本发明涉及一种3,5,7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-苯并吡喃-4-酮衍生物。
背景技术：
广金钱草为豆科植物广金钱草的干燥地上部分，是两广地区的大宗栽培药材，为《中国药典》收录品种，具有清热利湿、通淋排石之功效，在民间广泛用于治疗肾、肝、胆结石，临床疗效显著。早期使用的广金钱草为野生品，随着药材需求量的不断增大，药源日趋匮乏，目前栽培品已成为商品药材的主要来源。广金钱草靠种子繁殖，药材种子产量可观。但是作为非药用部位，除每年选种留种之外，种子尚有大量剩余。关于广金钱草种子的研究主要集中在种子优良度及质量标准方面。本发明研究发现：广金钱草种子中主要含有黄酮类成分，且其醇提物在体外具有抗氧化作用，以活性为导向对广金钱草种子的化学成分进行系统分离，可以获得一系列新化合物，扩大了广金钱草的药用部位，有利于充分利用药材资源。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种3,5,7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-苯并吡喃-4-酮衍生物。
本发明的另一目的在于提供一种3,5,7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-苯并吡喃-4-酮衍生物的制备方法。
本发明的再一目的在于提供一种3,5,7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-苯并吡喃-4-酮衍生物的应用。
本发明所采取的技术方案是：
一种3,5,7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-苯并吡喃-4-酮衍生物，其结构通式如下：
其中，R1为-OH或R2为-OH、R3为-H或-OH，且R1和R2不同时为-OH。
优选的，所述的衍生物为
上述3,5,7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-苯并吡喃-4-酮衍生物的制备方法，包括以下步骤：
1)将广金钱草干燥种子粉碎，用石油醚脱脂，再用乙醇回流提取，提取液经减压浓缩成浸膏，加蒸馏水混悬，再依次用氯仿、水饱和的正丁醇进行萃取，各部分萃取液减压浓缩，得到氯仿萃取物、正丁醇萃取物和水层留余物；
2)通过ODS柱层析分离、硅胶柱层析、CHCl3-MeOH洗脱、聚酰胺柱层析和羟丙基葡聚糖凝胶纯化对正丁醇萃取物进行处理，分离出不同结构的3,5,7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-苯并吡喃-4-酮衍生物。
本发明的有益效果是：本发明的3,5,7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-苯并吡喃-4-酮衍生物结构稳定，是从广金钱草种子中分离得到，具有很好的抗氧化作用，制备过程简单，可用作天然抗氧化剂。
附图说明
图1为抗坏血酸、正丁醇萃取物、氯仿萃取物和水层留余物的总还原能力测试结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释和说明。
实施例：
1)初步萃取：
将15kg广金钱草干燥种子粉碎，用石油醚脱脂，再用95％的乙醇回流提取3次，每次回流的时间为3h，合并提取液，减压浓缩成浸膏，加适量蒸馏水混悬，再依次用氯仿、水饱和的正丁醇进行多次萃取，各部分萃取液减压浓缩，得氯仿萃取物171g、正丁醇萃取物664g和水层留余物893g。
2)总黄酮含量测定：
①供试样品溶液的制备
分别称取氯仿萃取物63.5mg、正丁醇萃取物45.2mg、水层留余物175mg，置于3个25mL容量瓶中，用70％的乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，4℃冷藏，待用。
②对照品溶液的制备
称取山奈酚标准品5.0mg，置于50mL容量瓶中，用70％的乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，4℃冷藏，待用。
③标准曲线的制备
分别吸取山奈酚母液0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL、0.8mL、0.9mL置于6个10mL容量瓶中，加入0.1moL/L的AlCl3溶液2mL，摇匀放置6min后，再加入pH＝5.2的NaAc-HAc缓冲溶液1mL，用70％的乙醇定容，室温放置15min，再分别测定各山奈酚对照样品在417nm处的吸光度，每一个山奈酚对照样品平行测定3次。以山奈酚对照样品浓度(mg/mL)为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，回归方程为：Y＝80.876X+0.0220(R2＝0.9997)，在0.004～0.009mg/mL浓度范围内线形关系良好。
