ii)编码SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca3；

(iii)编码SEQ ID NO：10所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca4；

(iv)编码SEQ ID NO：11所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca5。

在本文中，所述野生型链霉菌是指天然环境中存在的、并未进行任何人工操作的链霉菌。

在本发明中，产生所述重组链霉菌的起始链霉菌是指对其进行本发明所示遗传操作例如基因失活的链霉菌。所述起始链霉菌可以是野生型链霉菌，也可以是具有其它遗传修饰但是不具有本发明所述遗传修饰的用于生产米尔贝霉素的链霉菌。

如本文所用，“重组”是指由于有意人为干预所获得的具有所需修饰的菌株，例如与相应天然(非重组)菌株相比，重组菌株低表达或者根本不表达特定天然基因或其活性。

在本发明中，术语“失活”包括部分失活和完全失活，是指基因功能部分或全部丧失，不能产生表达其编码的蛋白质、或蛋白质表达水平降低或消除、或表达的蛋白质的相关生物学活性被降低或消除，例如基因不能被转录或者转录的RNA不能被翻译为具有相应活性的蛋白质、或者产生的蛋白质的量或其活性与未进行所述失活操作的基因翻译的蛋白质的量或活性相比是降低的或者被消除，例如降低至少5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％甚至更多、或者被消除(即降低100％)。

在本发明中，术语“消除”是指与未进行所述遗传操作例如失活操作之前的菌株中存在的相应蛋白的活性相比，进行遗传操作后的菌株中蛋白的活性不可被检测到。

在本发明中，“至少X％相同性”理解为是指要比较的两个序列的氨基酸残基之间的百分比相同性，其是在所述两个序列的最佳排列对比后获得的。所述最佳排列对比可以通过使用本领域已知的任何方法获得，例如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源算法，Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源排列算法，Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.85:2444(1988)的相似性搜索方法及这些算法的计算机执行程序，如由NCBI站点上可用的BLAST P计算机软件所使用的那些。

本领域技术人员可以合理推断，在同一种属中，与参考蛋白质的氨基酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的蛋白质与参考蛋白质在生物体中执行相同的生物学功能。例如，在本发明所述链霉菌中，本领域技术人员能够合理预期与SEQ ID NO：8所示氨基酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的多肽与由SEQ ID NO：8所示氨基酸序列组成的多肽在生物体中执行相同的生物学功能，因此失活与SEQ ID NO：8所示氨基酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的多肽可以获得与失活SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的多肽相同的效果，例如降低或去除米尔贝霉素类似物α9和α10杂质组分含量。

在本发明中，术语“基因mpca2”是指在表达后产生具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的蛋白的基因。在一个实施方案中，基因mpca2具有SEQ ID NO：7的974-2452位核苷酸所示的核苷酸序列。

在本发明中，术语“基因mpca3”是指在表达后产生具有SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的蛋白的基因。在一个实施方案中，基因mpca3具有SEQ ID NO：7的2449-3606位核苷酸所示的核苷酸序列。

在本发明中，术语“基因mpca4”是指在表达后产生具有SEQ ID NO：10所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的蛋白的基因。在一个实施方案中，基因mpca4具有SEQ ID NO：7的3828-4892位核苷酸所示的核苷酸序列。

在本发明中，术语“基因mpca5”是指在表达后产生具有SEQ ID NO：11所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的蛋白的基因。在一个实施方案中，基因mpca5具有SEQ ID NO：7的620-892位核苷酸所示的核苷酸序列。

在本发明中，术语“基因”的最广泛的含义，包括脱氧核糖核苷酸序列，包含蛋白质编码区及参与基因表达的编码区邻近的序列。术语“基因”涵盖了cDNA和基因的基因组形式。基因的基因组形式或克隆含有由称作“内含子”或者“间插区”或者“间插序列”的非编码序列中断的编码区。内含子可含有调节元件如增强子。

如本文所用，编码特定氨基酸序列的基因是指该基因在适当生物体(例如产米尔贝霉素的链霉菌，特别是米尔贝霉素链霉菌)中表达时生成具有所述氨基酸序列的蛋白质。所述基因包括编码所述氨基酸序列的编码序列，还可以包括调节所述基因表达的调控序列，例如启动子等。例如，编码SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的基因mpca2是指mpca2基因在链霉菌例如米尔贝霉素链霉菌中表达时产生具有SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的多肽；在本发明中，mpca2基因不仅涵盖编码SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的核苷酸序列，也涵盖了调节其表达的调控序列，例如启动子等。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换应用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语也可用于天然发生的氨基酸聚合物，也可用于其保守修饰的变体及其中一或多个氨基酸残基是相应天然发生的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。

在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌选自重组米尔贝霉素链霉菌(例如重组CGMCC No.7677)、重组冰城链霉菌、重组吸水链霉菌例如重组吸水链霉菌金泪亚种和重组灰产色链霉菌。在进一步的实施方案中，本发明所述重组链霉菌是重组米尔贝霉素链霉菌。

在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌是以保藏号CGMCC No.7677保藏在CGMCC的米尔贝霉素链霉菌的重组菌株，其中相对于CGMCC No.7677链霉菌，所述重组菌株选自如下的一个、两个、三个或全部四个基因是失活的：

(i)编码SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca2；

(ii)编码SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca3；

(iii)编码SEQ ID NO：10所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca4；

(iv)编码SEQ ID NO：11所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca5。

在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌中的基因mpca2是失活的。在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌的基因组中SEQ ID NO：7所示的974-2452位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的核苷酸序列的片段是缺失或敲除的。在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌的基因组中SEQ ID NO：7所示的x-y位核苷酸是缺失或敲除的，其中x是974至1581的任一整数，y是1834至2452的任一整数。在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌的基因组中SEQ ID NO：7所示的1581-1834位核苷酸是缺失或敲除的。

