文蛤多肽及其制备方法与应用与流程

本发明属于海洋生物
技术领域：
，具体涉及文蛤多肽及其制备方法与应用。尤其是文蛤多肽mmp13及其类似物(mmp13-1、mmp13-2、mmp13-3、mmp13-4、mmp13-5)。
背景技术：
：衰老是人类生命过程的必然规律，也是一种不可抗拒的自然现象，而当前全球人口老龄化加剧的事实，迫使人类社会面临着艰巨的养老和抗衰老压力。衰老的自由基学说认为体内的活性氧及其自由基对机体细胞有明显的破坏作用，会引起各种生物结构的广泛损伤，包括生物膜变性、染色体移位、dna突变、组织破坏和老化等，最终导致机体衰老。运用衰老相关的现代理论，以食疗保健的方式来延缓衰老进程，不失为一种有效的抗衰老策略。以食源性的材料为物质基础，通过适宜的提取、制备方法，寻找具有抗氧化、延寿功能的生物活性成分，有助于开发延缓衰老功能相关的保健产品。传统医学对延年益寿和神经保护有悠久的研究历史，而丰富的海洋生物资源种类则为之提供了庞大的资源库。我国海洋资源丰富，海洋生物资源具有鲜明的地域特色，历代流传下来的著作颇多且记述详尽，为海洋资源的研究和开发提供了宝贵资料。自20世纪70年代以来，人们已经从海洋生物中分离出数万种新型化合物，包括肽类、蛋白质类、多糖类、生物碱类、萜类、大环聚酯类等类型。其中，肽类是海洋生物活性物质中数量最庞大的一类化合物，达数万种之多，包括海洋肽类毒素与海洋生物活性肽等。生物活性肽类具有分子量小、无免疫原性、结构简单、副作用小、功效显著等优点。此外，由于海洋生物生存的特定环境，海洋生物多肽的结构与陆生动植物肽(糖肽)有很大不同，多为小分子环肽，含有丰富的d型氨基酸、羟基酸、噻酚、恶唑环，有的还含有烯键与炔键，这大大提高了肽的生物稳定性及生物利用度。研究表明生物活性肽具有多种药理活性，可用于预防和 延缓衰老及衰老相关的多种疾病。kim等从皮氏叫姑鱼(johniusbelengerii)中分离活性化肽能够显著抑制脂质过氧化反应；shoji-kawata等鉴定一种可诱导自噬的多肽，能够有效地抑制多种致病因子；martorell等从可可(theobromacacao)中分离抗氧化活性肽13l(dnydnsagkwwvt)，可以减少阿尔茨海默病秀丽线虫aβ沉积，具有预防和治疗神经退行性疾病的潜能。因此，发掘海洋生物资源中具有抗氧化、延缓衰老、神经保护作用的多肽类活性成分有助于促进海洋生物资源的综合开发与利用。贝类性平、味甘、咸，具有滋阴补肾、调中的功效。《本草从新》记载着贝肉下气调中、利五脏、疗消渴的功效。其中，文蛤(meretrixmeretrixl.)又称蛤蜊，属于双壳纲帘蛤目帘蛤科的贝类，是我国重要的海洋贝类资源，其肉质鲜美、营养丰富，具有很高的食疗和药用价值。目前对文蛤多肽的研究主要集中在其抗肿瘤方面的利用，如公开号为cn102161699a的中国专利中公开了一种经硫酸铵分级沉淀、超滤、离子交换层析、疏水层析、反相层析后获得一种分子量为15kda、n-末端序列为ideiqntgggtnfr、具抗肿瘤活性的文蛤多肽，其应用于生物制药领域里预防和/或治疗恶性肿瘤。然而目前文蛤蛋白多肽在抗氧化、延缓衰老方面的应用和报道并不多，因此，开发具有延衰作用的文蛤活性多肽将对抗衰老及衰老相关疾病的预防和治疗均具有重大的意义，也将为文蛤多肽类产品的开发应用提供依据。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供具有抗氧化和延缓衰老活性的文蛤多肽及其制备方法与应用。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案。一种文蛤多肽mmp13，其具有seqidno:1所示的氨基酸序列。本发明通过将文蛤软体匀浆后离心，取上清干燥，乙醇提取、超滤膜截留、凝胶层析分离，反相液相色谱串联质谱分离得到文蛤多肽mmp13，其具有seqidno:1所示的氨基酸序列，序列具体为lsdrleetggass。本发明还提供了在具有seqidno:1所示的氨基酸序列的文蛤多肽mmp13的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基所得到的氨 基酸序列的文蛤多肽mmp13类似物。