一株重组菌及其在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D中的应用的制作方法

本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及一种重组菌及其在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D中的应用。
背景技术：
：随着人们对健康的关注意识日益提高，消费者对蔗糖的摄入量逐渐减少，食品工业致力于发展低热值高甜度的天然甜味剂。甜菊糖提取自原产于南美巴拉圭和巴西的多年生菊科草本植物甜叶菊，具有高甜度（为蔗糖的250～300倍）、低热量（仅为蔗糖的1/300）的特性，无毒副作用，无致癌物，食用安全，对高血压、糖尿病、肥胖症、心脏病、龋齿等病症还有一定的药理作用和辅助疗效。它是继甘蔗糖、甜菜糖之外的第三种有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被国际上誉为“世界第三糖源”。1998年，美国食品和药物管理局（FDA）同意将甜菊糖添加到食品饮料中。瑞士将甜菊糖列入本国药典作为糖浆剂、口服液或含片的主要甜味剂原料,取代了糖精钠等传统药用甜味剂。相对于日本、美国和瑞士，欧盟批准使用甜菊糖的时间稍晚一些。2008年欧盟正式批准其作为食品添加剂。由于对甜菊糖的需求量不断增加，许多国家包括日本、新加坡、马来西亚、韩国、中国、以色列、印度、巴西和澳大利亚等都已在商业化种植甜叶菊。甜叶菊的叶子含有多种天然的甜味糖甙如甜菊甙、莱鲍迪A-F、杜尔可甙A和甜茶甙。其中，莱鲍迪甙D虽然不是甜菊糖总甙中的主要糖甙，但其后苦味显著低于莱鲍迪甙A（ChemosensPercept.6(3):109–117）。2008年，美国FDA签发了确认莱鲍迪甙A能以最低95%的纯度用作零卡路里甜味剂的“通常认为是安全的”（“GRAS”）通知。莱鲍迪甙D与莱鲍迪甙A结构相似，只相差一个葡萄糖基，甜菊糖苷相关的结构物质的毒性研究也证实莱鲍迪甙D食用安全，可用于食品药品等领域(Int.J.Toxicol.,2013,32(4):261-273.)。因此，莱鲍迪甙D是比莱鲍迪甙A具有更好味质的潜在天然甜味剂。植物来源的UDP-糖基转移酶能催化莱鲍迪甙A糖基化生成莱鲍迪甙D，如UGT91D2(US2014/0357588A1)、EUGT11(WO/2013/022989A2)和UGTSL2（US2014/0357588A1,Biomolecules2014,4:374-389)等。糖基转移酶由于UDP-糖基转移酶所催化的转糖基反应中需要活化的糖基供体UDP-葡萄糖，为了降低成本，通常会采用再生UDP-葡萄糖再生体系，如在体系在加入UDP和蔗糖，在蔗糖合酶的作用下生成UDP-葡萄糖和果糖（Biotechnol.Adv.2016,34(2):88-111.）。专利CN201310353500.9和CN201410019981.4在以莱鲍迪甙A为底物制备莱鲍迪甙M过程中莱鲍迪甙D为其中间产物或直接用作制备莱鲍迪甙M的底物。反应体系中使用重组细胞，需要添加甲苯或其它细胞通透剂；或使用重组细胞冻干粉，而冻干粉的制备耗能、成本高；此外都需要额外添加UDP作为UDP-葡萄糖再生体系的辅底物。专利CN201410019981.4中虽然对CN201310353500.9的工艺进行了优化、但还需要调配UDP-糖基转移酶和蔗糖合酶的添加比例，重组菌用量大，产酶成本高。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供一种重组菌及其在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D中的应用，构建的重组菌可以共表达番茄来源的UDP-糖基转移酶UGTSL2和马铃薯来源的蔗糖合酶StSUS1，不需要分开表达和制备、也不需要调节两种酶之间的配比，应用于合成莱鲍迪甙D过程中直接使用重组菌破碎后的粗酶液，不需添加UDP或UDP-葡萄糖，以及细胞通透剂或其他化学试剂，简化了工艺过程，收率高。