在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌中的基因mpca3是失活的。在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌的基因组中SEQ ID NO：7所示的2449-3606位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的核苷酸序列的片段是缺失或敲除的。在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌的基因组中SEQ ID NO：7所示的x-y位核苷酸是缺失或敲除的，其中x是2449至2894的任一整数，y是3305至3606的任一整数。在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌的基因组中SEQ ID NO：7所示的2894-3305位核苷酸是缺失或敲除的。

在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌中的基因mpca4是失活的。在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌的基因组中SEQ ID NO：7所示的3828-4892位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的核苷酸序列的片段是缺失或敲除的。在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌的基因组中SEQ ID NO：7所示的x-y位核苷酸是缺失或敲除的，其中x是3828至3889的任一整数，y是4495至4892的任一整数。在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌的基因组中SEQ ID NO：7所示的3889-4495位核苷酸是缺失或敲除的。

在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌中的基因mpca5是失活的。在一个实施方案中，本发明所述重组链霉菌的基因组中SEQ ID NO：7所示的620-892位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的核苷酸序列的片段是缺失或敲除的。

在一个实施方案中，本发明所述基因失活是基因被敲除或替换。“敲除”是指基因的结构或调节机制的破坏。敲除可以通过例如靶向载体、置换载体或hit-and-run载体同源重组或者随机插入基因捕获载体致使完全或部分丧失基因功能。

本发明还提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括失活链霉菌中选自如下的任一个、任两个、任三个或全部基因：

(i)编码SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca2；

(ii)编码SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca3；

(iii)编码SEQ ID NO：10所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca4；

(iv)编码SEQ ID NO：11所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca5。

本领域中已知的任何适于链霉菌中的基因失活方法均可以用于进行本发明的基因失活，例如包括但不限于基因替换、基因敲除、插入失活、移码突变、定点诱变、基因部分缺失、基因沉默、RNAi、反义抑制等。对于通过上述方法失活基因可以参见本领域已知的教科书、技术手册和参考文献(例如Kieser T,Bibb M.Practical Streptomyces Genetics[M].Norwich:The John Innes Foundation,2000)。

在一个实施方案中，本发明提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括失活链霉菌中编码SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca2。

在一个实施方案中，本发明提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括缺失或敲除链霉菌中SEQ ID NO：7所示的974-2452位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的核苷酸序列的片段。在一个实施方案中，本发明提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括缺失或敲除链霉菌中SEQ ID NO：7所示的x-y位核苷酸，其中x是974至1581的任一整数，y是1834至2452的任一整数。

在一个实施方案中，本发明提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括缺失或敲除链霉菌中SEQ ID NO：7所示的1581-1834位核苷酸。

在一个实施方案中，本发明提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括失活链霉菌中编码SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca3。

在一个实施方案中，本发明提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括缺失或敲除链霉菌中SEQ ID NO：7所示的2449-3606位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的核苷酸序列的片段。在一个实施方案中，本发明提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括缺失或敲除链霉菌中SEQ ID NO：7所示的x-y位核苷酸，其中x是2449至2894的任一整数，y是3305至3606的任一整数。在一个实施方案中，本发明提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括缺失或敲除链霉菌中SEQ ID NO：7所示的2894-3305位核苷酸。

在一个实施方案中，本发明提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括失活链霉菌中编码SEQ ID NO：10所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca4。

在一个实施方案中，本发明提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括缺失或敲除链霉菌中SEQ ID NO：7所示的3828-4892位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的核苷酸序列的片段。在一个实施方案中，本发明提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括缺失或敲除链霉菌中SEQ ID NO：7所示的x-y位核苷酸，其中x是3828至3889的任一整数，y是4495至4892的任一整数。在一个实施方案中，本发明提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括缺失或敲除链霉菌中SEQ ID NO：7所示的3889-4495位核苷酸。

在一个实施方案中，本发明提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括失活链霉菌中编码SEQ ID NO：11所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca5。

在一个实施方案中，本发明提供了一种产生重组链霉菌的方法，包括缺失或敲除链霉菌中SEQ ID NO：7所示的620-892位核苷酸或其片段、或具有与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的核苷酸序列的片段。

在一个实施方案中，本发明所述方法用于产生重组米尔贝霉素链霉菌(例如CGMCC No.7677)、重组冰城链霉菌、重组吸水链霉菌例如重组吸水链霉菌金泪亚种或重组灰产色链霉菌。

在一个实施方案中，本发明所述基因失活是通过基因敲除或替换实现的。

在一个实施方案中，本发明提供了一种产生以保藏号CGMCC No.7677保藏在CGMCC的米尔贝霉素链霉菌的重组菌株的方法，包括失活(例如敲除)CGMCC No.7677中的选自如下的一个、两个、三个或全部四个基因：

(i)编码SEQ ID NO：8所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca2；

(ii)编码SEQ ID NO：9所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca3；

(iii)编码SEQ ID NO：10所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca4；和

(iv)编码SEQ ID NO：11所示氨基酸序列或与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的基因mpca5。

本发明还提供了一种生产米尔贝霉素的方法，包括使用本发明所述的重组链霉菌或根据本发明所述产生重组链霉菌的方法获得的重组链霉菌，任选包括回收、分离和/或纯化生产的米尔贝霉素。

本发明所述生产米尔贝霉素的方法可以采用本领域已知的合适步骤和条件(Takiguchi Y et al.1980,Milbemycins,a new family of macrolide antibiotics:fermentation,isolation and physico-chemical properties.J Antibiot(Tokyo).1980 Oct；33(10):1120-7)，例如包括但不限于在适于米尔贝霉素产生的条件下培养本发明所述的重组链霉菌或根据本发明所述产生重组链霉菌的方法获得的重组链霉菌，收获产生的米尔贝霉素，任选进行回收、分离和/或纯化。

