枯草芽孢杆菌、生物膜及其构建和应用的制作方法

本发明涉及合成生物学，基因工程技术和生物材料领域，特别是涉及一种枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌产生的生物膜及其构建方法和应用。

背景技术：

生物膜是由微生物、多糖、DNA、蛋白质和脂类等组成的复合体，生物膜通常与致病菌的感染和疾病相关联，很多菌分泌的生物膜是造成感染的罪魁祸首，引起抗药性并且难以去除。血链球菌通过导尿管注射到兔子体内，在30分钟内即可在灭过菌的导尿管表面上吸附，随后在血栓附近有链球菌菌落形成，并且观察到被纤维化胶囊包围，可见链球菌生物膜对感染及阻止白细胞的作用。同样囊性纤维化研究发现条件致病菌铜绿假单胞菌的生物膜形成与抗药性产生是同时发生的。

从材料和纳米科学的观点出发，生物膜中的蛋白成份通常富含疏水蛋白和淀粉样蛋白纤维等成份；淀粉样蛋白具有很强的机械性能，突出的化学和热稳定性，因此赋予生物膜优良的环境耐受性，而这些特性帮助微生物抵御外界恶劣的环境，获取有限的营养进行生存。实验证明，生物膜的这些特征如被正当加以利用，在环境修复、生物导电和生物防治等方面有广泛的应用。

生物膜在废水处理领域已有近百年的研究和应用，因为生物膜能有效吸附重金属和有机微污染物，复合生物修复比单一微生物或单一物理化学方法更为有效。固定枯草芽孢杆菌生物膜的反应器，能更有效地将有害的六价铬还原成毒性较小的三价铬。导电细菌的生物膜对于微生物燃料电池有着重要作用。有研究表明，地杆菌生物膜的密度与导电率为直接正相关。因此新发展的一种策略是构建人工生物膜进行导电，目前已取得不少进展。文献报道表明，通过基因工程改造提高施瓦氏菌的生物膜形成从而促进导电率提高了3.4倍。

以前报道的生物膜展示技术(比如大肠杆菌生物膜展示技术)是基于革兰氏阴性菌。由于其自身分泌系统的限制(特别是双层膜的限制)，利用生物膜展示融合肽段不能超过50个氨基酸，再加上大肠杆菌的生物安全隐患，大大阻碍了活体生物膜功能化材料的应用。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种分泌能力更强、功能化更全、生物性更安全的枯草芽孢杆菌、生物膜及其构建方法和应用。

为了达到上述目的，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌，其特征在于，其能够分泌TasA-R蛋白，R为功能基团。

进一步地，所述的R为肽或蛋白。

更进一步地，所述的R为短肽、粘性蛋白、荧光报告蛋白、环境降解酶、氢化酶、固氮酶或金属或半导体绑定蛋白等。

更进一步地，R为包含300个以上氨基酸的蛋白。

更进一步地，R包括组氨酸标签histag、spytag、snooptag、CBD、GFP、表皮生长因子(EGF，)、磁颗粒模板蛋白Mms6、贻贝足丝蛋白Mefp3和Mefp5、贻贝足丝蛋白Mgfp3和Mgfp5、红色荧光蛋白蛋白Mcherry、荧光蛋白Maple3、重金属结合蛋白MTs、铅结合蛋白PbrR、放射性铀结合蛋白SUP、有机磷水解酶OPH、塑料降解酶PETase和MHETase、镍铁氢化酶、铁铁氢化酶或固氮酶。

本发明还提供了一种枯草芽孢杆菌生物膜，其特征在于，其含有所述的TasA-R蛋白。

本发明还提供了上述的枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：将产生物膜的原始枯草芽孢杆菌的淀粉样蛋白的编码基因tasA或淀粉样蛋白的编码基因tasA以及产生胞外多糖的编码基因簇epsA-O和生物膜抑制子编码基因sinR中的至少一种在基因组上进行敲除，构建枯草芽孢杆菌突变株，转入TasA-R表达质粒，得到枯草芽孢杆菌。

进一步地，所述的TasA-R表达质粒为pHT01-tasA、pHT01-tasA-Histag、pHT01-tasA-spytag、pHT01-tasA-mgfp3-Histag、pHT01-tasA-mgfp5-Histag、pHT01-tasA-mefp3-Histag、pHT01-tasA-mefp5-Histag、pHT01-tasA-mms6-Histag、pHT01-tasA-mts-Histag、pHT01-tasA-pbrR-Histag、pHT01-tasA-sup-Histag、pHT01-tasA-mcherry-Histag、pHT01-tasA-maple3-Histag、pHT01-tasA-OPH-Histag或pHT01-tasA-OPH。

进一步地，所述的TasA-R表达质粒能够调控表达TasA-R融合蛋白。

更进一步地，所述的调控方法为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导、营养诱导、温控、光控或群体感应调控。

本发明还提供了上述的枯草芽孢杆菌的另一种构建方法，其特征在于，包括以下步骤：构建能够表达TasA-R蛋白的基因组替换整合质粒，将基因组替换整合质粒转入大肠杆菌菌株，从大肠杆菌中提取整合质粒，转入枯草杆菌菌株；或者，将产生物膜的原始枯草芽孢杆菌的淀粉样蛋白的编码基因tasA或淀粉样蛋白的编码基因tasA以及产生胞外多糖的编码基因簇epsA-O和生物膜抑制子编码基因sinR中的至少一种在基因组上进行敲除，构建枯草芽孢杆菌突变株，构建Sender质粒和Receiver质粒，将Sender质粒和Receiver质粒分别整合到构建枯草芽孢杆菌突变株的基因组中，得到Sender菌株及Receiver菌株，将能够表达TasA-R蛋白的基因插入到受QS信号分子活化的P3启动子下游进行表达，将表达质粒转化Receiver菌株。

进一步地，所述的基因组替换整合质粒为pMAD-tasA-histag，pMAD-tasA-mefp3-histag，pMAD-tasA-mefp5-histag，pMAD-tasA-mcherry-histag，pMAD-tasA-oph或pMAD-lacI-Pgrac-tasA-histag；所述的Sender质粒和Receiver质粒为pDG-P2-agrBDCA和pDG-P2-agrCA，所述的表达质粒为pMK-P3-tasA-histag、pMK-P3-tasA-mcherry-histagp、MK-P3-tasA-mefp3-histag、pMK-P3-tasA-mefp5-histag或pMK-P3-tasA-oph。

本发明还提供了上述的枯草芽孢杆菌或其形成的生物膜在生物催化、生物标记、制备生物材料、生物修复和生物粘性材料以及生物医药和能源领域中的应用。

与现有技术相比，本发明的主要技术优势和特点包括以下几方面：

1.本发明通过基因工程手段对细菌生物膜的主要成分(淀粉样蛋白)进行基因改性或基因融合，从而引入具有新功能的肽段或蛋白质。由于目标蛋白能够直接以细胞外基质分泌并在生物膜上展示，因而规避了上述传统蛋白表达和提纯蛋白所带来的各种问题。

2.本发明不仅能够保证所展示的短肽或蛋白质具有相应的蛋白活性和功能性。而且相应蛋白的化学和热稳定性也被证明大大增加。

3.由于生物膜直接和活体细胞相关联，因此该技术能够利用细胞自身对环境的感应(比如pH、温度和化学诱导物)或者通过基因环路对细胞的调控(比如基因光控环路)，实现功能化短肽/蛋白在时间和空间上的可控表达和分泌，从而最后实现智能化材料或酶催化的概念。

4.活体细胞生产生物膜的条件只需要包含最少营养的溶液(minimum media condition)并在有氧条件下培养，具有自我繁殖和再生等特点，而且很容易实现大规模的生产。

5、工程的生物膜具有典型的凝胶材料特性(弹性模量＞损耗模量)，具有自我再生(self-regeneration)和自我修复功能(self-healing)，可以作为凝胶材料在不同的领域进行应用。

6.该活体细胞生物膜展示技术以枯草芽孢杆菌生物膜淀粉样蛋白为基础，和已报道的基于大肠杆菌生物膜的淀粉样蛋白展示技术相比有以下独特的技术优势：

a)已报道的大肠杆菌生物膜的淀粉样蛋白展示技术，只能融合并分泌不能超过59个氨基酸的肽段和蛋白质，大大限制了应用范围；而枯草芽孢杆菌生物膜淀粉样蛋白展示技术，能融合并分泌超过包含337个氨基酸的功能化蛋白。

b)和大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌属于一般公认安全(Generally Recognized As Safe，GRAS)微生物范畴，其生物安全性更好，因而大大拓宽了其在医药、环境、能源和材料等方面的应用。

7、本发明通过对枯草芽孢杆菌生物膜的主要蛋白，即TasA淀粉样蛋白的基因改造和调控，实现枯草芽孢杆菌生物膜的展示平台。该平台较以往的报道具有分泌能力更强、功能化更全、生物安全性更高等优点。枯草芽孢杆菌生物膜的展示技术在生物催化、生物修复和生物粘性材料等领域有广泛的应用。

细菌枯草芽孢杆菌三基因突变株Bacillus subtilis ΔtasAΔsinRΔeps(002)于2016年6月6日保存在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，编号：12600，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

附图说明

图1为本发明的生物膜平台观察图，其中a为枯草芽孢杆菌3610野生型分泌的生物膜平台观察图；b为tasA基因敲除后的单突变菌株的生物膜平台观察图；c为tasA和sinR敲除后的双突变菌株的生物膜平台观察图；d为tasA、sinR、eps等基因簇同时敲除后的三突变菌株的生物膜平台观察图；

图2为本发明的野生型、突变株和携带质粒的基因工程菌的生物膜的纤维情况对比图，其中a为枯草芽孢杆菌野生型的生物膜的纤维显示图；b～d分别为敲掉基因的单突变株、双突变株和三突变株的生物膜的纤维显示图，e为转入空质粒的枯草芽孢杆菌基因工程菌的生物膜的纤维显示图；f～1为携带融合质粒并经过IPTG诱导的枯草芽孢杆菌基因工程菌的生物膜的纤维显示图；m～p为携带融合质粒未经过IPTG诱导的枯草芽孢杆菌基因工程菌的生物膜的纤维显示图；

图3为本发明的枯草芽孢杆菌生物膜平台及携带tasA-R融合质粒的基因工程菌生物膜平台的扫描电镜图对比图，其中a为枯草芽孢杆菌野生型的生物膜平台电镜图；b～c为敲掉基因的单突变株和双突变株的生物膜平台电镜图；d为转入空质粒的基因工程菌的生物膜平台电镜图；e～1为携带融合质粒的基因工程菌的生物膜平台电镜图；

图4为本发明的基因工程菌表达生物膜TasA-R的免疫电镜观察图；

图5为构建的融合质粒的图谱；

图6为群体感性系统QS调控的TasA-Histag生物膜绑定量子点的荧光图；

图7为生物膜与AuNPs共培养的TEM对比图，其中，a为携带质粒的基因工程菌与Ni-NTA AuNPs共培养的TEM图，b为枯草芽孢杆菌与AuNPs共培养的TEM图，c为绑定了AuNPs的生物膜催化对硝基苯酚还原反应的效果图；

图8为生物膜绑定量子点作为生物催化的测定图，其中a为TasA-Histag绑Cd_0.8Zn_0.2S等定量子点的TEM图，b为生物膜降解有机染料的效果图；

图9为携带pHT-tasA-mcherry质粒的基因工程菌有无IPTG诱导时，生物膜通过共聚焦荧光显微镜观察图；

图10为携带pHT-tasA-spytag质粒的基因工程菌有无IPTG诱导时，生物膜与蛋白Mcherry-spycatcher结合后的荧光显微镜观察图；

图11为携带pHT-tasA-oph质粒的基因工程菌有无IPTG诱导时对有机磷降解的曲线图。

图12为枯草芽孢杆菌中SinR抑制生物膜的编码基因的示意图。

图13为本发明的原理图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明提供的基因工程枯草芽孢杆菌生物膜展示技术主要是针对枯草芽孢杆菌的生物膜蛋白主要成分淀粉样蛋白tasA进行基因融合或改造。组成枯草芽孢杆菌生物膜的主要成分如表1所示。

表1枯草芽孢杆菌生物膜组成相关的基因(参见Vlamakis H.，Chai Y.，Beauregard P.，et al.Sticking together：building a biofilm the Bacillus subtilis way.Nature review Microbiology.11：157-168(2013).)：

SinR是一个双组份调控蛋白，是生物膜编码基因的抑制子，如图12所示。

如图12示意图所示，敲除了生物膜编码基因的ΔtasA单突变或ΔtasAΔeps以及ΔtasAΔepsΔsinR等多突变株，在有诱导物存在时，能外源表达并分泌TasA-R融合蛋白。TasA为来源于枯草芽孢杆菌的淀粉样蛋白，R为功能基团，中间用八个氨基酸的linker连接。TasA-R融合蛋白分泌表达并在生物膜上自组装成纤维，形成具有可调控的纳米生物材料生物膜。TasA-R也可以直接整合在基因组上而非通过携带质粒表达。R代表图中描述的几类功能基团，包括可结合金属或蛋白的短肽如Histag、Spytag和Mms6等，也有粘性蛋白Mefp3和Mefp5，荧光报告子Mcherry和Maple3以及有机磷降解酶OPH等，可在生物催化、生物修复和生物粘性材料等领域有应用。

根据R的不同功能，表达和分泌的蛋白分为以下几类：

(1)各种100个氨基酸以内的短肽：比如Histag，Spytag，CBD，EGF，Mms6以及其他细胞粘性蛋白等。Histag为组氨酸标签，能亲和结合多种金属离子如钴、镍、金、银等。Spytag为来自于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的一个短肽(peptide)，能特异性地与它的蛋白伙伴Spycatcher反应，当它们分别融合不同基团时也能进行体外反应。几丁质结合域(Chitin binding domain，CBD)通常为30-43个氨基酸的短肽，含有保守的甘氨酸和半胱氨酸残基。几丁质为广泛存在于自然界的一种含氮多糖类生物性高分子，TasA-CBD能结合几丁质，用于构建生物复合材料和3D打印等。表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)是最初从小鼠的下颌下腺提取的一种含有53个氨基酸残基的单链多肽，对调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用。Mms6为59个氨基酸的短肽，可以作为磁纳米颗粒结合模板。

(2)粘性蛋白作为生物粘性材料：Mefp3，Mefp5，Mgfp3and Mgfp5等。如图4中的pHT-tasA-mefp3和pHT-tasA-mefp5的图谱。Mussel foot protein(Mefp3)和Mefp5来源于贻贝的足丝蛋白。如图2中的i和l电镜观察图所示，融合了Mefp3和Mefp5的TasA都可以分泌到细胞外基质形成纤维。融合了Mfp3/5的蛋白能够赋予生物膜水下粘合特性。

(3)大于200个氨基酸的荧光报告蛋白：比如Mcherry，GFP和Maple3等。图5为pHT-tasA-mcherry和pHT-tasA-maple3的图谱。融合了Mcherry和Maple3的生物膜具有荧光特性。

(4)环境降解酶：比如重金属结合蛋白Metallothioneins(MTs，约63个氨基酸)、铅结合蛋白(PbrR，约144个氨基酸)、放射性铀结合蛋白(Uranyl-binding Protein，UP，约79个氨基酸)和有机磷水解酶(OPH，约340个氨基酸)和塑料降解酶等。图5包括pHT-tasA-oph的图谱。融合了有机磷水解酶OPH的tasA能以对氧磷、对硫磷和甲级对硫磷等有机磷为底物降解成对硝基苯酚。

最近从细菌中新发现的能降解聚(乙烯对苯二甲酸乙二醇酯(PET))的PET酶(PETase)和中间产物单(2-羧乙基)对苯二甲酸的降解酶(MHETase)，这两个酶能有效将PET降解成对苯二甲酸和乙二醇两个单体。因此PETase(290个氨基酸)和MHETase(603个氨基酸)都可以与tasA融合作为环境降解生物膜应用。

此外，生物膜在生物能源上有广泛的应用，因此一些能源相关的酶比如氢化酶和固氮酶等也可以融合在tasA纤维上。氢化酶是自然界微生物体内存在的一种金属酶，它能够催化氢气的氧化或者质子的还原，包括镍铁氢化酶和铁铁(唯铁Iron-only)氢化酶等。其中比较受关注的是唯铁氢化酶，主要催化质子的还原生成氢气作为清洁、高效无污染的可再生能源。大部分氢化酶在300-600个氨基酸内，可以通过tasA融合在枯草芽孢杆菌中分泌表达。固氮酶(nitrogenase)固氮酶是一种能够将分子氮还原成氨的酶，这类蛋白(MoFeprotein、NifH、NifU、NifM和NifS)大小约300～400个氨基酸，在实验证明可分泌的范围内。

