本发明涉及生物提取技术领域，尤其是涉及一种低分子量高硫酸化的海参岩藻聚糖硫酸酯制备方法。
背景技术：
海参是我国一种传统的药食同源性滋补品，在全球1100种的海参中，可食用海参仅占20余种，绝大多数为不可食用的低值海参。海参体壁是海参主要的食用或药用部位。在干海参中，蛋白质的含量高达85-90%左右，脂质约占4%，多糖约占6-10%，另外还含有钙、铁、锌、锰、硒、钼等微量元素。海参体壁中因含有多种生理活性物质而被广泛应用于中医的单方或复方药方及药膳或食疗组方中，如胶原蛋白、硫酸多糖、皂苷、甾醇、活性脂质等。
硫酸多糖是海参体壁的重要成分。目前已证明海参体壁中的硫酸多糖主要有两种：岩藻聚糖硫酸酯和岩藻糖基化硫酸软骨素，其中，海参岩藻聚糖硫酸酯是一类主要由l-岩藻糖组成的直链硫酸多糖。已证明海参岩藻聚糖硫酸酯具有显著的抗肿瘤、抗血栓、降血糖、降血脂、改善胰岛素抵抗、肝保护和肾保护的作用。岩藻聚糖硫酸酯的生物活性与其化学结构和理化性质密切相关，一般情况下，在一定的分子量范围内，分子量越低，生物活性越强。海参岩藻聚糖硫酸酯分子量较大，以海地瓜和梅花参为例，这两种海参岩藻聚糖硫酸酯分子量分别高达1614kda和1284kda，高分子量的岩藻聚糖硫酸酯很难被小肠细胞吸收进入体循环系统，在利用时多将其降解为低分子量的岩藻聚糖硫酸酯，具有粘度低、易吸收和生物利用率高的特点，且生物活性较强。此外，硫酸根的含量也对岩藻聚糖硫酸酯的生物活性有直接的影响，硫酸根含量越高，生物活性越强，国外也有相关通过增加硫酸根含量增强岩藻聚糖硫酸酯生物活性的报道，见论文《oversulfationoffucoidanenhancesitsanti-angiogenicandantitumoractivities》（biochemicalpharmacology2003年第65卷2期，173-179）。
目前，国内已有一些关于制备低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的报道，例如专利“低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯的制备方法”，专利号cn103087214a，该方法是以海参粉碎后利用酶解法获得海参岩藻聚糖硫酸酯为原料，通过超声处理打破糖苷键获得低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯，这种方法反应快速，对产物结构破坏小，但由于反应过快容易导致产物的分子量过低而使得海参岩藻聚糖硫酸酯活性受限。再例如专利“岩藻聚糖硫酸酯及其制备方法”，专利号cn104710539a，该方法是以棘皮动物为原料，酶解醇沉法获得岩藻聚糖硫酸酯，采用过氧化物降解法或酸降解法获得低聚岩藻聚糖硫酸酯，该方法因利用较高浓度的过氧化物或酸对岩藻聚糖硫酸酯进行降解，方法较剧烈，反应不易控制，对多糖分子结构破坏性较大。再例如“一种从泡叶藻中提取制备低分子岩藻聚糖硫酸酯的方法”，专利号cn103788219a，该方法是以泡叶藻为原料，直接利用盐酸对其进行多糖分离与降解，再经醇沉后获得低分子量岩藻聚糖硫酸酯，该方法反应较为剧烈，且因岩藻聚糖硫酸酯的提取和降解合为一步，对岩藻聚糖硫酸酯的分子量控制无法掌控。对于过硫酸化岩藻聚糖硫酸酯的制备，仅国外有相关的文献报道，而国内尚属于空白领域。国外报道是利用二甲基甲酰胺和三甲基铵三氧化硫共聚物共同作用下与岩藻聚糖硫酸酯发生硫化反应而制备过硫酸化岩藻聚糖硫酸酯，该方法制备的产物硫酸化水平较高，但三甲基铵三氧化硫共聚物价格昂贵，不利于工业化生产。
技术实现要素：
本发明是为了解决现有技术的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯制备方法所存在的上述问题，提供了一种工艺步骤简单，反应温和，对产物结构破坏小，无副反应，反应效率较高，无污染的低分子量高硫酸化的海参岩藻聚糖硫酸酯制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种低分子量高硫酸化的海参岩藻聚糖硫酸酯制备方法，包括以下步骤：
（1）将海参岩藻聚糖硫酸酯溶于水中，于30~40℃温度下进行第一次超声处理。本发明中所采用的海参岩藻聚糖硫酸酯是将海参粉碎后利用酶解醇沉法所获得的海参岩藻聚糖硫酸酯，该方法为本领域的常规方法，故不在此赘述。
（2）对步骤（1）中的海参岩藻聚糖硫酸酯溶液于60~80℃温度下进行微波处理。
（3）对步骤（2）中的海参岩藻聚糖硫酸酯溶液于40~50℃温度下进行第二次超声处理，所得溶液经透析、真空冷冻干燥后，得低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯。
