本发明涉及一种微生物培养方法，尤其涉及一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺。
背景技术：
屎肠球菌是我国农业部允许使用的16种可直接饲喂的饲料微生物品种之一。屎肠球菌作为乳酸菌家族成员之一，在提高幼年畜禽体增重、提高动物免疫力、调节肠道微生态平衡，提高营养吸收、减少腹泻率、降低死亡率等方面均有很好的效果，加之其对部分抗生素也具备很好的耐受性。因此，在目前的微生态制剂产业特别是饲料添加剂企业中，是深受众多厂家亲睐的一类乳酸菌产品。
目前，市场上常见的屎肠球菌是以液态发酵所得，产品活菌数虽高（可达200亿/g以上）但由于此类产品售价较高、易失活、保存条件苛刻，从而极大制约其产品在市场推广应用。
中国专利cn105132321a公开了一种屎肠球菌及其高密度固态发酵的培养基及方法，培养基成分(质量百分比)：麦麸15~25%，豆粕19~29%，甘蔗糖密3~5%，，活性炭2~4%，碳酸钙2~6%，β-环状糊精2~6%和水35~45%。该方法为：将屎肠球菌菌种按2~4%v/v的接种量接种到培养基中，于30-40℃的条件下密闭发酵，再将发酵产物于45-60℃烘干即可。但，该方法培养出来的屎肠球菌含较多的杂菌较多，不易常温贮存。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种杂菌少，易常温贮存的高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺。
为达到上述目的，本发明一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺，其特征在于该工艺包括下述顺序的步骤：
(1)菌株的筛选驯化：无菌操作取少量屎肠球菌冻干菌粉置于改良mrs培养基中，划线，37℃培养24h，分别挑取3-5个典型屎肠球菌单菌落分别划线mrs培养基中，连续纯化传代复壮3次，最后挑取复壮后屎肠球菌进行生理生化鉴定，待鉴定为屎肠球菌后，选取最优屎肠球菌单菌落，作为种子菌株，做一级种子液菌种；
(2)一级种子液培养：无菌操作挑取筛选驯化后屎肠球菌单菌落接种于一级种子培养液中，以30-40℃温度在摇床中培养8-24h，培养结束后即得一级种子液，置4℃冰箱中保存备用；
(3)二级种子液培养：以5%-10%v/v接种量将制备好的一级种子液接种到二级种子培养液中，以30-40℃温度在无菌环境下的种子罐培养8-24h获得二级种子液；
(4)固态发酵：以5%-20%v/v接种量将制备好的二级种子液均匀接种到固态发酵培养基中，在30-40℃无菌环境下发酵培养12-72h；
(5)烘干粉碎：发酵结束后将发酵产物置于30-50℃下烘干1-5h，再粉碎至50目即为屎肠球菌固态发酵成品；
(6)屎肠球菌检测计数：取上述粉碎产品用灭菌生理盐水按梯度逐级稀释，制成10-8的菌悬液，在灭菌平皿中注入250μl稀释后的菌悬液，再倒入适量的已熔化并冷至45℃左右的屎肠球菌检测用mrs培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入恒温培养箱中培养48h，待长出菌落后，计数。
改良mrs培养基配方（质量百分比）：葡萄糖1~2%，蛋白胨0.5~1.5%，牛肉膏0.5~1.5%，酵母浸粉0.2~1%，氯化钠0.2~0.8%，琼脂粉1~3%，碳酸钙0.1~3%，柠檬酸二铵0.1~1%，吐温800.01~0.1%，硫酸镁0.02~0.1%，硫酸锰0.01~0.05%，纯化水85.95~96.36%。
一级种子培养液配方（质量百分比）：蔗糖1~2%，葡萄糖1~2%，蛋白胨0.5~1.5%，碳酸钙1~5%，酵母浸粉0.2~1%，氯化钠0.2~0.8%，牛肉膏0.5~1.5%，硫酸镁0~0.8%，硫酸锰0.1~0.8%，磷酸氢二钾0.8~3.5%，纯化水86~95%。
二级种子液培养基配方（质量百分比）：蔗糖2~3%，葡萄糖0~1.5%，蛋白胨0.5~1.5%，碳酸钙1~5%，酵母浸粉0.2~1%，氯化钠0.2~0.8%，牛肉膏0.5~1.5%，硫酸镁0~0.8%，硫酸锰0.1~0.8%，磷酸氢二钾0.8~3.5%，纯化水86~95%。