以下实施例中，如无特殊说明，PCR扩增采用的反应体系(50μl)包括以下成份：

PCR反应条件为：98℃预变性20s，98℃10s，53℃30s，72℃30s，35个循环，最后72℃延伸2min，以去离子水为阴性对照。

以下实施例中，如无特殊说明，各抗生素溶液的配制方法为：羧苄青霉素(macklin，C805408)，红霉素(生工生物，A600192)，氯霉素(阿拉丁，C100331)，壮观霉素(sigma，S4014-5G-9)分别配制成100mg/ml的水溶液，10mg/ml的乙醇溶液，10mg/mL的乙醇溶液和100mg/mL的水溶液于-20℃保存。用时在融化的LB固体培养基中加少量于稀释至所需浓度后倒平板。

以下实施例中，如无特殊说明，带蓝白斑筛选液的平板的制备方法为：在相应平板上涂匀200μl的蓝白斑筛选液，室温静置30min待液体完全被吸干。

以下实施例中所用到的原始枯草芽孢杆菌3610为现有菌株，从芽孢杆菌保藏中心Bacillus Genetic Stock Center(BGSC)购买，保藏号为1L26；也可利用3610的comI失活菌株DS2569，现由上海科技大学保存，来源于美国印第安纳大学Daniel Keams教授课题组馈赠(Plasmid-Encoded ComI Inhibits Competence in the Ancestral 3610Strain of Bacillus subtilis.Journal of Bacteriology.2013，195(18)：4085-4093.Melissa A.Konkol，Kris M.Blair，Daniel B.Keams)，申请人保证从申请日起20年内向公众发放该生物材料。

以下实施例中所用到的2xYT培养基配方为(1L)：

Tryptone(胰蛋白胨) 16g；

Yeast extract(酵母提取物，Thermo Fisher Scientific，LP0021) 10g；

NaCl 4g。

10xMedium A base：(100mL)

Yeast extract(酵母提取物，同上) 1g；

Casamino acids(酪蛋白氨基酸) 0.2g；

加蒸馏水至90ml，高温蒸汽灭菌。加10ml 50％浓度的Glucose(葡萄糖)，过滤除菌，补至100mL。

10x Bacillus salts：(100ml)

加蒸馏水至100ml，高温蒸汽灭菌。

Medium A：(100mL)

蒸馏水 81ml

10xMedium A base 10ml；

10x Bacillus salts 9ml。

Medium B：(10mL)

Medium A 10ml；

50mM CaCl₂ 0.1ml；

250mM MgCl₂ 0.1ml。

实施例1：携带tasA-R表达质粒的枯草芽孢杆菌突变株的构建

(一)枯草芽孢杆菌突变株的构建：

枯草芽孢杆菌的生物膜主要成分是胞外多糖和淀粉样蛋白，主要由eps基因簇和tasA基因编码。

将产生物膜的原始枯草芽孢杆菌3610的淀粉样蛋白的编码基因tasA以及生物膜抑制子编码基因sinR在基因组上进行敲除，构建枯草芽孢杆菌突变株ΔtasAΔsinR001；将产生物膜的原始枯草芽孢杆菌的淀粉样蛋白的编码基因tasA以及产生胞外多糖的编码基因簇epsA-O和生物膜抑制子编码基因sinR在基因组上进行敲除，构建枯草芽孢杆菌突变株ΔtasAΔsinRΔeps002；该菌株于2016年6月6日保存在中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，(CGMCC编号：12600)。

将产生物膜的原始枯草芽孢杆菌的淀粉样蛋白的编码基因tasA以及产生胞外多糖的编码基因簇epsA-O在基因组上进行敲除，构建枯草芽孢杆菌突变株ΔtasAΔeps 003；

将产生物膜的原始枯草芽孢杆菌的淀粉样蛋白的编码基因tasA在基因组上进行敲除，构建枯草芽孢杆菌突变株ΔtasA004；

将产生物膜的原始枯草芽孢杆菌的产生胞外多糖的编码基因簇epsA-O在基因组上进行敲除，构建枯草芽孢杆菌突变株Δeps005。

构建上述5种突变株的具体方法为：

1、以完全基因组测序的枯草芽孢杆菌168基因组序列(基因组测序genebank号NC_000964)为依据，设计上游特异引物upstream-F和upstream-R和下游特异引物downstream-F和downstream-R。以野生型枯草芽孢杆菌3610基因组为模板，PCR扩出目的敲除基因在基因组上的上下游同源序列约1kb。其中上游片段的5’端和下游片段的3’端分别带有SalI/BglII(ΔtasAsinR)或NcoI/SmaI位点(ΔtasA，Δeps)。

1)对于构建ΔtasAΔsinR(001)，删除中间tasAsinR片段，上游片段所用引物对为D tasAsinR Upstream-F(SEQ ID NO：22)和D tasAsinR Upstream-R(SEQ ID NO：23)；下游片段所用引物对为D tasAsinR downstream-F(SEQ ID NO：24)和D tasAsinR downstream-R(SEQ ID NO：25)；

2)对于构建ΔtasAΔsinRΔeps(002)，在菌株001的基础上，进一步敲除epsA-O基因簇。扩增eps删除的上游片段的引物为：D eps Upstream-F(SEQ ID NO：26)和D eps Upstream-R(SEQ ID NO：27)；扩增下游片段的引物为：D eps downstream-F(SEQ ID NO：28)和D eps downstream-R(SEQ ID NO：29)；

3)对于构建ΔtasAΔeps(003)，在eps删除的基础上，进行tasA单基因删除。tasA删除的上游引物对为D tasA Upstream-F(SEQ ID NO：30)和D tasA Upstream-R(SEQ ID NO：31)，下游引物对为D tasA downstream-F(SEQ ID NO：31)和D tasA downstream-R(SEQ ID NO：32)；

4)对于构建ΔtasA(004)，使用上游引物对D tasA Upstream-F(SEQ ID NO：30)和D tasA Upstream-R(SEQ ID NO：31)，以及下游引物对为D tasA downstream-F(SEQ ID NO：31)和D tasA downstream-R(SEQ ID NO：32)；

5)对于构建Δeps(005)，扩增eps删除的上游片段的引物为：D eps Upstream-F(SEQ ID NO：26)和D eps Upstream-R(SEQ ID NO：27)；扩增下游片段的引物为：D eps downstream-F(SEQ ID NO：28)和D eps downstream-R(SEQ ID NO：29)。

2、基因组敲除整合质粒的构建：将上述上下游同源片段、与经相同内切酶消化后性化的pMAD载体(Biovecter，3549060)进行Gibson连接。使用NEB的Gibson Assembly试剂盒(NEB，E2611L)，根据各片段的长度和浓度，按所需比例分别加至EP管中。反应体系在50℃中恒温孵育连接1小时。Gibson assembly(NEB，E2611L)反应体系如下：

将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞(康为世纪，CW08085)。挑取具有羧苄青霉素抗性的单克隆，用提质粒试剂盒(天根，DP103)按照操作说明提取质粒DNA，用SalI和BglII双酶切(thermo scientific FD0644，FD0083)鉴定。鉴定得到的阳性质粒经测序无误后，即得到正确的整合质粒。

3、将基因组敲除整合质粒采用化学转化法转入大肠杆菌TG1菌株：

3.1从LB平板上挑活化的大肠杆菌TG1(Biovecter，BioVector105812-6)，接种于5ml的LB培养基，37℃振荡培养过夜。

3.2将菌液按1∶100的比例接种，取250μl菌液于25ml的LB培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD 600＝0.5左右。

3.3将菌液转入50ml离心管中，冰上放置10min。

3.4在4℃下，4000r/min离心10min，弃上清，将管倒置1min至液体流尽。

3.5用冰上预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液10ml轻轻悬浮细胞，冰上静置30min。

3.60-4℃，4000r/min离心10min，弃上清，加入2ml预冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置，得到感受态细胞。

3.7取200μl上述制备好的感受态细胞，加入步骤(2)得到的1μg整合质粒，化学转化法转入。

4、采用提质粒试剂盒(天根，DP103)按照操作说明从步骤(3)中得到的大肠杆菌TG1中提取整合质粒，采用Spizizen转化法转入枯草杆菌待敲除的菌株。Spizizen转化法的具体步骤如下：

4.1活化待转化的枯草杆菌3610(芽孢杆菌保藏中心Bacillus Genetic Stock Center(BGSC)，1L26)。

4.2挑新鲜单克隆接种于3ml的2xYT培养基，37℃过夜振荡培养。

4.3按1∶100比例将菌种接种于5ml的medium A中，37℃振荡培养3.5h。

4.4按1∶10比例接种medium A中的菌于medium B中，37℃振荡培养1.5h，制得感受态细胞。

4.5此刻制得感受态细胞，500μl的感受态细胞中加入1μg从大肠杆菌TG1中提取的整合质粒DNA。

4.6 37℃水浴静置感受态60min。

4.7 37℃振荡培养感受态细胞2h，涂带有蓝白斑筛选液(中国台湾生工，ZL001BS)和5μg/ml红霉素的LB培养基的平板，30℃培养过夜；其中，LB培养基的配制方法为：取LB培养基(中国台湾生工，LD001)2.5g溶于100ml蒸馏水，加1.5g琼脂粉，高温蒸汽灭菌，待冷却至约50℃时，加入红霉素溶液至终浓度。

5、筛选显蓝斑的单克隆，在含5μg/ml红霉素抗性的LB培养基中30℃培养过夜，将OD稀释为0.1接种到5ml含5μg/ml红霉素抗性的LB培养基中，先30℃培养2小时再将温度升高到42℃培养6h。稀释菌液10²-10⁴倍涂带有5μg/ml红霉素抗性和蓝白斑筛选液的LB平板，42℃培养过夜。

6、挑选上步平板显白色的单克隆，接种到5ml无抗LB培养基中30℃培养6小时再将温度升高到42℃培养3小时。稀释菌液10²-10⁴倍涂带有蓝白斑筛选液的LB平板，42℃培养过夜。

7、挑选上步平板显白色的单克隆，分别点在无抗LB培养基和带有5μg/ml红霉素抗性的LB平板上，挑选在LB培养基上生长但是在红霉素抗性中不能生长的单克隆。

8、对上步挑选的单克隆接种并用提基因组试剂盒(全式金，EE11-11)提取基因组，经PCR鉴定是否敲除成功。经过5-8步骤依次筛选最后PCR证明的得到的成功敲除的菌株进行保菌，分别构建得到枯草芽孢杆菌生物膜突变株001、002、003、004、005菌株。

菌落PCR(全式金，AS111-11)反应如下：

综上所述，本发明通过敲除淀粉样蛋白编码基因tasA和胞外多糖编码基因簇epsA-O以及生物膜抑制因子sinR等构建了各种相应的生物膜突变菌株。

在MSGG培养基(配方如下列出)中观察生物膜的表型，MSGG培养基配方如下：3-(吗啉基)丙磺酸100mM，丙三醇0.5％，谷氨酸钠一水0.5％，磷酸钾5mM，L-色氨酸50μg/ml，L-苏氨酸50μg/ml，盐酸硫胺(维他命B1)2μM，MgCl₂.6H₂O 2mM，CaCl₂ 700μM，FeCl₃.6H₂O 50μM，MnCl₂ 50μM，ZnCl₂ 1μM，其中，氨基酸溶液，盐酸硫胺和离子溶液用蒸馏水配制母液后过滤除菌，置于4℃冰箱保存，其余溶解于去离子水后高温蒸汽灭菌。使用时各物质稀释至上述使用浓度。如图1中a所示，为枯草芽孢杆菌野生型能形成一层褶皱的生物膜，如图1中b所示，敲掉了tasA基因的单突变株不能形成褶皱的生物膜，但还能形成一层较光滑的生物膜，如图1中c所示，敲掉了tasA和sinR后的双突变株，生物膜的产生更多，如图1中d所示，敲掉了tasA和sinR和eps基因簇后的三突变株，几乎不能形成生物膜(d)。

(二)构建TasA-R表达质粒，在步骤(一)中得到的枯草芽孢杆菌突变株中转入TasA-R表达质粒，得到能够分泌TasA-R融合蛋白的枯草芽孢杆菌，R为功能基团。

在生物膜突变株的基础上，本发明构建了一系列表达外源tasA-R的融合质粒，融合了带有不同功能化基团的肽段，质粒图谱如图5所示。在枯草芽孢杆菌的稳定表达质粒pHT01(mobitec公司)中插入tasA及其tasA-R融合基因片段，构建在IPTG诱导(Pgrac启动子)下调控表达的tasA-R融合质粒。除构建上述一系列基本tasA-R生物膜表达质粒，也可根据需要进行调控，调控不仅限于IPTG诱导，也有营养诱导、温控、光控以及群体感应调控等。

根据需要携带的目的表达质粒，构建pHT01-tasA等基本表达载体。构建上述所需的表达质粒，其涉及的主要步骤包括：

(1)根据已知的表达载体pHT01、tasA以及R片段的序列，以枯草杆菌168基因组(Biovector，枯草芽孢杆菌168)为模板，设计tasA的上下游特异引物，扩出tasA片段。根据已知的序列优化结果合成的R片段，设计R片段的上下游特异引物。其中tasA片段的5’端和R片段的3’端分别带有BamHI(或SmaI)和SmaI酶切位点。

tasA和R中间用八个或十个氨基酸的接头连接，tasA-R融合蛋白分泌表达并在生物膜上自组装成纤维，形成具有可调控的纳米生物材料生物膜，八个或十个氨基酸的接头可以为(GGGSGGGS或GGGGSGGGGS)，在基因合成或PCR得到R编码基因的时候将接头的序列加进去。

构建各质粒分别扩增tasA、R片段所用的引物如下：

1)对于构建质粒pHT01-tasA，tasA片段的正向引物Bam-tasA-F和反向引物Sma-tasA-R分别为：Bam-tasA-F(SEQ ID NO：33)和Sma-tasA-R(SEQ ID NO：34)。表达载体pHT01的序列见序列列表SEQ ID NO：19，插入的tasA片段对应DNA和氨基酸序列分别见SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，质粒图谱见图5。

2)对于构建质粒pHT01-tasA-Histag：引物为Bam-tasA-F(SEQ ID NO：33)和Sma-tasA-histag-R(SEQ ID NO：35)。质粒图谱见图5。Histag的氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：3。

3)对于构建pHT01-tasA-spytag：引物为Bam-tasA-F(SEQ ID NO：33)和Sma-tasA-spytag-R(SEQ ID NO：36)。质粒图谱见图5。Spytag的氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：4。

4)对于构建pHT01-tasA-mgfp3-Histag：引物为Bam-tasA-F(SEQ ID NO：33)和Sma-tasA-mgfp3-R(SEQ ID NO：37)。Mgfp3的氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：7。

5)对于构建pHT01-tasA-mgfp5-Histag：

引物为Sma-mgfp5-tasA-F(SEQ ID NO：38)和Sma-mgfp5-tasA-R(SEQ ID NO：39)。Mgfp5的氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：9。

6)对于构建pHT01-tasA-mefp3-Histag：分别使用引物对tasA-F(SEQ ID NO：40)/tasA-R(SEQ ID NO：41)和tasA-mefp3-F(SEQ ID NO：42)/tasA-mefp3-R(SEQ ID NO：43)。质粒图谱见图5。Mefp3的氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：6。

7)对于构建pHT01-tasA-mefp5-Histag：

分别使用引物对tasA-F(ID40)/tasA-R(SEQ ID NO：41)和tasA-mefp5-F(SEQ ID NO：44)/tasA-mefp5-R(SEQ ID NO：45)。质粒图谱见图5。Mefp5的氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：8。

8)对于构建pHT01-tasA-mms6-Histag：分别使用引物对tasA-F(SEQ ID NO：40)/tasA-R(SEQ ID NO：41)和tasA-mms6-F(SEQ ID NO：46)/tasA-mms6-R(SEQ ID NO：47)。质粒图谱见图5。Mms6的氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：5。

9)对于构建pHT01-tasA-mts-Histag：

在pHT01-tasA-mefp3-histag的基础上，PCR扩增出mrs基因，利用BamHI-SpeI酶切位点插入即将mefp3替换为mts片段得到pHT01-tasA-mts-Histag。PCR的引物为：mts-F(SEQ ID NO：48)/mts-R(SEQ ID NO：49)。质粒图谱见图5。mts的氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：13。

10)对于构建pHT01-tasA-pbrR-Histag：

同上，在pHT01-tasA-mefp3-histag的基础上，PCR扩增出pbrR基因，利用BamHI-SpeI酶切位点插入。

PCR的引物为：pbrR-F(SEQ ID NO：50)/pbrR-R(SEQ ID NO：51)。质粒图谱见图5。PbrR的氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：14。