在一个实施方案中，本发明提供了一种生产米尔贝霉素的方法，包括：在适于米尔贝霉素产生的条件下培养本发明的重组链霉菌或通过本发明的方法获得的重组链霉菌，收获产生的米尔贝霉素，任选进行回收、分离和/或纯化。

在一个实施方案中，本发明提供了一种生产米尔贝霉素的方法，包括：将本发明所述重组链霉菌或通过本发明的方法获得的重组链霉菌进行种子培养，然后接种发酵培养基并在适于米尔贝霉素产生的条件下进行发酵，收获发酵液，任选回收、分离和/或纯化产生的米尔贝霉素。

本发明所述种子培养和发酵培养可以使用本领域已知的任何合适方法、条件和材料。所述种子培养基和发酵培养基可以使用本领域已知的任何合适的培养基。进行纯化的方法可以使用本领域已知的任何合适方法和技术进行，例如包括但不限于层析萃取、结晶、树脂吸附、离子交换吸附、色层分离和HPLC等。

本发明还涉及本发明的重组链霉菌、通过本发明的方法获得的重组链霉菌、包含选自SEQ ID NO：8-11的任一氨基酸序列的多肽和/或编码选自SEQ ID NO：8-11的任一氨基酸序列及与其具有至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列相同性的氨基酸序列的核酸在制备重组链霉菌及在生产米尔贝霉素中的应用。

本发明还涉及包含SEQ ID NO：8-11的任一氨基酸序列的多肽。

本发明还涉及至少包含SEQ ID NO：7所示的1581-1834位核苷酸、SEQ ID NO：7所示的2894-3305位核苷酸和/或SEQ ID NO：7所示的3889-4495位核苷酸的核酸。

在一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO：7所示的974-2452位核苷酸、SEQ ID NO：7所示的2449-3606位核苷酸、SEQ ID NO：7所示的3828-4892位核苷酸、和/或SEQ ID NO：7所示的620-892位核苷酸的核酸。

附图说明

图1：米尔贝霉素类似物α9和α10质谱检测简图。图1(a):α9质谱峰图；图1(b):α10质谱峰图。

图2：用于构建文库的粘粒载体SuperCos 1简图。

图3：含有目标基因片段的柯斯质粒pSCM-7C11简图。

图4：菌株发酵产物的HPLC检测图谱。图4(a):原始菌株HS023发酵样品；图4(b):重组菌株HS023-102发酵样品；图4(c):重组菌株HS023-103发酵样品；图4(d):重组菌株HS023-104发酵样品。

具体实施方式

本发明利用米尔贝霉素产生菌HS023(CGMCC No.7677)染色体基因组构建Cosmid文库。利用PCR-targeting或者构建同源臂及加载抗性基因构建基因(mpca2、mpca3、mpca4、mpca5)的敲除载体，通过接合转移导入菌株HS023中，利用同源重组原理敲除目的基因，四个基因中敲除任何一个均可彻底阻断杂质组分米尔贝霉素类似物α9和α10的合成。

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当更改基因失活的突变位点以实现去除目标杂质。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试剂皆为普通市售品，皆可于市场购得。

其中，本发明采用：

原始链霉菌HS023保藏编号为CGMCC No.7677(CN 103789339 A)；

大肠杆菌ET12567(pUZ8002)菌株(可购自优宝生物，货号：ST1130)：转化了质粒pUZ8002(可购自E.coli Genetic Stock Center)的大肠杆菌ET12567(ATCC BAA-525)。参见MacNeil DJ等,Analysis of Streptomyces avermitilis genes required for avermectin biosynthesis utilizing a novel integration vector.Gene 111(1):61-8，1992。

阿泊拉霉素抗性基因来源载体pIJ773购自E.coli Genetic Stock Center；

制备采用的限制性内切酶、PCR扩增反应相关试剂购自Takara公司；

阿泊拉霉素(Apra)、卡那霉素(Km)购自生工上海有限公司；

pMD19T购自Takara公司；

平末端化所用的试剂盒均为BKL，购自Takara公司；

去磷试剂盒FastAP^TM，购自Thermo scientific fermentas公司；

III XL Packaging Extract购自Stratagene(USA)公司

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：链霉菌总DNA的提取

取链霉菌HS023冻存管孢子悬液50μL接种于30mL TSB培养基(购自Bacto Tryptic Soy Broth.BD公司)，28℃、220rpm培养48h后，于50mL离心管中，4000rpm离心10min，去上清，沉淀用30mL蔗糖-Tris缓冲液(其中蔗糖的质量百分数为10.3％，Tris-HCl的摩尔-体积浓度为10mM，pH值为8.0)洗涤2遍后，以5mL蔗糖-Tris缓冲液悬浮。加入质量-体积溶度为100mg/mL溶菌酶溶液20μL，37℃水浴2h。加入质量百分数为10％的SDS溶液500μL，温和颠倒直至基本澄清。加酚-氯仿-异戊醇(其中：酚-氯仿-异戊醇的体积比为25:24:1(pH值为8.0)溶液5mL，温和颠倒数次后，4000rpm离心10min。取上层溶液4mL，加酚-氯仿-异戊醇(pH值为8.0)溶液4mL，温和颠倒数次后4000rpm离心10min。接着取上层3mL溶液，加入摩尔-体积浓度为3mol/L的NaAc缓冲液(pH值为5.3)300μL、异丙醇3mL，温和颠倒数次后，将结团的沉淀挑到新的1.5mL离心管。沉淀用体积分数为70％乙醇水溶液洗涤2遍后，室温干燥。加入500μL Tris-HCl(pH8.0)溶解，得到链霉菌的总DNA。

