一种多环芳烃降解基因工程菌株、其构建方法及应用与流程

本发明涉及一种多环芳烃降解基因工程菌株、其构建方法及应用。

背景技术：

近年来，由雨水径流导致的城市面源污染受到越发广泛的关注。为了降低径流中污染物对城市水体的危害，国内外普遍采用建设雨水花园的方式对雨水径流进行收集与净化。但长期运行过程中，某些难降解污染物会在雨水花园内部出现富集现象，加重其内部及周边区域的生态风险。在这类污染物中，多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，简称PAHs)因为具有强烈的致畸、致癌、致突变效应，更受到了重点关注。

目前，未见针对雨水花园土壤中PAHs污染修复的系统研究，而传统修复方法普遍通过接种分离自异位原油污染场地得外源PAHs降解菌开展。这些菌株虽然有着良好的PAHs降解能力，但能否在理化性质及污染特征均有较大差异的雨水花园土壤中形成优势并发挥作用有待验证。在原油污染的土壤中，PAHs的浓度会达到较高的水平，足以通过生物抑制作用保证有降解能力的生物形成生长优势。而雨水花园中累积的PAHs浓度要比原油污染土壤低3-5个数量级，由于大量可同化有机物的存在，直接影响到PAHs特异性降解生物对于PAHs的优先利用；同时PAHs对其他微生物的抑制作用减小，使得特异性降解生物难以形成生长优势，从而降低了生物修复作用效率。

技术实现要素：

本发明目的在于针对现有雨水花园中PAHs生物修复技术的不足，提供一种多环芳烃降解基因工程菌株、其构建方法及应用。

一种多环芳烃降解基因工程菌株，该菌株Pseudomonas putida GLEB3已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2016年09月19日，保藏编号：CGMCCNo.13014，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

一种构建所述的多环芳烃降解基因工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

1)土著优势菌株的筛选与培养

采集接纳道路雨水径流的实地雨水花园土壤，提取总DNA进行高通量测序，分析微生物群落，辨识优势菌属；同时筛选、培养得到土壤样品中菌落丰度较高的纯种菌株，并通过形态学观察、理化特性研究、抗生素抗性试验及16S rRNA序列同源性分析进行鉴定并确立其系统发育地位；对比群落分析辨识出的优势菌属，挑选出对应的纯种菌株作为雨水花园的土著优势菌株；

2)重组质粒pUT-RHDGfp的构建

分别以Mycobacterium vanbaalenii PYR-1菌的基因组DNA及pGFPuv(购自Clontech公司，日本)质粒为模板，扩增环羟化双加氧酶编码基因序列基因RHD与荧光蛋白编码基因Gfp；随后采用重叠PCR的方式将RHD基因与荧光蛋白编码基因Gfp进行融合，得到RHDGfp基因；切胶回收后PCR产物并进行纯化，采用Not I酶进行酶切，同时切割质粒pUT-mini Tn5(Km)；连接酶切产物，得到重组质粒pUT-RHDGfp；

3)基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的构建

采用三亲结合的方式将融合基因RHDGfp的重组至Pseudomonas putida GLB3染色体，操作所需菌株如下：受体菌(Pseudomonas putida GLB3)、辅助菌(E.coli DH5α(pRK2073))、供体菌(E.coli DH5α(pUT-RHDGfp))；培养至菌落可见后，通过菌落PCR及阳性克隆扩大培养后的质粒酶切进行鉴定，筛选构建成功的基因工程菌株。

进一步地：

步骤3)中各菌株混合比例为1:2:1，混合体系采用10mM MgSO4溶液，所用平板培养基应为含有卡那霉素25mg/L及氯霉素25mg/L的LB平板培养基。

各步骤应用的引物序列如下：

一种将所述的多环芳烃降解基因工程菌株用于雨水花园土壤中PAHs污染修复的应用。

一种将所述的多环芳烃降解基因工程菌株的构建方法用于雨水花园土壤中PAHs污染修复的应用。

进一步地，从原位雨水花园中采集土样，加入PAHs二氯甲烷溶液，最终浓度10.00mg/kg，自然风干，粉碎，混匀；按照质量比5％加入所述基因工程菌株菌剂，混合均匀，每7天翻土一次，维持土壤含水量20-50wt％，并检测PAHs含量。