11)对于构建pHT01-tasA-sup-Histag：

同上，在pHT01-tasA-mefp3-histag的基础上，苏州金唯智公司直接合成sup基因，两端带有BamHI-SpeI酶切位点，直接插入亚克隆得到质粒pHT01-tasA-sup-Histag。质粒图谱见图5。sup的氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：15。

12)对于构建pHT01-tasA-mcherry-Histag：

分别使用引物对tasA-F(SEQ ID NO：40)/tasA-R(SEQ ID NO：41)和tasA-mcherry-F(SEQ ID NO：52)/tasA-mcherry-R(SEQ ID NO：53)。

质粒图谱见图5。Mcherry的氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：10。

13)对于构建pHT01-tasA-maple3-Histag：

分别使用引物对tasA-F(SEQ ID NO：40)/tasA-R(SEQ ID NO：41)和tasA-maple3-F(SEQ ID NO：54)/tasA-maple3-R(SEQ ID NO：55)。

质粒图谱见图5。Maple3的氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：11。

14)对于构建pHT01-tasA-OPH-Histag：

分别使用引物对tasA-F(SEQ ID NO：40)/tasA-R(SEQ ID NO：41)和tasA-oph-F(SEQ ID NO：56)/tasA-oph-R(SEQ ID NO：57)。

质粒图谱见图5。OPH的氨基酸序列见序列列表SEQ ID NO：12。

15)对于构建pHT01-tasA-OPH：

在前述14)中表达质粒pHT-tasA-OPH-Histag的基础上，利用BamHI(Thermo Scientific^TM，FD0055)/XbaI(Thermo Scientific^TM，FD0684)双酶切去除histag，扩增OPH片段，所用引物对为Bam-OPH no his F(SEQ ID NO：58)/Xba-OPH no his R(SEQ ID NO：59)，然后插入到载体中。

(2)表达载体的构建：将上述得到的tasA片段、R片段或tasA-R片段，和经双酶切后的pHT01载体，用Gibson Assembly(NEB，E2611L)连接。Gibson连接方法同步骤(一)中的2所述。

(3)表达载体转化DH5α(康为世纪CW08085)后，采用提质粒试剂盒(天根DP103)提取质粒，由苏州金唯智公司测序后，鉴定重组质粒正确。

(4)将重组质粒采用Spizizen转化法转入(同步骤(一)中的4所述。)枯草芽孢杆菌突变株(001或002或003或004)中，涂带有5μg/ml氯霉素抗性的LB平板，37℃培养过夜。

(5)挑选得到的单克隆，接种到含5μg/ml氯霉素抗性的LB培养基中，提取基因组，经菌落PCR鉴定是否含有目的基因片段(tasA片段或R片段)，如扩出条带则证明质粒转化成功。

除了上述IPTG诱导表达的质粒系统，本发明同时设计了群体感应系统活化的生物膜表达菌株，以非致病性的金黄色葡萄球菌RN4220基因组的序列为参考，设计构建了QS信号发送型质粒pDG-P2-agrBDCA和信号接收质粒pDG-P2-agrCA然后整合到枯草芽孢杆菌的基因组上，详见实施例2。

利用透射电子显微镜(TEM)和场发射扫描电子显微镜(FE-SEM)来观察细菌生物膜上分泌的淀粉样蛋白纤维。如图2所示，通过TEM观察，可以看到敲除tasA的突变株都没有纤维，而携带了表达质粒的突变株经过IPTG诱导后能恢复形成纤维的能力；没有IPTG诱导时不形成纤维。

IPTG诱导的步骤：将携带tasA-R融合质粒的工程菌接种于含5μg/ml氯霉素的LB液体培养基过夜(37℃，220rpm)，次日按1∶100比例接种于含1mmol/L IPTG和5μg/ml氯霉素的MSGG液体培养基中。

同样如图3的FE-SEM观察到，携带空质粒pHT01的突变株不产生物膜，而携带tasA-R融合质粒的基因工程菌经IPTG诱导后能恢复产生生物膜纤维。

取液体MSGG培养基中培养2天的生物膜溶液10μl，滴于铜网(中镜科仪，BZ10024a)上静置2-5min，用滤纸吸干。取10μl的blocking buffer于铜网上，静置30min，吸干。blocking buffer配方为：200ml PBS(life technology，00051)中加上40μl Tween 20(生工，A600560-0500)和0.4g脱脂奶粉(BD Difco，232100)。取10μl的一抗溶液(一抗稀释150倍于blocking buffer后使用)滴于铜网上，静置2h，吸干。取10μl的PBST洗一次，吸干。PBST的配方为：PBS+0.1％Tween 20。取10μl的二抗溶液(二抗稀释50倍于PBST后使用)滴于铜网上1h，吸干。取10μl的PBST洗一次，吸干。再用10μl的去离子水洗一次，吸干。取10μl的(2.5mg/ml)醋酸铀溶液滴于铜网，染色30s，吸干。

结果如图4所示，利用anti-TasA的一抗体(艾比玛特Abmart-艾比玛特生物医药(上海)有限公司定制合成抗体)孵育，然后用带有纳米金标的二抗(BBI solutions，Goat anti Rabbit IgG 20nm Gold)进行反应，通过免疫金标TEM证明生物膜分泌的纤维都为TasA-R融合纤维。

实施例2：携带tasA-R表达质粒的枯草芽孢杆菌突变株的构建

除了实施例1中所述的质粒表达方法，也可以进行枯草芽孢杆菌基因组直接替换方案。不敲除生物膜编码基因，而是直接在基因组水平将tasA替换为tasA-R基因。

基因组水平直接整合表达融合的tasA-R生物膜，有组成型表达以及启动子诱导型两种表达方式。

1.组成型tasA-R生物膜表达基因组整合菌株构建：

以tasA-histag，tasA-mefp3-histag，tasA-mefp5-histag，tasA-mcherry-histag和tasA-oph等片段整合到基因组上为例，包含以下步骤：

(1)以实施例1中的表达载体为模板，设计特异性上下游引物，扩出拟替换的tasA-histag、tasA-mefp3-histag、tasA-mefp5-histag、tasA-mcherry-histag和tasA-oph片段。以枯草杆菌168基因组序列为参考，设计tasA上游特异引物upstream-F和upstream-R和tasA下游特异引物downstream-F和downstream-R，扩出目的替换在基因组上的上下游同源序列约1kb。

涉及到的PCR引物如下：

对于构建pMAD-tasA-histag，pMAD-tasA-mefp3-histag，

pMAD-tasA-mefp5-histag，pMAD-tasA-mcherry-histag，pMAD-tasA-oph。

扩增tasA位点上游同源片段：引物对upstream-F(SEQ ID NO：60)/upstream-R(SEQ ID NO：61)；

扩增tasA位点下游同源片段：引物对downstream-F(SEQ ID NO：62) /downstream-R(SEQ ID NO：63)；

扩增要替换用的目标片段tasA-histag：引物对th-tasA-F(SEQ ID NO：64)/histag-R(SEQ ID NO：65)；

扩增要替换用的目标片段tasA-mefp3-5-H：引物对th-tasA-F(SEQ ID NO：64)/mefp3-5-R(SEQ ID NO：66)；

扩增要替换用的目标片段tasA-mcherry-His：引物对th-tasA-F(SEQ ID NO：64)/mecherry-R(SEQ ID NO：67)；

对于构建整合型质粒pMAD-tasA-oph：引物对tasAoph-mad F(SEQ ID NO：68)/oph-R(SEQ ID NO：69)用来扩增tasA-oph片段，再引物对sinI-F(SEQ ID NO：70)/sinI-mad R(SEQ ID NO：71)扩增下游同源片段，然后与pMAD进行Gibson连接即得到整合质粒。

(2)能够表达TasA-R蛋白的基因组替换整合质粒的构建：将上述目的替换片段、上下游同源片段与经NcoI(Themo Scientific^TM，FD0573)/SmaI(Thermo Scientific^TM，FD0663)或SalI(Thermo Scientific^TM，FD0644)/SmaI(tasA-oph)位点双酶切后的pMAD载体进行Gibson连接。Gibson连接方法同实施例1中步骤(一)中的2所述。

(3)将Gibson连接产物采用化学转化法转入大肠杆菌TG1菌株，涂于含50μg/ml羧苄青霉素抗性的LB平板。

(4)从大肠杆菌TG1中提取整合质粒，采用Spizizen转化法转入枯草杆菌待敲除的菌株(枯草芽孢杆菌3610或DS2569)，涂带有5μg/ml红霉素抗性且蓝白斑筛选液的LB平板，30℃培养过夜。

(5)筛选上步平板显蓝斑的单克隆，在含5μg/ml红霉素抗性的LB培养基中30℃培养过夜，将OD稀释为0.1接种到5ml含5μg/ml红霉素抗性的LB培养基中，先30℃培养2小时再将温度升高到42℃培养6hs。稀释菌液10²-10⁴倍涂带有5μg/ml红霉素抗性且蓝白斑筛选液的LB平板，42℃培养过夜。挑选上步平板显白色的单克隆，接种到5ml无抗LB培养基中30℃培养6小时再将温度升高到42℃培养3小时。稀释菌液10²-10⁴倍涂带有蓝白斑筛选液的LB平板，42℃培养过夜。

(6)挑选上步平板显白色的单克隆，分别点在无抗LB和带有5μg/ml红霉素的LB平板上，挑选在LB上生长但是在红霉素抗性中不能生长的单克隆。

(7)对上步挑选的单克隆接种并提取基因组，经PCR鉴定是否替换成功。以此方法得到基因组tasA分别被替换成tasA-histag、tasA-mefp3-histag、tasA-mefp5-histag、tasA-mcherry-histag、tasA-oph的菌株。

2.诱导型tasA-R生物膜表达基因组整合菌株构建。

可诱导或调控的基因组水平表达，不仅是IPTG诱导，也有营养诱导、温控、光控以及群体感应调控。

2.1以IPTG诱导为例，具体步骤为：

(1)以实施例1中构建的pHT01-tasA-R系列表达质粒为模板，扩增带有启动子在内的lacI-Pgrac-tasA-R片段；再以枯草杆菌168基因组序列为参考，设计上游特异引物upstream-F和upstream-R和下游特异引物downstream-F和downstream-R，扩出目的替换在基因组上的上下游同源序列约1kb。

涉及到的引物序列如下：

以pMAD-lacI-Pgrac-tasA-histag为例，

扩增上游片段：Sal-dA upstream-F(SEQ ID NO：72)/dA upstream-R(SEQ ID NO：73)；

扩增下游片段：dC downstream-F(SEQ ID NO：74)/bgl-dC downstream-R(SEQ ID NO：75)；

扩增替换的tasA-histag片段：tasA-histagF(SEQ ID NO：76)/tasA-histag-R(SEQ ID NO：77)。

(2)基因组替换整合质粒的构建：将上述目的替换片段、上下游同源片段与经SalI/BglII位点双酶切后的pMAD载体进行Gibson连接。Gibson连接方法同实施例1中步骤(一)中的2所述。

(3)将Gibson连接产物采用化学转化法转入大肠杆菌TG1菌株。

(4)从大肠杆菌TG1中提取整合质粒，采用Spizizen转化法转入枯草杆菌待敲除的菌株(枯草芽孢杆菌3610或DS2569)，涂带有5μg/ml红霉素抗性且蓝白斑筛选液的平板，30℃培养过夜。

(5)筛选上步平板显蓝斑的单克隆，在含5μg/ml红霉素抗性的LB培养基中30℃培养过夜，将OD稀释为0.1接种到5ml含5μg/ml红霉素抗性的LB中，先30℃培养2小时再将温度升高到42℃培养6h。稀释菌液10²-10⁴倍涂带有红霉素抗性且蓝白斑筛选液的平板，42℃培养过夜。

(6)挑选上步平板显白色的单克隆，接种到5ml无抗LB中30℃培养6小时再将温度升高到42℃培养3小时。稀释菌液10²-10⁴倍涂带有蓝白斑筛选液的平板，42℃培养过夜。

(7)挑选上步平板显白色的单克隆，分别点在无抗LB和带有5μg/ml红霉素的LB平板上，挑选在LB上生长但是在LB+5μg/ml红霉素抗性中不能生长的单克隆。

(8)对挑选的单克隆接种并提取基因组，经PCR鉴定是否替换成功。以此方法得到基因组上具有IPTG调控表达的tasA-histag整合菌株。

实验证明，基因组水平上组成型tasA-R或IPTG诱导型tasA-R生物膜都能表达，并且成功分泌有活性的TasA-R纤维。

2.2以群体感应系统(QS)为例：

(1)Sender质粒构建。对照金黄色葡萄球菌NCTC 8325(美国菌种保藏中心ATCC 35556)的群体感性系统的序列P2-agrBDCA，让苏州金唯智公司直接合成一段分泌信号的序列P2-agrBD，末尾带有转录终止子ter，得到的序列为P2-agrBD-ter，见序列SEQ ID NO：17。该片段前后带有BamHI-EcoRI位点，中间设计了HindIII、BglII、SalI等酶切位点，插入到整合质粒pDG1730(Biovector，pDG1730)的BamHI-EcoRI中，得到pDG-BamHI-P2-HindIII-agrBD-BglII-SalI-ter-EcoRI(pDG-P2-agrBD-ter)，该质粒可用于后面的agrCA的亚克隆构建。

(2)完整Sender质粒带自诱导构建。设计引物对hindbgl-agrCAF(SEQ ID NO：78)/sal-agrCA R(SEQ ID NO：79)，以金黄色葡萄球菌NCTC 8325(美国菌种保藏中心ATCC 35556)为模板，PCR扩增QS信号分子接收系统agrCA的基因片段，前后带有BglII(Thermo Scientific^TM，FD0083)/SalI(Thermo Scientific^TM，FD0644)位点，插入到pDG-P2-agrBD-ter的相应位点，得到包含整个操纵子的Sender质粒pDG-P2-agrBDCA-ter。

(3)Receiver质粒构建。如上引物，扩增的agrCA片段，用HindIII-SalI位点，插入到pDG-P2-agrBD-ter的相应位点，即得到仅有接收系统的Receiver质粒pDG-P2-agrCA-ter。

质粒图谱见图5。agrCA的PCR片段的序列见序列列表SEQ ID NO：18。

整合质粒pDG1730的序列见列表SEQ ID NO：21。

(4)将Sender质粒和Receiver质粒分别采用Spizizen转化法转到(001)突变菌株，涂于携带100μg/ml壮观霉素(Spe100)抗性的LB平板上，挑选在Spe100平板上长出的菌株，提取基因组作为模板做菌落PCR，得到目的条带，则得到amyE成功整合的Sender菌株P2-agrBDCA-ter以及Receiver菌株P2-agrCA-ter。

(5)将tasA-R融合基因插入到受QS信号分子活化的P3启动子(基因合成约158bp，具体序列见序列表SEQ ID NO：16)下游进行表达，将表达质粒转化Receiver菌株，即得到QS系统调控的TasA-R表达的系列菌株，比如P3-tasA-histag、P3-tasA-mcherry-histag、P3-tasA-mefp3-histag、P3-tasA-mefp5-histag和P3-tasA-oph等。

18)对于构建pMK-P3-tasA-histag：

先分别扩增P3、tasA-histag片段，然后Gibson连接经SalI-BamHI酶切的pMK4载体(Biovecter，3538208)，得到pMK-P3-tasA-histag。

扩增P3片段：引物对P3-pMK F(SEQ ID NO：81)/P3-tas R(SEQ ID NO：82)；

扩增tasA-histag片段：以pHT-tasA-histag为模板；

引物对Tas-P3F(SEQ ID NO：83)/TH-pMK R(SEQ ID NO：84)。

19)对于构建pMK-P3-tasA-meherry-histag：

与上述pMK-P3-tasA-histag的方法相同，扩增P3的引物一样，引物对P3-pMKF(SEQ ID NO：81)/P3-tas R(SEQ ID NO：82)；tasA-mcherry-histag片段的扩增是以pHT-tasA-mcherry-histag为模板，引物对Tas-P3F(SEQ ID NO：83)/TMCH-pMK R(SEQ ID NO：85)。

因为tasA与mcherry以及histag之间都设计了酶切位点，所以构建后续的pMK-P3-tasA-mefp3-histag、pMK-P3-tasA-mefp5-histag和pMK-P3-tasA-oph等表达质粒时可以利用酶切连接直接构建。

先用BamHI-SmaI酶切pMK-P3-tasA-mcherry-H，去掉700bp，回收6.6kb的pMK-P3-tasA片段。然后PCR扩增出目的片段，经BamHI-SmaI插入到酶切的pMK-P3-tasA载体中即可。

20)对于构建pMK-P3-tasA-mefp3-histag：以pHT-tasA-mefp3-histag为模板扩增mefp3-histag片段，引物对Bam-me3 F(SEQ ID NO：86)/Sma-me35 R(SEQ ID NO：87)。

