一种产酪醇的重组菌株及其构建方法与流程

本发明涉及一种产酪醇的重组菌株及其构建方法，属于微生物领域。

背景技术：

酪醇(4-(2-Hydroxyethyl)phenol)是一种天然的抗氧化剂，来源于橄榄油，是苯乙醇的一种衍生物。作为一种抗氧化剂，它可以保护细胞免受氧化伤害。对于酚类化合物，它具有很大工业价值。酪醇，以及它的衍生物，是合成各种有机物化合物的合成子。例如，酪醇可被用于制备商业上能得到的医药剂，如，倍他洛尔和美托洛尔，这些药剂是选择性的β1受体阻滞剂，同时可被用于治疗高血压、心绞痛、心力衰竭和青光眼。此外，酪醇可能是羟基酪醇的前体物质，羟基酪醇(2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethanol)是一种对于人类健康有益的抗氧化剂，较酪醇而言，它的抗氧化性强于酪醇，同时，它也可以合成很多聚合物。据有关研究表明，它具有很多生物性能，它预防心血管、骨质缺乏等疾病的发生。此外，酪醇还可以用作食品添加剂去改善食品的风味，如日本米酒。

由于酪醇巨大的工业价值，它渐渐得到了工业界人士的注意。目前，工业制备酪醇，主要是通过化学工艺法。现存的化学合成工艺有很多，例如，苯酚及其苯酚衍生物合成法、羧酸合成法、苯乙醇醇合成法、对硝基甲苯合成法等工艺。对羟基苯乙醇的合成方法很多，但目前国内真正实现工业化生产的仅有以苯酚及其衍生物和苯乙醇为原料进行合成，两种合成方法在工艺研究上比较成熟。以苯乙醇醇合成法为例，大多是采用先保护羟基，然后硝化、还原、重氮化、水解得到对羟基苯乙醇，收率为70％。此途径中，在硝基还原成氨基的过程中，研究者用不同催化剂可以得到不同产率的胺，主要的催化剂有铂黑和二氯化锡，所得到的产率分别为90％和88％。这种工艺产率高，但是它的弊端是原料苯乙醇的价格贵，供应紧张。其他化学合成工艺，如对硝基甲苯合成法原料价格相对低廉，货源较多，成本较低，但步骤较长，产率低，不利于环境的保护；对羟基苯乙烯合成法产率96％，纯度99％，产率和纯度都很高，具有一定的价值，但原料成本的大量投入同样制约了大规模的工业化生产。

为了解决上文提到的这些问题，生物合成法合成酪醇已成为研究热点，2014年天津工业所Yanfen Bai等将酿酒酵母中的丙酮酸脱羧酶基因ARO10在E.coli MG1655中异源表达，成功构建了产酪醇的重组微生物。随后，对染色体的改造，成功构建了高效合成酪醇的工程菌，产量可达6.8mM。

技术实现要素：

本发明提供了一株产酪醇的大肠杆菌(Escherichia coli)BE2，于2016年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2016462，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

本发明提供的大肠杆菌BE2，将源于酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因ARO10、芳香族氨基酸氨基转移酶基因ARO8，利用基因工程技术导入经过基因工程改造的敲除基因feaB与pheA大肠杆菌BL21(DE3)，在强启动子T7控制下表达，成功构建大肠杆菌工程菌BE0，在此株菌的基础上，进行化学诱变，筛选出性能性能优化的以酪氨酸为底物过量合成酪醇的重组大肠杆菌突变株BE2。

所述芳香族氨基酸氨基转移酶编码基因核苷酸序列如GenBank 852672所示；所述丙酮酸脱羧酶编码基因核苷酸序列GenBank 851987所示。

所述大肠杆菌BE2的构建步骤包括：

a)从酿酒酵母基因组扩增得到含有BamHⅠ和NcoⅠ酶切位点序列的ARO10基因片段；

b)构建pRSFDuet-ARO10重组载体：用限制性内切酶BamHⅠ、NcoⅠ分别酶切pRSFDuet-1质粒以及步骤a)得到的ARO10基因片段，并采用T4DNA连接酶连接反应，得到pRSFDuet-ARO10重组载体；

c)从酿酒酵母基因组扩增得到含有NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点序列的ARO 8基因片段；