④总黄酮含量测定
分别吸取2mL步骤①的氯仿萃取物、正丁醇萃取物和水层留余物，置于3个10mL容量瓶中，按照步骤③中的测试方法测试各样品的吸光度，以样品浓度(mg/mL)为横坐标(X)，吸光度为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，根据标准曲线计算各提萃取中的总黄酮含量。经过计算，氯仿萃取物、正丁醇萃取物和水层留余物中的总黄酮含量分别为：10.99mg/g、26.64mg/g和2.33mg/g。
3)抗氧化活性分析：
①总还原能力测定
取氯仿萃取物、正丁醇萃取物和水层留余物配制成不同浓度的样品溶液，各取溶液2.5mL，加入浓度为0.2mol/L磷酸缓冲液(pH＝6.6)2.5mL，再加入1％的铁氰化钾溶液2.5mL，混匀，在50℃水浴下作用20min后加入10％的三氯乙酸2.5mL，混匀后于4000r/m下离心10min，取上清液2.5mL与浓度为0.1％的氯化铁水溶液0.5mL混合，室温反应10min，于700nm波长下测定吸光度，抗坏血酸(Vc)为阳性对照。
各样品的总还原能力如图1所示，由图1可知：各样品的总还原能力大小(吸光度值越高表示其总还原能力越强)如下：抗坏血酸>正丁醇萃取物>氯仿萃取物>水层留余物。
②对羟基自由基(·OH)的清除作用
取氯仿萃取物、正丁醇萃取物和水层留余物配制成不同浓度的样品溶液，各取溶液0.5mL，加入7.5mmol/L邻二氮菲0.5mL、0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4)1.0mL、7.5mmol/L的FeSO4溶液1mL，充分混匀后，加入0.1％的H2O2溶液0.5mL，摇匀，置于37℃水浴保温1h，于510nm处测定吸光度，以抗坏血酸为阳性对照，计算：清除率(％)＝100％×(Ao-As)/Ao，式中，Ao为空白溶液的吸光度，As为样品溶液的吸光度。
在实验所选的浓度范围内，各样品对·OH的清除率(％)与样品浓度呈现良好线性关系，回归方程、R2及IC50值如表1所示。由表1可知：各样品对·OH的清除作用：抗坏血酸>正丁醇萃取物>氯仿萃取物>水层留余物。
③对超氧阴离子(·O2-)的清除作用
取试管若干，各加入50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.2)4.5mL，再分别加入不同质量浓度的样品溶液1.0mL，于25℃恒温水浴20min，加入25mmol/L邻苯三酚溶液0.1mL，混匀于25℃恒温水浴保温5min，立即加入8mmol/L盐酸溶液1.0mL终止反应，于322nm处测定吸光度，以Tris-HCl缓冲液为参比液，抗坏血酸为阳性对照，计算：清除率(％)＝100％×[1-(As-Aso)/Ao]，式中，Ao为加邻苯三酚不加样品溶液，As为加邻苯三酚也加样品溶液，Aso为不加邻苯三酚加样品溶液。
在实验所选的浓度范围内，各样品对·O2-的清除率(％)与样品浓度呈现良好线性关系，回归方程、R2及IC50值如表1所示。由表1可知：各样品对·O2-的清除作用：抗坏血酸>正丁醇萃取物>氯仿萃取物>水层留余物。
表1各样品对·OH和·O2-的清除作用
BE：正丁醇萃取物，CE：氯仿萃取物，WE：水层留余物。
④对ABTS自由基的清除作用
配制ABTS储备液：配制2.45mmol/L的K2S2O8溶液，用K2S2O8溶液溶解ABTS，配成7mmol/L的ABTS储备液，室温、避光静置12～16h。将ABTS储备液用磷酸盐缓冲液(10mmol/L，pH＝7.4)稀释，使其吸光度在734nm处达到0.700±0.020。分别移取不同质量浓度的样品溶液1mL于试管中，各加入2mL的ABTS储备液，涡流振荡30s，避光反应8min，于734nm处测定吸光度。以抗坏血酸为阳性对照，计算：清除率(％)＝100％×(Ao-As)/Ao，式中，Ao为ABTS储备液的吸光度，As为样品的吸光度。
在实验所选的浓度范围内，各样品对ABTS的清除率(％)与样品浓度呈现良好线性关系，回归方程、R2及IC50值如表2所示。由表2可知：各样品对ABTS的清除作用：抗坏血酸>正丁醇萃取物>氯仿萃取物>水层留余物。
表2各样品对ABTS的清除作用
BE：正丁醇提取物，CE：氯仿提取物，WE：水层提取物。
不同抗氧化实验模型均表明广金钱草种子的正丁醇萃取物具有明显的抗氧化活性，因此将其作为活性部位进行系统的化学成分分离。
4)活性部位的系统分离：
一种3,5,7-三羟基-2-(4-羟基苯基)-苯并吡喃-4-酮衍生物的制备方法，包括以下步骤：
①取正丁醇提取物适量，经ODS柱层析(MeOH-H2O，1:9→10:0)分离，合并后得到29个组分Fr.1～Fr.29；