PCR产物mefp3-histag片段经BamHI-SmaI插入酶切的载体中，连接得到pMK-P3-tasA-mefp3-histag。

21)对于构建pMK-P3-tasA-mefp5-histag：以pHT-tasA-mefp5-histag为模板扩增mefp5-histag片段，引物对Bam-me5F(SEQ ID NO：88)/Sma-me35R(SEQ ID NO：87)。

PCR产物mefp5-histag片段经BamHI-SmaI插入酶切的载体中，连接得到pMK-P3-tasA-mefp5-histag。

22)对于构建pMK-P3-tasA-oph：

以pHT-tasA-oph为模板扩增oph片段，引物对Bam-oph F(SEQ ID NO：89)/Sma-oph R(SEQ ID NO：90)。PCR产物oph片段经BamHI-SmaI插入酶切的载体中，连接得pMK-P3-tasA-oph。表达质粒pMK4的序列见列表SEQ ID NO：20，P3启动子序列见序列列表SEQ ID NO：16，TasA、Mcherry、Mefp3、Mefp5和OPH等氨基酸序列见序列列表。

实验证明，QS sender菌液的加入或共培养，能有效活化Receiver菌株的TasA-R生物膜的表达和分泌，并且具有相应的功能。

如图6所示，为加入Sender菌株的上清(含信号分子)后，Receiver菌分泌TasA-Histag生物膜能绑定量子点CdSe@ZnS。具体步骤为：将Sender菌株和带有tasA-histag的Receiver菌株，分别摇菌于5ml含LB+Spe100或LB+Spe100+C15培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜。次日5000g离心10min。收集Receiver/tasA-histag的菌体，用MSGG+Spe100(100μg/ml壮观霉素)+C15(5ug/ml氯霉素)培养基悬浮到OD600＝1。取离心后的Sender上清1∶1加入到悬浮的Receiver/tasA-histag MSGG菌体中，即相当于悬浮稀释至OD＝0.5。对照不加上清则完全用MSGG+Spe100+Cl5培养基悬浮到OD600＝0.5。然后分别取2ml菌液于24孔板中，加入1％Ni-NTA修饰的量子点CdSeS@ZnS(本实验室合成)。紫外照射可见荧光(图b)，而对照没有加Sender上清的生物膜几乎不能绑定量子点没有荧光。

实施例3：包含tasA-Histag融合蛋白的生物膜平台用于生物催化

表达tasA-histag生物膜的菌株，可以为基因组整合的组成型表达，也可以为IPTG诱导型表达或者携带IPTG诱导表达质粒的菌株，这里以实施例1中的ΔtasAΔsinRΔeps三突变的(002)突变株携带pHT01-tasA-histag表达质粒，IPTG诱导TasA-Histag为例，具体步骤为：

1.转化：将表达质粒转化生物膜突变株(002)，转化方法如下：

(1)活化待转化的实施例1中的ΔtasAΔsinRΔeps三突变的(002)突变株。

(2)挑新鲜单克隆接种于3ml的2xYT培养基，37℃过夜振荡培养。

(3)按1∶100接种过液菌于5ml的medium A中，37℃振荡培养3.5h。

(4)按1∶10接种medium A中的菌与medium B中，37℃振荡培养1.5h。

(5)此刻制得感受态细胞，500μl的感受态中加入pHT01-tasA-histag表达质粒或pHT01-tasA表达质粒至1μg。

(6)37℃静置60min。

(7)37℃振荡培养感受态细胞2h，涂于带5μg/ml氯霉素抗性的LB平板。

2.培养：分别接突变株002/pHT01-tasA-Histag和002/pHT01-tasA于5ml含5μg/ml氯霉素的LB培养基中37℃，220rpm振荡培养过夜。次日取出菌液，测定600nm处吸光值。菌液5000g离心10min，用适量带5μg/ml氯霉素抗性的MSGG培养基将菌体悬浮稀释至OD＝0.5，然后分别取2ml菌液于24孔板中，加入IPTG(0.5mM)，再加1％Ni-NTA修饰的AuNPs(后文中用AuNPs表示)(nanoprobes，2082-3ml)或者Ni-NTA修饰的量子点CdSeS@ZnS或者Cd_0.8Zn_0.2S量子点(本实验室合成)。将24孔板放置于30℃培养箱中静置培养。

Ni-NTA修饰的CdSeS@ZnS量子点的制备：CdO(282.5mg，2.2mmol)和OA(油胺，10mL)的混合液脱气并在氮气保护条件下加热至150℃，然后加入40mL的ODE(1-18烯)并且加热至305℃。将Se(42.6mg，0.54mmol)和S(1.9mg，0.06mmol)溶于0.6mL的TOP(三辛基膦)中，然后迅速注入反应混合液。反应混合液维持在305℃反应90s以促进CdSeS壳的生长，然后逐滴加入十二硫醇(0.59mL，3.4mmol)，反应混合液降至270℃。Zn(OAc)₂(1.049g，5.72mmol)溶于OA(8mL)和ODE(2mL)的混合液中，注入反应混合液，然后S(0.432g，13.5mmol)溶于TOP(7mL)中，快速注入反应混合液中，反应在270℃保持10min以促进完全成壳。得到的量子点溶于正己烷中并用无水乙醇洗三遍，得到CdSeS@ZnS量子点，重悬于20mL正己烷中保存。1mL的乙醇加入1mL(10μmol/mL)的CdSeS@ZnS量子点溶液中，离心，弃上清，并重悬于15mL的二氯甲烷。然后加入20mg/mL HS-NTA(本实验室合成)甲醇溶液(1mL，pH＝13)，缓慢搅拌2min，加入9mL的PBS溶液，分出水相并用0.2μm的滤膜过滤，所得溶液为具有NTA配体的CdSeS@ZnS量子点。在(500nmmol/mL)的具有NTA配体的CdSeS@ZnS量子点的水溶液(1mL)中加入(20μL)的50mM的NiCl₂溶液，得到具有Ni-NTA配体的6nm或8nm的金纳米颗粒(Ni-NTA修饰的AuNPs)。

Ni-NTA修饰的量子点Cd_0.8Zn_0.2S的制备：将0.0064g氧化镉，0.0081g氧化锌，0.5ml油酸和4ml 1-18烯混合然后加热到80℃，然后用真空泵抽气20分钟。往反应瓶中充入氮气，将反应温度升到310℃直至氧化镉与氧化锌的完全溶解，并形成澄清透明的溶液后，将温度降至300℃。把硫溶液(将0.0032g硫溶解到4mL1-18烯中，边搅拌边抽气)快速注入到热的反应液中。反应体系保持300℃三个小时以使得纳米晶体生长。反应液用25℃氯仿淬灭。加入甲醇使得纳米晶体析出，得到Cd_0.8Zn_0.2S纳米颗粒，将沉淀溶于二氯甲烷放于4℃冰箱保存。1mL的乙醇加入1mL(10μmol/mL)的上述合成的(6mmol/L)Cd_0.8Zn_0.2S纳米颗粒溶液中，离心，弃上清，并重悬于15mL的二氯甲烷。然后加入20mg/mLHS-NTA甲醇溶液(1mL，pH＝13)，缓慢搅拌2min，加入9mL的PBS溶液，分出水相并用0.2μm的滤膜过滤，所得溶液为具有NTA配体的Cd_0.8Zn_0.2S纳米颗粒。在(500nmmol/mL)的具有NTA配体的Cd_0.8Zn_0.2S纳米颗粒的水溶液(1mL)中加入(20μL)的50mM的NiCl₂溶液，得到具有Ni-NTA配体的Cd_0.8Zn_0.2S纳米颗粒。

HS-NTA的合成：

溴乙酸(8.34g，60mmol)溶于30mL的2M的氢氧化钠溶液得到溴乙酸溶液，N⁶-Cbz-L-赖氨酸(Cbz-lys)(8.4g，30mmol)溶于45mL的2M的氢氧化钠溶液得到Cbz-lys溶液。在冰浴条件下将Cbz-lys溶液逐滴加到溴乙酸溶液中，室温搅拌过夜。加热到70℃，反应2h后冷至室温。加入1M的HCl溶液使其沉淀完全，并将沉淀重新溶解在100mL的1M氢氧化钠溶液中。最后重新加入1M的HCl溶液使其沉淀完全，抽滤并干燥，得到9.55g的Cbz-NTA。

在三口烧瓶中加入Cbz-NTA(6g，15mmol)和Pd/C(钯碳)催化剂(10％，0.6g)，然后加入100mL的甲醇。在H₂氛围下室温搅拌过夜。过滤得到甲醇溶液，沉淀用40mL的去离子水溶解并抽滤得到水溶液。将甲醇溶液和水溶液旋干，然后将产物重新溶解于20mL去离子水中，加入乙醇直到溶液变浑浊，然后将其置于-20℃冷却析出，过滤并干燥得到3.4g的NH₂-NTA。

将NaHCO₃(1g，11.9mmol)和硫代丁内酯(0.6g，5.9mmol)溶于10mL的去离子水中，然后加入NH₂-NTA(1g，3.8mmol)。反应混合液72℃搅拌过夜，然后冷至室温。加入大约1mL的乙酸将pH调到3左右，旋蒸并使其在乙醇中重新结晶，抽滤并用乙醇和戊烷分别洗三次，干燥产物得到1.26g的HS-NTA。

3.制样观察与表征。2天后，取出孔板。取20μl菌液于铜网上，2min后用滤纸吸干培养基，滴加20μl ddH₂O洗涤样品，再用滤纸吸干。加入10μl(2.5mg/ml)醋酸铀染色2min，用滤纸吸干，再65℃烘干15min使样品干燥。最后将样品放于恒温箱中，透射电子显微镜观察。如图7a所示，分泌了TasA-Histag的生物膜能特异性地结合纳米金颗粒，如图7b所示，仅分泌TasA的生物膜不能结合纳米金颗粒或量子点QDs。

试剂：硼氢化钠(NaBH₄)，国药，80115865

Ches buffer：sigma，C2885-100G

对氧磷(Paraoxon)：sigma，36186-100mg

实验步骤：接002/pHT01-tasA-OPH和002/pHT01-tasA-Histag于含5μg/ml氯霉素抗性的液体LB培养基中过夜摇菌，5000g、10min收菌，重悬菌体于MSGG(0.5mM IPTG，5μg/ml氯霉素)中，调OD＝1。002/pHT01-tasA-OPH菌液置于平板中，002/pHT01-tasA-Histag菌液取等量三份，每份4ml于12孔板中，分别加入0，10μl，50μl AuNPs(500nm/l)，30℃静置培养2d。

002/pHT01-tasA-OPH：5000g、10min收菌，重悬菌体于pH＝10的ches buffer 中，调OD＝4。15ml菌液+1.67ml 10mM paraoxon，35℃反应2h。离心，取上清测A405。

002/pHT01-tasA-Histag：5000g、10min收菌，分别在菌体中加入002/pHT01-tasA-OPH反应上清液4ml，最后一份4ml上清液加入10μl AuNPs(500nm/l)。涡旋震荡，再在每个样品中加入100μl 2M NaBH₄。室温反应2h后，离心，取上清测A405。

结果如图7c所示，002/pHT01-tasA-Histag绑定纳米金颗粒，催化NaBH4还原对硝基苯酚成对氨基酚。

4.功能检测。绑定了量子点QDs的生物膜在光激发条件下，可以降解有机染料甲基橙，分时间间隔取样测定甲基橙的浓度(464nm吸收值)。

试剂：甲基橙(Methyl orange)，赛默飞世尔，151421000。甲基橙用PBS缓冲液(pH＝7)配成浓度为250mg/L母液。

实验步骤：将培养了2天的002/pHT01-tasA-Histag的菌液10000g离心10min收菌，用PBS重悬。取两份各23ml，一份加入200μl PBS，一份加入200μlQDs(500nm/ml)。在旋转摇床上结合30min。另取两份23ml PBS溶液，一份加入200μl PBS，一份加入200μlQDs(500nm/ml)。再在4份溶液中加入2ml甲基橙母液。将四份溶液分别倒入反应罐中反应。在0h，2h，4h，6h，8h，9h取样品500μl，离心测上清在464nm处的吸光值。

图8a显示生物膜结合量子点的TEM图，以及光照条件下降解有机染料甲基橙，b为降解速率曲线图。

Histag能特异性地结合Ni-NTAAuNPs以及量子点等，量子点在光激发下进行电子传递可降解有机染料，由于量子点被生物膜绑定，可以回收和循环利用，可用于导电、半导体和催化，属于生物催化领域。

实施例4包含tasA-mcherry融合蛋白的生物膜平台

表达tasA-mcherry生物膜的菌株，可以为基因组整合的组成型表达，也可以为IPTG诱导型表达或者携带IPTG诱导表达质粒的菌株，这里以实施例1中ΔtasAΔsinRΔeps三突变的(002)突变株携带pHT01-tasA-mcherry表达质粒，IPTG诱导TasA-Mcherry为例，具体步骤为：

1.转化：将表达质粒转化生物膜突变株(002)，转化方法如下：

(1)活化待转化的实施例1中的ΔtasAΔsinRΔeps三突变的(002)突变株。

(2)挑新鲜单克隆接种于3ml的2xYT培养基，37℃过夜振荡培养。

(3)按1∶100接种过液菌于5ml的medium A中，37℃振荡培养3.5h。

(4)按1∶10接种medium A中的菌与medium B中，37℃振荡培养1.5h。制得感受态细胞，500μl的感受态中加入pHT01-tasA-mcherry表达质粒至1μg。

(5)37℃静置60min。

(6)37℃振荡培养感受态细胞2h，涂于带5μg/ml氯霉素抗性的LB平板。

2.生物膜培养。接突变株002/pHT-tasA-mcherry于10ml含5μg/ml氯霉素的LB培养基中37℃，220rpm振荡培养过夜。次日取出菌液，测定600nm处吸光值。菌液5000g离心10min，用适量含5μ/ml氯霉素的MSGG培养基将菌体悬浮稀释至OD＝0.5，取两份10ml菌液于培养皿中，一份加入IPTG(0.5mM)，一份不加IPTG。将培养皿置于30℃培养箱静置培养。

3.生物膜观察。2天后，5000g离心10min收集菌体，用100μl无菌PBS重悬细菌。取10μl菌液滴于载玻片上，盖上盖玻片，在共聚焦荧光显微镜下观察Mcherry的红色荧光。结果发现，有IPTG诱导的细菌有红色荧光，而不加IPTG则没有红色荧光。如图9所示。

Mcherry荧光蛋白可用于生物标记，活体细胞的实时监测，属于生物材料领域。本实施例的生物膜平台中，枯草芽孢杆菌淀粉样蛋白融合一个荧光报告基因，有诱导物的情况下能分泌出来结合在生物膜上，本例中携带了TasA-Mcherry表达质粒基因工程菌能在荧光显微镜下看到红色的生物膜，因此该例证明TasA-Mcherry融合蛋白能成功表达，可用于一些活体细胞的实时监测。

实施例5包含TasA-Spytag融合蛋白的生物膜平台

表达tasA-spytag生物膜的菌株，可以为基因组整合的组成型表达，也可以为IPTG诱导型表达或者携带IPTG诱导表达质粒的菌株，这里以实施例1中ΔtasAΔsinRΔeps三突变的(002)突变株携带pHT01-tasA-spytag表达质粒，IPTG诱导TasA-Spytag为例，具体步骤为：

1.转化。将表达质粒转化生物膜突变株002，转化方法如下：

(1)活化待转化的枯草杆菌002。

(2)挑新鲜单克隆接种于3ml的2xYT培养基，37℃过夜振荡培养。

(3)按1∶100接种过液菌于5ml的medium A中，37℃振荡培养3.5h。

(4)按1∶10接种medium A中的菌与medium B中，37℃振荡培养1.5h。

(5)此刻制得感受态细胞，500μμl的感受态中加入pHT-tasA-spytag质粒至1μg。

(6)37℃静置60min。

(7)37℃振荡培养感受态细胞2h，涂于带氯霉素抗性的平板。

2.生物膜培养。接突变株002/pHT-tasA-spytag于20ml含5μg/ml氯霉素的LB培养基中37℃，220rpm振荡培养过夜。次日取出菌液，测定600nm处吸光值。菌液5000g离心10min，用适量含5μg/ml氯霉素的MSGG培养基将菌体悬浮稀释至OD＝0.5，取两份20ml菌液于培养皿中，一份加入IPTG(0.5mM)，一份不加IPTG。将培养皿置于30℃培养箱静置培养。

