一种提高枯草芽孢杆菌发酵液中α‑淀粉酶活的方法与流程

本申请属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一种提高枯草芽孢杆菌发酵液中α-淀粉酶活的方法。

背景技术：

枯草芽孢杆菌是一类分布广泛的革兰氏阳性杆状好氧细菌，无致病性，不易产生抗药性、与环境兼容性良好，并具有较强的向胞外分泌各种酶及抗生素的能力。枯草芽孢杆菌应用广泛，目前涉及发酵、病虫害防治、养殖业、污水处理等各个领域。然而，在芽孢形成的初级阶段，枯草芽孢杆菌通过“同种相食”（Cannibalism）过程推迟芽孢形成，即将形成芽孢的细胞产生并向胞外释放细菌毒素Skf（芽孢形成自杀因子）和Sdp（芽孢形成延迟蛋白），同时自身对毒素具有免疫机制，杀死未形成芽孢的姐妹细胞，利用死亡细胞释放的营养物质推迟芽孢的形成，由此造成培养过程中菌数的大量减少。

Sdp对应的基因簇由sdpA、sdpB、sdpC、sdpI、sdpR基因构成，sdpC基因为编码细菌毒素前体的核心基因。其中sdpA基因编码一种胞质蛋白SdpA，对SdpC进行修饰；sdpB基因编码一种跨膜蛋白SdpB，同样对SdpC进行修饰；sdpC基因编码含203个氨基酸的蛋白质前体pro-SdpC，经修饰后形成毒素Sdp；sdpI基因编码SdpI蛋白，是一种跨膜蛋白，具有免疫及信号传递功能，可以感应胞外细菌毒素Sdp，解除SdpR对SdpRI的抑制；sdpR基因编码含90个氨基酸组成的调节蛋白SdpR，与sdpRI的启动子结合，阻止其转录，并同SdpI共同参与分泌细菌毒素的细胞对毒素自身免疫机制的形成。

基于上述研究，如果能够对枯草芽孢杆菌中的sdpC基因进行突变，进而减少Sdp的形成，则有可能大幅度提高枯草芽孢杆菌的发酵培育效果，但现有技术中，尚未见到较好的报道成果。

技术实现要素：

本申请主要目的在于提供一种改造枯草芽孢杆菌的方法，从而提高枯草芽孢杆菌发酵液中α-淀粉酶活力。

本申请的主要技术方案如下所述。

一种提高枯草芽孢杆菌发酵液中α-淀粉酶活的方法，该方法通过采用基因工程方法对枯草芽孢杆菌菌株基因组进行改造实现，其基因组改造原理如图1所示，因此，该方法主要包括如下步骤：

（1）设计引物，PCR克隆扩增sdpBC部分序列DNA

PCR扩增时引物序列设计如下：

sdp F：5’-CGGAATTCTAAAGAGTGGGCAGAAGGAAC-3’，（5’端GAATTC部分序列为EcorI酶切位点）

sdp R：5’-CGGGATCCTTTACTAACTTTTTACCTTCTGT-3’；（5’端GGATCC部分序列为BamHI 酶切位点）

以枯草芽孢杆菌168菌株基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

（2）酶切和连接

将步骤（1）中的PCR扩增产物（sdpBC部分序列DNA）与质粒pMUTIN4，分别采用EcorI和BamHI进行双酶切；

对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收酶切产物；

对所回收的酶切产物采用T4 DNA 连接酶进行连接；

（3）转化、筛选并鉴定

将步骤（2）中的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子进行扩增培养，并提取质粒进行鉴定，鉴定正确的重组质粒即为所构建的同源单交换重组质粒，保存备用；