实施例2：米尔贝霉素产生菌基因组文库的构建

应用粘粒载体SuperCos 1(见图2)构建HS023基因组文库。首先建立合适的部分酶切体系用Sau3A1对50-100μg的高分子量的染色体DNA进行部分酶切，再用Tris饱和的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提两次，用氯仿:异戊醇(24:1)抽提一次。转移上层水相至一个新的管子，加入0.1体积的3mol/L醋酸钠、两倍体积的乙醇，混匀，-20℃放置30min。离心沉淀DNA(12000r/min，10min)，用70％乙醇洗涤DNA沉淀，干燥DNA沉淀，悬浮DNA沉淀于适当体积的TE缓冲液中，4℃保存备用。双cos位点载体SuperCos 1先用NheI充分消化质粒DNA，然后用CIAP充分处理，苯酚-氯仿抽提后乙醇沉淀回收，溶于适当体积水中，进一步用BamHI充分酶切，后苯酚-氯仿(pH8.0)抽提后，乙醇沉淀后溶于适当体积TE中，4℃保存备用。用过量载体和基因组片段混合，16℃连接过夜。连接完成后对连接混合物利用III XL Packaging Extract(Stratagene,USA)试剂盒，按照说明书进行包装反应。包装混合物按照转染程序转染宿主菌E.coli DH10B，涂布LB氨苄板。在获得的抗性克隆中随机挑取10个抽取质粒，电泳检测柯斯质粒中的外源片段插入情况，结果显示绝大多数的抗性克隆均有较大的插入。统计包装混合物转染后可以获得的菌落数发现，构建的基因组文库至少含有10000个以上的抗性克隆，文库能够对基因组实现很好的覆盖。

实施例3：基因文库筛选

设计通用引物PcaF/PcaR(SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2)，利用菌落PCR筛选实施例2构建的基因组文库，共筛选1000个单菌落，获得两个可能含有目的序列的Cosmid，分别编号pSCM-7C11和pSCM-4C12，利用通用引物T7和T3两端测序，结果显示pSCM-7C11载体中四个基因位于序列中央(见图3)，适合后续的基因操作，同时对pSCM-7C11进行测序，获得四个基因的全序列(见序列SEQ ID NO:7)。

实施例4：基因敲除质粒的构建

根据实施例3测序结果，设计引物Pca10/Pca11(SEQ ID NO:3/SEQ ID NO:4)，以pIJ773为模板，扩增aac(3)IV-oriT抗性盒，用于PCR-Targeting失活Mpca4基因，具体方法参照Gust et al.(PCR-targeted Streptomyces gene replacement identifies a protein domain needed for biosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(4):1541-1546)所述并遵照执行。最后将获得由aac(3)-oriT替换mpca4基因部分序列的载体pSCM-7C11M4，用于链霉菌HS023中Mpca4基因的失活。利用相同原理构建mpca3基因失活载体pSCM-7C11M3、mpca2基因失活载体pSCM-7C11M2(详见表1)。

表1：构建质粒信息

说明：*序列位点是指SEQ ID NO：7序列上的序列位点

实施例5：mpca4基因失活重组链霉菌的获得

将实施例4构建的质粒pSCM-7C11M4导入ET12567(pUZ8002)中，通过接合转移方法(参考文献Kieser T,Bibb M.Practical Streptomyces Genetics[M].Norwich:The John Innes Foundation,2000)导入到链霉菌HS023中，挑取单交换子；含有Km、Apra抗性的单交换子Apra抗性平板传两代，挑取单菌落，分别点种于Apra抗性平板和Km抗性平板，培养8天后，挑取Km^S、Apra^R的双交换子提取基因组；利用相应引物进行PCR(引物PCA12/PCA13，SEQ ID NO:5/SEQ ID NO:6)验证是否为双交换子；同时将PCR片段平末端克隆到pMD19T上送金斯瑞测序。PCR和测序双重验证确保获得的突变株为正确的双交换子，获得重组链霉菌HS023-104。

实施例6：mpca2和mpca3基因失活重组链霉菌的获得

利用同实施例5相同的方法，分别获得mpca2基因失活的重组链霉菌HS023-102和mpca3基因失活的重组链霉菌HS023-103。

实施例7：发酵验证

重组菌株以及原始菌株在YMS平板上30℃培养7天，进种子培养基(蔗糖1％，脱脂奶粉0.1％，蛋白胨0.35％，酵母膏0.5％，K₂PO₄ 0.05％，调节pH值为7.2，灭菌即得)，28℃、250rpm培养40小时后进发酵培养基(蔗糖16％，黄豆饼粉2％，酵母膏0.5％，麦芽膏0.5％，K₂HPO₄ 0.05％，FeSO₄·7H₂O 0.005％，CaCO₃ 0.3％，MgSO₄ 0.05％；调节pH值为7.2，灭菌即得)，接种量4％，28℃250rpm培养10天后放瓶，分别取1mL发酵液，用4mL无水甲醇浸泡过夜，离心取上清进行HPLC检测。HPLC分析条件，色谱柱：依利特Hypersil ODS2 5μm(4.6*250mm)；流动相：85％甲醇；吸收波长240nm；流速：1ml/min。

检测所得色谱图如图4所示，其中图4(a)显示本发明原始链霉菌经发酵后，对发酵液进行HPLC检测的图谱；图4(b)、(c)和(d)分别显示本发明实施例5和6获得的重组链霉菌HS023-102、HS023-103和HS023-104发酵后，对发酵液进行HPLC检测的图谱。

