双环肽E[c(RGDfK)]2及其制备方法与流程

本发明涉及环肽，具体地，涉及双环肽e[c(rgdfk)]2及其制备方法。

背景技术：

人们身体内所有器官都是由细胞组成。有序的细胞增长和分化可满足身体需要，维持身体健康。然而，如果细胞持续分裂，不再受身体控制，无限代谢生殖，那么这些额外的大量细胞就形成肿瘤。恶性肿瘤的细胞能侵犯、破坏邻近的组织和器官。而且，癌细胞可从肿瘤中穿出，进入血液或淋巴系统，危及生命。

目前已经研发出许多抗肿瘤药物，且都具有有效的药理活性，但是它们的溶解性差，在体内很快会被清除，以及具有一定的毒性和副作用，使得它们的临床应用受到了限制。

在药物研发中，多学科交叉越来越重要。高分子材料科学和药物制剂学的发展催生了药用高分子材料学。药用高分子材料直接促进了药物输送系统(drugdeliverysystem)的发展。药用高分子材料为开发缓释制剂、靶向制剂、自调式给药制剂、生物药的非注射给药制剂以及中药制剂的现代化提供了物质基础。两亲性聚合物胶束作为药物载体具有很多优势：(1)提高难溶性药物溶解度。难溶性药物可被包裹于胶束疏水性内核中，难溶药物在其中的分配系数高，具有很高的载药量；(2)提高药物稳定性。药物被包裹后，可避免一些外周环境因素的影响(例如对于一些蛋白药物或者多肽类药物，可以起到保护药物的作用，防止药物被酶解)；(3)提高生物利用度。胶束外壳的亲水段为胶束披上了一层“伪装”，不易被吞噬细胞或蛋白质识别，可避免被内状网皮系统(res)捕获，延长了胶束在血液和组织的滞留时间，提高药物的生物利用度；(4)靶向作用。被动靶向性或通过引入一些特殊功能基使胶束具有主动靶向性，提高疗效，降低副作用。

近年来，肿瘤成像和治疗的目标是αvβ3整合素，因为它在多种癌细胞类型(黑素瘤，成胶质细胞瘤，卵巢，乳腺，前列腺癌等)上过表达。这种整合素在人类肿瘤转移和肿瘤诱导的血管生成中发挥关键作用。arg-gly-asp(rgd)肽序列已被鉴定是选择性识别αvβ3整联蛋白有用的靶向配体。环状rgd五肽不仅对αvβ3具有高亲和力，尤其是环状五肽(arg-gly-asp-phe-lys)(c(rgdfk))以高亲和力选择性结合整联蛋白αvβ3。由于环肽比线形肽有更好的刚性强度和更好的特异性，同时，不易被体内氨肽酶羧肽酶等酶切割降解等优点，受到广泛重视。虽然环状rgd五肽具有上述优异的特性，但是其稳定性较差。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种双环肽e[c(rgdfk)]2及其制备方法，该双环肽e[c(rgdfk)]2具有优异的稳定性且该制备方法条件温和。

为了实现上述目的，本发明提供了一种双环肽e[c(rgdfk)]2的制备方法，该备方法包括：

1)将树脂与fmoc-asp-oall(fmoc-l-天冬氨酸alpha-烯丙酯)浸泡于dcm(二氯甲烷)中，接着加入diea(n，n-二异丙基乙胺)进行接触反应，然后进行洗涤；

2)将dcm、甲醇和diea加入反应体系中进行封头处理，接着加入哌啶进行脱保护，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；

3)将g(甘氨酸)、hobt(1-羟基苯并三氮唑)、tbtu(o-苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲四氟硼酸酯)加入反应体系中进行接触反应，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；

4)将r(精氨酸)、k(赖氨酸)、f(苯丙氨酸)依次加入反应体系中进行接触反应，接着加入pd(pph3)4(四(三苯基磷)钯)进行丙烯基去除反应，然后加入哌啶进行脱保护、洗涤至洗脱废液无色或淡红色；