进一步地，所述基因工程菌株用于接纳道路雨水径流的雨水花园土壤中多环芳烃的降解，且具有荧光指示降解过程的功能。

一种针对所述的应用的修复效果检验方法，包括以下步骤：

取基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3接种于LB固体培养基上，28℃培养24h，将长出的单菌落转接到含有卡那霉素100μg/ml的LB液体培养基内，28℃，120rpm摇床培养至OD₆₀₀值为1；将所得菌液按照体积比5％的比例转接到LB肉汤培养基，28℃，180rpm培养16h，得到Pseudomonas putida GLEB3的发酵菌液。将其与灭菌的秸秆生物炭按1：2(V：W)混匀后风干，制成固体菌剂；

从原位雨水花园中采集土样，加入PAHs二氯甲烷溶液，最终浓度10.00mg/kg，自然风干，粉碎，混匀。按照质量比5％加入生物修复固体菌剂，混合均匀，每7天翻土一次，维持土壤含水量20-40wt％，同时检测PAHs含量，评价基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的修复效果。

本发明的有益技术效果有：

本发明在原位解析雨水花园中PAHs污染特征及微生物群落结构的基础上，以其中筛选出的土著优势菌种Pseudomonas putida GLB3为受体菌(GenBank accession No.KT804567)，利用外源环羟化双加氧酶编码基因(片段来源Mycobacterium vanbaalenii PYR-1，GenBank accession No.CP000511)构建重组载体，并重组至受体菌基因组，提升原有土著优势菌种的PAHs降解能力，解决外源PAHs降解菌在雨水花园土壤中无法形成优势种群而难以发挥降解作用的问题。

附图说明

图1是雨水花园与不接纳雨水径流的对照组土壤中相对丰度处于前十位的原核微生物菌属分布图。

图2是本发明实施例雨水花园中土壤中所筛选出优势菌株的基于16S rRNA基因序列的系统发育树。

图3是本发明实施例电泳照片，以RHD-f1和RHD-r1为引物扩增RHD片段，扩增产物大小2010bp；以Gfp-f2和Gfp-r2为引物扩增Gfp片段，扩增产物大小743bp；以RHD-f1和Gfp-r2通过重叠PCR扩增RHDGfp片段，扩增产物大小2719bp。

图4是本发明实施例电泳照片，以RHD-f1和Gfp-r2进行PCR鉴定RHDGfp片段，扩增产物大小2719bp。

图5是本发明实施例电泳照片，以Not I酶切pUT-RHDGfp载体，酶切产物大小为7.1kb与2.7kb。

图6是本发明实施例电泳照片，以RHD-f1和Gfp-r2进行菌落PCR鉴定三亲结合重组菌获得的RHDGfp片段，扩增产物大小2719bp。

图7是本发明实施例电泳照片，以RHD-f1和Gfp-r2进行PCR鉴定重组菌基因组中的RHDGfp片段，扩增产物大小2719bp。

图8是本发明实施例基因工程菌Pseudomonas putida GLEB3对芘的降解能力及降解过程中RHDGfp片段的表达量及荧光强度变化图。

图9是对比基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3与供体菌株Mycobacterium vanbaalenii PYR-1对雨水花园土壤中PAHs的降解效率，表示出采用不同菌株进行生物强化修复过程中土壤样品中芘含量的变化。

具体实施方式

本发明实施例提供一株基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3(保藏号CGMCCNo.13014)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期是2016年09月19日，保藏编号：CGMCCNo.13014保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明实施例的基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的构建及效果验证方法，如下：