结果表明，本发明获得的基因失活重组菌株，和原始菌株相比较，杂质组份α9和α10彻底消除，菌株形态和发酵工艺未改变，且米尔贝霉素A3/A4的发酵单位较原始菌株最高增加30％。三个基因分别失活，均可以阻断杂质组份α9和α10的合成，而不影响米尔贝霉素A3/A4的合成(见表2)。

表2：菌株发酵数据

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江海正药业股份有限公司

<120> 生产米尔贝霉素的重组链霉菌及其制备方法和应用

<130> I2017TC1592CS

<160> 11

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 1

ggaccggctg ttctacgact acgagg 26

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 2

ccgacggaga ccaatgtctg cacgt 25

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 3

cgtatctgcc cgacagcgtc agcgtgaccg aggccgtcca ttccggggat ccgtcgacc 59

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 4

gccatcagct cgccctgggc cttcatcacc ctcagcatct gtaggctgga gctgcttc 58

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 5

tccatcgtcg gctgaggcgt at 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> primer

<400> 6

cgaccaattc ctggttcgca tg 22

<210> 7

<211> 5344

<212> DNA

<213> Streptomyces milbemycinicus

<400> 7

cgtacgccgc ctactaccgg cgctggtcgc tggtgtggga gagccaggcc ctgctgcgtg 60

ccgagccggt cgccggcgac cccgagctgg gcgggcgctt catcgagctg atcgatccgc 120

tgcgctaccc cgccgagggc ctgggcgacg acgcggtccg cgagatccgg cggctcaagg 180

cccggatgga atccgaacgc ctgccgcgcg gcgccgaccc caccacccac accaagctgg 240

gccgtggcgg cctgtccgac gtcgagtgga cggtgcagct gctccagatg cgccacggct 300

gggccgaacc gggcctgcgc accacccgca cccgcgaggc cctggccgcc gcccacgccg 360

ccgagctgat cggcgcggag gacgcgcaga ccctggacga ggcctgggtg ctggccaccc 420

gcgcgcgcaa cggcatcatg ctggtccgtg gccgccccgg taacacgttc cccagcggca 480

gccgcgaact ggcggcggtc tcccgttact tgggctacgg acccggcatg gtcggccaga 540

tgctcgacga ctaccgccgt acgacgcggc gggcgcgggc ggtggtggac cggctgttct 600

acgactacga gggctgagct cacactgact gggaacgcag ggacagcacg agatcggtga 660

tgctctccac gtccttgaag tggccgcccg tcaggtgggt ggccggcacc aggacaccga 720

gttcgtcccg cagatgggcc agcagccgcg cggtccggag cgagtccagg atgccccagg 780

ccagcagcgg tgtggtcggg gtgatctcgg cgaggtccgg gtcggcgacc aactcgtgcc 840

ggatatagcc gagaagcgtg tccagcaggg ccgagcgttc ggtgtcggac atgggaactc 900

caggtgttca agggcggagg cagggtggag tgcagggcgg tcaggcgcgt cggcagagtg 960

gggtgcaggg cggtcaggcg cggcggttcg gctccctcgt ccgcaactcc cgtgcgaggg 1020

cggcgcggtc ggtcttgccg ttggggccgc gggggatggc ctcgacggtg tgcaccgcgt 1080

cgatgatcat gtagctgggg agcagcgagg cgcagtgcct cttgaggtcg agcagttgtg 1140

gccgctgccc gggccgcggc acgacgacgg cgtggagccg tgccgcgtcg ctgctgcccg 1200

agacgaggac caccacgtcg ccgaccgccg ggtgcgcgcc gagggcggcc tccacctccc 1260

ccggctcgac ccggtgcccg cgcaccttcg ccaggtcgtc gaaccggccc agatactcca 1320

ggtcgccgtg ggcatcgcgg cggccgaggt ccccggtccg gtacgggccg tggtgcggcg 1380

ggcggcccca gtagcccagc atcacggtcg ggccgctgac gacgatctcc gccgtaccgt 1440

cgggccgggg ggccagacgt acgtcgttgc cgcagcaccc ggtgccgatc gggagcgggg 1500

tcgtacggac caggtcggcg gccgtcacct cgtaggacgt gcagacattg gtctccgtcg 1560

ggccgtacca gttgagcagc cgtacgccgg gccaggccgc gcgcagtcgc ttgatgtcct 1620

tgagcgggaa ggcttcgccc gcgaagacgc aggtgcgcag ggacagcggc ccccggtcca 1680

gcagccgccc ttggcgcatc aacagcagga acgccgacgg caccgagtac cagacggtga 1740

tccggcgccg ggcgagcacg tcgatgagct ggtcgggggc gtgggccagg gtgtcgggga 1800

cgaggtgtac cgaggctccg gcccggaagg cgccgtagag gtcgaacacc gacaggtcga 1860

aggtgaaggg cgcgtggttg gccagccggt cgccgggccg cagccgcagc ttttcggcgg 1920

cccagtcggt gaaggacagc gcgttgcggt ggctcaggca gacgcctttg ggctcgccgg 1980

tggagcccga ggtgtagagg atgtacgcgg ggtcgtcggg cgcggcgggg tggtgtgcgg 2040

ggcgtcgtcc cggctcggag gcgtcccgca gcgcggtgcg gtccaccacc tcgacgcgcg 2100

gaccgtccag gtcagccggg gcgggggcgt cgtcgaggtc ggtcaccacc agcgacgggc 2160

ggcagtccgc gatgatccgg cggacccggc cgatcgggtt cgaaggcgtc accggcacat 2220

agatcgctcc gatccgcagc acggcctgca tcagcgcgac cacctcggcg ctcttgcccg 2280

tccacagcag cacccggttc ccgggccgta cgcccgcgtc gagcagcgcc gcggcgtaac 2340

ggtcggcgag cgcgtcgagc cggccgtagc tgaggccgcc ggtcatatcg tggacggccg 2400

