一种多环芳烃降解基因工程菌株、其构建方法及应用与流程

本发明涉及一种多环芳烃降解基因工程菌株、其构建方法及应用。

背景技术：

在过去的十几年内，应用基因工程菌(GEB)进行环境修复的研究进展比较缓慢。单从技术角度来讲，研究学者们已经发现了大量的可以用于生物修复的遗传系统，通过基因工程改造微生物的相关代谢系统可以大大提高其对污染物的降解效率，因此GEB往往都具有良好的特异性降解能力。而真正限制GEB应用于环境修复的因素往往是其未知与不可控的生态风险，这些菌株所携带的外源抗性基因一旦通过水平转移进入其他生物体内，可能造成较为严重的抗性基因污染，同时GEB多为外来物种，其生长代谢是否会对土著微生物群落产生影响，均存在较大的不确定性。

为了解决上述问题，GEB在应用于环境修复前往往需要经过复杂而漫长的评估过程。如何将其改造得易监测、可控制是未来基因工程菌构建技术发展的趋势。研究表明，向GEB中导入可调控的自毁系统(Active biological containment systems，ABC)可以实现对菌株的人为诱导衰亡，该方法主要是通过调控导入的自杀基因得以实现。具有ABC系统的细菌一旦遇到诱导物质，其携带的自杀基因则会通过破坏细胞膜、降解核酸物质等方式启动自杀机制。虽然该系统功能的发挥会受到诱导物质接触程度、细菌胞内蛋白表达量等多方面因素的影响，无法保证100％的致死率，但该系统对实现人为控制GEB在环境中的生长、防范其扩散仍具有极大地应用潜力。

技术实现要素：

针对应用基因工程菌进行土壤修复过程中潜在的抗性基因污染及外源菌株扩散等生物安全风险，本发明提供一种具有诱导自毁机制的多环芳烃降解基因工程菌、其构建方法、应用以及自毁效率检验方法。

一种多环芳烃降解基因工程菌株，该菌株Pseudomonas putida GLEB3已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2016年09月19日，保藏编号：CGMCCNo.13014，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

进一步地：

所述构建方法包括以下步骤：

1)lac启动子与核酸酶基因nuc的融合

以pAH12质粒为模板，采用引物nuc-f与nuc-r扩增核酸酶基因nuc。随后采用Nde I和Hind III酶分别酶切扩增产物及pUC-18质粒，16℃连接过夜，构建pUC-nuc载体，转化至E.coli DH5α感受态细胞后，筛选阳性克隆；菌落PCR及酶切验证后，提取质粒，采用引物lacnuc-f与lacnuc-r扩增连接有上游lac启动子及操纵子的nuc基因，得到lacnuc融合基因；

2)重组转座子载体pUT-lacnuc的构建

切胶回收后lacnuc融合基因的PCR产物并进行纯化，采用Not I酶进行酶切，同时切割质粒pUT-mini Tn5(Km)；连接酶切产物，得到重组质粒pUT-lacnuc；

3)基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的构建

采用三亲结合的方式将融合基因lacnuc重组至Pseudomonas putida GLB3染色体，操作所需菌株如下：受体菌(Pseudomonas putida GLB3)、辅助菌(E.coli DH5α(pRK2073))、供体菌(E.coli DH5α(pUT-lacnuc))；培养至菌落可见后，通过菌落PCR及阳性克隆扩大培养后的质粒酶切进行鉴定，筛选构建成功的基因工程菌株。