②取Fr.16依次经过硅胶柱层析、CHCl3-MeOH(9:1→1:9)洗脱，合并后得到8个组分Fr.16-1～Fr.16-8，取Fr.16-8依次经过ODS柱层析(MeOH-H2O，1:9→4:6)、聚酰胺柱层析(MeOH-H2O，1:9→10:0)、Sephadex LH-20纯化，得到化合物1(12mg)和化合物2(10mg)；
③取Fr.19依次经过硅胶柱层析、CHCl3-MeOH(9:1→6:4)洗脱，合并后得到10个组分Fr.19-1～Fr.19-10，取Fr.19-10经Sephadex LH-20纯化得到化合物3(5mg)；
④取Fr.29依次经过硅胶柱层析(CHCl3-MeOH，9:1→0:10)、聚酰胺柱层析(CHCl3-MeOH，9:1→6:4)、Sephadex LH-20纯化，得到化合物4(37mg)。
化合物1：山奈酚-3-O-β-D-芹菜糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-芹菜糖苷
黄色粉末。
化合物1的波谱数据如表3所示。
由表3可知：
高分辨质谱显示分子量[M+Na]+：m/z 735.1755(计算值735.1748)，分子式为C31H36O19；
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)谱中：δH 12.66(1H,s,OH)、6.75(1H,d,J＝2.0Hz,H-8)、6.38(1H,d,J＝1.9Hz,H-6)提示为黄酮A环间位耦合质子信号；δH 8.14(2H,d,J＝9.0Hz)、6.89(2H,d,J＝9.0Hz)提示为黄酮B环AA’BB’系统；
HSQC谱中：三个端基质子δH 5.63(1H,d,J＝3.4Hz)、5.62(1H,d,J＝7.7Hz)、5.35(1H,d,J＝1.4Hz)分别于三个端基碳δC 107.2、98.4、108.8相关，提示该化合物中含有三个糖；
1H NMR、13C NMR图谱中：端基质子δH 5.63、5.35和端基碳δC 107.2、108.8为芹菜糖的典型信号。此外，两个仲碳信号δC 74.7、73.9和两个季碳信号δC 78.8、79.3进一步验证了上述推断。化合物1酸水解后，将水解产物与标准品比对，证实该化合物苷元为山奈酚，糖为芹菜糖和葡萄糖。端基质子δH 5.63的耦合常数J＝3.4Hz，表明此芹菜糖构型为β-D-呋喃型芹菜糖。第三个端基质子δH 5.62(J＝7.7Hz)应为葡萄糖的端基质子信号；
在HMBC谱中：端基质子δH 5.63(H-1””)与δC 162.5(C-7)相关，提示一个芹菜糖连接于C-7位；端基质子δH 5.62(H-1”)与δC 133.3(C-3)相关，提示葡萄糖连接于C-3位。将化合物1的碳谱数据与已报道的化合物山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖对比，发现化合物1的C-2”化学位移向低场移动了2.97ppm，而C-1”化学位移向高场移动了2.43ppm，由此推断第二个芹菜糖连接于C-2”；
故确定化合物1为：山奈酚-3-O-β-D-芹菜糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-芹菜糖苷，结构式为：
化合物2：山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-7-O-β-D-芹菜糖苷
黄色粉末。
化合物2的波谱数据如表3所示。
由表3可知：
高分辨质谱显示分子量[M+Na]+：m/z 603.1337(计算值603.1326)，分子式为C26H28O15，计算不饱和度为13，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示为黄酮类化合物；
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)谱中：δH 6.39(1H,d,J＝2.0Hz)和6.74(1H,d,J＝2.5Hz)为黄酮A环的间位耦合质子信号，即H-6和H-8。δH 8.08(2H,d,J＝9.0Hz)和6.88(2H,d,J＝9.0Hz)为黄酮B环AA’BB’系统。δH 5.47(1H,d,J＝7.5Hz)和5.62(1H,d,J＝3.5Hz)端基质子信号提示该化合物含糖；化合物2酸水解后，将水解产物与标准品比对，证实该化合物苷元为山奈酚，糖为芹菜糖和葡萄糖；
13C NMR(125MHz，DMSO-d6)和DEPT谱证实化合物中：共26个碳信号，包括3个亚甲基碳，13个次甲基碳，1个羰基碳和9个季碳。根据HSQC谱确定各质子信号和碳信号的归属(表5-1)。在碳谱的高场区有9个碳信号，加上两个端基碳(δC 100.8和107.1)推测为双碳氧糖。碳谱中显示有三个CH2信号，除了δC 60.8为葡萄糖C-6’信号外，同时存在的δC 74.6和61.9两个仲碳信号为芹菜糖的代表碳信号，故验证了酸水解的结果，化合物结构中含有葡萄糖和芹菜糖。在糖的优势构象中，凡是H-2’为α键的糖，当与苷元形成β-苷键，其中H-1’和H-2’为αα耦合系统，J＝6～9Hz，并呈现一个二重峰。由氢谱可知葡萄糖端基质子δH5.47(1H,d,J＝7.5Hz)，故葡萄糖为β-D构型；