固态发酵培养基配制（质量百分比）：豆粕10~40%、米糠2~10%，麸皮10~25%，碳酸钙1~10%，酵母浸粉0.1~2%，活性炭1~5%，硫酸镁0~1%，硫酸锰0~1%，纯化水40~75.9%，ph6.0~7.5，混合均匀，灭菌温度为110-121℃，灭菌时间1-30分钟，灭菌完成后待培养基温度降至40℃即可接种。
屎肠球菌检测用mrs培养基配方（质量百分比）：葡萄糖1~2%，蛋白胨0.5~1.5%，牛肉膏0.5~1.5%，碳酸钙1~5%，酵母浸粉0.2~1%，氯化钠0.2~0.8%，琼脂粉1~3%，纯化水86~95%。
典型屎肠球菌筛选驯化标准为：菌落形态为乳白色、圆形、表面光滑凸起、边缘整齐、直径0.5-2.0mm，菌落周围有一圈透明溶钙圈，溶钙圈越大越好，菌落大小均一，遗传性能稳定的菌株。
屎肠球菌生理生化鉴定：触酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、硫化氢试验阴性，革兰氏染色、葡萄糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖试验阳性。
摇床转速为120-240r/min。
种子罐转速为200-300r/min。
本发明具有如下优点:
1.杂菌率低，纯度高：≤2%；
2.可在常温中储存，耐贮存，方便运输：常温中保存1年，其活性还有85%，活性高；
3.耐高温：在40℃下保存，衰减率低；100℃下烘干，死亡率低。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
实施例一：
一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺，包括下述顺序的步骤：
(1)菌株的筛选驯化：无菌操作取少量屎肠球菌冻干菌粉置于包括葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，酵母浸粉0.2%，氯化钠0.2%，琼脂粉1%，碳酸钙0.1%，柠檬酸二铵0.1%，吐温800.01%，硫酸镁0.02%，硫酸锰0.01%，纯化水96.36%的改良mrs培养基中，划线，37℃培养24h，分别挑取3-5个典型屎肠球菌单菌落分别划线mrs培养基中，连续纯化传代复壮3次，最后挑取复壮后屎肠球菌进行生理生化鉴定，待鉴定为屎肠球菌后，选取最优屎肠球菌单菌落，作为种子菌株，做一级种子液菌种；
(2)一级种子液培养：无菌操作挑取筛选驯化后屎肠球菌单菌落接种于包括蔗糖1%，葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，碳酸钙1%，酵母浸粉0.2%，氯化钠0.2%，牛肉膏0.5%，硫酸镁0%，硫酸锰0.1%，磷酸氢二钾0.8%，纯化水95%的一级种子培养液中，以30-40℃温度在转速为120-240r/min的摇床中培养8-24h，培养结束后即得一级种子液，置4℃冰箱中保存备用；
(3)二级种子液培养：以5%-10%v/v接种量将制备好的一级种子液接种到包括蔗糖2%，葡萄糖0%，蛋白胨0.5%，碳酸钙1%，酵母浸粉0.2%，氯化钠0.2%，牛肉膏0.5%，硫酸镁0%，硫酸锰0.1%，磷酸氢二钾0.8%，纯化水95%的二级种子培养液中，以30-40℃温度在无菌环境下的转速为200-300r/min的种子罐培养8-24h获得二级种子液；
(4)固态发酵：以5%-20%v/v接种量将制备好的二级种子液均匀接种到包括豆粕10%、米糠2%，麸皮10%，碳酸钙1%，酵母浸粉0.1%，活性炭1%，硫酸镁0%，硫酸锰0%，纯化水75.9%的固态发酵培养基中，在30-40℃无菌环境下发酵培养12-72h；固态发酵培养基ph6.0~7.5，配制时需混合均匀，灭菌温度为110-121℃，灭菌时间1-30分钟，灭菌完成后待培养基温度降至40℃即可接种；
(5)烘干粉碎：发酵结束后将发酵产物置于30-50℃下烘干1-5h，再粉碎至50目即为屎肠球菌固态发酵成品；