1、土著优势菌株的筛选与培养

采集接纳道路雨水径流的实地雨水花园土壤，提取总DNA进行高通量测序，分析微生物群落，辨识优势菌属；同时筛选、培养得到土壤样品中菌落丰度较高的纯种菌株，并通过形态学观察、理化特性研究、抗生素抗性试验及16S rRNA序列同源性分析进行鉴定并确立其系统发育地位。对比群落分析辨识出的优势菌属，挑选出对应的纯种菌株作为雨水花园的土著优势菌株。

2、重组质粒pUT-RHDGfp的构建

分别以Mycobacterium vanbaalenii PYR-1菌的基因组DNA及pGFPuv(购自Clontech公司，日本)质粒为模板，扩增环羟化双加氧酶编码基因序列基因RHD与荧光蛋白编码基因Gfp。随后采用重叠PCR的方式将RHD基因与荧光蛋白编码基因Gfp进行融合，得到RHDGfp基因。切胶回收后PCR产物并进行纯化，采用Not I酶进行酶切，同时切割质粒pUT-mini Tn5(Km)。连接酶切产物，得到重组质粒pUT-RHDGfp。

3、基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的构建

采用三亲结合的方式将融合基因RHDGfp的重组至Pseudomonas putida GLB3染色体，操作所需菌株如下：受体菌(Pseudomonas putida GLB3)、辅助菌(E.coli DH5α(pRK2073))、供体菌(E.coli DH5α(pUT-RHDGfp))。各菌株混合比例为1:2:1，混合体系采用10mM MgSO₄溶液，所用平板培养基应为含有卡那霉素(25mg/L)及氯霉素(25mg/L)的LB平板培养基。培养至菌落可见后，通过菌落PCR及阳性克隆扩大培养后的质粒酶切进行鉴定，筛选构建成功的基因工程菌株。

将筛选所得菌株接种至含有芘的无机盐培养基，30℃，120rpm振荡培养，每隔2小时取1ml菌悬液测定芘的浓度；采用引物RHD-fq与RHD-rq对RHDGfp基因的表达量进行定量；同时采用酶标仪测定荧光强度(激发波长395nm，发射波长509nm，狭缝宽度5nm)。

4、基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的应用效果验证

取基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3接种于LB固体培养基上，28℃培养24h，将长出的单菌落转接到含有卡那霉素(100μg/ml)的LB液体培养基内，28℃，120rpm摇床培养至OD₆₀₀值为1。将所得菌液按照体积比5％的比例转接到LB肉汤培养基，28℃，180rpm培养16h，得到Pseudomonas putida GLEB3的发酵菌液。将其与灭菌的秸秆生物炭按1：2(V：W)混匀后风干，制成固体菌剂。

从原位雨水花园中采集土样，加入PAHs二氯甲烷溶液(最终浓度10.00mg/kg)，自然风干，粉碎，混匀。按照质量比5％加入生物修复固体菌剂，混合均匀，每7天翻土一次，维持土壤含水量20-40wt％，同时检测PAHs含量，评价基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的修复效果。

上述各步骤中所用引物名称、序列及作用如下：

实施例1：土著优势菌株的筛选与培养

采集实地雨水花园与不接纳道路雨水径流的对照组土壤，提取总DNA进行高通量测序，根据各菌属的相对丰度高低辨别出雨水花园土壤中前十位的优势菌属(图1：生物滞留池与对照组土壤中相对丰度最高的十种原核微生物菌属分布)；同时筛选、培养得到土壤样品中菌落丰度较高的纯种菌株，通过16S rRNA序列同源性分析确立其系统发育地位。筛选出属于优势菌属的纯菌株作为受体菌。本实施例中选用一株恶臭假单胞菌菌株Pseudomonas putida GLB3为受体菌(GenBank accession No.KT804567)(图2：基于16S rRNA基因序列的菌株GLB3的系统发育树)。但本发明并不局限于此，图一种所列出的其他菌属下的菌株均可作为受体菌。