3.功能表征。2天后，5000g离心10min收集菌体，用PBS(life technology，00051)洗3次，最后重悬于1ml PBS中，等分成两份(每份500μl)，一份加入500μl Spycatcher-Mcherry蛋白，另一份加入500μl PBS，室温孵育1h。再用PBS洗三次，然后重悬菌体于100μl PBS中。取10μl滴于载玻片上，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察Mcherry的红色荧光。结果发现，有IPTG诱导的细菌有红色荧光，而不加IPTG则没有红色荧光。如图10所示。Spytag能特异性地与Spycatcher反应，当它们分别融合不同基团时也能进行体外反应。

Spycatcher-Mcherry蛋白制备步骤：

1.构建：基因片段spycatcher-mcherry由苏州金唯智公司合成并通过NdeI(Thermo Fisher Scientific，ER0581)和XhoI(Thermo Fisher Scientific，ER0691)位点插入到质粒pET22b(优宝生物公司，货号VT1200)中。

Spycatcher-Mcherry的氨基酸序列见ID91。

2.将构建好的PET22b-spycatcher-mcherry转化入大肠杆菌BL21(DE3)(全式金，CD601-02)，得到蛋白表达菌株。

3.接上述菌株至5ml含50μg/ml羧苄青霉素(Carb50)的LB液体培养基过夜培养，次日将5ml菌液接500ml大瓶的LB+Carb50液体培养基，于37℃，220rpm条件下培养约3h至OD600为1。再加入IPTG至终浓度为1mM，于16℃，220rpm条件下继续培养12h。

4.收集菌液500ml，等分2份，于4000g，4℃条件下离心15min，弃上清。

5.在沉淀中加入30ml的PBS缓冲液使菌体重悬，置于50ml烧杯中。

6.将重悬后的菌液用超声破碎仪(Fisher scientific，FB120)进行超声破碎，超声条件为：400W，工作5s，间隔5秒，共40min，重复3次。

7.取超声破碎后的菌液，于10000g，4℃条件下离心40min，将上清倒入钴柱(含钴离子的NiNTA树脂)(clontech，635503)中，待上清液自然流干。

8.加入过量约50ml的20mM浓度的咪唑(安耐吉，E020263-1kg)溶液冲洗钴柱，以去除杂蛋白，再加入5ml的150mM浓度的咪唑溶液冲洗钴柱，得到目的蛋白溶液。

经发现，携带pHT-tasA-spytag的枯草芽胞杆菌在有IPTG诱导的情况下，分泌TasA-Spytag纤维，加入Spycatcher-Mcherry蛋白进行反应，在荧光显微镜下观察到绑定了蛋白的红色生物膜；而没有IPTG诱导的对照组同样加入Spycatcher-Mcherry蛋白，但看不到特异性结合的红色生物膜。说明分泌的TasA-Spytag生物膜3具有特异性结合Spycatcher的活性。

实施例6包含TasA-OPH融合蛋白的生物膜平台

表达tasA-oph生物膜的菌株，可以为基因组整合的组成型表达，也可以为IPTG诱导型表达或者携带IPTG诱导表达质粒的菌株，这里以实施例1中ΔtasAΔsinRΔeps三突变的002突变株携带pHT01-tasA-oph表达质粒，IPTG诱导TasA-OPH为例，具体步骤为：

1.转化。将表达质粒转化生物膜突变株002，转化方法如下：

(1)活化待转化的枯草杆菌002。

(2)挑新鲜单克隆接种于3ml的2xYT培养基，37℃过夜振荡培养。

(3)按1∶100的比例接种过液菌于5ml的medium A中，37℃振荡培养3.5h。

(4)按1∶10的比例接种medium A中的菌与medium B中，37℃振荡培养1.5h。

(5)此刻制得感受态细胞，500μl的感受态细胞中加入pHT01-tasA-oph表达质粒至1μg。

(6)37℃静置60min。

(7)37℃振荡培养感受态细胞2h，涂于带氯霉素抗性的平板。

2.生物膜培养。分别接空质粒002/pHT01和突变株002/pHT-tasA-oph于10ml含5μg/ml氯霉素的LB培养基中，37℃，220rpm振荡培养过夜。次日取出菌液，测定600nm处吸光值。菌液5000g离心10min，用适量含5μg/ml氯霉素的MSGG培养基将菌体悬浮稀释至OD＝1，然后分别取10ml菌液于培养皿中，加入IPTG(0.5mM)，将培养皿置于30℃培养箱静置培养。

3.功能鉴定。生物膜培养2天后，5000g离心10min收集菌体。用2ml无菌Ches buffer(pH8-10)重悬菌体，底物对氧磷浓度0.5mM，35℃反应，间隔10-30min取样测定。反应液离心取上清测定405nm吸光值。由于产物对硝基苯酚(PNP)在405nm有特异性吸收峰，因此可以对照标准曲线用A405计算产物PNP的量。结果表明TasA-OPH生物膜有显著降解有机磷生成对硝基苯酚的活性。OPH可降解有机磷，属于生物催化和生物修复领域。

如图11所示，在IPTG诱导情况下，不加IPTG诱导的以及携带空质粒pHT01或只表达TasA-Histag的菌株对照。有IPTG诱导情况下表达TasA-OPH的生物膜能显著降解有机磷生成对硝基苯酚，405m吸收曲线显著，而只表达TasA-Histag生物膜或不加IPTG诱导的工程菌或空质粒对照菌则几乎不降解有机磷。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海科技大学

<120> 生物膜平台及其构建方法和应用

<130> 2016

<160> 91

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 786

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) tasA

<400> 1

atgggtatga aaaagaaatt gagtttagga gttgcttctg cagcactagg attagcttta 60

gttggaggag gaacatgggc agcatttaac gacattaaat caaaggatgc tacttttgca 120

tcaggtacgc ttgatttatc tgctaaagag aattcagcga gtgtgaactt atcaaatcta 180

aagccgggag ataagttgac aaaggatttc caatttgaaa ataacggatc acttgcgatc 240

aaagaagttc taatggcgct taattatgga gattttaaag caaacggcgg cagcaataca 300

tctccagaag atttcctcag ccagtttgaa gtgacattgt tgacagttgg aaaagagggc 360

ggcaatggct acccgaaaaa cattatttta gatgatgcga accttaaaga cttgtatttg 420

atgtctgcta aaaatgatgc agcggctgct gaaaaaatca aaaaacaaat tgaccctaaa 480

ttcttaaatg caagcggtaa agtcaatgta gcaacaattg atggtaaaac cgctcctgaa 540

tatgatggtg ttccaaaaac accaactgac ttcgatcagg ttcaaatgga aatccaattc 600

aaggatgata aaacaaaaga tgaaaaaggg cttatggttc aaaataaata tcaaggcaac 660

tccattaagc ttcaattctc attcgaagct acacagtgga acggcttgac aatcaaaaag 720

gaccatactg ataaagatgg ttacgtgaaa gaaaatgaaa aagcgcatag cgaggataaa 780

aattaa 786

<210> 2

<211> 261

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TasA

<400> 2

Met Gly Met Lys Lys Lys Leu Ser Leu Gly Val Ala Ser Ala Ala Leu

1 5 10 15

Gly Leu Ala Leu Val Gly Gly Gly Thr Trp Ala Ala Phe Asn Asp Ile

20 25 30

Lys Ser Lys Asp Ala Thr Phe Ala Ser Gly Thr Leu Asp Leu Ser Ala

35 40 45

Lys Glu Asn Ser Ala Ser Val Asn Leu Ser Asn Leu Lys Pro Gly Asp

50 55 60

Lys Leu Thr Lys Asp Phe Gln Phe Glu Asn Asn Gly Ser Leu Ala Ile

65 70 75 80

Lys Glu Val Leu Met Ala Leu Asn Tyr Gly Asp Phe Lys Ala Asn Gly

85 90 95

Gly Ser Asn Thr Ser Pro Glu Asp Phe Leu Ser Gln Phe Glu Val Thr

100 105 110

Leu Leu Thr Val Gly Lys Glu Gly Gly Asn Gly Tyr Pro Lys Asn Ile

115 120 125

Ile Leu Asp Asp Ala Asn Leu Lys Asp Leu Tyr Leu Met Ser Ala Lys

130 135 140

Asn Asp Ala Ala Ala Ala Glu Lys Ile Lys Lys Gln Ile Asp Pro Lys

145 150 155 160

Phe Leu Asn Ala Ser Gly Lys Val Asn Val Ala Thr Ile Asp Gly Lys

165 170 175

Thr Ala Pro Glu Tyr Asp Gly Val Pro Lys Thr Pro Thr Asp Phe Asp

180 185 190

Gln Val Gln Met Glu Ile Gln Phe Lys Asp Asp Lys Thr Lys Asp Glu

195 200 205

Lys Gly Leu Met Val Gln Asn Lys Tyr Gln Gly Asn Ser Ile Lys Leu

210 215 220

Gln Phe Ser Phe Glu Ala Thr Gln Trp Asn Gly Leu Thr Ile Lys Lys

225 230 235 240

Asp His Thr Asp Lys Asp Gly Tyr Val Lys Glu Asn Glu Lys Ala His

245 250 255

Ser Glu Asp Lys Asn

260

<210> 3

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列Histag

<400> 3

His His His His His His

1 5

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列Spytag

<400> 4

Ala His Ile Val Met Val Asp Ala Tyr Lys Pro Thr Lys

1 5 10

<210> 5

<211> 59

<212> PRT

<213> 人工序列Mms6

<400> 5

Gly Gly Thr Ile Trp Thr Gly Lys Gly Leu Gly Leu Gly Leu Gly Leu

1 5 10 15

Gly Leu Gly Ala Trp Gly Pro Ile Ile Leu Gly Val Val Gly Ala Gly

20 25 30

Ala Val Tyr Ala Tyr Met Lys Ser Arg Asp Ile Glu Ser Ala His Ser

35 40 45

Asp Glu Glu Val Glu Leu Arg Asp Ala Leu Ala

50 55

<210> 6

<211> 48

<212> PRT

<213> 人工序列（贻贝足丝蛋白Mefp3）

<400> 6

Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Asn Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr

20 25 30

Lys Gly Trp Asn Asn Gly Trp Asn Arg Gly Arg Arg Gly Lys Tyr Trp

35 40 45

<210> 7

<211> 47

<212> PRT

<213> 人工序列（贻贝足丝蛋白Mgfp3）

<400> 7

Ala Asp Tyr Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Pro Pro Arg Arg Tyr Gly Gly