5)将diea、hobt、hbtu(苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯)加入反应体系中进行接触反应，接着加入水合肼(n，n-二甲基甲酰胺)和dmf的混合溶液进行二次反应，然后洗涤脱除dde直至茚三酮检测为蓝色；

6)将fmoc-glu-oh(fmoc-l-谷氨酸/芴甲氧羰基-l-谷氨酸)、hobt、dmf、tbtu滴加至反应体系中进行接触反应，接着洗涤直至茚三酮检测为无色或者微弱的蓝色；

7)将哌啶加入反应体系中进行脱保护，接着依次通过dmf、dcm、甲醇洗涤，然后干燥、加入切割液切割、沉降、纯化以制得双环肽e[c(rgdfk)]2；

其中，树脂选自2-cl树脂和wang树脂中的至少一者。

本发明还提供了一种双环肽e[c(rgdfk)]2，该双环肽e[c(rgdfk)]2通过上述的制备方法制备而得。

在上述技术方案，本发明先用固相合成法合成出稳定性能好的双环肽e[c(rgdfk)]2。与现有技术相比，该双环肽e[c(rgdfk)]2能够使得制得的抗癌药物在生物体内具有更优异的稳定性，使其具有较广阔的应用前景。同时，该制备方法条件温和，进而使得其适用于规模化生产。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1是双环肽的化学结构图：

图2是检测例1中双环肽的质谱图；

图3是检测例2中双环肽的hplc检测图；

图4是检测例3中双环肽对温度稳定性的检测结果图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种双环肽e[c(rgdfk)]2的制备方法，该备方法包括：

1)将树脂与fmoc-asp-oall(fmoc-l-天冬氨酸alpha-烯丙酯)浸泡于dcm(二氯甲烷)中，接着加入diea(n，n-二异丙基乙胺)进行接触反应，然后进行洗涤；

2)将dcm、甲醇和diea加入反应体系中进行封头处理，接着加入哌啶进行脱保护，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；

3)将g(甘氨酸)、hobt(1-羟基苯并三氮唑)、tbtu(o-苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲四氟硼酸酯)加入反应体系中进行接触反应，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；

4)将r(精氨酸)、k(赖氨酸)、f(苯丙氨酸)依次加入反应体系中进行接触反应，接着加入pd(pph3)4(四(三苯基磷)钯)进行丙烯基去除反应，然后加入哌啶进行脱保护、洗涤至洗脱废液无色或淡红色；

5)将diea、hobt、hbtu(苯并三氮唑-n，n，n'，n'-四甲基脲六氟磷酸酯)加入反应体系中进行接触反应，接着加入水合肼(n，n-二甲基甲酰胺)和dmf的混合溶液进行二次反应，然后洗涤脱除dde直至茚三酮检测为蓝色；

6)将fmoc-glu-oh(fmoc-l-谷氨酸/芴甲氧羰基-l-谷氨酸)、hobt、dmf、tbtu滴加至反应体系中进行接触反应，接着洗涤直至茚三酮检测为无色或者微弱的蓝色；

7)将哌啶加入反应体系中进行脱保护，接着依次通过dmf、dcm、甲醇洗涤，然后干燥、加入切割液切割、沉降、纯化以制得双环肽e[c(rgdfk)]2；

其中，树脂选自2-cl树脂和wang树脂中的至少一者。

在在上述制备方法的步骤1)中，各物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤1)中，相对于1g的树脂，fmoc-asp-oall的用量为0.5-0.6g，dcm的用量为20-30ml，diea的用量为1-1.5ml。

在在上述制备方法的步骤1)中，浸泡条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤1)中，浸泡至少满足以下条件：浸泡温度为20-25℃，浸泡时间为2-5min。

在上述制备方法的步骤1)中，接触反应条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤1)中，接触反应至少满足以下条件：反应温度为20-25℃，反应时间为2-3h。

在上述制备方法的步骤2)中，物料的用量可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤2)中，相对于1g的树脂，dcm的用量为20-30ml，甲醇的用量为1-1.5ml，diea的用量为1-1.5ml，哌啶的用量为5-20ml。

