高纯度的甜菊醇糖苷的制作方法
【专利摘要】描述了制备高度纯化的甜菊醇糖苷，特别地莱鲍迪苷A、D和X的方法。所述方法包括表达来自甜叶菊的UDP-葡萄糖基转移酶，所述酶能够将某些甜菊醇糖苷转化成莱鲍迪苷A、D和X。高度纯化的莱鲍迪苷A、D和X在可食用和可咀嚼组合物例如任何饮料、糕饼、焙烤食品、饼干和口香糖中可用作无热量甜味剂。
【专利说明】高纯度的甜菊醇糖苷
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于制备包含甜菊醇糖苷(steviol glycoside)的组合物,包括高度纯化的甜菊醇糖苷组合物的生物催化法。
[0002]通过引用并入序列表
[0003]将2013年3月12日创建的、具有5KB(千字节)的数据并且与本文同时提交的、标题为〃PureCircle_22PCT_ST25.txt〃的文本文件通过引用整体并入本申请。
[0004]发明背景
[0005]高强度甜味剂具有比蔗糖甜味水平高许多倍的甜味水平。它们基本上是无热量的并且通常用于饮食和低卡路里产品，包括食品和饮料。高强度甜味剂不引发升糖反应，从而使得它们适合用于针对糖尿病患者的产品和目的在于控制碳水化合物摄入的其它产品。
[0006]甜菊醇糖苷是一类在甜叶菊(stevia rebaudiana Bertoni)(原产于南美某些地区的菊科(Asteraceae(Compositae))的多年生灌木)叶中发现的化合物。它们的结构特征在于单个碱，甜菊醇，差异在于位置C13和C19上碳水化合物残基的存在。它们在甜菊属(Stevia)叶中积累，构成约10%_20%的总干重。基于干重，在甜菊属叶中发现的4种主要糖苷通常包括甜菊苷(stevioside) (9.1%)、莱鲍迪苷A (3.8%)、莱鲍迪苷C (0.6-1.0%)和杜尔可苷A(dulcoside A) (0.3%)。其它已知的甜菊醇糖苷包括莱鲍迪苷(rebaudioside) B、C、0^、？和父,甜菊双苷(steviolbioside)和甜叶悬钩子苷(rubusoside)。
[0007]虽然已知用于从甜叶菊制备甜菊醇糖苷的方法，但这些方法大多不适合于商业使用。
[0008]因此，仍然存在对用于制备包含甜菊醇糖苷的组合物(包括高度纯化的甜菊醇糖苷组合物)的简单、高效且经济的方法的需要。
[0009]发明概述
[0010]本发明提供了通过下述来制备包含靶甜菊醇糖苷的组合物的生物催化法:将包含甜菊醇糖苷底物的起始组合物与UDP-葡萄糖基转移酶接触，从而产生包含靶甜菊醇糖苷的组合物，所述靶甜菊醇糖苷与甜菊醇糖苷底物相比，包含一个或多个额外的葡萄糖单位。
[0011]起始组合物可以是包含至少一种甜菊醇糖苷底物的任何组合物。在一个实施方案中，甜菊醇糖苷底物选自甜菊单苷(steviolmonoside)、甜菊双苷、甜叶悬钩子苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷1、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷X、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O、合成的甜菊醇糖苷或其组合。起始组合物可以是商购获得的或制备的。起始组合物可包含纯化的甜菊醇糖苷底物或部分纯化的甜菊醇糖苷底物。
[0012]在一个实施方案中，甜菊醇糖苷底物是甜叶悬钩子苷。
[0013]在另一个实施方案中，甜菊醇糖苷底物是甜菊苷。
[0014]在另一个实施方案中，甜菊醇糖苷底物是莱鲍迪苷A。
[0015]在另一个实施方案中，甜菊醇糖苷底物是莱鲍迪苷D。
[0016]靶甜菊醇糖苷可以是任何已知的甜菊醇糖苷。在一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是甜菊单苷、甜菊双苷、甜叶悬钩子苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷1、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷X、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O或合成的甜菊醇糖苷。
[0017]在一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是甜菊苷。