gcgcctccgg ggtgcgttcg gccgcctcga ccaccagtcg gtgcaggctc acagtcctat 2460

gctccttgcg atcaactgcc gctggatctc ggaggttccg gagaagacgg tcgtcggcag 2520

cgcgtccctg accgccgcct cgataccttc ctcgcgcaga cagccccggc cgccgaacaa 2580

ctgcatggca tccagcgaac tggccacggc cgcctcggag acggccagct tggacagcga 2640

cacccacagg gaggcgtccg ggtcgtcgcg gtccagtgcg tcgcaggccc ggtagagcag 2700

cagccgcccg ctctccagcc gcagcttcat atcgacgacg cggttgctca ccgactggaa 2760

ctcggccagc cgcttaccgg actgccgacg ctgccgtacg tgctccacgc accggtcgag 2820

cagccgctgc tgcactccca gatacaccgc gaagaggcag gaccgctccc accgcatgga 2880

gtgctggaag atcgcgccgc cttggcctgg ggcgccgagc acctgctcgt cgggtacgaa 2940

gcagtcgtcg aacgtcaccg ccgcggccgg acacgacagc agccccatct tgtccagcgg 3000

ctgccccacc gccagccctg gggcgccacg ctcgacgacg aacgcggtca cccccaggtg 3060

tccggcctgc ggatcggtgg tcgcgtacgt cacgaacaca tcggccaccg gtccattgct 3120

cacaaagctc tttgtgccgc tgagcagaaa accgtccgcg acccgccggg cggtcaccgt 3180

cagccgggcg acatccgagc cggattccgg ctccgtcatg gcgtttccgg cgatcagctc 3240

cccggagcac attcggggca gcagccgctt acgcgtatcg ggtggcgcga aatcgaggat 3300

cggcattccg caggagaaca gatgagcggc ggcggcgaac agaattccgg tgtccgcaca 3360

gccgcggccg gcggactcga atacgagcgc ggtgtccagc gcgccgagcc ccccgccgcc 3420

ctccgccgtc ggcacgctcg ccccgagcag ccccaggtcc gcaaggcggg accattcggc 3480

gcgggtgtac gccgacgccg acgccgtggg ctgatgatcg cccggcccgg cgggaaaggc 3540

ggtctgcgtt cgggccagga cgctggcgca acggtcgcgt tgttgtccgc tgagtgtgaa 3600

gtccatgggg ccgccctcct gtttcgggaa aagcgaattt caggtgtagc cgcaaagctc 3660

gacggtcgca agggagggga aaaagaaatt cacggactcc atcgtcggct gaggcgtatt 3720

cgagttggaa gcgaccgcct ctcttccgcg tcggcgtata cggagaaaag ccgaaccgaa 3780

attcacggac aggtgcgaag gggtgtacgt acatgcggac atcggatgtg tacatcgccg 3840

ccgtcgggac gtatctgccc gacagcgtca gcgtgaccga ggccgtccgg cagggacggc 3900

tggacgccgc cgaagcggag cggtccggtc tgctcggcgc ggccgtcgcg ggcgacaccc 3960

ccgcaccgga gatgggggtc cgcgcggtcc gtacggcctt ggggcgctgg ggcggcgata 4020

tctcggagct ggggctgctg ctctacgtcg agggttaccg ctgcggcccc gacggatggc 4080

ttccgcagtc gtatgtgatg cgcgaggcgg ttggcggcga tctgctggcg gtgggggtac 4140

ggcagggatg caacggggtc ttcggcgccc tcgaactggc ggcggcacat cttcggggcg 4200

gcggcagcga ggcggcgctg atcgtcgcgg ccgacaacat gggctcaccc ctggtggacc 4260

gctggcgggc gagcccgggg tatctcctcg ccgacggcgc ggcagcgctg gtgctcaccc 4320

ggtccgcggg cttcgcccgg ctgctgtccg tcaactccaa ggccgtaccg gaactcgaag 4380

ccctgcaccg cggcatccag ccactggatc cgtccggctc ggcccggcca gtgccgctcg 4440

agctcggcgc caggcagcgg gaattcctcg gcggtgacga cgcaccgaag gactggatgc 4500

tgagggtgat gaaggcccag ggcgagctga tggccaaaac ccttgaggag gcgggcatcg 4560

ccgccgagga catgacccgc gtcgtcaccg cccatgcgaa ccaggaattg gtcgacgcgt 4620

ggctgtcctc cctgggccgc accctggagc agtccgcctg gagcttcggc cgaagggtgg 4680

gccacctcat ggccggcgac cagctggcct ccttcgagca tctgctcatg gccggcgaga 4740

tcggccccgg cgaccgcgtc ctgctggtcg gctccggccc cggcctgggc atcgcggcag 4800

ccgtcgtgga gctcaccgcg ctcccgccgt gggtacccgg accccgcgcc cagtcagaca 4860

ccgtgacccc ggccgccgac gggtggcgct gaccgtgacg gcggccgcgc cgccgtacgg 4920

catctcaagc gtgcggcgtg aaacggcagg gcagccgcgt cattccgtgg atggacgtcc 4980

cggtcacaaa ctcgggctca cccgcctcga tatcgggcag catccgcagc agttcccgga 5040

agaggattct cagctgcgcc ctggcgagct gggcggccag gcagtagtgc gcaccgccac 5100

cgccgaagga cagctggggg ttgggatcgc gggcgaggtc aaaacgtccc ggttcgcgga 5160

agacggccgc gtcgcggttg cccgaggcgt agaacatcac caccttgtcc cctgccgaga 5220

tgtgccggcc gccgagccgg gtgggggcca ccgccgtacg gcggaaggtc agcacgggtg 5280

tggcgtagcg caggatctcc tccacggcgg ggccgatccg gccgtcgagg ccggccagca 5340

gcca 5344

<210> 8

<211> 492

<212> PRT

<213> Streptomyces milbemycinicus

<400> 8

Met Ser Leu His Arg Leu Val Val Glu Ala Ala Glu Arg Thr Pro Glu

1 5 10 15

Ala Pro Ala Val His Asp Met Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Gly Arg Leu