步骤3)中各菌株混合比例为1:1:1，混合体系采用10mM MgSO4溶液，所用平板培养基应为含有卡那霉素25mg/L及氯霉素25mg/L的LB平板培养基。

各步骤应用的引物序列如下：

一种所述的多环芳烃降解基因工程菌株用于实现应用基因工程菌GEB的人为诱导衰亡，控制GEB在环境中的生长的应用。

进一步地，使用被异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导自毁的功能进行诱导自毁。

一种将所述的多环芳烃降解基因工程菌株的构建方法用于实现应用基因工程菌GEB的人为诱导衰亡，控制GEB在环境中的生长的应用。

一种针对所述应用的诱导自毁效率检验方法，包括以下步骤：

挑取含有融合基因lacnuc的重组菌单菌落接种于LB肉汤，30℃培养，待OD₆₀₀值达到0.6时，吸取10ml菌悬液转移至灭菌离心管，加入IPTG进行诱导自杀，使其最终浓度为12mg/L，继续于30℃培养，按照一定的间隔时间取样测定OD₆₀₀值并取100μl稀释1:400后的菌悬液接种于含有氯霉素25mg/L的LB平板培养基，30℃过夜培养后对菌落进行计数；同时采用含有pUC-nuc质粒的E.coli JM109及不含ABC系统的受体菌Pseudomonas putida GLB3分别作为阳性与阴性对照，进行相同诱导自杀实验。

进一步地，用于E.coli JM109稀释菌液接种的LB平板采用氨苄青霉素100mg/L取代卡那霉素。

本发明的有益技术效果有：

本发明在原位解析雨水花园中PAHs污染特征及微生物群落结构的基础上，以其中筛选出的土著优势菌种Pseudomonas putida GLB3为受体菌(GenBank accession No.KT804567)，选择Serratia marcescens菌株携带的核酸酶基因(nuc)及lac启动子构建ABC系统。先将nuc基因片段连接至pUC-18载体lac启动子下游，通过PCR扩增lac启动子及nuc基因，得到lacnuc融合片段。进而插入至pUT/mini-Tn5转座载体，通过其转座子将上述片段重组入Pseudomonas putida GLB3菌株的基因组，实现ABC系统的构建。从而，本发明有效提高基因工程菌株在生长过程中的可控性，降低应用其进行微生物强化修复过程中的生物安全风险。

附图说明

图1是本发明实施例电泳照片，以nuc-f和nuc-r为引物扩增nuc片段，扩增产物大小801bp。

图2是本发明实施例电泳照片，以Nde I与Hind III酶切pUC-nuc载体。

图3是本发明实施例电泳照片，以lacnuc-f和lacnuc-r进行PCR扩增lacnuc片段，扩增产物大小970bp。

图4是本发明实施例电泳照片，以lacnuc-f和lacnuc-r进行PCR鉴定pUT-lacnuc载体中的lacnuc片段。

图5是本发明实施例电泳照片，以Not I酶切pUT-lacnuc载体，酶切产物大小为7.1kb与0.97kb。

图6是本发明实施例电泳照片，以lacnuc-f和lacnuc-r进行PCR鉴定重组菌基因组及质粒DNA是否携带lacnuc片段，扩增产物大小970bp。

图7是本发明实施例基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3、受体菌Pseudomonas putida GLB3与含有pUC-nuc质粒的菌株E.coli JM109在IPTG诱导与非诱导条件下的生长曲线。

具体实施方式

本发明实施例提供一种假单胞菌基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3。菌种保藏编号：CGMCCNo.13014。假单胞菌基因工程菌株的构建方法是利用从受多环芳烃污染的雨水花园土壤中筛选出的土著优势菌株Pseudomonas putida GLB3(GenBank accession No.KT804567)作为受体菌，将Serratia marcescens菌株携带的核酸酶基因(nuc)连接至lac启动子下游构后，通过三亲结合的方法将上述融合基因导入受体菌基因组，实现异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对菌株的诱导后自毁功能。对比基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3、受体菌Pseudomonas putida GLB3与含有pUC-nuc质粒的菌株E.coli JM109在诱导与非诱导条件下的生长能力，证明基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3在人为进行IPTG诱导后，表现出了明显了衰亡效应。由此，证明本发明可有效提高基因工程菌株在生长过程中的人为可控性，降低其应用过程中的生物安全风险。