[0018]在另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷A。
[0019]在另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷D。
[0020]在另一个实施方案中，靶甜菊醇糖苷是莱鲍迪苷X。
[0021]UDP-葡萄糖基转移酶可以是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜菊醇糖苷底物以提供靶甜菊醇糖苷的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在一个实施方案中，在宿主中产生UDP-葡萄糖基转移酶。宿主可以是例如大肠杆菌(E.coli)、酵母菌属的种(Saccharomycessp.)、曲霉菌属的种(Aspergillus sp.)、毕赤酵母属的种(Pichia sp.)。在另一个实施方案中，合成Μ)Ρ-葡萄糖基转移酶。
[0022]可以以任何适当形式(包括游离的、固定的形式或作为完整细胞系统)提供UDP-葡萄糖基转移酶。UDP-葡萄糖基转移酶的纯度可发生变化，例如，其可以提供为粗制的、半纯化的或纯化的酶制剂。
[0023]在一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是游离的。在另一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是固定的，例如固定在无机或有机支持物上。在另一个实施方案中，以完整细胞系统的形式(例如作为活微生物细胞)或以细胞裂解物的形式提供UDP-葡萄糖基转移酶。
[0024]在一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜叶悬钩子苷以形成甜菊苷的任何m)P-葡萄糖基转移酶。在特定实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2。
[0025]在一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至甜菊苷以形成莱鲍迪苷A的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。
[0026]在另一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至莱鲍迪苷A以形成莱鲍迪苷D的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2。
[0027]在另一个实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是能够将至少一个葡萄糖单位添加至莱鲍迪苷D以形成莱鲍迪苷X的任何UDP-葡萄糖基转移酶。在特定实施方案中，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。
[0028]任选地，本发明的方法还包括再循环UDP以产生UDP-葡萄糖。在一个实施方案中，所述方法包括，通过提供再循环催化剂和再循环底物来再循环UDP，从而可使用催化量的UDP-葡萄糖基转移酶和UDP-葡萄糖进行甜菊醇糖苷底物至靶甜菊醇糖苷的生物转化(图 3)。
[0029]在一个实施方案中，再循环催化剂是蔗糖合酶。
[0030]在一个实施方案中，再循环底物是蔗糖。
[0031]任选地，本发明的方法还包括，将靶甜菊醇糖苷与起始组合物分离。可通过任何适当的方法例如结晶、通过膜的分离、离心、提取、色谱分离或这类方法的组合来分离靶甜菊醇糖苷。
[0032]在一个实施方案中，分离产生包含按干重计超过约80%的靶甜菊醇糖苷的组合物，即高度纯化的甜菊醇糖苷组合物。在另一个实施方案中，分离产生包含按重量计超过90%的靶甜菊醇糖苷的组合物。在特定实施方案中，组合物包含按重量计超过约95%的靶甜菊醇糖苷。
[0033]靶甜菊醇糖苷可以以任何多态形式或无定形形式(包括水合物、溶剂化物、无水形式或其组合)存在。
[0034]纯化的靶甜菊醇糖苷可用作甜味剂用于可消费产品。适当的可消费产品包括但不限于食品、饮料、药物组合物、烟制品、营养制品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物。
[0035]附图概述
