一株能高效利用瓜氨酸的短乳杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株能高效利用瓜氨酸的短乳杆菌及其应用，属于生物发酵
技术领域：
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背景技术：
：氨基甲酸乙酯(ethylcarbamate，简称ec)是一种致癌物，广泛存在于香肠、发酵酸面团、酱油、葡萄酒和黄酒等发酵食品和酒精饮料中。研究发现，黄酒中ec含量相对较高，主要由乙醇与尿素、瓜氨酸等氨甲酰基化合物在加热条件下反应形成。因此，降低黄酒中ec前体尿素和瓜氨酸的含量成为控制ec的有效措施。黄酒中尿素主要来源于酵母的尿素循环，而瓜氨酸则主要来源于乳酸菌的精氨酸脱亚胺酶途径。目前主要通过选育低产尿素的酵母或筛选高产脲酶的菌株应用于黄酒发酵，但是并不能同时降低瓜氨酸的含量。如果能够筛选到不产瓜氨酸或者能够吸收利用瓜氨酸的乳酸菌，则可以进一步解决降低ec前体的问题。在葡萄酒、香肠、发酵酸面团等发酵食品和酒精饮料生产过程中也发现了能够重吸收瓜氨酸的乳酸菌，如葡萄酒中分离的布氏乳杆菌lactobacillusbuchnericuc-3，用于香肠发酵的清酒乳杆菌lactobacillussakeictc494，从发酵酸面团分离的发酵乳杆菌lactobacillusfermentumimdo130101等，但这些菌株需要在无精氨酸存在时才能吸收利用瓜氨酸，且只能吸收部分瓜氨酸，最多吸收300mg。本发明的意义在于从黄酒发酵液中筛选得到一种能够高效吸收利用瓜氨酸的短乳杆菌，并将其应用于黄酒酿造中，从而能够高效吸收并利用发酵液中的瓜氨酸，减少ec的形成，提高黄酒的饮用安全性。技术实现要素：本发明提供了一株能高效吸收利用瓜氨酸的短乳杆菌(lactobacillusbrevis)2-34。所述短乳杆菌2-34于2017年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno:m2017140。所述短乳杆菌l.brevis2-34分离自黄酒发酵液，分离方法如下：将黄酒发酵液用无菌生理盐水(0.85％，w/v)按1:2比例稀释，涂布mrs平板，置于厌氧罐中30℃培养3-5天，挑取单菌落接种至mrs液体培养基，培养2天，镜检确定菌株形态后，提取基因组进行16srdna鉴定。所述mrs培养基为10g/l蛋白胨，10g/l牛肉膏，5g/l酵母粉，20g/l葡萄糖，5g/l乙酸钠，2g/l柠檬酸铵，2g/l磷酸氢二钾，1ml/l吐温-80，0.58g/l七水合硫酸镁，0.25g/l一水合硫酸锰，固体培养基则另外添加20g/l的琼脂。所述短乳杆菌l.brevis2-34为革兰氏阳性菌，杆状，部分细胞聚集形成短链，过氧化氢酶检测为接触酶阴性，运动型试验证明无运动性，不还原硝酸盐，不液化明胶，可利用阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖麦芽糖、蜜二糖、蔗糖、木糖等8种糖类，可产生乳酸。所述短乳杆菌l.brevis2-34的保藏方法为：挑取平板上的单菌落于mrs液体培养基，培养16h后吸取1ml菌液于甘油冻存管，并添加1ml50％甘油。所述短乳杆菌l.brevis2-34的培养条件为：从甘油管中吸取50μl菌液接种于3mlmrs液体培养基，30℃静置活化培养12～16h到达对数中期，然后根据需要将种子液扩大培养。所述短乳杆菌l.brevis2-34在以精氨酸(5g/l)为前体物质的mrs培养基(即mrs-arg培养基)中生长时，精氨酸逐渐减少，瓜氨酸积累，说明该菌利用精氨酸并向胞外分泌瓜氨酸(最高达102mg/l)，至对数中期时，胞外瓜氨酸消失，之后也不再向胞外分泌瓜氨酸，说明菌体可重新吸收并利用瓜氨酸。该菌在以瓜氨酸(4g/l)为前体物质的mrs培养基(即mrs-cit培养基)中生长时，吸收瓜氨酸并将其利用，当进入对数期中期时，瓜氨酸利用率显著提高，至成熟期即可将瓜氨酸全部吸收利用完。所述短乳杆菌l.brevis2-34在含5％～15％(v/v)酒精的mrs-arg和mrs-cit培养基中培养时，能够继续生长并利用精氨酸和瓜氨酸，酒精浓度越高生长速率越慢，精氨酸、瓜氨酸的利用率也越低，但经过发酵后，最终菌体浓度与在不含酒精的培养基中一致，精氨酸和瓜氨酸也都能被吸收利用。本发明提供了一种应用上述短乳杆菌l.brevis2-34于黄酒酿造提高黄酒饮用安全性的方法，将菌种活化扩培后，制备高密度菌液(108～1010cfu/l)，按0.1％～1％(ml/l)的比例与酒母、水、糯米、麦曲原料混匀后落罐，进行发酵。本发明的一种实施方式中，将短乳杆菌l.brevis2-34接种至活化培养基活化12-16h，接种到5l自动厌氧发酵罐进行高密度发酵，培养温度30℃，ph5.0，培养时间36-48h，经15000g冷冻离心10min制备高密度菌液(108～1010cfu/l)。在不改变其它工艺的情况下，将高密度菌液(108～1010cfu/l)应用于黄酒酿造，在落罐时以0.1％～1％(ml/l)的比例与酒母、水、糯米、麦曲原料混匀后，进行发酵。本发明的有益效果本发明的短乳杆菌l.brevis2-34进行黄酒酿造，相比不添加短乳杆菌l.brevis2-34进行黄酒酿造优越之处在于，在保持黄酒风味的基础上，显著降低黄酒发酵液中瓜氨酸和氨基甲酸乙酯的含量，在后酵结束时，相比没有加入短乳杆菌l.brevis2-34的黄酒发酵液，接种了短乳杆菌l.brevis2-34的醪液中瓜氨酸和氨基甲酸乙酯含量分别减少了58.2％和29.6％。