1 5 10 15

Gly Asn Tyr Asn Arg Tyr Gly Arg Arg Tyr Gly Gly Tyr Lys Gly Trp

20 25 30

Asn Asn Gly Trp Lys Arg Gly Arg Trp Gly Arg Lys Tyr Tyr His

35 40 45

<210> 8

<211> 74

<212> PRT

<213> 人工序列（贻贝足丝蛋白Mefp5）

<400> 8

Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Ala Tyr His

1 5 10 15

Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr

20 25 30

Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys

35 40 45

Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg

50 55 60

Lys Gly Tyr Lys Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser

65 70

<210> 9

<211> 76

<212> PRT

<213> 人工序列（贻贝足丝蛋白Mgfp5）

<400> 9

Ser Ser Glu Glu Tyr Lys Gly Gly Tyr Tyr Pro Gly Asn Thr Tyr His

1 5 10 15

Tyr His Ser Gly Gly Ser Tyr His Gly Ser Gly Tyr His Gly Gly Tyr

20 25 30

Lys Gly Lys Tyr Tyr Gly Lys Ala Lys Lys Tyr Tyr Tyr Lys Tyr Lys

35 40 45

Asn Ser Gly Lys Tyr Lys Tyr Leu Lys Lys Ala Arg Lys Tyr His Arg

50 55 60

Lys Gly Tyr Lys Lys Tyr Tyr Gly Gly Gly Ser Ser

65 70 75

<210> 10

<211> 237

<212> PRT

<213> 人工序列（红色荧光蛋白Mcherry）

<400> 10

Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe Met

1 5 10 15

Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe Glu

20 25 30

Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr Ala

35 40 45

Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp Ile

50 55 60

Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His Pro

65 70 75 80

Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe Lys

85 90 95

Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val Thr

100 105 110

Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys Leu

115 120 125

Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys Thr

130 135 140

Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly Ala

145 150 155 160

Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly His

165 170 175

Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val Gln

180 185 190

Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser His

195 200 205

Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly Arg

210 215 220

His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ala Gly

225 230 235

<210> 11

<211> 236

<212> PRT

<213> 人工序列（光活化荧光蛋白Maple3）

<400> 11

Val Ser Lys Gly Glu Glu Thr Ile Met Ser Val Ile Lys Pro Asp Met

1 5 10 15

Lys Ile Lys Leu Arg Met Glu Gly Asn Val Asn Gly His Ala Phe Val

20 25 30

Ile Glu Gly Glu Gly Ser Gly Lys Pro Phe Glu Gly Ile Gln Thr Ile

35 40 45

Asp Leu Glu Val Lys Glu Gly Ala Pro Leu Pro Phe Ala Tyr Asp Ile

50 55 60

Leu Thr Thr Ala Phe His Tyr Gly Asn Arg Val Phe Thr Lys Tyr Pro

65 70 75 80

Arg Lys Ile Pro Asp Tyr Phe Lys Gln Ser Phe Pro Glu Gly Tyr Ser

85 90 95

Trp Glu Arg Ser Met Thr Tyr Glu Asp Gly Gly Ile Cys Asn Ala Thr

100 105 110

Asn Asp Ile Thr Met Glu Glu Asp Ser Phe Ile Asn Lys Ile His Phe

115 120 125

Lys Gly Thr Asn Phe Pro Pro Asn Gly Pro Val Met Gln Lys Arg Thr

130 135 140

Val Gly Trp Glu Val Ser Thr Glu Lys Met Tyr Val Arg Asp Gly Val

145 150 155 160

Leu Lys Gly Asp Val Lys Met Lys Leu Leu Leu Lys Gly Gly Ser His

165 170 175

Tyr Arg Cys Asp Phe Arg Thr Thr Tyr Lys Val Lys Gln Lys Ala Val

180 185 190

Lys Leu Pro Lys Ala His Phe Val Asp His Arg Ile Glu Ile Leu Ser

195 200 205

His Asp Lys Asp Tyr Asn Lys Val Lys Leu Tyr Glu His Ala Val Ala

210 215 220

Arg Asn Ser Thr Asp Ser Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 12

<211> 336

<212> PRT

<213> 人工序列（有机磷水解酶OPH）

<400> 12

Ser Ile Gly Thr Gly Asp Arg Ile Asn Thr Val Arg Gly Pro Ile Thr

1 5 10 15

Ile Ser Glu Ala Gly Phe Thr Leu Thr His Glu His Ile Cys Gly Ser

20 25 30

Ser Ala Gly Phe Leu Arg Ala Trp Pro Glu Phe Phe Gly Ser Arg Lys

35 40 45

Ala Leu Ala Glu Lys Ala Val Arg Gly Leu Arg Arg Ala Arg Ala Ala

50 55 60

Gly Val Arg Thr Ile Val Asp Val Ser Thr Phe Asp Ile Gly Arg Asp

65 70 75 80

Val Ser Leu Leu Ala Glu Val Ser Arg Ala Ala Asp Val His Ile Val

85 90 95

Ala Ala Thr Gly Leu Trp Phe Asp Pro Pro Leu Ser Met Arg Leu Arg

100 105 110

Ser Val Glu Glu Leu Thr Gln Phe Phe Leu Arg Glu Ile Gln Tyr Gly

115 120 125

Ile Glu Asp Thr Gly Ile Arg Ala Gly Ile Ile Lys Val Ala Thr Thr

130 135 140

Gly Lys Ala Thr Pro Phe Gln Glu Leu Val Leu Lys Ala Ala Ala Arg

145 150 155 160

Ala Ser Leu Ala Thr Gly Val Pro Val Thr Thr His Thr Ala Ala Ser

165 170 175

Gln Arg Asp Gly Glu Gln Gln Ala Ala Ile Phe Glu Ser Glu Gly Leu

180 185 190

Ser Pro Ser Arg Val Cys Ile Gly His Ser Asp Asp Thr Asp Asp Leu

195 200 205

Ser Tyr Leu Thr Ala Leu Ala Ala Arg Gly Tyr Leu Ile Gly Leu Asp

210 215 220

His Ile Pro His Ser Ala Ile Gly Leu Glu Asp Asn Ala Ser Ala Ser

225 230 235 240

Ala Leu Leu Gly Ile Arg Ser Trp Gln Thr Arg Ala Leu Leu Ile Lys

245 250 255

Ala Leu Ile Asp Gln Gly Tyr Met Lys Gln Ile Leu Val Ser Asn Asp

260 265 270

Trp Leu Phe Gly Phe Ser Ser Tyr Val Thr Asn Ile Met Asp Val Met

275 280 285

Asp Arg Val Asn Pro Asp Gly Met Ala Phe Ile Pro Leu Arg Val Ile

290 295 300

Pro Phe Leu Arg Glu Lys Gly Val Pro Gln Glu Thr Leu Ala Gly Ile

305 310 315 320

Thr Val Thr Asn Pro Ala Arg Phe Leu Ser Pro Thr Leu Arg Ala Ser

325 330 335

<210> 13

<211> 60

<212> PRT

<213> 人工序列Metallothionein（重金属结合蛋白）

<400> 13

Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala Gly

1 5 10 15

Ser Cys Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser Cys

20 25 30

Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys Ile

35 40 45

Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala

50 55 60

<210> 14

<211> 144

<212> PRT

<213> 人工序列PbrR（铅离子结合蛋白）

<400> 14

Asn Ile Gln Ile Gly Glu Leu Ala Lys Arg Thr Ala Cys Pro Val Val

1 5 10 15

Thr Ile Arg Phe Tyr Glu Gln Glu Gly Leu Leu Pro Pro Pro Gly Arg

20 25 30

Ser Arg Gly Asn Phe Arg Leu Tyr Gly Glu Glu His Val Glu Arg Leu

35 40 45

Gln Phe Ile Arg His Cys Arg Ser Leu Asp Met Pro Leu Ser Asp Val

50 55 60

Arg Thr Leu Leu Ser Tyr Arg Lys Arg Pro Asp Gln Asp Cys Gly Glu

65 70 75 80

Val Asn Met Leu Leu Asp Glu His Ile Arg Gln Val Glu Ser Arg Ile

85 90 95

Gly Ala Leu Leu Glu Leu Lys His His Leu Val Glu Leu Arg Glu Ala

100 105 110

Cys Ser Gly Ala Arg Pro Ala Gln Ser Cys Gly Ile Leu Gln Gly Leu

115 120 125

Ser Asp Cys Val Cys Asp Thr Arg Gly Thr Thr Ala His Pro Ser Asp

130 135 140

<210> 15

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工序列P3启动子（QS活化的启动子）

<400> 15

aaatacttaa ctgttaaatg taatttgtat ttaatatttt aacataaaaa aatttacagt 60

taagaataaa aaacgactag ttaagaaaaa ttggaaaata aatgctttta gcatgtttta 120

atataactag atcacagaga tgtgatggaa aatagttg 158

<210> 16

<211> 7956

<212> DNA

<213> 表达质粒pHT01序列

<400> 16

ttaagttatt ggtatgactg gttttaagcg caaaaaaagt tgctttttcg tacctattaa 60

tgtatcgttt tagaaaaccg actgtaaaaa gtacagtcgg cattatctca tattataaaa 120

gccagtcatt aggcctatct gacaattcct gaatagagtt cataaacaat cctgcatgat 180

aaccatcaca aacagaatga tgtacctgta aagatagcgg taaatatatt gaattacctt 240

tattaatgaa ttttcctgct gtaataatgg gtagaaggta attactatta ttattgatat 300

ttaagttaaa cccagtaaat gaagtccatg gaataataga aagagaaaaa gcattttcag 360

gtataggtgt tttgggaaac aatttccccg aaccattata tttctctaca tcagaaaggt 420

ataaatcata aaactctttg aagtcattct ttacaggagt ccaaatacca gagaatgttt 480

tagatacacc atcaaaaatt gtataaagtg gctctaactt atcccaataa cctaactctc 540

cgtcgctatt gtaaccagtt ctaaaagctg tatttgagtt tatcaccctt gtcactaaga 600

aaataaatgc agggtaaaat ttatatcctt cttgttttat gtttcggtat aaaacactaa 660

tatcaatttc tgtggttata ctaaaagtcg tttgttggtt caaataatga ttaaatatct 720

cttttctctt ccaattgtct aaatcaattt tattaaagtt catttgatat gcctcctaaa 780

tttttatcta aagtgaattt aggaggctta cttgtctgct ttcttcatta gaatcaatcc 840

ttttttaaaa gtcaatatta ctgtaacata aatatatatt ttaaaaatat cccactttat 900

ccaattttcg tttgttgaac taatgggtgc tttagttgaa gaataaaaga ccacattaaa 960

aaatgtggtc ttttgtgttt ttttaaagga tttgagcgta gcgaaaaatc cttttctttc 1020

ttatcttgat aataagggta actattgccg atcgtccatt ccgacagcat cgccagtcac 1080

tatggcgtgc tgctagcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 1140

ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 1200

aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 1260

cgagctcagg ccttaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg 1320

aaacctgtcg tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 1380

tattgggcgc cagggtggtt tttcttttca ccagtgagac gggcaacagc tgattgccct 1440

tcaccgcctg gccctgagag agttgcagca agcggtccac gctggtttgc cccagcaggc 1500

gaaaatcctg tttgatggtg gttaacggcg ggatataaca tgagctgtct tcggtatcgt 1560

cgtatcccac taccgagata tccgcaccaa cgcgcagccc ggactcggta atggcgcgca 1620

ttgcgcccag cgccatctga tcgttggcaa ccagcatcgc agtgggaacg atgccctcat 1680

tcagcatttg catggtttgt tgaaaaccgg acatggcact ccagtcgcct tcccgttccg 1740

ctatcggctg aatttgattg cgagtgagat atttatgcca gccagccaga cgcagacgcg 1800

ccgagacaga acttaatggg cccgctaaca gcgcgatttg ctggtgaccc aatgcgacca 1860

gatgctccac gcccagtcgc gtaccgtctt catgggagaa aataatactg ttgatgggtg 1920

tctggtcaga gacatcaaga aataacgccg gaacattagt gcaggcagct tccacagcaa 1980

tggcatcctg gtcatccagc ggatagttaa tgatcagccc actgacgcgt tgcgcgagaa 2040

gattgtgcac cgccgtttta caggcttcga cgccgcttcg ttctaccatc gacaccacca 2100

cgctggcacc cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt 2160

gcagggccag actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt 2220

gtgccacgcg gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg 2280

ttttcgcaga aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac 2340

cggcatactc tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcat caaaatcgtc tccctccgtt 2400

tgaatatttg attgatcgta accagatgaa gcactctttc cactatccct acagtgttat 2460

ggcttgaaca atcacgaaac aataattggt acgtacgatc tttcagccga ctcaaacatc 2520

aaatcttaca aatgtagtct ttgaaagtat tacatatgta agatttaaat gcaaccgttt 2580

tttcggaagg aaatgatgac ctcgtttcca ccggaattag cttggtacca gctattgtaa 2640

cataatcggt acgggggtga aaaagctaac ggaaaaggga gcggaaaaga atgatgtaag 2700

cgtgaaaaat tttttatctt atcacttgaa attggaaggg agattcttta ttataagaat 2760

tgtggaattg tgagcggata acaattccca attaaaggag gaaggatcct ctagagtcga 2820

cgtccccggg gcagcccgcc taatgagcgg gcttttttca cgtcacgcgt ccatggagat 2880

ctttgtctgc aactgaaaag tttatacctt acctggaaca aatggttgaa acatacgagg 2940

ctaatatcgg cttattagga atagtccctg tactaataaa atcaggtgga tcagttgatc 3000

agtatatttt ggacgaagct cggaaagaat ttggagatga cttgcttaat tccacaatta 3060

aattaaggga aagaataaag cgatttgatg ttcaaggaat cacggaagaa gatactcatg 3120

ataaagaagc tctaaaacta ttcaataacc ttacaatgga attgatcgaa agggtggaag 3180

gttaatggta cgaaaattag gggatctacc tagaaagcca caaggcgata ggtcaagctt 3240

aaagaaccct tacatggatc ttacagattc tgaaagtaaa gaaacaacag aggttaaaca 3300

aacagaacca aaaagaaaaa aagcattgtt gaaaacaatg aaagttgatg tttcaatcca 3360

taataagatt aaatcgctgc acgaaattct ggcagcatcc gaagggaatt catattactt 3420

agaggatact attgagagag ctattgataa gatggttgag acattacctg agagccaaaa 3480

aactttttat gaatatgaat taaaaaaaag aaccaacaaa ggctgagaca gactccaaac 3540

gagtctgttt ttttaaaaaa aatattagga gcattgaata tatattagag aattaagaaa 3600

gacatgggaa taaaaatatt ttaaatccag taaaaatatg ataagattat ttcagaatat 3660

gaagaactct gtttgttttt gatgaaaaaa caaacaaaaa aaatccacct aacggaatct 3720

caatttaact aacagcggcc aaactgagaa gttaaatttg agaaggggaa aaggcggatt 3780

tatacttgta tttaactatc tccattttaa cattttatta aaccccatac aagtgaaaat 3840

cctcttttac actgttcctt taggtgatcg cggagggaca ttatgagtga agtaaaccta 3900

aaaggaaata cagatgaatt agtgtattat cgacagcaaa ccactggaaa taaaatcgcc 3960

aggaagagaa tcaaaaaagg gaaagaagaa gtttattatg ttgctgaaac ggaagagaag 4020

atatggacag aagagcaaat aaaaaacttt tctttagaca aatttggtac gcatatacct 4080

tacatagaag gtcattatac aatcttaaat aattacttct ttgatttttg gggctatttt 4140

ttaggtgctg aaggaattgc gctctatgct cacctaactc gttatgcata cggcagcaaa 4200

gacttttgct ttcctagtct acaaacaatc gctaaaaaaa tggacaagac tcctgttaca 4260

gttagaggct acttgaaact gcttgaaagg tacggtttta tttggaaggt aaacgtccgt 4320

aataaaacca aggataacac agaggaatcc ccgattttta agattagacg taaggttcct 4380

ttgctttcag aagaactttt aaatggaaac cctaatattg aaattccaga tgacgaggaa 4440

gcacatgtaa agaaggcttt aaaaaaggaa aaagagggtc ttccaaaggt tttgaaaaaa 4500

gagcacgatg aatttgttaa aaaaatgatg gatgagtcag aaacaattaa tattccagag 4560

gccttacaat atgacacaat gtatgaagat atactcagta aaggagaaat tcgaaaagaa 4620

atcaaaaaac aaatacctaa tcctacaaca tcttttgaga gtatatcaat gacaactgaa 4680

gaggaaaaag tcgacagtac tttaaaaagc gaaatgcaaa atcgtgtctc taagccttct 4740

tttgatacct ggtttaaaaa cactaagatc aaaattgaaa ataaaaattg tttattactt 4800

gtaccgagtg aatttgcatt tgaatggatt aagaaaagat atttagaaac aattaaaaca 4860

gtccttgaag aagctggata tgttttcgaa aaaatcgaac taagaaaagt gcaataaact 4920

gctgaagtat ttcagcagtt ttttttattt agaaatagtg aaaaaaatat aatcagggag 4980

gtatcaatat ttaatgagta ctgatttaaa tttatttaga ctggaattaa taattaacac 5040

gtagactaat taaaatttaa tgagggataa agaggataca aaaatattaa tttcaatccc 5100

tattaaattt taacaagggg gggattaaaa tttaattaga ggtttatcca caagaaaaga 5160

ccctaataaa atttttacta gggttataac actgattaat ttcttaatgg gggagggatt 5220

aaaatttaat gacaaagaaa acaatctttt aagaaaagct tttaaaagat aataataaaa 5280

agagctttgc gattaagcaa aactctttac tttttcattg acattatcaa attcatcgat 5340

ttcaaattgt tgttgtatca taaagttaat tctgttttgc acaacctttt caggaatata 5400

aaacacatct gaggcttgtt ttataaactc agggtcgcta aagtcaatgt aacgtagcat 5460

atgatatggt atagcttcca cccaagttag cctttctgct tcttctgaat gtttttcata 5520

tacttccatg ggtatctcta aatgattttc ctcatgtagc aaggtatgag caaaaagttt 5580

atggaattga tagttcctct ctttttcttc aactttttta tctaaaacaa acactttaac 5640

atctgagtca atgtaagcat aagatgtttt tccagtcata atttcaatcc caaatctttt 5700

agacagaaat tctggacgta aatcttttgg tgaaagaatt tttttatgta gcaatatatc 5760

cgatacagca ccttctaaaa gcgttggtga atagggcatt ttacctatct cctctcattt 5820

tgtggaataa aaatagtcat attcgtccat ctacctatcc tattatcgaa cagttgaact 5880

ttttaatcaa ggatcagtcc tttttttcat tattcttaaa ctgtgctctt aactttaaca 5940

actcgatttg tttttccaga tctcgagggt aactagcctc gccgatcccg caagaggccc 6000

ggcagtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 6060

aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 6120

attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 6180

cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 6240

aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 6300

ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 6360

gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 6420

attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 6480

tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 6540

tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 6600

atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 6660

agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 6720

aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 6780

caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 6840

ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 6900

gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 6960

tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 7020

atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 7080

tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 7140

accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 7200

gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 7260

caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgtccttc 7320

tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 7380

ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 7440

tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 7500

gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 7560

tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 7620

gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 7680

gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 7740

ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 7800

ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta 7860

ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag 7920

tgagcgagga agcggaagag cgcccaatac gcatgc 7956

<210> 17

<211> 5585

<212> DNA

<213> 表达质粒pMK4序列

<400> 17

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttgg 240

ctgcaggtcg acggatcccc gggaattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg 300

aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc 360

gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg 420

aatggcgcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat 480

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 540

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 600

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 660

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 720

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 780

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 840

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 900

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 960

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 1020

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 1080

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 1140

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 1200

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 1260

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 1320

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 1380

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 1440

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 1500

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 1560

ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 1620

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 1680

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 1740

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 1800

agatccatat ccttcttttt ctgaaccgac ttctcctttt tcgcttcttt attccaattg 1860

ctttattgac gttgagcctc ggaaccctta acaatcccaa aacttgtcga atggtcggct 1920

taatagctca cgctatgccg acattcgtct gcaagtttag ttaagggttc ttctcaacgc 1980

acaataaatt ttctcggcat aaatgcgtgg tctaattttt atttttaata accttgatag 2040

caaaaaatgc cattccaata caaaaccaca tacctataat cgataaccac ataacagtca 2100

taaaaccact cctttttaac aaactttatc acaagaaata tttaaatttt aaatgccttt 2160

attttgaatt ttaaggggca ttttaaagat ttaggggtaa atcatatagt tttatgccta 2220

aaaacctaca gaagctttta aaaagcaaat atgagccaaa taaatatatt ctaattctac 2280

aaacaaaaat ttgagcaaat tcagtgtcga ttttttaaga cactgcccag ttacatgcaa 2340

attaaaattt tcatgatttt ttatagttcc taacagggtt aaaatttgta taacgaaagt 2400

ataatgttta tataacgtta gtataataaa gcattttaac attatacttt tgataatcgt 2460

ttatcgtcgt catcacaata acttttaaaa tactcgtgca taattcaaca gctgacctcc 2520

caataactac atggtgttat cgggaggtca gctgttagca cttatatttt gttattgttc 2580

ttcctcgatt tcgtctatca ttttgtgatt aatttctctt ttttcttgtt ctgttaagtc 2640

ataaagttca ctagctaaat actctttttg tttccaaata taaaaaattt gatagatata 2700

ttcggttgga tcaatttctt ttaagtaatc taaatcccca ttttttaatt tctttttagc 2760

ctctttaaat aatcctgaat aaactaatac ctgtttacct ttaagtgatt tataaaatgc 2820

atcaaagact ttttgattta ttaaataatc actatcttta ccagaatact tagccatttc 2880

atataattct ttattattat tttgtcttat tttttgaact tgaacttgtg ttatttctga 2940

aatgcccgtt acatcacgcc ataaatctaa ccattcttgt tggctaatat aatatctttt 3000

atctgtgaaa tacgatttat ttactgcaat taacacatga aaatgaggat tataatcatc 3060

tcttttttta ttatatgtaa tctctaactt acgaacatat ccctttataa cactacctac 3120

tttttttctc tttataagtt ttctaaaaga attattataa cgttttattt cattttctaa 3180

ttcatcactc attacattag gtgtagtcaa agttaaaaag ataaactcct ttttctcttg 3240

ctgcttaata tattgcatca tcaaagataa acccaatgca tcttttctag cttttctcca 3300

agcacagaca ggacaaaatc gatttttaca agaattagct ttatataatt tctgtttttc 3360

taaagtttta tcagctacaa aagacagaaa tgtattgcaa tcttcaacta aatccatttg 3420

attctctcca atatgacgtt taataaattt ctgaaatact tgatttcttt gttttttctc 3480

agtatacttt tccatgttat aacacataaa aacaacttag ttttcacaaa ctatgacaat 3540

aaaaaaagtt gctttttccc ctttctatgt atgtttttta ctagtcattt aaaacgatac 3600

attaataggt acgaaaaagc aacttttttt gcgcttaaaa ccagtcatac caataactta 3660

agggtaacta gcctcgccgg caatagttac ccttattatc aagataagaa agaaaaggat 3720

ttttcgctac gctcaaatcc tttaaaaaaa cacaaaagac cacatttttt aatgtggtct 3780

tttattcttc aactaaagca cccattagtt caacaaacga aaattggata aagtgggata 3840

tttttaaaat atatatttat gttacagtaa tattgacttt taaaaaagga ttgattctaa 3900

tgaagaaagc agacaagtaa gcctcctaaa ttcactttag ataaaaattt aggaggcata 3960

tcaaatgaac tttaataaaa ttgatttaga caattggaag agaaaagaga tatttaatca 4020

ttatttgaac caacaaacga cttttagtat aaccacagaa attgatatta gtgttttata 4080

ccgaaacata aaacaagaag gatataaatt ttaccctgca tttattttct tagtgacaag 4140

ggtgataaac tcaaatacag cttttagaac tggttacaat agcgacggag agttaggtta 4200

ttgggataag ttagagccac tttatacaat ttttgatggt gtatctaaaa cattctctgg 4260

tatttggact cctgtaaaga atgacttcaa agagttttat gatttatacc tttctgatgt 4320

agagaaatat aatggttcgg ggaaattgtt tcccaaaaca cctatacctg aaaatgcttt 4380

ttctctttct attattccat ggacttcatt tactgggttt aacttaaata tcaataataa 4440

tagtaattac cttctaccca ttattacagc aggaaaattc attaataaag gtaattcaat 4500

atatttaccg ctatctttac aggtacatca ttctgtttgt gatggttatc atgcaggatt 4560

gtttatgaac tctattcagg aattgtcaga taggcctaat gactggcttt tataatatga 4620

gataatgccg actgtacttt ttacagtcgg ttttctaatg tcactaacct gccccgttag 4680

ttgaagaagg tttttatatt acagctccag atctaggtga agatcctttt tgataatctc 4740

atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 4800

atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 4860

aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 4920

aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag 4980

ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 5040

ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 5100

tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 5160

ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 5220

acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 5280

gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 5340

cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 5400

aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 5460

atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 5520

gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 5580

gaaga 5585

<210> 18

<211> 7602

<212> DNA

<213> 整合质粒pDG1730序列

<400> 18

aacaaaattc tccagtcttc acatcggttt gaaaggagga agcggaagaa tgaagtaaga 60

gggatttttg actccgaagt aagtcttcaa aaaatcaaat aaggagtgtc aagaatgttt 120

gcaaaacgat tcaaaacctc tttactgccg ttattcgctg gatttttatt gctgtttcat 180

ttggttctgg caggaccggc ggctgcgagt gctgaaacgg cgaacaaatc gaatgagctt 240

acagcaccgt cgatcaaaag cggaaccatt cttcatgcat ggaattggtc gttcaatacg 300

ttaaaacaca atatgaagga tattcatgat gcaggatata cagccattca gacatctccg 360

attaaccaag taaaggaagg gaatcaagga gataaaagca tgtcgaactg gtactggctg 420

tatcagccga catcgtatca aattggcaac cgttacttag gtactgaaca agaatttaaa 480

gaaatgtgtg cagccgctga agaatatggc ataaaggtca ttgttgacgc ggtcatcaat 540

cataccacca gtgattatgc cgcgatttcc aatgaggtta agagtattcc aaactggaca 600

catggaaaca cacaaattaa aaactggtct gatcggatcc tagaagctta tcgaattcct 660

gcagccctgg cgaatggcga ttttcgttcg tgaatacatg ttataataac tataactaat 720

aacgtaacgt gactggcaag agatattttt aaaacaatga ataggtttac acttacttta 780

gttttatgga aatgaaagat catatcatat ataatctaga ataaaattaa ctaaaataat 840

tattatctag ataaaaaatt tagaagccaa tgaaatctat aaataaacta aattaagttt 900

atttaattaa caactatgga tataaaatag gtactaatca aaatagtgag gaggatatat 960

ttgaatacat acgaacaaat taataaagtg aaaaaaatac ttcggaaaca tttaaaaaat 1020

aaccttattg gtacttacat gtttggatca ggagttgaga gtggactaaa accaaatagt 1080

gatcttgact ttttagtcgt cgtatctgaa ccattgacag atcaaagtaa agaaatactt 1140

atacaaaaaa ttagacctat ttcaaaaaaa ataggagata aaagcaactt acgatatatt 1200

gaattaacaa ttattattca gcaagaaatg gtaccgtgga atcatcctcc caaacaagaa 1260

tttatttatg gagaatggtt acaagagctt tatgaacaag gatacattcc tcagaaggaa 1320

ttaaattcag atttaaccat aatgctttac caagcaaaac gaaaaaataa aagaatatac 1380

ggaaattatg acttagagga attactacct gatattccat tttctgatgt gagaagagcc 1440

attatggatt cgtcagagga attaatagat aattatcagg atgatgaaac caactctata 1500

ttaactttat gccgtatgat tttaactatg gacacgggta aaatcatacc aaaagatatt 1560

gcgggaaatg cagtggctga atcttctcca ttagaacata gggagagaat tttgttagca 1620

gttcgtagtt atcttggaga gaatattgaa tggactaatg aaaatgtaaa tttaactata 1680

aactatttaa ataacagatt aaaaaaatta taaaaaaatt gaaaaaatgg tggaaacact 1740

tttttcaatt tttttgtttt attatttaat atttgggaaa tattcattct aattggtaat 1800

cagattttag aaaacaataa acccttgcat agggggatct cgacatggat gagcgatgat 1860

gatatccgtt taggctgggc ggtgatagct tctcgttcag gcagtacgcc tcttttcttt 1920

tccagacctg agggaggcgg aaatggtgtg aggttcccgg ggaaaagcca aataggcgat 1980

cgcgggagtg ctttatttga agatcaggct atcactgcgg tcaatagatt tcacaatgtg 2040

atggctggac agcctgagga actctcgaac ccgaatggaa acaaccagat atttatgaat 2100

cagcgcggct cacatggcgt tgtgctggca aatgcaggtt catcctctgt ctctatcaat 2160

acggcaacaa aattgcctga tggcaggtat gacaataaag ctggagcggg ttcatttcaa 2220

gtgaacgatg gtaaactgac aggcacgatc aatgccaggt ctgtagctgt gctttatcct 2280

gatgatattg caaaagcgcc tcatgttttc cttgagaatt acaaaacagg tgtaacacat 2340

tctttcaatg atcaactgac gattaccttg cgtgcagatg cgaatacaac aaaagccgtt 2400

tatcaaatca ataatggacc agacgacagg cgtttaagga tggagatcaa ttcacaatcg 2460

gaaaaggaga tccaatttgg caaaacatac accatcatgt taaaaggaac gaacagtgat 2520

ggtgtaacga ggaccgagaa atacagtttt gttaaaagag atccagcgtc ggccaaaacc 2580

atcggctatc aaaatccgaa tcattggagc caggtaaatg cttatatcta taaacatgat 2640

gggagccgag taattgaatt gaccggatct tggcctggaa aaccaatgac taaaaatgca 2700

gacggaattt acacgctgac gctgcctgcg gacacggata caaccaacgc aaaagtgatt 2760

tttaataatg gcagcgccca agtgcccggt cagaatcagc ctggctttga ttacgtgcta 2820

aatggtttat ataatgactc gggcttaagc ggttctcttc cccattgagg gcaaggctag 2880

acgggactta ccgaaagaaa ccatcaatga tggtttcttt tttgttcata aatcagacaa 2940

aacttttctc ttgcaaaagt ttgtgaagtg ttgcacaata taaatgtgaa atacttcaca 3000

aacaaaaaga catcaaagag aaacataccc tgcaaggatg ctgatattgt ctgcatttgc 3060

gccggagcaa accaaaaacc tggtgagaca cgccttgaat tagtagaaaa gaacttgaag 3120

attttcaaag gcatcgttag tgaagtcatg gcgagcggat ttgacggcat tttcttagtc 3180

gcgacgcgag gctggatggc cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg cggcatcggg 3240

atgcccgcgt tgcaggccat gctgtccagg caggtagatg acgaccatca gggacagctt 3300

caaggatcgc tcgcggctct taccagccta acttcgatca ctggaccgct gatcgtcacg 3360

gcgatttatg ccgcctcggc gagcacatgg aacgggttgg catggattgt aggcgccgcc 3420

ctataccttg tctgcctccc cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc cacctactga 3480

agtggatttc tttaagagct cctttaactt cctcaccagt agttgtatcg gtaccataag 3540

tagaagcagc aacccaagta gctttaccag catccggttc aaccagcata gtaagaatct 3600

tactggacat cggcagttct tcgaacagtg cgccaactac cagctctttc tgcagttcat 3660

tcagggcacc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa acgatcctca 3720

tcctgtctct tgatccatgg attacgcgtt aacccgggcc cgcggatgca tatgatcaga 3780

tcctttaact ctggcaaccc tcaaaattga atgagacatg ctacacctcc ggataataaa 3840

tatatataaa cgtatataga tttcataaag tctaacacac tagacttatt tacttcgtaa 3900

ttaagtcgtt aaaccgtgtg ctctacgacc aaaactataa aacctttaag aactttcttt 3960

ttttacaaga aaaaagaaat tagataaatc tctcatatct tttattcaat aatcgcatcc 4020

gattgcagta taaatttaac gatcactcat catgttcata tttatcagag ctcgtgctat 4080

aattatacta attttataag gaggaaaaaa tatgggcatt tttagtattt ttgtaatcag 4140

cacagttcat tatcaaccaa acaaaaaata agtggttata atgaatcgtt aataagcaaa 4200

attcatataa ccaaattaaa gagggttata atgaacgaga aaaatataaa acacagtcaa 4260

aactttatta cttcaaaaca taatatagat aaaataatga caaatataag attaaatgaa 4320

catgataata tctttgaaat cggctcagga aaaggccatt ttacccttga attagtaaag 4380

aggtgtaatt tcgtaactgc cattgaaata gaccataaat tatgcaaaac tacagaaaat 4440

aaacttgttg atcacgataa tttccaagtt ttaaacaagg atatattgca gtttaaattt 4500

cctaaaaacc aatcctataa aatatatggt aatatacctt ataacataag tacggatata 4560

atacgcaaaa ttgtttttga tagtatagct aatgagattt atttaatcgt ggaatacggg 4620

tttgctaaaa gattattaaa tacaaaacgc tcattggcat tacttttaat ggcagaagtt 4680

gatatttcta tattaagtat ggttccaaga gaatattttc atcctaaacc taaagtgaat 4740

agctcactta tcagattaag tagaaaaaaa tcaagaatat cacacaaaga taaacaaaag 4800

tataattatt tcgttatgaa atgggttaac aaagaataca agaaaatatt tacaaaaaat 4860

caatttaaca attccttaaa acatgcagga attgacgatt taaacaatat tagctttgaa 4920

caattcttat ctcttttcaa tagctataaa ttatttaata agtaagttaa gggatgcata 4980

aactgcatcc cttaacttgt ttttcgtgtg cctatttttt gtgaatcgat tatgtctttt 5040

gcgcagtcgg cttaaaccag ttttcgctgg tgcgaaaaaa gagtgtcttg tgacacctaa 5100

attcaaaatc tatcggtcag atttataccg atttgatttt atatattctt gaataacata 5160

cgccgagtta tcacataaaa gcgggaacca atcatcaaat ttaaacttca ttgcataatc 5220

cattaaactc ttaaattcta cgattccttg ttcatcaata aactcaatca tttctttaat 5280

taatttatat ctatctgttg ttgttttctt taataattca tcaacatcta caccgccata 5340

aactatcata tcttcttttt gatatttaaa tttattagga tcttaaggcc taggtctaga 5400

gtctttgttt tgacgccatt agcgtacgta acaatcctcg ttaaaggaca aggacctgag 5460

cggaagtgta tcgtacagta gacggagtat actagtatag tctatagtcc gtggaattat 5520

tatatttatc tccgacgata ttctcatcag tgaaatccag ctggagttct ttagcaaatt 5580

tttttattag ctgaacttag tattagtggc catactcctc caatccaaag ctatttagaa 5640

agattactat atcctcaaac aggcggtaac cggcctcttc atcgggaatg cgcgcgacct 5700

tcagcatcgc cggcatgtcc ccctggcgga cgggaagtat ccagctcgag gtcgggccgc 5760

gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 5820

aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 5880

ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 5940

cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 6000

ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 6060

cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 6120

agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 6180

gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct 6240

gaagccagtt accttcggaa aaagagttga tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 6300

tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 6360

agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 6420

agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 6480

atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 6540

cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 6600

actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 6660

aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 6720

cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 6780

ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 6840

cattgctgca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 6900

ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 6960

cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 7020

ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 7080

tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 7140

ggcgtcaaca cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 7200

aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 7260

gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 7320

gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 7380

ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 7440

catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 7500

atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta 7560

taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcaagaa tt 7602

<210> 19

<211> 79

<212> PRT

<213> 人工序列（放射性铀结合蛋白SUP）

<400> 19

Leu Asp Cys Arg Glu Arg Ile Glu Lys Asp Leu Glu Asn Leu Glu Lys

1 5 10 15

Glu Leu Met Glu Met Lys Ser Ile Lys Leu Ser Asp Asp Glu Glu Ala

20 25 30

Val Val Glu Arg Ala Leu Asn Tyr Arg Asp Asp Ser Val Tyr Tyr Leu

35 40 45

Glu Lys Gly Asp His Ile Thr Ser Phe Gly Cys Ile Thr Tyr Ala Glu

50 55 60

Gly Leu Thr Asp Ser Leu Arg Met Leu His Arg Ile Ile Glu Gly

65 70 75

<210> 20

<211> 1113

<212> DNA

<213> 人工序列（合成的P2-agrBD-ter序列）

<400> 20

ggatcctatt ttccatcaca tctctgtgat ctagttatat taaaacatgc taaaagcatt 60

tattttccaa tttttcttaa ctagtcgttt tttattctta actgtaaatt tttttatgtt 120

aaaatattaa atacaaatta catttaacag ttaagtattt atttcctaca gttaggcaat 180

ataatgataa aagattgtac taaatcgtat aatgacagtg aggagagtgg tgtaaaaaag 240

cttttgaatt attttgataa taaaattgac cagtttgcca cgtatcttca aaagagaaat 300

aacttagatc atattcaatt tttgcaagta cgattaggga tgcaggtctt agctaaaaat 360

ataggtaaat taattgttat gtatactatt gcctatattt taaacatttt tctgtttacg 420

ttaattacga atttaacatt ttatttaata agaagacatg cacatggtgc acatgcacct 480

tcttcttttt ggtgttatgt agaaagtatt atactattta tacttttacc tttagtaata 540

gtaaattttc atattaactt tttaattatg attattttaa cagttatttc tttaggtgta 600

atctcagtat atgctcctgc agcaactaaa aagaagccca ttcctgtgcg acttattaaa 660

cgaaaaaaat attatgcgat tattgttagt ttaacccttt tcattatcac acttatcatc 720

aaagagccat ttgcccaatt cattcaatta ggcatcataa tagaagctat tacattatta 780

cctattttct ttattaagga ggacttaaaa tgaatacatt atttaactta ttttttgatt 840

ttattactgg gattttaaaa aacattggta acatcgcagc ttatagtact tgtgacttca 900

taatggatga agttgaagta ccaaaagaat taacacaatt acacgaataa agatctgtcg 960

actactagag ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt 1020

tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc tactagagtc acactggctc accttcgggt 1080