在上述制备方法的步骤2)中，封头处理条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤2)中，封头处理至少满足以下条件：处理温度为20-25℃，处理时间为30-50min。

在上述制备方法的步骤2)中，脱保护条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤2)中，脱保护至少满足以下条件：温度为20-25℃，时间为15-30min。

在上述制备方法的步骤3)中，物料用量可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能能够更好合成，优选地，在步骤3)中，相对于1g的树脂，g的用量为0.9-1g，hobt的用量为0.5-0.6g，tbtu的用量为1-1.5g。

在上述制备方法的步骤3)中，接触反应条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤3)中，接触反应至少满足以下条件：反应温度为20-25℃，反应时间为1-1.5h。

在上述制备方法的步骤4)中，物料用量可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤4)中，相对于10mg的树脂，r的用量为2-2.5g，k的用量为1.6-2g，f的用量为1.2-1.5g，pd(pph3)4的用量为1.2-1.5g。

在上述制备方法的步骤4)中，接触反应条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤4)，接触反应至少满足以下条件：反应温度为20-25℃，反应时间为45-60min。

在上述制备方法的步骤4)中，丙烯基去除反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤4)中，丙烯基去除反应至少满足以下条件：反应温度为20-25℃，反应时间为2-3h。

在上述制备方法的步骤5)中，物料用量可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤5)中，相对于1g的树脂，diea的用量为1-1.5ml，hobt的用量为0.5-0.6g，hbtu的用量为1.1-1.5g，水合肼dmf溶液的用量为15-20ml，并且水合肼dmf混合溶液中水合肼的浓度不低于20％；

在上述制备方法的步骤5)中，接触反应条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤5)中，接触反应至少满足以下条件：反应温度为20-25℃，反应时间为4-8h。

在上述制备方法的步骤5)中，二次反应条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤5)中，二次反应至少满足以下条件：反应温度为20-25℃，反应时间为2-4h。

在上述制备方法的步骤6)中，物料用量可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤6)中，相对于1g的树脂，fmoc-glu-oh的用量为1-1.1g，hobt的用量为0.5-0.6g，dmf的用量为15-20ml，tbtu的用量为1-1.5g。

在上述制备方法的步骤6)中，接触反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤6)中，接触反应至少满足以下条件：反应温度为20-25℃，滴加完成后反应时间为1-2h。

在上述制备方法的步骤7)中，接触反应的条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，在步骤7)中，相对于1g的树脂，哌啶的用量为15-20ml。

在上述制备方法的步骤7)中，切割液的具体组分可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，切割液由tfa(三氟乙酸)、tis(三异丙基硅烷)、edt(1，2-乙二硫醇)和水组成；其中，各组分的含量可以在宽的范围内选择，更优选地，tfa、tis、edt和水的体积比为95：1.5-2.5：1.5-2.5：0.8-1.2。

在上述制备方法的步骤7)中，切割条件可以在宽的范围内选择，但是为了使得制得的双环肽e[c(rgdfk)]2能够更好合成，优选地，切割至少满足以下条件：切割温度为20-25℃，切割时间为2-2.5h。

本发明还提供了一种双环肽e[c(rgdfk)]2，该双环肽e[c(rgdfk)]2通过上述的的制备方法制备而得。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。双环肽纯度的纯度的检测是通过液相色谱(hplc)测得，稳定性测试是通过精密ph计，电热恒温水浴锅和荧光分光光度计。

实施例1

制备双环肽e[c(rgdfk)]2

a、称量2-cl树脂1g于20ml的20℃的dcm中浸泡2min，然后用dmf、dcm各洗一次；以20mldcm作溶剂，称量0.5g的fmoc-asp-oall，与1ml的diea、2-cl树脂1g在20℃下反应2h，然后用dmf洗涤2次；用20mldcm+1ml甲醇+1mldiea在20℃下封头30min，用dmf洗涤3次；用15ml哌啶在20℃下脱保护，反应15min，然后用dmf洗涤4次，直至茚三酮检测为蓝色；