此外，短乳杆菌l.brevis2-34分离自黄酒发酵醪液，属于食品安全的乳酸菌。生物材料保藏短乳杆菌2-34lactobacillusbrevis2-34，于2017年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno:m2017140。附图说明图1短乳杆菌l.brevis2-34在mrs-arg培养基中培养时菌体浓度和氨基酸含量的变化。图2短乳杆菌l.brevis2-34在mrs-cit培养基中培养时菌体浓度和氨基酸含量的变化。具体实施方式实施例1短乳杆菌l.brevis2-34筛选方法将黄酒发酵液用无菌生理盐水(0.85％，w/v)按1:2比例稀释，涂布mrs平板，置于厌氧罐中30℃培养3-5天，挑取单菌落接种至mrs液体培养基，培养2天，镜检确定菌株形态后，提取基因组进行16srdna鉴定。所述mrs培养基为10g/l蛋白胨，10g/l牛肉膏，5g/l酵母粉，20g/l葡萄糖，5g/l乙酸钠，2g/l柠檬酸铵，2g/l磷酸氢二钾，1ml/l吐温-80，0.58g/l七水合硫酸镁，0.25g/l一水合硫酸锰，固体培养基则另外添加20g/l的琼脂。实施例2短乳杆菌l.brevis2-34的鉴定方法将黄酒发酵液与无菌生理盐水(0.85％，w/v)以1:2比例稀释，涂布到mrs平板上，在厌氧罐中生长3-5天，挑取单菌落到mrs液体培养基培养，镜检确定菌株形态后用ezup株式细菌基因组提取试剂盒(上海生工)提取该菌的基因组，以基因组为模板，以序列分别如seqidno:2和seqidno:3的细菌16srdna通用引物27f和1492r(5’-agagtttgatcctggctcag-3’，/5’-ggttaccttgttacgactt-3’)为引物进行pcr，扩增16srdna基因(约1400bp)，并送至上海天霖生物公司测序，将序列与ncbi已有序列比对，确定该菌为短乳杆菌(序列相似度为99％)，16srdna核苷酸序列见seqidno.1。该菌已于2017年3月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctccno:m2017140。实施例3短乳杆菌l.brevis2-34瓜氨酸利用能力的检测将mrs培养基中活化的短乳杆菌l.brevis2-34按1％接种量接种到氨基酸检测培养基(mrs培养基中添加5g/l精氨酸的mrs-arg以及添加4g/l瓜氨酸的mrs-cit培养基)，30℃静置培养72h，发酵过程中连续取样，高效液相色谱检测发酵液中精氨酸和瓜氨酸的含量。结果显示，该菌在mrs-arg培养基中生长时，精氨酸逐渐减少，瓜氨酸积累，至对数中期时(培养18h)瓜氨酸积累102mg/l，说明该菌利用精氨酸并向胞外分泌瓜氨酸，此后，精氨酸进一步被菌株利用，但胞外瓜氨酸消失，菌株也不再向胞外分泌瓜氨酸，说明该菌株可重新吸收并利用瓜氨酸(图1)。该菌在mrs-cit培养基中生长时，随着菌体生长即可吸收瓜氨酸并将其利用，培养12h进入对数期中期时，瓜氨酸利用速率显著提高，培养至21h时，培养基中的瓜氨酸可全部被吸收利用完(图2)。实施例4不添加短乳杆菌l.brevis2-34黄酒酿造黄酒酿造工艺流程：浸米-蒸饭-冷却-拌曲-落罐-前酵-后酵-过滤澄清。浸米：取适量糯米，加水浸过米层10cm，28℃浸泡3天。蒸饭：浸泡后的糯米进行常压蒸煮，大量蒸汽冒出后维持25min。冷却：将蒸熟的糯米置于通风摊凉至室温。拌曲：按照130g生麦曲、40g熟麦曲每1kg糯米的比例添加麦曲，并摊拌均匀。落罐：将拌好的糯米和麦曲、水(1.7l每1kg糯米)、酵母种子液(10％v/v)一起加入发酵罐，混合均匀。前酵：30℃发酵3-4天。后酵：15℃发酵15天左右。过滤澄清。实施例5短乳杆菌l.brevis2-34在黄酒酿造中的应用将短乳杆菌l.brevis2-34接种至活化培养基mrs(ph5.0)，30℃活化培养12-16h，接种到5l自动厌氧发酵罐进行高密度发酵，培养温度30℃，ph5.0，培养时间36-48h，经15000g冷冻离心10min制备高密度菌液(1010cfu/l)。进行黄酒酿造时，在不改变其它工艺的情况下，在落罐时将高密度菌液以0.1％(ml/l)的比例与酒母、水、糯米、麦曲原料混匀后，进行发酵。实施例6短乳杆菌l.brevis2-34在黄酒酿造中的应用将短乳杆菌l.brevis2-34接种至活化培养基mrs(ph5.0)，30℃活化培养12-16h，接种到5l自动厌氧发酵罐进行高密度发酵，培养温度30℃，ph5.0，培养时间36-48h，经15000g冷冻离心10min制备高密度菌液(108cfu/l)。进行黄酒酿造时，在不改变其它工艺的情况下，在落罐时将高密度菌液以0.5％(ml/l)的比例与酒母、水、糯米、麦曲原料混匀后，进行发酵。实施例7短乳杆菌l.brevis2-34在黄酒酿造中的应用将短乳杆菌l.brevis2-34接种至活化培养基mrs(ph5.0)，30℃活化培养12-16h，接种到5l自动厌氧发酵罐进行高密度发酵，培养温度30℃，ph5.0，培养时间36-48h，经15000g冷冻离心10min制备高密度菌液(109cfu/l)。进行黄酒酿造时，在不改变其它工艺的情况下，在落罐时将高密度菌液以0.5％(ml/l)的比例与酒母、水、糯米、麦曲原料混匀后，进行发酵。实施例8短乳杆菌l.brevis2-34在黄酒酿造中的应用将短乳杆菌l.brevis2-34接种至活化培养基mrs(ph5.0)，30℃活化培养12-16h，接种到5l自动厌氧发酵罐进行高密度发酵，培养温度30℃，ph5.0，培养时间36-48h，经15000g冷冻离心10min制备高密度菌液(109cfu/l)。