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一株重组菌，所述重组菌中同时含有番茄来源糖基转移酶UGTSL2基因和马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因，所述番茄来源糖基转移酶UGTSL2基因序列如SEQ.NO.1所示，其编码的番茄来源糖基转移酶UGTSL2的氨基酸序列如SEQ.NO.3所示，所述马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因序列如SEQ.NO.2所示，其编码的马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1氨基酸序列如SEQ.NO.4所示。将番茄来源糖基转移酶UGTSL2基因克隆到pRSFDuet-1的NdeI与XhoI位点之间，构建得到重组质粒pRSFDuet-SL2，然后再将马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因克隆到pRSFDuet-SL2的NcoI和EcoRI位点之间，构建得到重组质粒pRSFDuet-SL2-SUS1，将重组质粒pRSFDuet-SL2-SUS1转化到宿主细胞中，得到重组菌。所述的重组菌在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D中的应用。将重组菌诱导表达后取粗酶液，加入到反应混合物中催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D，所述反应混合物中包括莱鲍迪甙A、蔗糖和磷酸钠缓冲液。所述重组菌的诱导表达条件为：将重组菌接种到LB培养基中，于20~37℃、250rpm振荡培养8h，再将培养菌液按2%接种量接入诱导培养基中，于200rpm，20~37℃培养2h，待OD600达到0.2左右时转25℃诱导培养22h，离心收集菌体。所述反应混合物中莱鲍迪甙A浓度为4~10g/L，蔗糖浓度为30~50g/L，粗酶液浓度为2~10g/L，采用磷酸钠缓冲液调节pH为6.4~8；进一步地，优选莱鲍迪甙A浓度为10g/L，蔗糖浓度为30g/L，粗酶液浓度为8g/L，采用磷酸钠缓冲液调节pH为7.2。所述反应温度为20~55℃，反应时间为2~25h。所述LB培养基配方为0.5g/L酵母粉、0.5g/L氯化钠、1g/L胰蛋白胨、0.05g/L卡纳霉素。所述诱导培养基配方为25g/L酵母粉、15g/L胰蛋白胨、10g/L氯化钠、2g/L葡萄糖、0.05~0.2g/L乳糖。诱导培养基中优选乳糖浓度为0.1g/L。通过控制反应条件，在30℃，pH7.2，底物莱鲍迪甙A：蔗糖质量比1:3、酶浓度为8mg/mL、反应时间16h时，莱鲍迪甙D摩尔收率提高了1.7倍，达到86%。有益效果：本发明构建的共表达番茄来源UDP-糖基转移酶UGTSL2和马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1的重组菌作为生物催化剂，不需要分开表达和制备UDP-糖基转移酶与蔗糖合酶，也不需要调节两种酶之间的配比。重组菌可以在-20℃或-80℃保存，反应中使用重组菌破碎后的粗酶液，避免了酶的分离纯化，也无需制作冻干粉，简化了工艺过程。在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D过程中，反应液中不需添加UDP或UDP-葡萄糖，显著降低成本。反应液中不需添加任何细胞通透剂或其他化学试剂，环境友好性更佳。莱鲍迪甙D的产率高达10.8g/L。附图说明图1：蔗糖合酶StSUS1与糖基转移酶UGTSL2偶联反应示意图；图2：反应液样品HPLC检测结果图。具体实施方式以下实施例中，莱鲍迪甙D采用液相色谱检测，HPLC在安捷伦AgilentTechnologies1290Infinity液相色谱仪上进行，色谱分析条件如下：色谱柱：Agilent5TC-C18（Netheriands）250×4.6mm；流动相为0.1%甲酸：乙腈（70:30；V:V）；流速1min/mL；柱温55℃；检测波长：210nm。莱鲍迪甙D标准品购自上海源叶生物科技有限公司。