本发明实施例的基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的构建及诱导自杀效率评价方法，如下：

1、lac启动子与核酸酶基因nuc的融合

以pAH12质粒为模板，采用引物nuc-f与nuc-r扩增核酸酶基因nuc。随后采用Nde I和Hind III酶分别酶切扩增产物及pUC-18质粒，16℃连接过夜，构建pUC-nuc载体，转化至E.coli DH5α感受态细胞后，筛选阳性克隆。菌落PCR及酶切验证后，提取质粒，采用引物lacnuc-f与lacnuc-r扩增连接有上游lac启动子及操纵子的nuc基因，得到lacnuc融合基因。

2、重组转座子载体pUT-lacnuc的构建

切胶回收后lacnuc融合基因的PCR产物并进行纯化，采用Not I酶进行酶切，同时切割质粒pUT-mini Tn5(Km)。连接酶切产物，得到重组质粒pUT-lacnuc。

3、基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的构建

采用三亲结合的方式将融合基因lacnuc重组至Pseudomonas putida GLB3染色体，操作所需菌株如下：受体菌(Pseudomonas putida GLB3)、辅助菌(E.coli DH5α(pRK2073))、供体菌(E.coli DH5α(pUT-lacnuc))。各菌株混合比例为1:1:1，混合体系采用10mM MgSO₄溶液，所用平板培养基应为含有卡那霉素(25mg/L)及氯霉素(25mg/L)的LB平板培养基。培养至菌落可见后，通过菌落PCR及阳性克隆扩大培养后的质粒酶切进行鉴定，筛选构建成功的基因工程菌株。

4、基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的诱导自杀效率研究

挑取含有融合基因lacnuc的重组菌单菌落接种于LB肉汤，30℃培养，待OD₆₀₀值达到0.6时，吸取10ml菌悬液转移至灭菌离心管，加入IPTG进行诱导自杀，使其最终浓度为12mg/L，继续于30℃培养，按照一定的间隔时间取样测定OD₆₀₀值并取100μl稀释后(1:400)的菌悬液接种于含有氯霉素(25mg/L)的LB平板培养基，30℃过夜培养后对菌落进行计数。同时采用含有pUC-nuc质粒的E.coli JM109及不含ABC系统的受体菌Pseudomonas putida GLB3分别作为阳性与阴性对照，进行相同诱导自杀实验(用于E.coli JM109稀释菌液接种的LB平板采用氨苄青霉素(100mg/L)取代卡那霉素)。

上述各步骤中所用引物名称、序列及作用如下：

实施例1：lac启动子与核酸酶基因nuc的融合

以引物nuc-f和nuc-r扩增nuc片段；PCR反应体系(50μl)：模板DNA1.0μl；HS Premix(宝生工，大连)25.0μl；50μM引物0.5μl；ddH₂O 23.0μl；PCR反应程序：94℃预变性3min；(94℃预变性30s—57℃退火5s—72℃延伸90s)×30个循环；72℃延伸10min。扩增结果见图1(图1：PCR扩增nuc基因，其中M：5000bp DNA Marker，1：nuc基因片段)。凝胶电泳成像可见特异性扩增条带，片段长度预期(801bp)相符。使用Nde I和Hind III酶切载体pUC-18以及nuc片段的扩增产物，连接后得到质粒pUC-nuc转化至E.coli DH5α中扩增提取质粒后，可以以其为模板扩增出nuc片段，使用Nde I和Hind III酶切可见pUC-18载体以及nuc片段(参见图2：pUC-nuc载体的PCR与酶切鉴定，其中M：5000bp DNA Marker，1：Nde I与Hind III酶切产物)。以载体pUC-nuc为模板，使用引物lacnuc-f与lacnuc-r扩增包含上游lac启动子及操纵子的的nuc基因，PCR反应体系同上，反应程序中退化温度变更为59℃。得到与预期一致的特异性扩增片段(970bp)(参见图3：pMD-lacnuc载体的PCR与酶切鉴定，其中M：5000bp DNA Marker，1：PCR扩增lacnuc片段)。