[0036]附图用于提供对本发明的进一步理解。附图举例说明本发明的实施方案并且与说明书一起用于解释本发明的实施方案的原理。
[0037]图1显示reb X的结构。
[0038]图2显示从甜菊苷生物催化产生reb X。
[0039]图3显示使用酶UGT76G1从甜菊苷生物催化产生reb A，以及通过蔗糖合酶进行UDP至UDP-葡萄糖的伴随再循环。
[0040]图4显示reb X的IR谱。
[0041]图5显示从reb D生物催化产生reb X的产物的HPLC色谱，如实施例14中描述的。保留时间为24.165分钟的峰对应于未反应的reb D。保留时间为31.325分钟的峰对应于reb X0
[0042]图6显示通过生物催化从reb D产生的纯化的reb X的HPLC色谱。
[0043]图7显示reb X标准品的HPLC色谱。
[0044]图8显示reb X标准品与从reb D的生物转化纯化的reb X的共注射的HPLC色
-1'TfeP曰。
[0045]图9显示reb X标准品和在reb D的生物转化后纯化的reb X的IHNMR谱的叠加。
[0046]图10显示从reb D生物催化产生后纯化的reb X的HRMS谱。
[0047]详细说明
[0048]本发明提供了，从包含甜菊醇糖苷底物的起始组合物制备包含靶甜菊醇糖苷的组合物的生物催化方法，其中与甜菊醇糖苷底物相比，靶甜菊醇糖苷包含一个或多个额外的葡萄糖单位。
[0049]本发明的一个目的是，提供从其它甜菊醇糖苷和/或其混合物制备甜菊醇糖苷，特别地甜菊苷、reb A、reb D和reb X的高效生物催化方法。
[0050]如本文中所用，〃生物催化〃或〃生物催化的〃是指，使用天然催化剂例如酶蛋白质来对有机化合物进行化学转化。生物催化也可称为生物转化或生物合成。分离的生物催化法和完整细胞生物催化法都是本领域已知的。生物催化剂酶蛋白可以是天然存在的或重组产生的蛋白质。
[0051]如本文中所用，术语"甜菊醇糖苷"是指甜菊醇的糖苷，包括但不限于天然存在的甜菊醇糖苷，例如甜菊单苷、甜菊双苷、甜叶悬钩子苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷1、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷
H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷X、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O，合成的甜菊醇糖苷，例如酶促葡糖基化(glucosylated)的甜菊醇糖苷及其组合。
[0052]甜菊醇及其糖苷的化学结构
[0053]
【权利要求】
1.一种用于产生高度纯化的靶甜菊醇糖苷的方法，包括步骤: a.提供包含底物甜菊醇糖苷的起始组合物； b.提供UDP-葡萄糖基转移酶； c.任选地提供能够进行UDP-葡萄糖过量产生和再循环的生物催化剂以及用于所述再循环的底物； d.将UDP-葡萄糖基转移酶与包含起始组合物的介质接触，以产生包含靶甜菊醇糖苷的组合物，所述靶甜菊醇糖苷与底物甜菊醇糖苷相比，包含一个或多个额外的葡萄糖单位；和 e.将靶甜菊醇糖苷与介质分离，以提供高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物。
2.权利要求1的方法，其中所述底物甜菊醇糖苷选自甜菊单苷、甜菊双苷、甜叶悬钩子苷、杜尔可苷B、杜尔可苷A、莱鲍迪苷B、莱鲍迪苷G、甜菊苷、莱鲍迪苷C、莱鲍迪苷F、莱鲍迪苷A、莱鲍迪苷1、莱鲍迪苷E、莱鲍迪苷H、莱鲍迪苷L、莱鲍迪苷K、莱鲍迪苷J、莱鲍迪苷X、莱鲍迪苷D、莱鲍迪苷N、莱鲍迪苷O、合成的甜菊醇糖苷及其组合。
3.权利要求1的方法，其中UDP-葡萄糖基转移酶是能够催化甜叶悬钩子苷至甜菊苷、甜菊苷至reb A、reb A至reb D和/或reb D至rebX的葡萄糖基化的UDP-葡萄糖基转移酶。
4.权利要求1的方法，其中当底物甜菊醇糖苷是甜叶悬钩子苷并且靶甜菊醇糖苷是甜菊苷时，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2，当底物甜菊醇糖苷是甜菊苷并且靶甜菊醇糖苷是reb A时，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1，当底物甜菊醇糖苷是reb A并且靶甜菊醇糖苷是reb D时，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT91D2，或当底物甜菊醇糖苷是reb D并且靶甜菊醇糖苷是reb X时，UDP-葡萄糖基转移酶是UGT76G1。