实施例1重组菌株S1的构建番茄来源糖基转移酶UGTSL2的基因序列如SEQ.NO.1所示，马铃薯来源蔗糖合酶StSUS1基因序列如SEQ.NO.2所示，经密码子优化后由南京金斯瑞公司合成。设计引物GGGAATTCCATATGGCGACCAACCTGCG和CCGCTCGAGTTAGTGGTGATGATGGTGATGTTTG扩增UGTSL2基因，将该基因亚克隆到pRSFDuet-1（Novagen）的NdeI与XhoI位点之间，构建重组质粒pRSFDuet-SL2；设计引物TAATAAGGAGATATACCATGGCCGAACGTGTCCTGACCC和AGGCGCGCCGAGCTCGAATTCTTATTCAGCTGCCAGCG，用南京诺唯赞生物科技有限公司的一步克隆试剂盒（OneStepCloningKit，Vazyme）将StSUS1基因亚克隆到pRSFDuet-SL2的NcoI和EcoRI位点之间，构建重组质粒pRSFDuet-SL2-SUS1。以pRSFDuet-SL2-SUS1为模板，设计引物CATGCCATGGCCGAACGTGTC和CCGGAATTCTTATTCAGCTGCCAGCG，将StSUS1基因亚克隆到pET22b(+)（Novagen）的NcoI和EcoRI位点之间，构建重组质粒pET22b-SUS1。将pRSFDuet-SL2-SUS1和pET22b-SUS1转化到大肠杆菌BL21（DE3），获得重组菌BL21（pRSFDuet-SL2-SUS1，pET22b-SUS1），简称S1。分子克隆操作中TransFastTaqDNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司，T4DNA连接酶及限制性内酶均购自大连TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。转化步骤参考《分子克隆实验指南》（（美）J.萨姆布鲁克等著；黄培堂等译；科学出版社有限责任公司；第三版，上册，P91），根据质粒的抗性筛选转化子，再提质粒经酶切验证以确认阳性克隆。实施例2重组菌S2的构建以实施例1中构建的重组质粒pRSFDuet-SL2-SUS1为模板，设计引物AAGGAAAAAAGCGGCCGCTATGGCGACCAACCTGC和CCGGAATTCGTGGTGATGATGGTGATGTTTGCTC扩增UGTSL2基因，将其亚克隆到pET22b(+)（Novagen）的NotI与EcoRI位点之间，构建重组质粒pET22b-SL2。将pRSFDuet-SL2-SUS1和pET22b-SL2转化到大肠杆菌BL21（DE3），获得重组菌BL21（pRSFDuet-SL2-SUS1，pET22b-SL2），简称S2。实施例3重组菌S3的构建将实施例1中构建的pRSFDuet-SL2和pET22b-SUS1转化到大肠杆菌BL21（DE3），获得重组菌BL21（pRSFDuet-SL2，pET22b-SUS1），简称S3。实施例4重组菌S4的构建将实施例1中构建的pRSFDuet-SL2-SUS1转化到大肠杆菌BL21（DE3），获得重组菌BL21（pRSFDuet-SL2-SUS1），简称S4。实施例5诱导表达重组酶及粗酶液制备将重组菌S1~S4分别接种到含有0.05g/L卡纳霉素的5mLLB培养基（0.5g/L酵母粉，0.5g/L氯化钠，1g/L胰蛋白胨），于37℃、250rpm振荡培养8h，再将培养菌液按2%接种量接入含有100mL诱导培养基（25g/L酵母粉，15g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，2g/L葡萄糖，0.05g/L乳糖）的500mL摇瓶中，于200rpm，30℃培养2h，待OD600达到0.2左右时转25℃诱导22h离心收集菌体。超声破菌，离心取上清液为粗酶液，置于4℃冰箱待用。在50mL三角瓶中加入10mL的反应混合物，包含10g/L莱鲍迪甙A（购自曲阜海根甜菊制品有限公司）、50g/L蔗糖、50mM磷酸钠缓冲调节混合物的pH为7.2，然后分别加入3mg/mLS1~S4的粗酶液，反应在30℃、200rpm条件下进行，反应2-25h后取样于95℃加热5min灭活酶，离心取上清，采用高效液相色谱（HPLC）检测莱鲍迪甙浓度，结果见表1。