（4）将所构建的同源单交换重组质粒转化枯草芽孢杆菌168，并检测鉴定

采用Spizizen低盐环境感受态转化法，将所构建的同源单交换重组质粒转化枯草芽孢杆菌168菌株，并进一步进行检测鉴定，确定转化后的枯草芽孢杆菌菌株构建正确；

检测鉴定时，以转化后的枯草芽孢杆菌菌株的基因组DNA为模板，进行PCR检测鉴定，PCR检测时，引物序列设计如下：

sdpF-2：5’-CGGAATTCCATTATTAGATTCAAGGCGA-3’，（引物sdpF-2是理论整合位点处上游基因组的部分序列）

pMUTIN4 R：5’-CCACAGTAGTTCACCACCTTTTC-3’。

针对上述提高枯草芽孢杆菌发酵液中α-淀粉酶活的方法，也可以理解为一种改造枯草芽孢杆菌的方法，该方法包括如下步骤：

（1）设计引物，PCR克隆扩增sdpBC部分序列DNA

PCR扩增时引物序列设计如下：

sdp F：5’-CGGAATTCTAAAGAGTGGGCAGAAGGAAC-3’，（5’端GAATTC部分序列为EcorI酶切位点）

sdp R：5’-CGGGATCCTTTACTAACTTTTTACCTTCTGT-3’；（5’端GGATCC部分序列为BamHI 酶切位点）

以枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板，进行PCR扩增；

（2）酶切和连接

将步骤（1）中的PCR扩增产物（sdpBC部分序列DNA）与质粒pMUTIN4，分别采用EcorI和BamHI进行双酶切；

对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收酶切产物；

对所回收的酶切产物采用T4 DNA 连接酶进行连接；

（3）转化、筛选并鉴定

将步骤（2）中的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子进行扩增培养，并提取质粒进行鉴定，鉴定正确的重组质粒即为所构建的同源单交换重组质粒，保存备用；

（4）将所构建的同源单交换重组质粒转化枯草芽孢杆菌168，并检测鉴定

采用Spizizen低盐环境感受态转化法，将所构建的同源单交换重组质粒转化枯草芽孢杆菌168，并进一步进行检测鉴定，确定转化后的枯草芽孢杆菌菌株构建正确。

所述改造枯草芽孢杆菌的方法在α-淀粉酶制备中的应用，通过该方法改造枯草芽孢杆菌168菌株，可以较好提高发酵液中α-淀粉酶酶活。

总体而言，本申请以生理及转化背景比较清楚、并已经完成序列测定的枯草芽孢杆菌168菌株作为研究示例，通过同源重组的方法，对芽孢形成延迟蛋白基因sdpC进行插入突变。初步研究表明，通过该方法所获得的改造后的菌株，其活菌数及α-淀粉酶活均得到了较好提升，表现出较好的应用价值，同时也为其他菌株改造奠定了应用基础。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌基因簇sdpBC插入构建重组菌株技术原理示意图；

图2为sdpBC部分序列DNA片段的PCR产物凝胶电泳图，其中M：DM3100 1KB DNA Ladder；1：sdpBC中长724bp的DNA片段；

图3为所构建重组质粒pMUTIN4+sdpBC电泳图谱，其中M：DM3100 1KB DNA Ladder；1-3：重组质粒pMUTIN4+sdpBC的电泳图；

图4为对所构建重组质粒pMUTIN4+sdpBC中sdpBC基因部分序列的PCR检测图，其中M：BM2000 DNA Marker；1：sdpC基因中长724 bp的DNA片段；

图5为对枯草芽孢杆菌168同源单交换重组质粒转化子的PCR验证，其中M：BM2000 DNA Marker；1:枯草芽孢杆菌168基因组；2-4:转化子14号、16号和20号；

图6为枯草芽孢杆菌168及其突变转化子菌株培养24h后活菌数；

图7为枯草芽孢杆菌168及其突变转化子菌株培养48h后芽孢数；

图8为枯草芽孢杆菌168及其突变转化子α-淀粉酶活力对比。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的介绍说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

生物材料：

枯草芽孢杆菌168菌株、枯草芽孢杆菌整合型质粒pMUTIN4，购自杭州宝赛生物科技有限公司；

引物序列合成及测序，由北京华大基因公司提供完成；

实验试剂：

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，利用去离子水定容至1000mL，适度加热使其充分溶解，按每瓶100mL的量分装至500mL三角瓶当中，121℃灭菌30min；（LB固体培养基，另外加入20g琼脂粉）；

PCR扩增用试剂盒，北京康润诚业生物科技有限公司产品；

质粒提取试剂盒，捷恩麦克生物科技公司产品；

实验仪器：

PCR仪，伯乐生命医学产品（上海）有限公司产品。

实施例1

由于以质粒pMUTIN4为基础的重组质粒的构建是本申请的基础，具体过程如下。

（1）设计引物，PCR克隆扩增sdpBC部分序列DNA

首先，设计PCR扩增用引物序列如下：

sdp F：5’-CGGAATTCTAAAGAGTGGGCAGAAGGAAC-3’，（5’端GAATTC部分序列为EcorI酶切位点）

sdp R：5’-CGGGATCCTTTACTAACTTTTTACCTTCTGT-3’；（5’端GGATCC部分序列为BamHI 酶切位点）

其次，以枯草芽孢杆菌168基因组DNA（DNA提取采用细胞/细菌/酵母基因组DNA小量提取试剂盒进行提取，试剂盒购自上海莱枫生物科技有限公司）为模板，进行PCR扩增，25μL扩增体系设计如下：