5.权利要求1的方法，其中在微生物中表达m)P-葡萄糖基转移酶，所述微生物选自大肠杆菌、酵母菌属的种、曲霉菌属的种、毕赤酵母属的种或适合用于容纳UDP-葡萄糖基转移酶基因及其随后的表达的另一种适当的微生物。
6.权利要求1的方法，其中在步骤(c)中，在微生物中表达生物催化剂，所述微生物选自大肠杆菌、酵母菌属的种、曲霉菌属的种、毕赤酵母属的种或适合于UDP-葡萄糖再循环酶基因及它们的随后表达和起作用的另一种微生物。
7.权利要求1的方法，其中将步骤(b)中的UDP-葡萄糖基转移酶和任选地步骤(c)中的生物催化剂包含在相同的微生物细胞中。
8.权利要求1的方法，其中将步骤(b)中的UDP-葡萄糖基转移酶和/或步骤(c)中的生物催化剂以游离或固定形式的粗制的、半纯化的和纯化的酶制剂、活微生物细胞、完整的微生物细胞、细胞裂解物和/或本领域已知的生物催化剂的任何其它形式使用。
9.权利要求1的方法 ，其中祀甜菊醇糖苷选自甜菊苷、rebA、reb D、reb X及其混合物。
10.权利要求1的方法，其中使用结晶、通过膜的分离、离心、提取、色谱分离或所述方法的组合来将靶甜菊醇糖苷与反应介质分离。
11.权利要求1的方法，其中所述底物甜菊醇糖苷是甜叶悬钩子苷并且靶甜菊醇糖苷是甜菊苷。
12.权利要求1的方法，其中所述底物甜菊醇糖苷是甜菊苷并且靶甜菊醇糖苷是rebA0
13.权利要求1的方法，其中所述底物起始甜菊醇糖苷是rebA并且靶甜菊醇糖苷是reb D0
14.权利要求1的方法，其中所述底物甜菊醇糖苷是rebD并且靶甜菊醇糖苷是reb X。
15.权利要求1的方法，其中重复步骤(a)-(e)。
16.权利要求15的方法，其中重复步骤(a)-(e)一次。
17.权利要求15的方法，其中重复步骤(a)-(e)二次。
18.权利要求1的方法，其中靶甜菊醇糖苷含量按干重计大于约95%。
19.权利要求18的方法,其中祀甜菊醇糖苷选自甜菊苷、rebA、reb D和reb X。
20.权利要求18的方法，其中靶甜菊醇糖苷是rebX。
21.根据权利要求1的方法制备的高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物，其中靶甜菊醇糖苷含量按干重计大于约95%。
22.权利要求21的高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物，其中靶甜菊醇糖苷选自rebD和reb X。
23.一种按照权利要求1的方法制备的高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物，其中靶甜菊醇糖苷是多态的。
24.权利要求23的高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物，其中靶甜菊醇糖苷是rebD或rebX。
25.一种包含权利要求1的高度纯化的靶糖苷组合物的可消费产品，其中所述产品选自食品、饮料、药物组合物、烟制品、营养制品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物。
26.一种包含权利要求1的高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物的可消费产品，其中所述产品选自食品、饮料、药物组合物、烟制品、营养制品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物，并且其中靶甜菊醇糖苷是reb D0 26.一种包含权利要求1的高度纯化的靶甜菊醇糖苷组合物的可消费产品，其中所述产品选自食品、饮料、药物组合物、烟制品、营养制品组合物、口腔卫生组合物和化妆品组合物，并且其中靶甜菊醇糖苷是reb X。
【文档编号】A23L1/236GK103974628SQ201380002119
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年3月12日 优先权日:2012年5月22日
【发明者】阿韦季克·马尔科相, 因德拉·普拉卡什, 文卡塔·赛·普拉卡什·查图维杜拉, C·哈林, P·罗布, R·泰阿莱 申请人:谱赛科有限责任公司, 可口可乐公司, 阿韦季克·马尔科相, 因德拉·普拉卡什