实施例2：重组转座子载体pUT-lacnuc的构建

使用Not I限制性内切酶酶切lacnuc基因及载体pUT/mini-Tn5Km，酶切产物纯化后回收lacnuc片段与pUT/mini-Tn5Km连接，连接产物转化至E.coli DH5αλpir中。挑取平板上的阳性克隆利用引物lacnuc-f与lacnuc-r进行菌落PCR进行验证，验证结果呈阳性(见图4：pUT-lacnuc载体的PCR验证，其中M：10000bp DNA Marker，1：lacnuc基因片段)；同时，对提取的质粒进行Not I酶切，凝胶电泳结果显示在7.1kb与1kb处附近存在两条条带(见图5：pUT-lacnuc载体的酶切鉴定，其中M：5000bp DNA Marker，1：Not I酶切产物)，分别对应pUT/mini-Tn5Km质粒与lacnuc基因，证明pUT-lacnuc重组表达载体构建成功。

实施例3：基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的构建

采用三亲结合的方式将融合基因lacnuc的重组至Pseudomonas putida GLB3染色体，操作所需菌株如下：受体菌(Pseudomonas putida GLB3)、辅助菌(E.coli DH5α(pRK2073))、供体菌(E.coli DH5α(pUT-lacnuc))。各菌株混合比例为1:2:1，混合体系采用10mM MgSO₄溶液，所用平板培养基应为含有卡那霉素(25mg/L)及氯霉素(25mg/L)的LB平板培养基。培养至菌落可见后，挑取菌落，采用引物lacnuc-f与lacnuc-r进行lacnuc 基因的菌落PCR验证。图6表明lacnuc基因已成功转化入受体菌Pseudomonas putida GLB3，将该重组菌命名为Pseudomonas putida GLEB3(保藏号CGMCCNo.13014)。在含有氯霉素的LB培养基中增殖重组菌Pseudomonas putida GLEB3，分别提取其基因组DNA与质粒DNA，并以此为模板，使用引物lacnuc-f与lacnuc-r扩增lacnuc基因。重组菌Pseudomonas putida GLEB3的基因组可以扩增出lacnuc基因片段，而提取的质粒DNA则无法扩增(图6：三亲结合重组菌的PCR验证及lacnuc基因的定位，其中M：10000bp DNA Marker，1，4：基因组的lacnuc基因扩增验证，2，3：提取质粒后lacnuc基因扩增验证)，说明lacnuc基因在重组菌株生长的过程中已经整合至细菌基因组。

实施例4：基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的诱导自杀效率研究

挑取含有融合基因lacnuc的重组菌单菌落及接种于LB肉汤，30℃培养，待OD₆₀₀值达到0.6时，吸取1ml菌悬液转移至灭菌离心管，加入IPTG进行诱导自杀，使其最终浓度为12mg/L，继续于30℃培养，按照一定的间隔时间取样测定OD₆₀₀值并取100μl稀释后(1:400)的菌悬液接种于含有氯霉素(25mg/L)的LB平板培养基，30℃过夜培养后对菌落进行计数。同时采用含有pUC-nuc质粒的E.coli JM109及不含ABC系统的基因工程菌Pseudomonas putida GLEB3分别作为阳性与阴性对照，进行相同诱导自杀实验(用于E.coli JM109稀释菌液接种的LB平板采用氨苄青霉素(100mg/L)取代卡那霉素)，结果见(图7：菌株Pseudomonas putida GLEB3、Pseudomonas putida GLB3与含有pUC-nuc质粒的菌株E.coli JM109在IPTG诱导与非诱导条件下的生长曲线)。