b、向体系中投0.9gg和0.5mghobt，加1gtbtu作为催化剂，20mldmf作溶剂在20℃下反应1h，然后洗涤3次，直至茚三酮检测为蓝色；依次加入2gr、1.6gk、1.2gf于20℃下反应45min；

c、用1.2g的pd(pph3)4，在20℃下反应2h去除丙烯基；用15ml哌啶于20℃下脱保护处理15min，然后用dmf、dcm、甲醇依次洗涤，至洗脱废液无色或淡红色；加1mldiea、0.5ghobt、1.1mghbtu、用15mldmf做反应溶剂，于20℃下反应4h，使其形成环肽；

d、向体系中加15ml水合肼dmf溶液(水合肼的浓度为20％)于20℃下反应2h，洗涤干净，脱除dde，茚三酮检测为蓝色即可。再称取1g的fmoc-glu-oh、15ml的hobt溶液(浓度为33％，溶剂为dmf)，并且加入1g的tbtu，按照缓慢滴定的方式加入反应系统中(反应系统可加入一定量dmf以供鼓泡)，待完全滴加完全后于20℃下再反应1h内。反应结束后洗涤，茚三酮检测为无色或者微弱的蓝色即可；用15ml哌啶于20℃下脱保护处理15min，然后dmf、dcm、甲醇依次洗涤，甲醇洗涤吹干；按质量体积比1g：10ml加切割液(含有tfa、tis、edt和水，并且体积比依次为为95：2：2：1)切割，沉降，纯化检测得到双环肽e[c(rgdfk)]2(纯度88.22％，质量0.48g)。

实施例2

制备双环肽e[c(rgdfk)]2

a、称量2-cl树脂1g于30ml的25℃的dcm中浸泡5min，然后用dmf、dcm各洗一次；以30mldcm作溶剂，称量0.6g的moc-asp-oall，与1.5ml的diea、2-cl树脂1g在25℃下反应3h，然后用dmf洗涤2次；用30mldcm+1.5ml甲醇+1.5mldiea在25℃下封头50min，用dmf洗涤3次；用20ml哌啶在25℃下脱保护，反应30min，然后用dmf洗涤4次，直至茚三酮检测为蓝色；

b、向体系中投1gg和0.6ghobt，加1.5gtbtu作为催化剂，30mldmf作溶剂在25℃下反应1.5h，然后洗涤3次，直至茚三酮检测为蓝色；依次加入2.5gr、2gk、1.5gf于25℃下反应1h；

c、用1.5g的pd(pph3)4，在25℃下反应3h去除丙烯基；用20ml哌啶于25℃下脱保护处理30min，然后用dmf、dcm、甲醇依次洗涤，至洗脱废液无色或淡红色；加1.5mldiea、0.6ghobt、1.5ghbtu、用30mldmf做反应溶剂，于25℃下反应8h，使其形成环肽；

d、向体系中加20ml水合肼dmf溶液(水合肼的浓度为20％)于25℃下反应4h，洗涤干净，脱除dde，茚三酮检测为蓝色即可。再称取1.1g的fmoc-glu-oh、0.6g的hobt溶液(浓度为20％，溶剂为dmf)，并且加入1.5g的tbtu，按照缓慢滴定的方式加入反应系统中(反应系统可加入一定量dmf以供鼓泡)，待完全滴加完全后于25℃下再反应3h内。反应结束后洗涤，茚三酮检测为无色或者微弱的蓝色即可；用20ml哌啶于25℃下脱保护处理30min，然后dmf、dcm、甲醇依次洗涤，甲醇洗涤吹干；按质量体积比1g：10ml加切割液(含有tfa、tis、edt和水，并且体积比依次为为95：2：2：1)切割，沉降，纯化检测得到双环肽e[c(rgdfk)]2(纯度89.21％，质量0.38g)。