实施例2：重组质粒pUT-RHDGfp的构建

以Mycobacterium vanbaalenii PYR-1菌的基因组DNA为模板，使用引物以RHD-f1和RHD-r1为引物扩增去除了RHD基因编码的铁硫蛋白β亚基终止子并连接有Gfp基因5’端17个碱基的序列，扩增产物大小2010bp；以pGFPuv(购自Clontech公司，日本)质粒为模板，使用引物Gfp-f2和Gfp-r2扩增去除了Gfp基因编码的绿色荧光蛋白的启动子并连接有RHD基因3’端17个碱基的序列，扩增产物大小743bp；以RHD-f1和Gfp-r2作引物，上述两条扩增片段作为模板，进行扩增得到重叠目的片段—RHDGfp融合基因，扩增产物大小2719bp(图3：重叠PCR扩增RHDGfp基因，其中M：5000bp DNA Marker，1：RHD基因片段，2：RHDGfp基因片段，3：Gfp基因片段)。RHD基因与Gfp基因的PCR反应体系(50μl)：模板DNA1.0μl；HS Premix(宝生工，大连)25.0μl；50μM引物0.5μl；ddH2O 23.0μl；RHD基因与Gfp基因的PCR反应程序：94℃预变性3min；(94℃预变性30s—59℃退火5s—72℃延伸90s)×30个循环；72℃延伸10min。

重叠PCR反应体系(50μl)：RHD2基因扩增产物(50ng/μl)0.5μl；Gfp基因扩增产物(50ng/μl)0.5μl；HS Premix(宝生工，大连)25.0μl；50μM引物0.3μl；ddH2O 23.4μl；重叠PCR反应程序：94℃预变性3min；(94℃预变性30s—55℃退火7s—72℃延伸150s)×30个循环；72℃延伸10min。

切胶回收后重叠PCR产物并进行纯化，采用Not I酶进行酶切，同时切割质粒pUT-mini Tn5(Km)。连接酶切产物，得到重组质粒pUT-RHDGfp。连接产物转化至E.coli DH5αλpir中。挑取阳性克隆利用引物RHD-f1和Gfp-r2进行菌落PCR进行验证，验证结果呈阳性(图4：pUT-RHDGfp载体的PCR验证，其中M：5000bp DNA Marker，1：RHDGfp基因片段)；同时，对提取的质粒进行Not I酶切，凝胶电泳结果显示在7.1kb与2.7kb处附近存在两条条带(图5：pUT-RHDGfp载体的酶切鉴定，其中M：5000bp DNA Marker，1：Not I酶切产物)，分别对应pUT-mini Tn5(Km)质粒与RHDGfp基因，证明pUT-RHDGfp重组表达载体构建成功。

序列1为实施例2中由RHD-f1和Gfp-r2扩增得到的RHDGfp序列(去除酶切位点2695bp)。

实施例3：基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的构建

采用三亲结合的方式将融合基因RHDGfp的重组至Pseudomonas putida GLB3染色体，操作所需菌株如下：受体菌(Pseudomonas putida GLB3)、辅助菌(E.coli DH5α(pRK2073))、供体菌(E.coli DH5α(pUT-RHDGfp))。各菌株混合比例为1:2:1，混合体系采用10mM MgSO4溶液，所用平板培养基应为含有卡那霉素(25mg/L)及氯霉素(25mg/L)的LB平板培养基。培养至菌落可见后，挑取菌落，采用引物RHD-f1和Gfp-r2进行RHDGfp基因的菌落PCR验证。验证结果呈阳性(图6：三亲结合重组菌的PCR验证，其中M：5000bp DNA Marker，1-3：RHDGfp基因片段)，表明RHDGfp基因已成功转化入受体菌Pseudomonas putida GLB3，将该重组菌命名为Pseudomonas putida GLEB3(保藏号CGMCCNo.13014)。在含有氯霉素的LB培养基中增殖重组菌Pseudomonas putida GLEB3，分别提取其基因组DNA与质粒DNA，并以此为模板，使用引物RHD-f1和Gfp-r2扩增RHDGfp基因。重组菌Pseudomonas putida GLEB3的基因组可以扩增出RHDGfp基因片段，而提取的质粒DNA则无法扩增(图7：RHDGfp基因的定位，其中M：5000bp DNA Marke，1：基因组的RHDGfp基因扩增，2：提取质粒后RHDGfp基因扩增)，说明RHDGfp基因在重组菌株生长的过程中已经整合至细菌基因组。