菌株Pseudomonas putida GLEB3在整合入lacnuc后，在未受IPTG条件诱导的情况下，生长曲线与原菌株几乎一致，说明以野生菌株Pseudomonas putida GLB3为受体构建的基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3体内可以表达lacI阻遏蛋白，ABC系统的构建并未影响菌株Pseudomonas putida GLEB3在正常情况条件下的生长。而在接受IPTG诱导后，菌株Pseudomonas putida GLEKB3的生长速率显著下降，生长曲线提前进入平台期。结合表1中对应的存活菌落数进行分析发现，生长曲线进入平台期后随时间增长，存活的菌落数显著下降。对比接受IPTG诱导的原始菌株Pseudomonas putida GLEB3则未发现上述现象，初步证明是重组入其基因组的lacnuc基因赋予了其被IPTG诱导自杀能力，IPTG实现了对菌株体内lacI阻遏蛋白阻断，从而启动了lac启动子下游基因的表达。针对含有pUC-nuc质粒的菌株E.coli JM109的诱导试验产生了与菌株Pseudomonas putida GLEKB3相似的结果：菌株在IPTG诱导后，生长速率显著降低，并在一段时间后停止生长。由此可以验证菌株Pseudomonas putida GLEKB3的IPTG诱导自杀能力是由重组入其基因组的lacnuc基因导致，菌株Pseudomonas putida GLEB3体内的ABC系统构建成功。

表1：菌株Pseudomonas putida GLKB3、Pseudomonas putida GLB3与含有pUC-nuc质粒的菌株E.coli JM109在不同诱导时间后的存活菌落数比较

本发明利用的受体菌株是在深圳光明新区低影响示范工程雨水花园土壤中获得的一株恶臭假单胞菌菌株Pseudomonas putida GLB3为受体菌(GenBank accession No.KT804567)，经高通量测序解析土壤生物群落结构确定该菌株所在属别为优势菌属。核酸酶nuc携带质粒pAH12由中国科学院动物研究所伍一军教授及德国奥尔登堡大学Wackernagel教授馈赠。本发明应用基因工程手段，将来自pAH12质粒的核酸水解酶编码基因连接至pUC-18载体的lac启动子下游，并扩增lacnuc融合基因后通过三亲结合的方式重组至受体菌基因组，以实现异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)对重组菌株的诱导自毁功能，提高基因工程菌株在生长过程中的可控性，降低应用其进行微生物强化修复过程中的生物安全风险。

以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学深圳研究生院

<120> 一种多环芳烃降解基因工程菌株、其构建方法及应用

<130> 16A100483JYC

<160> 2

<210> 1

<211> 801

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcgcttta acaacaagat gttggccctg gccgccctgc tgttcgccgc tcaggcgtcg 60

gccgacacgc tcgaatccat cgacaactgc gcggtcggct gcccgactgg tggcagcagc 120

aacgtgtcta tcgtgcgtca tgcttatacg ttgaacaaca acagtaccac caagttcgcc 180

aactgggtgg cttatcacat caccaaagac acgccggcca gcggcaagac gcgcaactgg 240

aaaaccgatc cggcgctcaa cccggcggac acgttagcgc ccgccgatta caccggcgcc 300

aatgcggcgc tgaaggtcga tcgcggtcat caggcgccgc tggcttcgct ggcgggcgtt 360

tccgactggg aatcgctgaa ctacctgtcc aacatcacgc cgcaaaagtc cgatcttaac 420

cagggcgcct gggcgcggct ggaagatcag gaacgcaagc tgatcgatcg cgccgatatc 480

tcctcggtct ataccgtgac cgggccgctg tatgaacgcg atatgggcaa actgccgggc 540

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ccggcggtga accactatgc cgccttcctg ttcgatcaga acacgccgaa gggcgccgat 660

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ttgatgggct gcaaaaactg a 801

<210> 2

<211> 946

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca 60

cacaggaaac agctatgacc atgattacga attcgagctc ggtacccggg gatcctctag 120

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cggctgcccg actggtggca gcagcaacgt gtctatcgtg cgtcatgctt atacgttgaa 300

caacaacagt accaccaagt tcgccaactg ggtggcttat cacatcacca aagacacgcc 360

ggccagcggc aagacgcgca actggaaaac cgatccggcg ctcaacccgg cggacacgtt 420

agcgcccgcc gattacaccg gcgccaatgc ggcgctgaag gtcgatcgcg gtcatcaggc 480

gccgctggct tcgctggcgg gcgtttccga ctgggaatcg ctgaactacc tgtccaacat 540

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