d)构建重组载体pRSFDuet-ARO10-ARO8：用限制性内切酶NdeⅠ、XhoⅠ分别酶切步骤b)得到的重组载体pRSFDuet-ARO10以及步骤c)得到的基因片段ARO8，并采用T4DNA连接酶连接反应，得到重组载体pRSFDuet-ARO10-ARO8；

e)用CaCl₂转化法将重组载体pRSFDuet-ARO10-ARO8导入敲除pheA和feaB的大肠杆菌，得到大肠杆菌工程菌BE0；

f)诱变得到重组大肠杆菌突变株BE2。

本发明还提供应用所述大肠杆菌BE2生产酪醇的方法，是以酪氨酸为底物，以大肠杆菌BE2全细胞作为催化剂合成酪醇。

具体地，培养、收集大肠杆菌BE2菌体，将其置于全细胞反应液中，使其OD₆₀₀约为18，反应20h左右。

本发明提供了生物合成法合成酪醇，将源于酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶基因ARO10、芳香族氨基酸氨基转移酶基因ARO8，在强启动子T7控制下，使其过表达，利用基因工程技术导入敲除基因feaB与pheA的大肠杆菌BL21(DE3)，成功构建大肠杆菌工程菌BE0，在此株菌的基础上，进行化学诱变，筛选出性能优化的以酪氨酸为底物过量合成酪醇的重组大肠杆菌突变株BE2，以酪氨酸为底物，用全细胞生物转化的方法合成酪醇，这种方法具有操作简单，污染小，产率较高的特点；以10mM酪氨酸为底物，发酵20h可产酪醇达8.71mM，酪氨酸转化率可达87.1％。

生物材料保藏

大肠杆菌(Escherichia coli)BE2，于2016年9月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016462，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

附图说明

图1为大肠杆菌工程菌合成酪醇的途径；

图2为实施例1所得的含有特异性酶切位点序列的ARO10基因片段的电泳图，其中，1为ARO10基因，M为标记；

图3为重组质粒pRSFDuet-ARO10的酶切鉴定电泳图，其中1、2为pRSFDuet-ARO10酶切产物，M为标记；

图4为实施例1所得的含有特异性酶切位点序列的ARO8基因片段电泳图，其中，1为ARO8基因，M为标记；

图5为所得pRSFDuet-ARO10-ARO8重组质粒的酶切鉴定电泳图，其中1-2：为pRSFDuet-ARO10-ARO8，M为标记；

图6为高效液相色谱测酪醇标准样品所得到的色谱图，酪醇的出峰时间在6.02分钟左右；

图7为高效液相色谱测重组菌的发酵液所得到的色谱图。

具体实施方式

实施例1

一、含有丙酮酸脱羧酶的编码基因的重组质粒pRSFDuet-ARO10的构建

根据已报道的酿酒酵母丙酮酸脱羧酶的编码基因ARO10核苷酸序列(ARO10基因序列的GenBank号为851987)，设计如下引物，在上游引物中引入NcoⅠ酶切位点(用下划线标出)，在下游引物中引入BamHⅠ酶切位点(用下划线标出)。

aro101：CATGCCATGGGCATGTCTGAAATTACTTTGGGT

aro102：GGCGCCGCGGATCCTATTTTTTATTTCTTTTA

以酿酒酵母Eby100基因组DNA为模板，以aro101、aro102为引物，进行PCR扩增。将得到的PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，得到一条约1908bp的特异性条带，其大小与GenBank已公布的基因长度一致，经进一步DNA测序表明扩增得到丙酮酸脱羧酶基因。将扩增得到的ARO10基因和表达载体pRSFDUet-1重组载体经限制性内切酶NcoⅠ与BamHⅠ双酶切，并采用T4DNA连接酶连接反应，构建了pRSFDUet-ARO10重组质粒。利用限制性内切酶进行酶切验证，结果见图4，酶切得到大小约3829bp和1908bp的带，与预期相当，酶切验证结果证明的pRSFDUet-ARO10结构正确。图2中，泳道M为DL 5000DNA Marker，泳道1为ARO10的PCR产物；图3中，泳道M为DL 5000DNA Marker，泳道1、2为限制性内切酶NcoⅠ与BamHⅠ双酶切后的重组质粒pRSFDUet-ARO10。