将筛选所得菌株接种至含有芘的无机盐培养基，30℃，120rpm振荡培养，每隔2小时取1ml菌悬液测定芘的浓度；采用引物RHD-fq与RHD-rq对RHDGfp基因的表达量进行定量；同时采用酶标仪测定荧光强度(激发波长395nm，发射波长509nm，狭缝宽度5nm)。该菌株对芘的降解能力，降解过程中RHDGfp片段的表达量以及荧光强度变化均表明RHDGfp基因赋予了重组菌对芘的降解能力及相应的荧光指示功能(图8：基因工程菌Pseudomonas putida GLEB3对芘的降解曲线与(a)生长曲线，(b)荧光强度，(c)RHDGfp融合基因表达量的对比，(d)荧光强度变化与表达量比)。

序列2为实施例3中由RHD-fq和RHD-rq扩增得到的RHDGfp序列(208bp)。

实施例4：基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3的应用效果验证

取基因工程菌株Pseudomonas putida GLEB3接种于LB固体培养基上，28℃培养24h，将长出的单菌落转接到含有卡那霉素(100g/ml)的LB液体培养基内，28℃，120rpm摇床培养至OD600值为1。将所得菌液按照体积比5％的比例转接到LB肉汤培养基，28℃，180rpm培养16h，得到Pseudomonas putida GLEB3的发酵菌液。将其与灭菌的秸秆生物炭按1：2(V：W)混匀后风干，制成固体菌剂。

本发明利用的受体菌株是在深圳光明新区低影响示范工程雨水花园土壤中获得的一株恶臭假单胞菌菌株Pseudomonas putida GLB3为受体菌(GenBank accession No.KT804567)，经高通量测序解析土壤生物群落结构确定该菌株所在属别为优势菌属。供体菌株Mycobacterium vanbaalenii PYR-1(GenBank accession No.CP000511)，购自德国DSMZ菌种库，具有良好的PAHs降解效果。本发明应用基因工程手段，将来自供体菌株的环羟化双加氧酶编码基因重组至受体菌基因组，以达到提升雨水花园中原有土著优势菌的PAHs降解能力的目的。

以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应当视为属于本发明的保护范围。

序列表

序列表

<110> 清华大学深圳研究生院

<120> 一种多环芳烃降解基因工程菌株、其构建方法及应用

<130> 16A100484JYC

<160> 2

<210> 1

<211> 2695

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtctattg tcggtaagaa cgacattcag caactggtag cggcgggcca agaaggcctt 60