枯草芽孢杆菌168基因组DNA，1μL；

引物sdp F，1μL；

引物sdp R，1μL；

GenStar 2×TaqMix，12.5μL；

ddH₂O，9.5μL；

PCR反应程序如下：94℃、5min；94℃、30s，57℃、30s，72℃、45s，34cycles；72℃、10min；

对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析，并回收扩增产物。

PCR产物凝胶电泳图如图2所示。从图2中可以看出，PCR产物符合预期的724bp，进一步经北京华大基因公司测序后，表明扩增产物序列正确。

（2）酶切和连接

将步骤（1）中的PCR扩增产物（sdpBC部分序列DNA）与质粒pMUTIN4，分别采用EcoRI和BamHI进行双酶切，50μL酶切体系设计如下：

限制性内切酶EcorI，1μL；

限制性内切酶BamHI，1μL；

Cut Smart Buffer，5μL；

质粒pMUTIN4（或sdpBC部分序列DNA），10μL；

ddH₂O，33μL；

37℃酶切3h。

对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收酶切产物。

对所回收的酶切产物采用T4 DNA 连接酶进行连接，10μL的线性化后质粒pMUTIN4与DNA片段连接体系设计如下：

T4 DNA Ligase，1μL；

T4 DNA Ligase Buffer，1μL；

pMUTIN4线性化质粒，1μL；

纯化后两DNA片段（即酶切后sdpBC部分序列），7μL；

16℃连接16h。

（3）转化、筛选并鉴定

将步骤（2）中的连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子进行扩增培养；

提取质粒后进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。检测结果可以看出，sdpBC部分序列已经整合进入质粒pMUTIN4基因组中。

进一步地，对所提取质粒进行PCR检测鉴定，PCR检测时，以所提取重组质粒为模板，以步骤（1）中所设计sdp F和sdp R为扩增引物，25μL扩增体系设计如下：

重组质粒，1μL；

sdp F，1μL；

sdp R，1μL；

GenStar 2×TaqMix，12.5μL；

ddH₂O，9.5μL；

PCR反应程序如下：94℃、5min；94℃、30s，60.4℃、30s，72℃、2min03s，34cycles；72℃、10min；

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。这一结果表明，所构建的质粒为同源单交换重组质粒。

实施例2

将实施例1所构建重组质粒转化枯草芽孢杆菌168，并进一步筛选获得重组后的突变菌株，其对枯草芽孢杆菌168基因组改造的技术原理如图1所示，基于同源单交换的原理进行基因组整合，具体的转化、筛选过程简要介绍如下。

将实施例1所构建的同源单交换重组质粒转化枯草芽孢杆菌168，并检测鉴定

采用Spizizen低盐环境感受态转化法，将实施例1所构建的同源单交换重组质粒转化枯草芽孢杆菌168，具体过程如下。

（1）制备枯草芽孢杆菌168菌株感受态细胞

将保存于-80℃超低温冰箱中的枯草芽孢杆菌168菌株，划线后置于37℃培养箱培养48h；

挑取菌落至2mL的SPI培养基中（均利用50mL离心管进行操作），37℃、200 rpm培养过夜；

第二天上午取100μL培养液转接5mL的SPI培养基中，37℃、200 rpm培养至对数生长末期(约4-5h)；

取0.2mL培养液至2mL的SPII培养基中，37℃、200rpm培养90min；

加入20μL的10mmol/L的EGTA，再于37℃、200 rpm培养10min；分装成0.5mL每管备用。

（2）转化

在每支装有感受态细胞的离心管中加入对应的重组质粒DNA（1μg左右），于37℃、100 rpm振荡培养90min，之后于25℃、5000rpm条件下离心1min，弃去400μL上清液，将沉淀的菌体与剩余的上清液混匀，得到100μL菌悬液，涂布于含6μg/mL红霉素的抗性平板中，37℃黑暗培养箱中培养12h，挑取单菌落（拟转化子）进行检测。

（3）转化子的筛选

挑取单菌落（拟转化子）于5mL含6µg/mL红霉素的液体LB培养基中培养，提取基因组DNA（采用细胞/细菌/酵母基因组DNA小量提取试剂盒提取）后进行PCR检测；