所述的氨基酸取代、缺失或添加，可以在氨基酸序列的任意位点进行，只要具有改造后的氨基酸序列的多肽具有抗氧化和延缓衰老活性即可。类似的，所取代、缺失或添加的氨基酸的数目也是任意的，只要具有改造后的氨基酸序列的多肽具有抗氧化和延缓衰老活性。其中，在一些实施方案中，所述文蛤多肽mmp13类似物，其具有seqidno:2所示的氨基酸序列，序列具体为qlsdrleetggass，命名为mmp13-1。在一些实施方案中，所述文蛤多肽mmp13类似物，其具有seqidno:3所示的氨基酸序列，序列具体为ieqlsdrleetggass，命名为mmp13-2。在一些实施方案中，所述文蛤多肽mmp13类似物，其具有seqidno:4所示的氨基酸序列，序列具体为qieqlsdrleetggass，命名为mmp13-3。在一些实施方案中，所述文蛤多肽mmp13类似物，其具有seqidno:5所示的氨基酸序列，序列具体为lsdrleetggassiqhe，命名为mmp13-4。在一些实施方案中，所述文蛤多肽mmp13类似物，其具有seqidno:6所示的氨基酸序列，序列具体为qieqlsdrleetggassiqhe，命名为mmp13-5。本发明也提供了编码本发明所述文蛤多肽mmp13及其类似物的dna分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的特定多肽的核苷酸序列。对于编码本发明所述文蛤多肽mmp13及其类似物的dna分子，本领域技术人员可以很容易的利用现有公知的方法制造合成。诸如，通过选择对应于构成所述的氨基酸序列的氨基酸残基的密码子，可很容易地确定和提供相应于文蛤多肽mmp13及其类似物多肽的氨基酸序列的dna分子。本发明还提供了所述文蛤多肽的制备方法，文蛤软体匀浆后离心，取上清干燥，乙醇提取醇溶多肽，用截留分子量为3kda超滤膜截留，收集分子量<3kda的超滤组分，凝胶色层析法分离后，反相液相色谱串联质谱分离。作为优选，所述的制备方法中，所述匀浆后离心为5000g～15000g离心10min～50min。作为优选，所述的制备方法中，所述乙醇提取为加入60％～80％乙醇提取，提取时间为12～24h。作为优选，所述的制备方法中，所述凝胶层析法分离具体为sephadexg-25的凝胶层析柱对mw<3kda多肽组分进行分离，以500μl的上样体积和20 mg/ml的浓度进行进针加样，以水为流动相、1ml/min的速度进行洗脱，紫外检测器检测各个时间点的洗脱液在280nm处的吸光值，收集200min内的洗脱组分。作为优选，所述的制备方法中，反相液相色谱串联质谱分离具体为取收集的200min内的洗脱组分，溶解于含0.1v/v％甲酸、2v/v％乙腈的水溶液中，纳升液相色谱-质谱联用分析；所述纳升液相色谱-质谱联用分析为在纳升液相色谱的捕集柱上进样，以0.1v/v％甲酸、2v/v％乙腈的水溶液以2.5μl/min的流速洗脱10min，然后以0.1v/v％甲酸、2v/v％水的乙腈溶液进行梯度洗脱，液相洗脱梯度为50min内b液从5～35％，分析柱为反相色谱柱，同时进行质谱扫描分析。所述分析柱可以为c18反相色谱柱，规格为75μm×15cm，3μm，百草枯是一类电子受体，作用于细胞的氧化还原反应，在细胞内活化为氧自由基是毒作用的基础，所形成的过量超氧化阴离子自由基及过氧化氢(h2o2)等可引起多组织器官细胞膜脂质过氧化，从而造成多系统组织器官的损害。因此，抑制其对细胞的氧化损伤能够有效缓解神经毒性。本发明将所述文蛤多肽mmp13加入百草枯造模的秀丽线虫培养液中，定时统计秀丽线虫存活的比率，检测所述文蛤多肽mmp13对百草枯诱导的氧化胁迫的影响，结果显示本发明所述文蛤多肽mmp13具有显著的抗氧化作用。寿命作为衰老的最可靠、最具代表性的衡量指标，可从整体水平评价了生物个体或群体的衰老程度。