表1：上述4株菌诱导表达后取粗酶液进行反应，以采用重组菌S4诱导表达后获取粗酶液反应的反应液中莱鲍迪甙D的产量最高，为4.71g/L。其次是采用菌株S2和S3粗酶的反应液，莱鲍迪甙D浓度为2.87和2.89g/L，而采用菌株S1粗酶的反应液中莱鲍迪甙D浓度最低（0.98g/L）。其原因可能是由于株菌S1—S3中都含有两个质粒，诱导表达时菌株负担大，目的蛋白大多以包含体形式存在，难以稳定控制两种重组酶的比例，使其偶联反应不能达到更高的产量。实施例6温度对重组菌S4的诱导表达的影响将重组菌S4接种到含有0.05g/L卡纳霉素的5mLLB培养基（0.5g/L酵母粉，0.5g/L氯化钠，1g/L胰蛋白胨），37℃条件下、250rpm振荡培养8h，再将培养菌液按2%接种量接入含有100mL诱导培养基（25g/L酵母粉，15g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，2g/L葡萄糖，0.05g/L乳糖）的500mL摇瓶中，于200rpm，分别在30℃条件下培养2h，待OD600达到0.2左右时，分别在20℃，25℃，30℃，37℃诱导22h离心收集菌体，超声破菌，离心取上清液为粗酶液，置于4℃冰箱待用。分别取不同诱导温度下获取的粗酶液，在温度30℃，pH7.2，莱鲍迪甙A10g/L，蔗糖30g/L，8mg/mL粗酶液的条件下进行反应，莱鲍迪甙D产量见表2。表2温度(℃)莱鲍迪甙D（g/L）209.76257.98305.90370.45在20℃条件下诱导产酶，其粗酶液合成莱鲍迪甙D产量最高，为9.76g/L。实施例7乳糖浓度对重组菌S4的诱导表达的影响将重组菌S4接种到含有0.05g/L卡纳霉素的5mLLB培养基（0.5g/L酵母粉，0.5g/L氯化钠，1g/L胰蛋白胨），37℃条件下、250rpm振荡培养8h，再将培养菌液按2%接种量接入含有不同乳糖浓度的100mL诱导培养基（25g/L酵母粉，15g/L胰蛋白胨，10g/L氯化钠，2g/L葡萄糖，分别为0.02g/L、0.05g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L的乳糖浓度）的500mL摇瓶中，于200rpm，分别在30℃条件下培养2h，待OD600达到0.2左右时，分别在20℃诱导22h离心收集菌体，超声破菌，离心取上清液为粗酶液，置于4℃冰箱待用。分别取不同乳糖浓度诱导下获取的粗酶液，在温度30℃，pH7.2，莱鲍迪甙A10g/L，蔗糖30g/L，8mg/mL粗酶液的条件下进行反应，莱鲍迪甙D产量见表3。表3乳糖浓度（g/L）莱鲍迪甙D（g/L）0.0210.070.058.00.110.780.1510.230.210.12由实施例6和7可以得到重组菌S4的最佳诱导条件为：诱导温度20℃，诱导剂乳糖浓度为0.1g/L。实施例8采用重组菌S4诱导表达后获取的粗酶液进行反应，在50mL三角瓶中，10mL反应混合物中包含10g/L莱鲍迪甙A，50g/L蔗糖，pH7.2的50mM磷酸钠缓冲，3mg/mL粗酶液，反应在30℃和200rpm条件下进行。加入粗酶液启动反应，分别在反应0、2、7、14和25h后取样于95℃加热5min灭活酶，离心取上清，测得不同时间反应液中莱鲍迪甙D的含量，结果见表4。表4时间（h）莱鲍迪甙D(g/L)00.1320.9873.37145.69256.1在25h反应液中莱鲍迪甙D产量最高，这时反应液中莱鲍迪甙D的浓度为6.1g/L。但14h已经达到了5.69g/L，可见14h后，反应进行缓慢，产物积累很少。实施例9采用重组菌S4诱导表达后获取的粗酶液进行反应。在50mL三角瓶中，10mL反应混合物中包含10g/L莱鲍迪甙A，50g/L蔗糖，pH7.2的50mM磷酸钠缓冲，3mg/mL粗酶液，反应分别在20、30、37、45、55℃和200rpm条件下进行。加入粗酶液启动反应，反应14h后取样于95℃加热5min灭活酶，离心取上清，测得不同反应温度下反应液中莱鲍迪甙D的含量，结果见表5。表5温度(℃)莱鲍迪甙D(g/L)202.75303.82373.56451.01550.24可见在30℃条件下反应液中莱鲍迪甙D产量最高，这时反应液中莱鲍迪甙D的浓度为3.82g/L。