20 25 30

Asp Ala Leu Ala Asp Arg Tyr Ala Ala Ala Leu Leu Asp Ala Gly Val

35 40 45

Arg Pro Gly Asn Arg Val Leu Leu Trp Thr Gly Lys Ser Ala Glu Val

50 55 60

Val Ala Leu Met Gln Ala Val Leu Arg Ile Gly Ala Ile Tyr Val Pro

65 70 75 80

Val Thr Pro Ser Asn Pro Ile Gly Arg Val Arg Arg Ile Ile Ala Asp

85 90 95

Cys Arg Pro Ser Leu Val Val Thr Asp Leu Asp Asp Ala Pro Ala Pro

100 105 110

Ala Asp Leu Asp Gly Pro Arg Val Glu Val Val Asp Arg Thr Ala Leu

115 120 125

Arg Asp Ala Ser Glu Pro Gly Arg Arg Pro Ala His His Pro Ala Ala

130 135 140

Pro Asp Asp Pro Ala Tyr Ile Leu Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Glu

145 150 155 160

Pro Lys Gly Val Cys Leu Ser His Arg Asn Ala Leu Ser Phe Thr Asp

165 170 175

Trp Ala Ala Glu Lys Leu Arg Leu Arg Pro Gly Asp Arg Leu Ala Asn

180 185 190

His Ala Pro Phe Thr Phe Asp Leu Ser Val Phe Asp Leu Tyr Gly Ala

195 200 205

Phe Arg Ala Gly Ala Ser Val His Leu Val Pro Asp Thr Leu Ala His

210 215 220

Ala Pro Asp Gln Leu Ile Asp Val Leu Ala Arg Arg Arg Ile Thr Val

225 230 235 240

Trp Tyr Ser Val Pro Ser Ala Phe Leu Leu Leu Met Arg Gln Gly Arg

245 250 255

Leu Leu Asp Arg Gly Pro Leu Ser Leu Arg Thr Cys Val Phe Ala Gly

260 265 270

Glu Ala Phe Pro Leu Lys Asp Ile Lys Arg Leu Arg Ala Ala Trp Pro

275 280 285

Gly Val Arg Leu Leu Asn Trp Tyr Gly Pro Thr Glu Thr Asn Val Cys

290 295 300

Thr Ser Tyr Glu Val Thr Ala Ala Asp Leu Val Arg Thr Thr Pro Leu

305 310 315 320

Pro Ile Gly Thr Gly Cys Cys Gly Asn Asp Val Arg Leu Ala Pro Arg

325 330 335

Pro Asp Gly Thr Ala Glu Ile Val Val Ser Gly Pro Thr Val Met Leu

340 345 350

Gly Tyr Trp Gly Arg Pro Pro His His Gly Pro Tyr Arg Thr Gly Asp

355 360 365

Leu Gly Arg Arg Asp Ala His Gly Asp Leu Glu Tyr Leu Gly Arg Phe

370 375 380

Asp Asp Leu Ala Lys Val Arg Gly His Arg Val Glu Pro Gly Glu Val

385 390 395 400

Glu Ala Ala Leu Gly Ala His Pro Ala Val Gly Asp Val Val Val Leu

405 410 415

Val Ser Gly Ser Ser Asp Ala Ala Arg Leu His Ala Val Val Val Pro

420 425 430

Arg Pro Gly Gln Arg Pro Gln Leu Leu Asp Leu Lys Arg His Cys Ala

435 440 445

Ser Leu Leu Pro Ser Tyr Met Ile Ile Asp Ala Val His Thr Val Glu

450 455 460

Ala Ile Pro Arg Gly Pro Asn Gly Lys Thr Asp Arg Ala Ala Leu Ala

465 470 475 480

Arg Glu Leu Arg Thr Arg Glu Pro Asn Arg Arg Ala

485 490

<210> 9

<211> 385

<212> PRT

<213> Streptomyces milbemycinicus

<400> 9

Met Asp Phe Thr Leu Ser Gly Gln Gln Arg Asp Arg Cys Ala Ser Val

1 5 10 15

Leu Ala Arg Thr Gln Thr Ala Phe Pro Ala Gly Pro Gly Asp His Gln

20 25 30

Pro Thr Ala Ser Ala Ser Ala Tyr Thr Arg Ala Glu Trp Ser Arg Leu

35 40 45

Ala Asp Leu Gly Leu Leu Gly Ala Ser Val Pro Thr Ala Glu Gly Gly

50 55 60

Gly Gly Leu Gly Ala Leu Asp Thr Ala Leu Val Phe Glu Ser Ala Gly

65 70 75 80

Arg Gly Cys Ala Asp Thr Gly Ile Leu Phe Ala Ala Ala Ala His Leu

85 90 95

Phe Ser Cys Gly Met Pro Ile Leu Asp Phe Ala Pro Pro Asp Thr Arg

100 105 110

Lys Arg Leu Leu Pro Arg Met Cys Ser Gly Glu Leu Ile Ala Gly Asn

115 120 125

Ala Met Thr Glu Pro Glu Ser Gly Ser Asp Val Ala Arg Leu Thr Val

130 135 140

Thr Ala Arg Arg Val Ala Asp Gly Phe Leu Leu Ser Gly Thr Lys Ser

145 150 155 160

Phe Val Ser Asn Gly Pro Val Ala Asp Val Phe Val Thr Tyr Ala Thr

165 170 175

Thr Asp Pro Gln Ala Gly His Leu Gly Val Thr Ala Phe Val Val Glu