进行黄酒酿造时，在不改变其它工艺的情况下，在落罐时将高密度菌液以1％(ml/l)的比例与酒母、水、糯米、麦曲原料混匀后，进行发酵。实施例9短乳杆菌l.brevis2-34在降低黄酒中氨基甲酸乙酯的应用以对照发酵罐黄酒醪液为参照样，利用气质联用的方法，对实施例8的添加体积比为1％短乳杆菌l.brevis2-34高密度菌液酿造的黄酒醪液中的氨基甲酸乙酯进行测定，如表1所示，接种了短乳杆菌l.brevis2-34的醪液中瓜氨酸和氨基甲酸乙酯含量分别减少了58.2％和29.6％。表1黄酒醪液中瓜氨酸和氨基甲酸乙酯的含量对照组醪液添加短乳杆菌l.brevis2-34醪液瓜氨酸38.5±1.116.1±0.8氨基甲酸乙酯含量(ug/l)43.8±3.230.88±2.6虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。序列表<110>江南大学<120>一株能高效利用瓜氨酸的短乳杆菌及其应用<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>1469<212>dna<213>人工合成<400>1gggagggcggctgctatactgcagtcgaacgagcttccgttgaatgacgtgcttgcactg60attttaacaatgaagcgagtggcgaactggtgagtaacacgtggggaatctgcccagaag120caggggataacacttggaaacaggtgctaataccgtataacaacaaaatccgcatggatt180ttgtttgaaaggtggcttcggctatcacttctggatgatcccgcggcgtattagttagtt240ggtgaggtaaaggcccaccaagacgatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggcca300cattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccaca360atggacgaaagtctgatggagcaatgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaa420ctctgttgttaaagaagaacacctttgagagtaactgttcaagggttgacggtatttaac480cagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttg540tccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagcct600tcggcttaaccggagaagtgcatcggaaactgggagacttgagtgcagaagaggacagtg660gaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcg720gctgtctagtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagat780accctggtagtccatgccgtaaacgatgagtgctaagtgttggagggtttccgcccttca840gtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactc900aaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgc960gaagaaccttaccaggtcttgacatcttctgccaatcttagagataagacgttcccttcg1020gggacagaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggtta1080agtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattcagttgggcactctggt1140gagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgcccctta1200tgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaacgagtcgcgaagtcgtgaggct1260aagctaatctcttaaagccgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaa1320gttggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgt1380acacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagccggtgagataaccttcg1440ggagtcagccgtctaaggtgaccagatgg1469<210>2<211>20<212>dna<213>人工合成<400>2agagtttgatcctggctcag20<210>3<211>19<212>dna<213>人工合成<400>3ggttaccttgttacgactt19当前第1页12