本发明涉及一种体外消化分离角质形成细胞的新方法，属于组织细胞学领域。
背景技术：
角质形成细胞是构成表皮细胞的主要组成部分，是一种可以分泌形成角质蛋白的细胞，根据其不同的分化进程，在皮肤结构中的分布为基底细胞层、棘细胞层、颗粒细胞层、角质层。自1967年briggaman从皮肤中分离出角质形成细胞，至今50年来，培养方法不停的发展和演变，培养技术在不断进步。体外培养的角质形成细胞具有增殖修复的能力，可以移植于烧伤创面进行修复。烧伤病人在修复创面时往往面临的是供皮区的有限，在最小的供皮面积培养出更多的细胞用于修复创面是尤为重要。在培养细胞过程中，首先需要将角质形成细胞提取分离出来然后才能进行培养，现在广泛应用的方法为两步酶消化法，第一步用中性蛋白酶或胶原蛋白酶等将表皮层组织和真皮层组织分离，第二部再用胰蛋白酶将表皮层组织消化分离为单个细胞。其中消化分离细胞的环节必然存在一部分细胞未从组织上消化下来造成浪费，而常用的胰蛋白酶消化方法若过长时间消化组织，虽然更充分分离细胞，但却由于长时间的消化作用而损伤细胞的功能，如何在最小的皮肤中获取最大化的细胞量同时保持较高活性的细胞功能是提高细胞培养效率的重要因素。
技术实现要素：
为了克服现有技术中角质形成细胞在消化分离过程中未彻底消化下来和长时间彻底消化而影响细胞活性的缺陷，本发明的目的在于提供一种改良的角质形成细胞消化分离的提取方法，以解决上述问题。
本发明提供了一种动态多次的重复消化的方法，包括动态的方式和多次的重复。
进一步的讲所述的动态方式为在消化过程中用移液器吸头在消化所用的器皿中进行顺时针和逆时针交替搅拌，使组织和胰蛋白酶溶液充分接触，使消化的角质形成细胞快速脱离组织。搅拌消化进行2分钟后立即吸出胰蛋白酶溶液，此时胰蛋白酶溶液含有一定量较早消化分离的角质形成细胞，将其加入事先准备好的消化中止溶液中(大豆胰蛋白酶中止溶液或含有10％血清的dmem培养液)，即完成一次消化。
进一步的讲重复多次是上述的动态消化步骤重复进行5次。
进一步的讲在胰蛋白酶消化分离细胞前需准备好分离出的表皮层组织，分离表皮层前需将皮肤组织剪切成宽约0.3cm，长1-3cm的皮条，分离表皮层组织后需经不含钙镁的pbs液清洗至少1次并且不剪碎该组织。
进一步的讲所使用的消化酶为经提前水浴预热为37℃的0.25％胰蛋白酶溶液，并保持37℃，所加入盛放表皮层组织的器皿中的胰蛋白酶量是组织体积的5倍以上，保证完全淹没组织。
附图说明
图1为本发明操作过程的示意图；
图中①盛有胰蛋白酶中止液的50ml离心管，②设施为37℃的恒温水浴锅，③盛有浓度为0.25％胰蛋白酶-edta的容器，④1ml移液器吸头，⑤表皮层组织，⑥培养皿。
该示意图展示了本发明的主要操作步骤，将预热至37℃的胰蛋白酶-edta溶液③转移至(右边虚线箭头)培养皿，经过顺时针和逆时针交替搅拌(两个实线箭头)，然后再转移至(左边虚线箭头)盛有胰蛋白酶中止液的50ml离心管①进行中止消化。
具体实施方式
以下具体实例进一步描述并检验本发明，本发明不仅仅限于该实例。在本发明的范围内或者在不脱离本发明的主体思想和内容内，也可以用于提取鼠等其他动物的表皮细胞，也可以对于诸如胰蛋白酶的浓度、剂量、时间和重复次数做出适当的调整，对于本领域的技术人员来说是显而易见的，且包含在本发明的范围之内。
实例
皮肤标本来自泌尿外科包皮环切术后的组织，将组织标本用含有三抗的dpbs清洗血渍，用眼科剪进行修剪皮下组织，再剪成宽约0.3cm，长1-2cm的皮条，转移至15ml离心管，加满用dpbs稀释的浓度为0.125％的dispase溶液(0.22um滤膜过滤除菌)，摇晃离心管至皮片在液体中均匀悬浮，平放于4℃冰箱过夜。次日取出离心管，在超净台中进行分离提取细胞实验，将皮片及溶液倒入培养皿中，用小镊将皮条转移至另一培养皿，加入含三抗的dpbs，进行漂洗，将培养皿盖口朝上放置于超净台面，在皿盖中用小镊从组织中分离出表皮层，再次用含有三抗的dpbs进行漂洗3次。
将分离的表皮层组织用无菌干纱布块吸干水分，用剪刀分开成两部分，随机分为实验组和对照组，在电子天平上分别称重并记录。
实验组为动态多次的胰蛋白酶消化方法，首先准备50ml离心管并加入15ml含10％胎牛血清的dmem培养液，在分离表皮细胞前预先将浓度为0.25％胰蛋白酶-edta溶液在水浴缸预热至37℃，将称重后的实验组表皮层组织放入60mm培养皿中，加入3ml提前预热至37℃的0.25％胰蛋白酶-edta溶液，用微量移液器吸头持续搅拌2min后可见胰酶溶液颜色转为黄褐色，将溶液吸取后加入上述备好培养液的离心管中，微量移液器吹吸混均胰酶溶液和培养液，再取3ml的0.25％胰蛋白酶-edta溶液，用微量移液器吸头搅拌约2min后将溶液再次转移至离心管中，共重复5次，将50ml离心管中液体用200目滤网过滤至另一支50ml离心管，加入少量dpbs清洗离心管中残留细胞再过滤至另一离心管，在室温下将滤液进行离心，180g，5min。
对照组为传统的酶消化法，将称重后的对照组表皮层组织放入60mm培养皿中，用眼科剪剪碎成微粒状，大小约1mm；加入0.25％胰蛋白酶-edta溶液3ml，在37℃环境下消化约10min后取出，加入3ml含10％胎牛血清的dmem培养液，用5ml移液管进行吹吸混均，可见混合液粘稠，通过吹吸使细胞脱离组织，将混合液用200目滤网过滤至50ml离心管并按上述方式进行离心。
各取以上所述两组细胞悬液10ul分别加入两支0.6mlep管中，各加入10ul台盼蓝溶液后混匀，1min后在细胞计数板上计数，坏死细胞为蓝色，活细胞为无色透明状，用血球计数板在倒置相差显微镜下分别计数活细胞和坏死细胞。计算单位重量表皮层组织提取活细胞数量[活细胞数量÷表皮层组织称重]，计算细胞存活率[活细胞数量÷(活细胞数量+坏死细胞数)×100％]。本实验重复8次。结果以均数±标准差表示，应用统计学中的配对t检验方法进行比较。
动态多次重复消化法和传统消化法的消化效率比较(n＝8，
本实验通过台盼蓝染色和血球计数板对两种方法提取的细胞进行计数，由上表结果可知新方法提取的活细胞数目显著多于传统方法，大约是传统方法的3倍，尽管活细胞占总细胞数的比例较传统方法稍偏低，这可能因为消化的足够彻底，将表皮层组织最表层已调亡的细胞过多消化分离。总之所提取的活的角质细胞数目显著得到提高。