二、含有芳香族氨基酸氨基转移酶编码基因的pRSFDUet-ARO10-ARO8重组载体的构建

根据已报道的酿酒酵母芳香族氨基酸氨基转移酶的编码基因ARO8核苷酸序列(ARO8基因序列的GenBank号为852672)，设计如下引物，在上游引物中引入NdeⅠ酶切位点(用下划线标出)，在下游引物中引入XhoⅠ酶切位点(用下划线标出)。

aro81：GGAATTCCATATGACTTTACCTGAATCAAAAGAC

aro82：CCGCTCGAGCTATTTGGAAATACCAAATTCTTCGT

以酿酒酵母Eby100基因组DNA为模板，以aro81、aro82为引物，进行PCR扩增。将得到的PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1泳道2所示，得到一条约1503bp的特异性条带，其大小与GenBank已公布的基因长度一致，经进一步DNA测序表明扩增得到丙酮酸脱羧酶基因。将扩增得到的ARO8基因和b步骤一获得重组载体pRSFDUet-ARO10经限制性内切酶NdeⅠ与XhoⅠ双酶切，并采用T4DNA连接酶连接反应，构建了重组质粒pRSFDUet-ARO10-ARO8。利用限制性内切酶进行酶切验证，结果见图4，酶切得到大小约5737bp和1503bp的带，与预期相当，酶切验证结果证明pRSFDUet-ARO10-ARO8的结构正确。图4中，泳道M为DL 5000DNA Marker，泳道1为ARO8的PCR产物；图5中，泳道M为DL 5000DNA Marker，泳道1、2为限制性内切酶NdeⅠ与XhoⅠ双酶切后的重组质粒pRSFDUet-ARO10-ARO8。

三、Red同源重组技术敲除大肠杆菌BL21(DE3)的基因feaB

根据NCBI公布的基因feaB核苷酸序列(feaB基因序列的GenBank号为945933)，及质粒pKD13序列，设计如下引物，在上游引物中引入与基因序列同源的50bp序列，在下游引物中引入与基因序列同源的50bp序列。

YFeaB1:ATGACAGAGCCGCATGTAGCAGTATTAAGCCAGGTCCAACAGTTTCTCGAGTGTGGCTGGAGCTGCTTC

YFeaB2:TTAATACCGTACACACACCGCTTAGTTTCACACCAACCGTCCAGCCAGTATTCCGGGGATCCGTCGACC

以质粒pKD13为模板，以为YFeaB1、YFeaB2引物，进行PCR扩增。将得到的PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1泳道2所示，得到一条约1503bp的特异性条带，其大小与GenBank已公布的基因长度一致，经进一步DNA测序表明扩增得到含有同源臂的基因片段。将扩增得到的基因片段导入含有质粒pKD46的大肠杆菌BL21(DE3)中，经抗性平板筛选，得到的转化子经菌落PCR验证，扩增得到了1780bp的片段，得到整合上抗性标记基因的阳性转化子。在42℃消除温敏型质粒pKD46，经抗性平板筛选，得到在卡那霉素抗性平板长而不能在氨苄青霉素抗性平板上生长的转化子，在将质粒pCP20转化上述得到的阳性转化子，经抗性平板筛选，经菌落PCR验证，扩增得到274bp的片段，鉴定为阳性转化子。将得到的阳性转化子经42℃过夜培养，消除质粒pCP20，将长出的单菌落经抗性平板筛选，得到在卡那霉素抗性平板与氨苄青霉素抗性平板均不长的转化子，此转化子为删除基因基因feaB的突变株。

四、Red同源重组技术敲除已删除基因feaB的大肠杆菌BL21(DE3)的基因pheA

根据NCBI公布的基因pheA核苷酸序列(pheA基因序列的GenBank号为947081)，及质粒pKD13序列，设计如下引物，在上游引物中引入与基因序列同源的50bp序列，在下游引物中引入与基因序列同源的50bp序列。