PCR上游引物sdpF-2，依据枯草芽孢杆菌168基因组设计；下游引物pMUTIN4 R，根据质粒pMUTIN4设计，确保一次PCR检测即确定插入突变阳性转化子；具体引物序列设计如下：

sdpF-2：5’-CGGAATTCCATTATTAGATTCAAGGCGA-3’，（引物sdpF-2是理论整合位点处上游基因组的部分序列）

pMUTIN4 R：5’-CCACAGTAGTTCACCACCTTTTC-3’；

以转化子的基因组DNA为模板，25μL扩增体系设计如下：

转化子基因组DNA，1μL；

sdpF-2，1μL；

pMUTIN4 R，1μL；

GenStar 2×TaqMix，12.5μL；

ddH₂O，9.5μL；

PCR反应程序如下：94℃、5min；94℃、30s，54℃、30s，72℃、56s，34cycles；72℃、10min；

对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示。从图5中可以看出，枯草芽孢杆菌168基因组中没有得到PCR产物，而转化子中可得到PCR产物，并符合预期大小（924bp），表明转化子染色体中已插入重组质粒。进一步地，对PCR产物进行测序验证，表明序列顺序和插入方向均正确，即，所获得的重组菌株是正确的，符合预期。

对重组后的枯草芽孢杆菌菌株（转化子）的生物学特性进行评价，其中主要包括对转化子培养一定条件后的活菌数及芽孢数的生物量的统计，也包括发酵产物的α-淀粉酶活力的评价，以确定改造后菌株是否具有一定的应用前景。相关过程简要介绍如下。

（1）转化子的活菌数及芽孢数的测定和评价

采用LB液体培养基，以原始出发菌株枯草芽孢杆菌168作为对照，以所构建的转化子16号和20号作为实验例（16号、20号仅是构建过程中的实验编号，并不具有实际意义），分别进行培养，培养基是LB培养液，37℃、 220rpm振荡培养至OD₆₀₀=0.5左右时，分别取2mL培养液转接接种至200 mL的LB液体培养基中，进行培养；

培养至24h时，进行稀释平板计数，此结果即为菌液中的活菌数；

培养至48 h时，各取1mL菌液，95℃保温30 min，确保枯草芽孢杆菌营养细胞在高温的环境下全部被杀死（正常情况下，细菌营养细胞在70~80℃温度下处理10min即可被全部杀死），然后进行平板稀释计数，此结果即是菌液中芽孢数。

活菌数测定结果如图6所示。芽孢数测定结果如图7所示。

从图6中可见，培养24h，转化子总菌数比出发菌株分别提高了48%及35%。从图7中可见，培养48 h，转化子芽孢数比出发菌株分别提高了95%及84%。这一结果表明，所构建的重组菌株（转化子）的sdpBC蛋白失去了活性，因而活菌数量和芽孢数量都得到了明显增长。

（2）转化子α-淀粉酶活力测定和评价

在上述“活菌数及芽孢数”测定评价过程中，在转接后的菌液培养过程中，分别取培养至9h、12h、15h、18h、22h、26h、30h、34h的菌液，对菌液中的α-淀粉酶活力进行测定，α-淀粉酶活采用DNS法进行测定，具体测定步骤如下：

（1）取1mL菌液样品，4℃、8000rpm/min离心20min，取上清液，即为粗酶液，将粗酶液平均分为两份，其中一份煮沸20分钟灭活作为对照；

（2）向步骤（1）中的粗酶液及对照样分别加入2%可溶性淀粉溶液1mL、蒸馏水3mL，60℃保温5min；

（3）向步骤（2）溶液中加入浓度为0.1mol/L的柠檬酸缓冲液（pH=6.5）1mL，60℃水浴保温30min；

（4）向步骤（3）溶液中加入1.5mL DNS试剂，沸水浴5min，然后迅速冷却，加蒸馏水定容至20mL；

（5）将步骤（4）溶液摇匀，分光光度计测定520nm处的OD值，并查阅麦芽糖溶液的吸光值标准曲线得到对应的麦芽糖含量。

在本发明中，酶活力单位定义为：在60℃、pH=6.5的条件下，30min释放1mg麦芽糖所需的酶量为一个酶活力单位。

检测结果如图8所示。从图8可见，转化子16号菌株在9h、12h、15h、18h、22h、26h、30h和34h的培养时间中α-淀粉酶的酶活相比168出发菌株依次提高47.25%、129.06%、57.14%、 23.06 %、22.93%、50.49 %、37.16% 和33.87%；转化子20号菌株在对应培养时间内α-淀粉酶活相比168出发菌株依次提高38.71%、63.60%、33.05%、21.56%、19.07%、40.46% 、18.63% 和28.69%。这一结果表明，改造后菌株，其发酵液中α-淀粉酶的酶活得到了明显提升，具有较好地应用前景。