将芹菜糖的1H NMR和13C NMR数据与文献[134]比对，确定结构中的芹菜糖为β-D构型。
在HMBC谱中：葡萄糖的端基质子δH 5.47(1H,d,J＝7.5Hz)与黄酮母核上的C-3(δC133.5)相关，表明葡萄糖的端基与苷元的3-O位相连。芹菜糖的端基质子δH 5.62(1H,d,J＝3.5Hz)与黄酮母核上的C-7(δC 162.5)相关，表明芹菜糖的端基与苷元的7-O位相连。根据HMBC谱的其他相关信号验证了上述推断；
故确定化合物2为：山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-7-O-β-D-芹菜糖苷，结构式为：
表3化合物1和2的波谱数据(in DMSO-d6，500and 125MHz)
化合物3：山奈酚-7-O-β-D-芹菜糖苷
黄色粉末。
化合物3的波谱数据如表4所示。
由表4可知：
高分辨质谱显示分子量[M-H]-：m/z 417.0807(计算值417.0822)，分子式为C20H18O10；
合物3的波谱数据与化合物2很相近，只是缺少3-O-β-D-葡萄糖，故确定化合物3为：山奈酚-7-O-β-D-芹菜糖苷，结构式为：
化合物4：2″-(E)-p-香豆酰基槲皮苷
黄色粉末。
化合物4的波谱数据如表4所示。
由表4可知：
高分辨质谱显示分子量[M-H]-：m/z 593.1273(计算值593.1295)，分子式为C30H26O13，计算不饱和度为18，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示为黄酮类化合物；
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)谱中：δH 12.55(1H,s)，6.41(1H,d,J＝2.0Hz)和6.21(1H,d,J＝2.0Hz)质子信号提示黄酮A环上为5,7二羟基取代。δH 7.34(1H,d,J＝2.5Hz)，7.30(1H,dd,J＝8.5,2.5Hz)和6.89(1H,d,J＝8.5Hz)质子信号提示黄酮B环上为3’,4’-二羟基取代。δH 5.50(1H,d,J＝1.5Hz)，5.43(1H,dd,J＝3.5,1.5Hz)，3.23-3.74(3H,m)和0.89(3H,d,J＝5.5Hz)质子信号提示该化合物含糖。化合物4酸水解后，将水解产物与标准品比对，证实含有L-鼠李糖；
13C NMR(125MHz，DMSO-d6)和DEPT谱证实化合物中共30个碳信号，包括1个甲基碳，16个次甲基碳，2个羰基碳和11个季碳。根据HSQC谱确定各质子信号和碳信号的归属(表5-1)；
在HMBC谱中，δH 7.34(1H,d,J＝2.5Hz,H-2’)与δC 157.4(C-2)，148.6(C-4’)，121.2(C-6’)存在相关峰；δH 7.30(1H,dd,J＝8.5,2.5Hz,H-6’)与δC 157.4(C-2)，115.7(C-2’)，148.6(C-4’)存在相关峰，说明该化合物的苷元为槲皮素；
HMBC谱中，δH 5.50(1H,d,J＝1.5Hz,H-1”)与δC 133.4(C-3)存在相关峰，说明L-鼠李糖连接在C-3上。δH 7.56(2H,d,J＝8.5Hz,H-2”’,6”’)和6.79(2H,d,J＝8.5Hz,H-3”’,5”’)提示含有1,4-取代苯环。δH 7.57(1H,d,J＝16.0Hz,H-7”’)和6.39(1H,d,J＝16.0Hz,H-8”’)为反式烯烃结构片段。HMBC谱中，δH H-7”’与δC 130.5(C-2”’)，114.1(C-8”’)，165.9(C-9”’)存在相关峰；H-8”’与125.1(C-1”’)和C-9”’存在相关峰。综上，可知化合物中含有(E)-p-coumaroyl结构片段[135]。3-O-鼠李糖基中的H-2”(5.43，1H,dd,J＝3.5,1.5Hz)质子信号和C-2”(71.6)信号均向低场偏移，由此推测coumaroyl片段连接于鼠李糖的C-2”位上；
HMBC谱中，H-1”与C-3，C-4”(δC 68.6)，C-5”(δC 71.6)存在相关峰，H-2”与C-4”，C-9”’存在相关峰；
综上所述，证实化合物4为：2″-(E)-p-香豆酰基槲皮苷，结构式为：
表4化合物3和4的波谱数据(in DMSO-d6，500and 125MHz)
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。