gggcctttct gcgtttatat actagaggaa ttc 1113

<210> 21

<211> 2063

<212> DNA

<213> agrCA序列

<400> 21

aagcttagat ctagagagtg tgatagtagg tggaattatt aaatagttat aattttgttt 60

tattcgtatt aactcaaatg atattaatgt ttacaatacc agctataatt agtggtatta 120

agtacagtaa acttgattat tttttcatca tagtaatttc gacattatcg ttatttctat 180

ttaaaatgtt tgatagcgcg tccttaatca tattaacttc atttattatt ataatgtatt 240

ttgtcaaaat caaatggtat tctattttgt tgattatgac ttcgcagatt attctatact 300

gtgctaacta catgtatata gttatatatg catatatcac caaaatttct gatagtatat 360

ttgtaatatt ccctagcttt tttgtagttt atgtgactat tagtatacta ttctcatata 420

taataaatag agttctcaaa aaaattagca caccatatct aatactaaac aaaggatttt 480

taatagttat ttcgactatc ttactgctta ctttttcatt atttttcttt tattcacaaa 540

taaactcgga tgaagctaaa gtaataaggc agtattcttt tatttttatt ggtatcacta 600

tatttttaag tatattaaca tttgttattt ctcaatttct ccttaaagag atgaaatata 660

aacgtaatca agaagaaatt gaaacctatt atgaatatac attgaagatt gaagctatca 720

acaacgaaat gcgcaagttc cgtcatgatt atgtcaatat cttaacgaca ctttcagaat 780

acattcgaga agatgacatg cctggcctac gtgattattt caataaaaat attgtaccta 840

tgaaagacaa tttacaaatg aatgctataa aattaaatgg tatcgagaat cttaaagtac 900

gtgaaattaa aggcttaatt actgcgaaaa ttttacgtgc acaagaaatg aatattccga 960

ttagtatcga aatacccgat gaagtaagta gcattaactt gaatatgatc gatttaagtc 1020

gcagtattgg tattattctt gataatgcaa ttgaggcatc aactgaaatt gatgacccta 1080

tcattcgcgt tgcatttatt gaaagtgaaa attcagtaac gtttattgtt atgaataaat 1140

gcgctgatga tataccacgc attcatgaat tgttccaaga aagtttttct actaaaggtg 1200

aaggtcgtgg tttaggtcta tcaactttaa aagaaattgc tgataatgca gacaatgtct 1260

tattagatac aattatcgaa aatggtttct ttattcaaaa agttgaaatt attaacaact 1320

agccataagg atgtgaatgt atgaaaattt tcatttgcga agacgatcca aaacaaagag 1380

aaaacatggt taccattatt aaaaattata taatgataga agaaaagcct atggaaattg 1440

ccctcgcaac tgataatcct tatgaggtgc ttgagcaagc taaaaatatg aatgacatag 1500

gctgttactt tttagatatt caactttcaa ctgatattaa tggtatcaaa ttaggcagtg 1560

aaattcgtaa gcatgaccca gttggtaaca ttattttcgt tacgagtcac agtgaactta 1620

cctatttaac atttgtctac aaagttgcag cgatggattt tatttttaaa gatgatccag 1680

ctgaattaag aactcgaatt atagactgtt tagaaactgc acatacacgc ttacaattgt 1740

tgtctaaaga taatagcgtt gaaacgattg aattaaaacg tggcagtaat tcagtgtatg 1800

ttcaatatga tgatattatg ttttttgaat catcaacaaa atctcacaga ctcattgccc 1860

atttagataa ccgtcaaatt gaattttatg gtaatttaaa agaactgagt caattagatg 1920

atcgtttctt tagatgtcat aatagctttg tcgtcaatcg ccataatatt gaatctatag 1980

attcgaaaga gcgaattgtc tattttaaaa ataaagaaca ctgctatgca tcggtgagaa 2040

acgttaaaaa aatataagtc gac 2063

<210> 22

<211> 33

<212> DNA

<213> D tasAsinR Upstream-F

<400> 22

ggggtcgaca tgtttcgatt gtttcacaat cag 33

<210> 23

<211> 43

<212> DNA

<213> D tasAsinR Upstream-R

<400> 23

tcataccgta aatcctttct gattaagtag acatggtgct gtc 43

<210> 24

<211> 43

<212> DNA

<213> D tasAsinR downstream-F

<400> 24

gacagcacca tgtctactta atcagaaagg atttacggta tga 43

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> D tasAsinR downstream-R

<400> 25

gcgagatctg cgtttttttc aagcaaacag 30

<210> 26

<211> 29

<212> DNA

<213> D eps Upstream-F

<400> 26

aaaggatccg caatcctcgg actggcggg 29

<210> 27

<211> 46

<212> DNA

<213> D eps Upstream-R

<400> 27

gagaatcaaa ataaaccttc cgcgtattca tagccttcag ccttcc 46

<210> 28

<211> 46

<212> DNA

<213> D eps downstream -F

<400> 28

ggaaggctga aggctatgaa tacgcggaag gtttattttg attctc 46

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> D eps downstream-R

<400> 29

aaagtcgact tccgctgcga tgtgcccat 29

<210> 30

<211> 59

<212> DNA

<213> D tasA Upstream-F

<400> 30

ttacacatta actagacaga tctatcgatg catgccatgg aaaccagaaa gcggactta 59

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> D tasA Upstream-R

<400> 31

taacagcaaa aaaaagagac ggccc 25

<210> 32

<211> 57

<212> DNA

<213> D tasA downstream-F

<400> 32

tatgaatact gggccgtctc ttttttttgc tgttaggtaa gctccccttt tattgaa 57

<210> 33

<211> 55

<212> DNA

<213> D tasA downstream-R

<400> 33

tctgcagaag cttctagaat tcgagctccc gggatcaaac ggatacgaaa ggcac 55

<210> 34

<211> 39

<212> DNA

<213> Bam-tasA-F

<400> 34

gggggatcca tgggtatgaa aaagaaattg agtttagga 39

<210> 35

<211> 39

<212> DNA

<213> Sma-tasA-R

<400> 35

gggcccgggt taatttttat cctcgctatg cgctttttc 39

<210> 36

<211> 39

<212> DNA

<213> Sma-tasA-histag-R

<400> 36

gggcccgggt tagtggtggt ggtggtggtg atttttatc 39

<210> 37

<211> 93

<212> DNA

<213> Sma-tasA-spytag-R

<400> 37

gggcccgggt tatttggtgg gtttatatgc atcgaccata acgatgtgcg cggagccccc 60

gccggagccc ccgccatttt tatcctcgct atg 93

<210> 38

<211> 38

<212> DNA

<213> Sma-tasA-mgfp3-R

<400> 38

gggcccgggt tagtggtggt ggtggtggtg atgataat 38

<210> 39

<211> 38

<212> DNA

<213> Sma-mgfp5-tasA-F

<400> 39

gggcccggga tgagttctga agaatacaaa ggtggtta 38

<210> 40

<211> 37

<212> DNA

<213> Sma-mgfp5-tasA-R

<400> 40

gggcccgggt tagtggtggt ggtggtggtg attttta 37

<210> 41

<211> 85

<212> DNA

<213> tasA-F

<400> 41

tctttattat aagaattgtg gaattgtgag cggataacaa ttcccaatta aaggaggaag 60

atgggtatga aaaagaaatt gagtt 85

<210> 42

<211> 87

<212> DNA

<213> tasA-R

<400> 42

ttcgggccat agtaatccgc ggatcctgag cctcctcctc ctgatcctcc gccgccgccg 60

gcatttttat cctcgctatg cgctttt 87

<210> 43

<211> 87

<212> DNA

<213> tasA-mefp3-F

<400> 43

aaaagcgcat agcgaggata aaaatgccgg cggcggcgga ggatcaggag gaggaggctc 60

aggatccgcg gattactatg gcccgaa 87

<210> 44

<211> 112

<212> DNA

<213> tasA-mefp3-R

<400> 44

tgaaaaaagc ccgctcatta ggcgggctgc cccggggacg tcgactctag aggatcttat 60

ggccaatgat gatggtgatg atggtgacta gtccagtatt tgccgcgtct gc 112

<210> 45

<211> 89

<212> DNA

<213> tasA-mefp5-F

<400> 45

aaaagcgcat agcgaggata aaaatgccgg cggcggcgga ggatcaggag gaggaggctc 60

aggatccagc agcgaagagt ataagggcg 89

<210> 46

<211> 114

<212> DNA

<213> tasA-mefp5-R

<400> 46

tgaaaaaagc ccgctcatta ggcgggctgc cccggggacg tcgactctag aggatcttat 60

ggccaatgat gatggtgatg atggtgacta gtgctgctgc cgccgtaata ctta 114

<210> 47

<211> 86

<212> DNA

<213> tasA-mms6-F

<400> 47

cgtgaaagaa aatgaaaaag cgcatagcga ggataaaaat ggcggcggag gatcaggcgg 60

cggcggcagc ggcggcacaa tttgga 86

<210> 48

<211> 90

<212> DNA

<213> tasA-mms6-R

<400> 48

cgctcattag gcgggctgcc ccggggacgt cgactctaga ggatcttaat gatgatggtg 60

atgatggtgt gccagcgcat cgcgcagttc 90

<210> 49

<211> 30

<212> DNA

<213> mts-F

<400> 49

aaaggatccg accctaattg ttcttgcgca 30

<210> 50

<211> 30

<212> DNA

<213> mts-R

<400> 50

aatactagtc gcgcaacagc tgcatttatc 30

<210> 51

<211> 29

<212> DNA

<213> pbrR-F

<400> 51

aaaggatcca atatccagat cggcgagct 29

<210> 52

<211> 29

<212> DNA

<213> pbrR-R

<400> 52

aaaactagtg tcgcttggat gggcggtgg 29

<210> 53

<211> 87

<212> DNA

<213> tasA-mcherry-F

<400> 53

aaaagcgcat agcgaggata aaaatgccgg cggcggcgga ggatcaggag gaggaggctc 60

aggatccgtg agcaagggcg aggagga 87

<210> 54

<211> 107

<212> DNA

<213> tasA-mcherry-R

<400> 54

tgaaaaaagc ccgctcatta ggcgggctgc cccggggacg tcgactctag aggatcttaa 60

tgatgatggt gatgatggtg actagtaccc gccttgtaca gctcgtc 107

<210> 55

<211> 89

<212> DNA

<213> tasA-maple3-F

<400> 55

aaaagcgcat agcgaggata aaaatgccgg cggcggcgga ggatcaggag gaggaggctc 60

aggatccgtg agcaaaggcg aggagacaa 89

<210> 56

<211> 117

<212> DNA

<213> tasA-maple3-R

<400> 56

tgaaaaaagc ccgctcatta ggcgggctgc cccggggacg tcgactctag aggatcttat 60

ggccaatgat gatggtgatg atggtgacta gtcttataga gttcgtccat gctgtcg 117

<210> 57

<211> 23

<212> DNA

<213> tasA-OPH-F

<400> 57

cgtgaaagaa aatgaaaaag cgc 23

<210> 58

<211> 22

<212> DNA

<213> tasA-OPH-R

<400> 58

tgaaaaaagc ccgctcatta gg 22

<210> 59

<211> 24

<212> DNA

<213> Bam-OPH no his F

<400> 59

tcaggatcct ctatcggtac cggt 24

<210> 60

<211> 43

<212> DNA

<213> Xba-OPH no his R

<400> 60

gactctagag gatcttaact agttgacgcc cgcaaggtcg gtg 43

<210> 61

<211> 62

<212> DNA

<213> upstream-F

<400> 61

ttacacatta actagacaga tctatcgatg catgccatgg aaaccagaaa gcggacttaa 60

gc 62

<210> 62

<211> 25

<212> DNA

<213> upstream-R

<400> 62

taacagcaaa aaaaagagac ggccc 25

<210> 63

<211> 22

<212> DNA

<213> downstream-F

<400> 63

agcaactcct aaactcaatt tc 22

<210> 64

<211> 54

<212> DNA

<213> downstream-R

<400> 64

tctgcagaag cttctagaat tcgagctccc gggtaaaaca aaaggtgata ataa 54

<210> 65

<211> 21

<212> DNA

<213> th-tasA-F

<400> 65

atgggtatga aaaagaaatt g 21

<210> 66

<211> 56

<212> DNA

<213> histag-R

<400> 66

tatgaatact gggccgtctc ttttttttgc tgttattagt ggtggtggtg gtggtg 56

<210> 67

<211> 56

<212> DNA

<213> mefp3-5-R

<400> 67

tatgaatact gggccgtctc ttttttttgc tgttattatg gccaatgatg atggtg 56

<210> 68

<211> 56

<212> DNA

<213> mecherry-R

<400> 68

tatgaatact gggccgtctc ttttttttgc tgttattaat gatgatggtg atgatg 56

<210> 69

<211> 50

<212> DNA

<213> tasAoph-mad F

<400> 69

gtcgggcgat atcggatcca tatgacgatg ggtatgaaaa agaaattgag 50

<210> 70

<211> 44

<212> DNA

<213> oph-R

<400> 70

tcataccgta aatcctttct gattaactag tgctcgctct cagt 44

<210> 71

<211> 44

<212> DNA

<213> sinI-F

<400> 71

actgagagcg agcactagtt aatcagaaag gatttacggt atga 44

<210> 72

<211> 61

<212> DNA

<213> sinI-mad R

<400> 72

cattaactag acagatctat cgatgcatgc catggtaccc gcgttttttt caagcaaaca 60

g 61

<210> 73

<211> 33

<212> DNA

<213> Sal-dA upstream-F

<400> 73

ggggtcgaca tgtttcgatt gtttcacaat cag 33

<210> 74

<211> 41

<212> DNA

<213> dA upstream-R

<400> 74

gactggaaag cgggcagtga ttaagtagac atggtgctgt c 41

<210> 75

<211> 42

<212> DNA

<213> dC downstream-F

<400> 75

accaccacca ccaccactga tcagaaagga tttacggtat ga 42

<210> 76

<211> 30

<212> DNA

<213> bgl-dC downstream-R

<400> 76

gcgagatctg cgtttttttc aagcaaacag 30

<210> 77

<211> 41

<212> DNA

<213> tasA-histagF

<400> 77

gacagcacca tgtctactta atcactgccc gctttccagt c 41

<210> 78

<211> 42

<212> DNA

<213> tasA-histag-R

<400> 78

tcataccgta aatcctttct gatcagtggt ggtggtggtg gt 42

<210> 79

<211> 36

<212> DNA

<213> hindbgl-agrCAF

<400> 79

cccaagctta gatctagaga gtgtgatagt aggtgg 36

<210> 80

<211> 31

<212> DNA

<213> sal-agrCA R

<400> 80

cctgtcgact tatatttttt taacgtttct c 31

<210> 81

<211> 87

<212> DNA

<213> P3-pMK F

<400> 81

agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gcttggctgc 60

aggttttaca ccactctcct cactgtc 87

<210> 82

<211> 66

<212> DNA

<213> P3-tas R

<400> 82

cagaagcaac tcctaaactc aatttctttt tcatacccat caactatttt ccatcacatc 60

tctgtg 66

<210> 83

<211> 54

<212> DNA

<213> Tas-P3 F

<400> 83

cacagagatg tgatggaaaa tagttgatgg gtatgaaaaa gaaattgagt ttag 54

<210> 84

<211> 88

<212> DNA

<213> TH-pMK R

<400> 84

gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attcccgggg 60

atcttagtgg tggtggtggt ggtgattt 88

<210> 85

<211> 90

<212> DNA

<213> TMCH-pMK R

<400> 85

gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga attcccgggg 60

atcttaatga tgatggtgat gatggtgact 90

<210> 86

<211> 24

<212> DNA

<213> Bam-me3 F

<400> 86

acaggatccg cggattacta tggc 24

<210> 87

<211> 23

<212> DNA

<213> Sma-me35 R

<400> 87

tggcccgggg acgtcgactc tag 23

<210> 88

<211> 27

<212> DNA

<213> Bam-me5 F

<400> 88

acaggatcca gcagcgaaga gtataag 27

<210> 89

<211> 23

<212> DNA

<213> Bam-oph F

<400> 89

aaaggatcct caattggcac ggg 23

<210> 90

<211> 24

<212> DNA

<213> Sma-oph R

<400> 90

ggccccgggt taactagtgc tcgc 24

<210> 91

<211> 386

<212> PRT

<213> 合成Spycatcher-Mcherry人工序列（氨基酸）

<400> 91

Met Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ala

1 5 10 15

Met Val Asp Thr Leu Ser Gly Leu Ser Ser Glu Gln Gly Gln Ser Gly

20 25 30

Asp Met Thr Ile Glu Glu Asp Ser Ala Thr His Ile Lys Phe Ser Lys

35 40 45

Arg Asp Glu Asp Gly Lys Glu Leu Ala Gly Ala Thr Met Glu Leu Arg

50 55 60

Asp Ser Ser Gly Lys Thr Ile Ser Thr Trp Ile Ser Asp Gly Gln Val

65 70 75 80

Lys Asp Phe Tyr Leu Tyr Pro Gly Lys Tyr Thr Phe Val Glu Thr Ala

85 90 95

Ala Pro Asp Gly Tyr Glu Val Ala Thr Ala Ile Thr Phe Thr Val Asn

100 105 110

Glu Gln Gly Gln Val Thr Val Asn Gly Lys Ala Thr Lys Gly Asp Ala

115 120 125

His Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Tyr His

130 135 140

His His His His His Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile

145 150 155 160

Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn

165 170 175

Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro

195 200 205

Phe Ala Trp Asp Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala

210 215 220

Tyr Val Lys His Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe

225 230 235 240

Pro Glu Gly Phe Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly

245 250 255

Val Val Thr Val Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile

260 265 270

Tyr Lys Val Lys Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val

275 280 285

Met Gln Lys Lys Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr

290 295 300

Pro Glu Asp Gly Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu

305 310 315 320

Lys Asp Gly Gly His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala

325 330 335

Lys Lys Pro Val Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu

340 345 350

Asp Ile Thr Ser His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu

355 360 365

Arg Ala Glu Gly Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

370 375 380

Ala Gly

385