YPheA1:AGGCAACACTATGACATCGGAAAACCCGTTACTGGCGCTGCGAGAGAAAAGTGTGGCTGGAGCTGCTTC

YPheA2:TCAGGTTGGATCAACAGGCACTACGTTCTCACTTGGGTAACAGCCCAATAATTCCGGGGATCCGTCGACC

以质粒pKD13为模板，以YPheA1、YPheA2为引物，进行PCR扩增。将得到的PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图1泳道2所示，得到一条约1503bp的特异性条带，其大小与GenBank已公布的基因长度一致，经进一步DNA测序表明扩增得到含有同源臂的基因片段。将扩增得到的基因片段导入含有质粒pKD46的已删除基因feaB的大肠杆菌BL21(DE3)中，经抗性平板筛选，得到的转化子经菌落PCR验证，扩增得到了1658bp的片段，得到整合上抗性标记基因的阳性转化子。在42℃消除温敏型质粒pKD46，经抗性平板筛选，得到在卡那霉素抗性平板长而不能在氨苄青霉素抗性平板上生长的转化子，在将质粒pCP20转化上述得到的阳性转化子，经抗性平板筛选，经菌落PCR验证，扩增得到499bp的片段，鉴定为阳性转化子。将得到的阳性转化子经42℃过夜培养，消除质粒pCP20，将长出的单菌落经抗性平板筛选，得到在卡那霉素抗性平板与氨苄青霉素抗性平板均不长的转化子，此转化子即为删除基因feaB和基因pheA的突变株。命名为BE0。

五、以酪氨酸为底物全细胞转化合成酪醇的工艺

以得到的宿主BE0，通过全细胞催化，以酪氨酸为底物，合成酪醇。将重组突变菌BE2接种到20mL LB液体培养基中，37℃过夜培养，1％的接种量转接50mL新鲜液体LB培养基，以经过优化的最优条件OD₆₀₀＝0.6，加入0.2mM IPTG诱导剂，在25℃诱导培养8h，收集菌体，将其置于全细胞反应液(100mM Tris-HCl buffer(pH 7.4),10mM MgCl₂,2mM NADH,2mM thiamine pyrophosphate,0.2mM pyridoxal phosphate)中，使其OD₆₀₀约为18，发酵20h，适当时间收集发酵液，离心取上清，将其用作高效液相色谱分析。

高效液相所用色谱柱为Cosmosil5C18-MS-II column，所用流动相为纯甲醇和0.1％三氟乙酸，甲醇的浓度在0～5min从20％增加到80％，之后保持80％浓度10min。高效液相色谱检测酪醇所用检测器为紫外检测器，所用条件洗脱流速为0.4ml/min，检测波长为222nm。

六、获得性能优化的以酪氨酸为底物过量合成酪醇的重组大肠杆菌突变株

划出发菌株大肠杆菌BE0单菌落接种于盛有5ml肉汤培养液的三角瓶中，37℃培养过夜。第二天添加5ml新鲜的肉汤培养液，充分混匀后，分装成2只三角瓶，继续培养5h。将两只三角瓶的菌液分别倒入离心管中，3500rpm离心10min，弃去上清液，打匀沉淀，其中一管吸入5ml生理盐水，然后倒入另一离心管，二管并成一管。吸取菌液1ml于离心管中，冰冻1h，制成静止细胞。加入5ml醋酸缓冲液(pH＝4.0)，再加入13.8mg亚硝酸钠，于37℃下诱变处理5～8min。加入0.1mol/LNaOH中和至pH＝7.0，中止亚硝酸作用。处理后的菌液经过处理，后培养后，涂布于含有青霉素的平板上，培养12h，通过青霉素法淘汰野生型，筛选得到500个突变株。将得到500个突变株接种到10mL LB液体培养基中，37℃过夜培养，1％的接种量转接10mL新鲜液体LB培养基，以经过优化的最优条件OD₆₀₀＝0.6，加入0.2mM IPTG诱导剂，在25℃诱导培养8h，收集菌体，将其置于全细胞反应液中，使其OD₆₀₀约为18，发酵20h，收集发酵液，离心取上清，将其用作高效液相色谱分析。

经发酵实验，筛选出一株性能优化的以酪氨酸为底物过量合成酪醇的重组大肠杆菌突变株。以10mM酪氨酸为底物，重组菌株BE0可产酪醇达6.7mM，在重组菌株BE0基础上，经过化学诱变得到的菌株BE2，可产酪醇达8.71mM。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种产酪醇的重组菌株及其构建方法

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<170> PatentIn version 3.3

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