(6)屎肠球菌检测计数：取上述粉碎产品用灭菌生理盐水按梯度逐级稀释，制成10-8的菌悬液，在灭菌平皿中注入250μl稀释后的菌悬液，再倒入适量的已熔化并冷至45℃左右的包括葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.5%，碳酸钙1%，酵母浸粉0.2%，氯化钠0.2%，琼脂粉1%，纯化水95%的屎肠球菌检测用mrs培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入恒温培养箱中培养48h，待长出菌落后，计数。
典型屎肠球菌筛选驯化标准为：菌落形态为乳白色、圆形、表面光滑凸起、边缘整齐、直径0.5-2.0mm，菌落周围有一圈透明溶钙圈，溶钙圈越大越好，菌落大小均一，遗传性能稳定的菌株。
屎肠球菌生理生化鉴定：触酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、硫化氢试验阴性，革兰氏染色、葡萄糖、麦芽糖、木糖、阿拉伯糖、纤维二糖试验阳性。
实施例二：
一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺，包括下述顺序的步骤：
(1)菌株的筛选驯化：无菌操作取少量屎肠球菌冻干菌粉置于包括葡萄糖2%，蛋白胨1.5%，牛肉膏1.5%，酵母浸粉1%，氯化钠0.8%，琼脂粉3%，碳酸钙3%，柠檬酸二铵1%，吐温800.1%，硫酸镁0.1%，硫酸锰0.05%，纯化水85.95%的改良mrs培养基中，划线，37℃培养24h，分别挑取3-5个典型屎肠球菌单菌落分别划线mrs培养基中，连续纯化传代复壮3次，最后挑取复壮后屎肠球菌进行生理生化鉴定，待鉴定为屎肠球菌后，选取最优屎肠球菌单菌落，作为种子菌株，做一级种子液菌种；
(2)一级种子液培养：无菌操作挑取筛选驯化后屎肠球菌单菌落接种于包括蔗糖2%，葡萄糖2%，蛋白胨1.5%，碳酸钙5%，酵母浸粉1%，氯化钠0.8%，牛肉膏1.5%，硫酸镁0.8%，硫酸锰0.8%，磷酸氢二钾3.5%，纯化水86%的一级种子培养液中，以30-40℃温度在转速为120-240r/min的摇床中培养8-24h，培养结束后即得一级种子液，置4℃冰箱中保存备用；
(3)二级种子液培养：以5%-10%v/v接种量将制备好的一级种子液接种到包括蔗糖3%，葡萄糖1.5%，蛋白胨1.5%，碳酸钙5%，酵母浸粉1%，氯化钠0.8%，牛肉膏1.5%，硫酸镁0.8%，硫酸锰0.8%，磷酸氢二钾3.5%，纯化水86%的二级种子培养液中，以30-40℃温度在无菌环境下的转速为200-300r/min的种子罐培养8-24h获得二级种子液；
(4)固态发酵：以5%-20%v/v接种量将制备好的二级种子液均匀接种到包括豆粕40%、米糠10%，麸皮25%，碳酸钙10%，酵母浸粉2%，活性炭5%，硫酸镁1%，硫酸锰1%，纯化水40%的固态发酵培养基中，在30-40℃无菌环境下发酵培养12-72h；固态发酵培养基配制需混合均匀，灭菌温度为110-121℃，灭菌时间1-30分钟，灭菌完成后待培养基温度降至40℃即可接种；
(5)烘干粉碎：发酵结束后将发酵产物置于30-50℃下烘干1-5h，再粉碎至50目即为屎肠球菌固态发酵成品；
(6)屎肠球菌检测计数：取上述粉碎产品用灭菌生理盐水按梯度逐级稀释，制成10-8的菌悬液，在灭菌平皿中注入250μl稀释后的菌悬液，再倒入适量的已熔化并冷至45℃左右的包括葡萄糖2%，蛋白胨1.5%，牛肉膏1.5%，碳酸钙5%，酵母浸粉1%，氯化钠0.8%，琼脂粉3%，纯化水86%的屎肠球菌检测用mrs培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入恒温培养箱中培养48h，待长出菌落后，计数。
实施例三
一种高纯度、耐常温贮存屎肠球菌固态发酵培养工艺，包括下述顺序的步骤：