180 185 190

Arg Gly Ala Pro Gly Leu Ala Val Gly Gln Pro Leu Asp Lys Met Gly

195 200 205

Leu Leu Ser Cys Pro Ala Ala Ala Val Thr Phe Asp Asp Cys Phe Val

210 215 220

Pro Asp Glu Gln Val Leu Gly Ala Pro Gly Gln Gly Gly Ala Ile Phe

225 230 235 240

Gln His Ser Met Arg Trp Glu Arg Ser Cys Leu Phe Ala Val Tyr Leu

245 250 255

Gly Val Gln Gln Arg Leu Leu Asp Arg Cys Val Glu His Val Arg Gln

260 265 270

Arg Arg Gln Ser Gly Lys Arg Leu Ala Glu Phe Gln Ser Val Ser Asn

275 280 285

Arg Val Val Asp Met Lys Leu Arg Leu Glu Ser Gly Arg Leu Leu Leu

290 295 300

Tyr Arg Ala Cys Asp Ala Leu Asp Arg Asp Asp Pro Asp Ala Ser Leu

305 310 315 320

Trp Val Ser Leu Ser Lys Leu Ala Val Ser Glu Ala Ala Val Ala Ser

325 330 335

Ser Leu Asp Ala Met Gln Leu Phe Gly Gly Arg Gly Cys Leu Arg Glu

340 345 350

Glu Gly Ile Glu Ala Ala Val Arg Asp Ala Leu Pro Thr Thr Val Phe

355 360 365

Ser Gly Thr Ser Glu Ile Gln Arg Gln Leu Ile Ala Arg Ser Ile Gly

370 375 380

Leu

385

<210> 10

<211> 354

<212> PRT

<213> Streptomyces milbemycinicus

<400> 10

Met Tyr Ile Ala Ala Val Gly Thr Tyr Leu Pro Asp Ser Val Ser Val

1 5 10 15

Thr Glu Ala Val Arg Gln Gly Arg Leu Asp Ala Ala Glu Ala Glu Arg

20 25 30

Ser Gly Leu Leu Gly Ala Ala Val Ala Gly Asp Thr Pro Ala Pro Glu

35 40 45

Met Gly Val Arg Ala Val Arg Thr Ala Leu Gly Arg Trp Gly Gly Asp

50 55 60

Ile Ser Glu Leu Gly Leu Leu Leu Tyr Val Glu Gly Tyr Arg Cys Gly

65 70 75 80

Pro Asp Gly Trp Leu Pro Gln Ser Tyr Val Met Arg Glu Ala Val Gly

85 90 95

Gly Asp Leu Leu Ala Val Gly Val Arg Gln Gly Cys Asn Gly Val Phe

100 105 110

Gly Ala Leu Glu Leu Ala Ala Ala His Leu Arg Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Ala Ala Leu Ile Val Ala Ala Asp Asn Met Gly Ser Pro Leu Val Asp

130 135 140

Arg Trp Arg Ala Ser Pro Gly Tyr Leu Leu Ala Asp Gly Ala Ala Ala

145 150 155 160

Leu Val Leu Thr Arg Ser Ala Gly Phe Ala Arg Leu Leu Ser Val Asn

165 170 175

Ser Lys Ala Val Pro Glu Leu Glu Ala Leu His Arg Gly Ile Gln Pro

180 185 190

Leu Asp Pro Ser Gly Ser Ala Arg Pro Val Pro Leu Glu Leu Gly Ala

195 200 205

Arg Gln Arg Glu Phe Leu Gly Gly Asp Asp Ala Pro Lys Asp Trp Met

210 215 220

Leu Arg Val Met Lys Ala Gln Gly Glu Leu Met Ala Lys Thr Leu Glu

225 230 235 240

Glu Ala Gly Ile Ala Ala Glu Asp Met Thr Arg Val Val Thr Ala His

245 250 255

Ala Asn Gln Glu Leu Val Asp Ala Trp Leu Ser Ser Leu Gly Arg Thr

260 265 270

Leu Glu Gln Ser Ala Trp Ser Phe Gly Arg Arg Val Gly His Leu Met

275 280 285

Ala Gly Asp Gln Leu Ala Ser Phe Glu His Leu Leu Met Ala Gly Glu

290 295 300

Ile Gly Pro Gly Asp Arg Val Leu Leu Val Gly Ser Gly Pro Gly Leu

305 310 315 320

Gly Ile Ala Ala Ala Val Val Glu Leu Thr Ala Leu Pro Pro Trp Val

325 330 335

Pro Gly Pro Arg Ala Gln Ser Asp Thr Val Thr Pro Ala Ala Asp Gly

340 345 350

Trp Arg

<210> 11

<211> 90

<212> PRT

<213> Streptomyces milbemycinicus

<400> 11

Met Ser Asp Thr Glu Arg Ser Ala Leu Leu Asp Thr Leu Leu Gly Tyr

1 5 10 15

Ile Arg His Glu Leu Val Ala Asp Pro Asp Leu Ala Glu Ile Thr Pro

20 25 30

Thr Thr Pro Leu Leu Ala Trp Gly Ile Leu Asp Ser Leu Arg Thr Ala

35 40 45

Arg Leu Leu Ala His Leu Arg Asp Glu Leu Gly Val Leu Val Pro Ala

50 55 60

Thr His Leu Thr Gly Gly His Phe Lys Asp Val Glu Ser Ile Thr Asp

65 70 75 80

Leu Val Leu Ser Leu Arg Ser Gln Ser Val

85 90