实施例3

制备双环肽e[c(rgdfk)]2

a、称量2-cl树脂1g于25ml的23℃的dcm中浸泡3min，然后用dmf、dcm各洗一次；以25mldcm作溶剂，称量0.6g的fmoc-asp-oall，与1.2ml的diea、2-cl树脂1g在23℃下反应2.5h，然后用dmf洗涤2次；用25mldcm+1.2ml甲醇+1.2mldiea在23℃下封头45min，用dmf洗涤3次；用17ml哌啶在23℃下脱保护，反应20min，然后用dmf洗涤4次，直至茚三酮检测为蓝色；

b、向体系中投1gg和0.55ghobt，加1.7gtbtu作为催化剂，25mldmf作溶剂在23℃下反应50min，然后洗涤2次，直至茚三酮检测为蓝色；依次加入2.2gr、1.8gk、1.4gf于23℃下反应50min；

c、用1.4g的pd(pph3)4，在23℃下反应2.5h去除丙烯基；用17ml哌啶于23℃下脱保护处理20min，然后用dmf、dcm、甲醇依次洗涤，至洗脱废液无色或淡红色；加1.2mldiea、0.55ghobt、1.3ghbtu、用25mldmf做反应溶剂，于23℃下反应6h，使其形成环肽；

d、向体系中加17ml水合肼dmf溶液(水合肼的浓度为20％)于23℃下反应3h，洗涤干净，脱除dde，茚三酮检测为蓝色即可。再称取1.1g的fmoc-glu-oh、25ml的hobt溶液(浓度为22％，溶剂为dmf)，并且加入1.7g的tbtu，按照缓慢滴定的方式加入反应系统中(反应系统可加入一定量dmf以供鼓泡)，待完全滴加完全后于23℃下再反应3h内。反应结束后洗涤，茚三酮检测为无色或者微弱的蓝色即可；用17ml哌啶于23℃下脱保护处理20min，然后dmf、dcm、甲醇依次洗涤，甲醇洗涤吹干；按质量体积比1g：10ml加切割液(含有tfa、tis、edt和水，并且体积比依次为为95：2：2：1)切割，沉降，纯化检测得到双环肽e[c(rgdfk)]2(纯度89.41％，质量0.42g)。

检测例1

对上述实施例1中制得的双环肽e[c(rgdfk)]2进行质谱检测，检测见过见图2，通过该图可知，该双环肽e[c(rgdfk)]2的结构与图1相吻合。

按照相同的方法对实施例2-3中制得的双环肽e[c(rgdfk)]2进行质谱检测，检测结果与实施例1中制得的双环肽e[c(rgdfk)]2的检测结果基本保持一致。

检测例2

对上述实施例中制得的双环肽e[c(rgdfk)]2进行hplc检测，检测结果见图3，通过该图可知，该双环肽e[c(rgdfk)]2的结构与图1相吻合。

按照相同的方法对实施例2-3中制得的双环肽e[c(rgdfk)]2进行hplc质谱检测，检测结果与实施例1中制得的双环肽e[c(rgdfk)]2的检测结果基本保持一致。

检测例3

在不同ph值和不同温度下对双环肽稳定性进行研究：

1)取一定量的双环肽溶液，用1mol/lhcl溶液和1mol/lnaoh溶液调整溶液的ph值分别为2.0、4.0、6.0、8.0、10.0，配置浓度为23.00μg/ml，体积为5ml的多肽溶液，于37℃水浴中放置4h，每隔一小时取样，之后立即用2mol/ltris缓冲液(ph＝7.0)将ph调至7右，测溶液中多肽的含量，研究不同ph值对双环肽稳定性的影响，结果见表1。

表1

2)取双环肽冻干粉用ph为6.4的pbs缓冲溶液配成20.00μg/ml溶液，分别取4ml于试管中，在60℃、70℃、75℃和80℃的条件下加热，每隔一小时取样，在冰水浴中迅速冷却后测定溶液中双环肽的含量，共11次取样，研究不同加热处理对双环肽稳定性的影响，结果见图4。

按照相同的方法对实施例2-3中制得的双环肽e[c(rgdfk)]2进行温度和酸碱性稳定性检测，检测结果与实施例1中制得的双环肽e[c(rgdfk)]2的检测结果基本保持一致。

通过表1和图3可知，本发明提供的双环肽对于酸碱性以及温度均有优异的稳定性。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。