(1)菌株的筛选驯化：无菌操作取少量屎肠球菌冻干菌粉置于包括葡萄糖1.5%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母浸粉0.6%，氯化钠0.5%，琼脂粉2%，碳酸钙2%，柠檬酸二铵0.5%，吐温800.05%，硫酸镁0.06%，硫酸锰0.025%，纯化水90%的改良mrs培养基中，划线，37℃培养24h，分别挑取3-5个典型屎肠球菌单菌落分别划线mrs培养基中，连续纯化传代复壮3次，最后挑取复壮后屎肠球菌进行生理生化鉴定，待鉴定为屎肠球菌后，选取最优屎肠球菌单菌落，作为种子菌株，做一级种子液菌种；
(2)一级种子液培养：无菌操作挑取筛选驯化后屎肠球菌单菌落接种于包括蔗糖1.5%，葡萄糖1.5%，蛋白胨1%，碳酸钙3%，酵母浸粉0.6%，氯化钠0.5%，牛肉膏1%，硫酸镁0.4%，硫酸锰0.35%，磷酸氢二钾2%，纯化水90%的一级种子培养液中，以30-40℃温度在转速为120-240r/min的摇床中培养8-24h，培养结束后即得一级种子液，置4℃冰箱中保存备用；
(3)二级种子液培养：以5%-10%v/v接种量将制备好的一级种子液接种到包括蔗糖2.5%，葡萄糖0.5%，蛋白胨1%，碳酸钙3%，酵母浸粉0.6%，氯化钠0.5%，牛肉膏1%，硫酸镁0.4%，硫酸锰0.35%，磷酸氢二钾2%，纯化水90%的二级种子培养液中，以30-40℃温度在无菌环境下的转速为200-300r/min的种子罐培养8-24h获得二级种子液；
(4)固态发酵：以5%-20%v/v接种量将制备好的二级种子液均匀接种到包括豆粕25%、米糠6%，麸皮12.5%，碳酸钙6%，酵母浸粉1%，活性炭3%，硫酸镁0.5%，硫酸锰0.5%，纯化水55%的固态发酵培养基中，在30-40℃无菌环境下发酵培养12-72h；固态发酵培养基配制需混合均匀，灭菌温度为110-121℃，灭菌时间1-30分钟，灭菌完成后待培养基温度降至40℃即可接种；
(5)烘干粉碎：发酵结束后将发酵产物置于30-50℃下烘干1-5h，再粉碎至50目即为屎肠球菌固态发酵成品；
(6)屎肠球菌检测计数：取上述粉碎产品用灭菌生理盐水按梯度逐级稀释，制成10-8的菌悬液，在灭菌平皿中注入250μl稀释后的菌悬液，再倒入适量的已熔化并冷至45℃左右的包括葡萄糖1.5%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，碳酸钙3%，酵母浸粉0.6%，氯化钠0.5%，琼脂粉2%，纯化水90%的屎肠球菌检测用mrs培养基，与菌液混匀，冷却、待凝固后，放入恒温培养箱中培养48h，待长出菌落后，计数。
以上实施例效果：
由于屎肠球菌在培养过程中分泌乳酸将培养基中的碳酸钙溶解，使得菌落的周围形成一个透明圈，因此，在计数时有透明圈的菌落即为屎肠球菌，而无透明圈的菌落为杂菌。每克粉碎产品活菌数计算公式：同一稀释度三个以上重复平皿菌落平均数×108×4单位：cfu/g
1.常温下储存衰减实验
实验方法：实验选取3个不同生产批次的屎肠球菌产品，用铝箔袋封口，放置于室内避光常温条件下存储（说明：该存放地为福建龙岩，夏季室内最高温度达35℃，冬季室内温度最低在5℃以上），每天早晚记录室内温湿度，每隔3个月取样做平皿活菌计数，观察统计衰减情况。
表1.常温下保存1年衰减情况统计
实验结果：实验中3个样品都是在2-3月陆续开始，实验结果表明存放3个月本发明屎肠球菌产品衰减在0-2%之间，在存放6个月、9个月衰减最严重在5-12%之间（夏季高温乳酸菌衰减加剧有关），最后三个月衰减率为2%-3%之间（冬季温度较低乳酸菌衰减缓慢）。说明本专利产品在经过一年常温条件下保存，衰亡损失率≤15%。
2.高温衰减试验：
实验方法1：从市场上挑取不同厂家生产的固态、液态屎肠球菌与本发明产品做40℃高温保存对比实验。实验结果如下表：
表2.40℃恒温培养箱中保存7天衰减情况统计
实验结果：从上表可以得出本发明专利产品屎肠球菌在40℃高温环境下保存7天其衰减率远低于上述固态发酵和液态发酵屎肠球菌。
实验方法2：从市场上挑取不同厂家生产的固态、液态屎肠球菌与本发明产品做100℃高温抗逆性对比实验。实验结果如下表：
表3.100℃高温抗逆性对比情况统计
实验结果：从上表可以得出本发明专利产品屎肠球菌在100℃高温环境下抗逆性远高于上述固态发酵和液态发酵屎肠球菌。