（4）将低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯溶于二甲基甲酰胺中，加入k2co3，混匀，再加入过量的甲基磺酸甲酯，在搅拌条件下进行硫酸酯化反应，得反应溶液。碳酸钾可提供钾离子，具有催化作用，碳酸钾还可保证反应时ph的稳定，便于反应充分进行。
（5）在反应溶液中加入乙酸乙酯后充分混匀，静置，离心分离，沉淀经70%乙醇溶液清洗后，复溶于水中，经透析，真空冷冻干燥，即得低分子量高硫酸化的海参岩藻聚糖硫酸酯。
作为优选，步骤（1）中，第一次超声处理的工艺参数为：超声声场强度为40~50w/cm2，超声频率为20~25khz，超声时间10~15min。第一次超声强度小，是预处理，其目的是破坏细胞间的联接作用。
作为优选，步骤（2）中，微波处理的工艺参数为：微波功率400~600w，微波时间5~15min。
作为优选，步骤（3）中，第二次超声处理的工艺参数为：超声声场强度为100~300w/cm2，超声频率为20~25khz，超声时间30~60min。第二次超声强度大，是正式的提取实验，目的是打开糖苷键。
作为优选，步骤（3）中，低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯与k2co3的质量比为1：（1.2~1.4）。
作为优选，步骤（4）中，硫酸酯化反应的反应温度50~70℃，反应时间4~8h。酯化温度在50~60℃变化时，所得产物硫酸根含量呈增加趋势，酯化温度在60~70℃变化时，产物硫酸根含量基本不变；酯化反应时间在4~6h变化时，所得产物硫酸根含量呈增加趋势，在6~8h变化时，所得产物硫酸根含量基本保持不变。因此本发明中严格控制硫酸酯化反应的反应温度50~70℃，反应时间4~8h。
作为优选，硫酸酯化反应期间采用55~100w的强光照射。通过光照可以促进反应，在55~100w的光照下，产物硫酸根含量较高。
作为优选，步骤（5）中，反应溶液中加入10倍体积量的乙酸乙酯。
作为优选，静置时间为2~3h。
作为优选，离心工艺参数为：离心转速3500~4500r/min，离心时间10~15min。
因此，本发明具有如下有益效果：
（1）以海参岩藻聚糖硫酸酯为原料，采用超声波-微波联合降解法打破糖苷键，分解海参岩藻聚糖硫酸酯，对产物结构破坏小，无副反应，反应温和，海参岩藻聚糖硫酸酯不易过度降解而使分子量过低，易于控制分子量大小；
（2）选用甲基磺酸甲酯与低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯进行硫酸酯化反应，反应成本较低，制备过程简单，反应效率较高，无污染；
（3）最终产品分子量低，硫酸根含量高，具有更强的生物活性，具有抗氧化、降血糖、降血脂等功效，且更利于人体吸收，可应用于相应的保健品、功能食品或医用配方食品等行业，具有极高的社会、经济意义和应用潜力。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做进一步的描述。
实施例1
（1）将1g海参岩藻聚糖硫酸酯溶于50ml水中，于30℃温度下进行第一次超声处理，第一次超声处理的工艺参数为：超声声场强度为40w/cm2，超声频率为20khz，超声时间10min；
（2）对步骤（1）中的海参岩藻聚糖硫酸酯溶液于60℃温度下进行微波处理，微波处理的工艺参数为：微波功率400w，微波时间5min；
（3）对步骤（2）中的海参岩藻聚糖硫酸酯溶液于40℃温度下进行第二次超声处理，所得溶液经分子截留量为1000kda的透析袋透析、真空冷冻干燥（于0.1mpa的真空度、－45℃干燥48h）后，得0.87g低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯，第二次超声处理的工艺参数为：超声声场强度为100w/cm2，超声频率为20khz，超声时间30min；将所得的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯采用凝胶渗透色谱法检测产物分子量，其分子量为252.6kda（原海参岩藻聚糖硫酸酯分子量为1614.1kda）；
（4）取0.5g低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯并将其溶于8ml二甲基甲酰胺中，按低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯与k2co3的质量比为1：1.2的配比加入0.6gk2co3混匀，再加入过量的甲基磺酸甲酯，在搅拌条件下进行硫酸酯化反应，硫酸酯化反应的反应温度50℃，反应时间4h，得反应溶液，硫酸酯化反应期间采用55w的强光照射；
（5）在反应溶液中加入10倍体积量的乙酸乙酯后充分混匀，静置2h，离心分离，离心转速3500r/min，离心时间10min，沉淀经70%乙醇溶液清洗后，复溶于水中，经分子截留量为50kda的透析袋透析，真空冷冻干燥（于0.1mpa的真空度、－45℃干燥48h），即得0.56g低分子量高硫酸化的海参岩藻聚糖硫酸酯。