gctaagggcc gtctgcccgc cgggctggtc gccaacgcag aactccacaa gctcgaagct 120

cagcgagtct tcggccggtg ctggcaattc ctggcccacg agacggagat cccccaggca 180

ggggactacg tggtccgata tctgggtggc ggttcgatca tcgttgtccg cggcgaagac 240

ggcgaagtgc gcgccatggc gaactcgtgt cggcaccgcg gaacaatgct gtgccgcacg 300

gagatgggca acacttcgca cttccgctgc ccctatcacg gctggaccta ccgcaatacc 360

ggaactctgg cgggtgtacc cgcacaaaaa gaggtctatg gggtcgagat ggacaagaac 420

gagtggagtc ttacccaggt tccgcgcctc gagaactacc gcggaatgat attcggttgc 480

ctggacgaga aggcagaacc tctcgttgat tatttgggcg atatggcgtg gtatctggac 540

ctgatcaccc agaagtccaa gggtggactg gaggtgcggg gtgagcccca gcgttggatc 600

atcgactcca actggaagct cggcgcggac aactttgtcg gggacgccta ccacacgttg 660

atgacgcacc gatcggcggt cgagctcggt ctggctccgc ccgatccaaa attcgcgtcg 720

gagccggcgc atatcagtct ctccaacggt cacggcctcg gcgtcctcgg ggtgccgccc 780

gggcaaccga tgccgccctt tatgaactat ccacccgagg tcgtcgatgg actcgcagcg 840

gcttacggcg atcaggaccg cgcagacatg cttcagcgtt cggccttcat tcacggcacg 900

gtctttccca acctgtcgtt cctcaacgtc ctcatcggta gggacaagaa gtcaatgcca 960

gtgccgatgt tgacatttcg gctgtggcgt ccactgtcac acgacacgat ggaagtttgg 1020

tcgtggtttc tcgtcgagaa ggatgccgac gaagagttca aacagcagtc gtatgagacc 1080

tacgtacgaa cgttcggcat ctccggtgtg ttcgaacagg acgacgccga gacttggcgc 1140

tccatcactg cgggaacgca aggcattctc gcaggcagcc agacactcaa cttcgagatg 1200

ggcatgggtg tgctgaccag cgacgacacg tggaaggggc ccggtcgtcc cctgtccagc 1260

gggtacgcgg agcgtaacca acgcgaattc tggggtcgcc tgttggagtt actcaccgac 1320

tcaggcgatg acgccagcga aaccgagccc aaaccccaac tactcgcgca atctcggacc 1380

aatacagacg aggtcgcctg atgaggcatc aggcaactgc ttgtctcaca accacaatca 1440

accaggtcat aaaggatggt gtgccatggt agcgacggtc gagcaacagc ttctgctccg 1500

ctgcgagatg gagaactttc tgttcgaaga ggcggagctg ctgaacgacg gccggtttca 1560

cgactggcta gaactgtgcg ccgaagatat ccactacgtc atcccggtgc gcgtgagcag 1620

agaacgcgcc aacggcgacg gaaattcgac gaccatgacc cactgggatg acgactacgc 1680

aggcttggag ctgcgggtgc tacgtctgga caccgaatac gcatgggcag aagatccgcc 1740

ctcacggatc cgacaccacg tgtcgaatgt gcgggtacgc cccggcgcag ggacggacga 1800

atacgatgtc cgctccaacc ttctcgtgtt ccgcaacagg ggggacagcc cgcagcacga 1860

cctcatctct gcggagcgcc acgatgtcat ccgccgcagt gagatgggcc tgcggttagc 1920

gagccgacgg gtagtgcttg accatgccgt tgtcggcacc cacaatctgg ctaacttctt 1980

cagtaaagga gaagaacttt tcactggagt tgtcccaatt cttgttgaat tagatggtga 2040

tgttaatggg cacaaatttt ctgtcagtgg agagggtgaa ggtgatgcaa catacggaaa 2100

acttaccctt aaatttattt gcactactgg aaaactacct gttccatggc caacacttgt 2160

cactactttc tcttatggtg ttcaatgctt ttcccgttat ccggatcata tgaaacggca 2220

tgactttttc aagagtgcca tgcccgaagg ttatgtacag gaacgcacta tatctttcaa 2280

agatgacggg aactacaaga cgcgtgctga agtcaagttt gaaggtgata cccttgttaa 2340

tcgtatcgag ttaaaaggta ttgattttaa agaagatgga aacattctcg gacacaaact 2400

cgagtacaac tataactcac acaatgtata catcacggca gacaaacaaa agaatggaat 2460

caaagctaac ttcaaaattc gccacaacat tgaagatgga tccgttcaac tagcagacca 2520

ttatcaacaa aatactccaa ttggcgatgg ccctgtcctt ttaccagaca accattacct 2580

gtcgacacaa tctgcccttt cgaaagatcc caacgaaaag cgtgaccaca tggtccttct 2640

tgagtttgta actgctgctg ggattacaca tggcatggat gagctctaca aataa 2695

<210> 2

<211> 189

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gacggacgaa tacgatgtcc gctccaacct tctcgtgttc cgcaacaggg gggacagccc 60

gcagcacgac ctcatctctg cggagcgcca cgatgtcatc cgccgcagtg agatgggcct 120

gcggttagcg agccgacggg tagtgcttga ccatgccgtt gtcggcaccc acaatctggc 180

taacttctt 189