实施例10采用重组菌S4诱导表达后获取的粗酶液进行反应。在50mL三角瓶中，10mL反应混合物中包含10g/L莱鲍迪甙A，50g/L蔗糖，3mg/mL粗酶液，50mM磷酸钠缓冲pH分别配置为6.4、6.8、7.2、7.6和8，反应在30℃、200rpm条件下进行。加入粗酶液启动反应，反应14h后取样于95℃加热5min灭活酶，离心取上清，测得不同反应pH下反应液中莱鲍迪甙D的含量，结果见表6。表6pH莱鲍迪甙D（g/L）6.42.836.85.557.25.837.63.658.03.31测得在pH7.2条件下反应液中莱鲍迪甙D产量最高，这时反应液中莱鲍迪甙D的浓度为5.83g/L。实施例11采用重组菌S4诱导表达后获取的粗酶液进行反应。在50mL三角瓶中，10mL反应混合物中包含10g/L莱鲍迪甙A，质量比分别为1：1、1：3、1：5、1：7和1：10的蔗糖，pH7.2的50mM磷酸钠缓冲，3mg/mL粗酶液，反应在30℃、200rpm条件下进行。加入粗酶液启动反应，反应14h后取样于95℃加热5min灭活酶，离心取上清，测得不同底物浓度配比下反应液中莱鲍迪甙D的含量，结果见表7。表7莱鲍迪甙A:蔗糖莱鲍迪甙D(g/L)1:13.601:34.071:53.821:73.381:103.50当莱鲍迪甙A与蔗糖的质量比为1：3时反应液中莱鲍迪甙D产量最高，为4.07g/L。实施例12采用重组菌S4诱导表达后获取的粗酶液进行反应。在50mL三角瓶中，10mL反应混合物中包含10g/L莱鲍迪甙A，50g/L蔗糖，pH7.2的50mM磷酸钠缓冲，粗酶液蛋白浓度分别为2、4、6、8和10mg/mL，反应在30℃、200rpm条件下进行。加入粗酶液启动反应，反应14h后取样于95℃加热5min灭活酶，离心取上清，测得不同粗酶液浓度下反应液中莱鲍迪甙D的含量，结果见表8。表8酶浓度（g/L）莱鲍迪甙D（g/L）21.454364.9388.2108.2当粗酶液蛋白浓度为8和10mg/mL时反应液中莱鲍迪甙D产量最高，为8.2g/L。由实施例8-12可知，最佳反应条件为：采用重组菌S4诱导表达后获取的粗酶液进行反应。在50mL三角瓶中，10mL反应混合物中包含10g/L莱鲍迪甙A，30g/L蔗糖，pH7.2的50mM磷酸钠缓冲，粗酶液蛋白浓度8mg/mL，反应在30℃、200rpm条件下进行。加入粗酶液启动反应，反应16h后取样于95℃加热5min灭活酶，离心取上清，反应液中莱鲍迪甙D产量最高，为10.8g/L，产率为86%。SEQUENCELISTING<110>南京工业大学<120>一株重组菌及其在催化莱鲍迪甙A生成莱鲍迪甙D中的应用<130><160>12<170>PatentInversion3.3<210>1<211>1329<212>DNA<213>人工序列<400>1atggcgaccaacctgcgtgtgctgatgttcccgtggctggcgtacggtcacatcagcccg60tttctgaacattgcgaaacagctggcggatcgtggcttcctgatctacctgtgcagcacc120cgtattaacctggagagcatcattaagaaaatcccggaaaagtatgcggacagcatccac180ctgattgagctgcaactgccggagctgccggaactgccgccgcactatcacaccaccaac240ggtctgccgccgcacctgaacccgaccctgcacaaggcgctgaaaatgagcaagccgaac300tttagccgtatcctgcagaacctgaaaccggatctgctgatttacgacgtgctgcagccg360tgggcggagcacgttgcgaacgaacaaaacattccggcgggtaaactgctgaccagctgc420gcggcggtgttcagctatttctttagctttcgtaagaacccgggcgttgagttcccgttt480ccggcgatccacctgccggaagtggaaaaggttaaaatccgtgagattctggcgaaagaa540ccggaggaaggtggccgtctggatgagggtaacaagcagatgatgctgatgtgcaccagc600cgtaccatcgaggcgaaatacattgactattgcaccgaactgtgcaactggaaggtggtt660ccggtgggtccgccgttccaagatctgatcaccaacgatgcggacaacaaagagctgatt720gactggctgggtaccaagcacgaaaacagcaccgtgttcgttagctttggcagcgagtac780ttcctgagcaaagaagatatggaggaagttgcgtttgcgctggagctgagcaacgtgaac840ttcatctgggttgcgcgttttccgaaaggcgaggaacgtaacctggaagatgcgctgccg900aagggcttcctggagcgtattggtgaacgtggccgtgtgctggacaagtttgcgccgcag960ccgcgtatcctgaaccacccgagcaccggtggcttcattagccactgcggttggaacagc1020gcgatggagagcatcgattttggcgttccgatcattgcgatgccgatccacaacgaccaa1080ccgattaacgcgaaactgatggtggagctgggtgtggcggttgaaatcgttcgtgacgat1140gacggtaaaatccaccgtggcgagattgcggaaaccctgaagagcgtggttaccggcgag1200accggcgaaattctgcgtgcgaaagtgcgtgaaatcagcaaaaacctgaagagcattcgt1260gatgaggaaatggacgcggttgcggaggaactgatccaactgtgccgtaacagcaacaag1320agcaaataa1329<210>2<211>2418<212>DNA<213>人工序列<400>2atggccgaacgtgtcctgacccgtgtccatagtctgcgtgaacgtgttgatgctaccctg60gctgcccaccgtaatgaaatcctgctgtttctgagtcgtattgaaagccacggcaaaggt120atcctgaaaccgcacgaactgctggcagaatttgatgctattcgccaggatgacaaaaac180aaactgaacgaacatgcattcgaagaactgctgaaaagcacccaagaagctatcgtcctg240ccgccgtgggtggcactggcaattcgtctgcgcccgggcgtttgggaatacatccgtgtt300aacgtcaatgcgctggttgtggaagaactgagtgtgccggaatatctgcagtttaaagaa360gaactggtcgatggcgcgtccaacggtaatttcgtgctggaactggactttgaaccgttc420accgcctcatttccgaaaccgaccctgacgaaatcgattggcaacggtgttgaatttctg480aatcgtcatctgagcgccaaaatgttccacgataaagaatctatgaccccgctgctggaa540tttctgcgcgcacatcactataaaggtaaaaccatgatgctgaacgatcgtattcagaac600agcaatacgctgcaaaatgtgctgcgcaaagcggaagaatacctgatcatgctgccgccg660gaaaccccgtacttcgaatttgaacataaattccaggaaattggcctggaaaaaggctgg720ggtgatacggcagaacgtgtgctggaaatggtttgcatgctgctggatctgctggaagct780ccggacagctgtaccctggaaaaatttctgggtcgcattccgatggttttcaacgtcgtg840atcctgtctccgcacggctattttgcgcaggaa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