将所得的低分子量高硫酸化的海参岩藻聚糖硫酸酯采用离子色谱法检测产物硫酸根含量，其硫酸根含量为40.1%（原海参岩藻聚糖硫酸酯硫酸根含量为26.3%）。
实施例2
（1）将1g海参岩藻聚糖硫酸酯溶于50ml水中，于40℃温度下进行第一次超声处理，第一次超声处理的工艺参数为：超声声场强度为50w/cm2，超声频率为25khz，超声时间15min；
（2）对步骤（1）中的海参岩藻聚糖硫酸酯溶液于80℃温度下进行微波处理，微波处理的工艺参数为：微波功率600w，微波时间15min；
（3）对步骤（2）中的海参岩藻聚糖硫酸酯溶液于50℃温度下进行第二次超声处理，所得溶液经分子截留量为1000kda的透析袋透析、真空冷冻干燥（于0.1mpa的真空度、－45℃干燥48h）后，得0.85g低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯，第二次超声处理的工艺参数为：超声声场强度为300w/cm2，超声频率为25khz，超声时间60min；将所得的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯采用凝胶渗透色谱法检测产物分子量，其分子量为254.8kda（原海参岩藻聚糖硫酸酯分子量为1614.1kda）；
（4）取0.5g低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯并将其溶于8ml二甲基甲酰胺中，按低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯与k2co3的质量比为1：1.4的配比加入0.7gk2co3混匀，再加入过量的甲基磺酸甲酯，在搅拌条件下进行硫酸酯化反应，硫酸酯化反应的反应温度70℃，反应时间8h，得反应溶液，硫酸酯化反应期间采用100w的强光照射；
（5）在反应溶液中加入10倍体积量的乙酸乙酯后充分混匀，静置3h，离心分离，离心转速4500r/min，离心时间15min，沉淀经70%乙醇溶液清洗后，复溶于水中，经分子截留量为50kda的透析袋透析，真空冷冻干燥（于0.1mpa的真空度、－45℃干燥48h），即得0.52g低分子量高硫酸化的海参岩藻聚糖硫酸酯。
将所得的低分子量高硫酸化的海参岩藻聚糖硫酸酯采用离子色谱法检测产物硫酸根含量，其硫酸根含量为43.3%（原海参岩藻聚糖硫酸酯硫酸根含量为26.3%）。
实施例3
（1）将1g海参岩藻聚糖硫酸酯溶于50ml水中，于35℃温度下进行第一次超声处理，第一次超声处理的工艺参数为：超声声场强度为45w/cm2，超声频率为22khz，超声时间12min；
（2）对步骤（1）中的海参岩藻聚糖硫酸酯溶液于70℃温度下进行微波处理，微波处理的工艺参数为：微波功率450w，微波时间10min；
（3）对步骤（2）中的海参岩藻聚糖硫酸酯溶液于45℃温度下进行第二次超声处理，所得溶液经分子截留量为1000kda的透析袋透析、真空冷冻干燥于0.1mpa的真空度、－45℃干燥48h）后，得0.85g低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯，第二次超声处理的工艺参数为：超声声场强度为200w/cm2，超声频率为23khz，超声时间40min；将所得的低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯采用凝胶渗透色谱法检测产物分子量，其分子量为263.0kda（原海参岩藻聚糖硫酸酯分子量为1614.1kda）；
（4）取0.5g低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯并将其溶于8ml二甲基甲酰胺中，按低分子量海参岩藻聚糖硫酸酯与k2co3的质量比为1：1.3的配比加入0.65gk2co3混匀，再加入过量的甲基磺酸甲酯，在搅拌条件下进行硫酸酯化反应，硫酸酯化反应的反应温度60℃，反应时间5h，得反应溶液，硫酸酯化反应期间采用70w的强光照射；
（5）在反应溶液中加入10倍体积量的乙酸乙酯后充分混匀，静置2.5h，离心分离，离心转速4000r/min，离心时间12min，沉淀经70%乙醇溶液清洗后，复溶于水中，经分子截留量为50kda的透析，真空冷冻干燥（于0.1mpa的真空度、－45℃干燥48h），即得低分子量高硫酸化的海参岩藻聚糖硫酸酯。
将所得的低分子量高硫酸化的海参岩藻聚糖硫酸酯采用离子色谱法检测产物硫酸根含量，其硫酸根含量为40.8%（原海参岩藻聚糖硫酸酯硫酸根含量为26.3%）。
由上述实施例可知，通过本发明获得的低分子量高硫酸化的海参岩藻聚糖硫酸酯分子量低，硫酸根含量高，具有更强的生物活性。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。