本发明将所述文蛤多肽mmp13及其类似物(mmp13-1、mmp13-2、mmp13-3、mmp13-4、mmp13-5)加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中培养后，定时统计秀丽线虫的存活情况，检测所述文蛤多肽mmp13及其类似物对秀丽线虫寿命的影响。结果显示，本发明所述文蛤多肽mmp13及其类似物能够延长秀丽线虫在自然条件下的存活时间，具有延缓衰老进程的作用。因此，本发明提供了所述文蛤多肽mmp13及其类似物(mmp13-1、mmp13-2、mmp13-3、mmp13-4、mmp13-5)在制备抗氧化、抗衰老的药物中的应用。本领域技术人员可将本发明所述文蛤多肽mmp13及其类似物(mmp13-1、mmp13-2、mmp13-3、mmp13-4、mmp13-5)直接或间接加入 制备不同剂型时所需的药学上可接受的各种常用辅料，如填充剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂等，以常规药物制剂方法，制成常用制剂如片剂、胶囊剂、注射液、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂和滴丸剂等。其中，填充剂如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸；崩解剂如琼脂，碳酸钙，土豆淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠，低取代羟丙基纤维素；润滑剂如滑石粉，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，月桂硫酸钠；粘合剂如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯酮，蔗糖和阿拉伯胶。本发明所述文蛤多肽mmp13及其类似物(mmp13-1、mmp13-2、mmp13-3、mmp13-4、mmp13-5)还可以制备成抗氧化、抗衰老的保健品。由上述技术方案可知，本发明提供了文蛤多肽及其制备方法与应用。本发明所述文蛤多肽其具有seqidno:1所示的氨基酸序列。实验结果表明本发明所述文蛤多肽mmp13及其类似物均具有很好的抗氧化、抗衰老作用。本发明提供的制备方法，能够充分利用文蛤丰富资源得到具有强抗氧化、抗衰老作用文蛤多肽mmp13及其类似物。本发明所述文蛤多肽mmp13及其类似物可以用于制备成抗氧化、抗衰老药物或者抗氧化、抗衰老保健品，应用范围广泛，具有良好的经济和社会效应。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。图1示实施例1凝胶层析分离色谱图；图2示文蛤多肽mmp13的高效液相色谱图；图3示文蛤多肽mmp13的质谱图；图4示实施例2抗百草枯诱导的氧化胁迫实验中文蛤多肽mmp13对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；图5示实施例3秀丽线虫寿命实验中文蛤多肽mmp13对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；图6示实施例3秀丽线虫寿命实验中文蛤多肽mmp13-1对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；图7示实施例3秀丽线虫寿命实验中文蛤多肽mmp13-2对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；图8示实施例3秀丽线虫寿命实验中文蛤多肽mmp13-3对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；图9示实施例3秀丽线虫寿命实验中文蛤多肽mmp13-4对秀丽线虫存活率影响的生存曲线；图10示实施例3秀丽线虫寿命实验中文蛤多肽mmp13-5对秀丽线虫存活率影响的生存曲线。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。为了进一步理解本发明，下面结合具体实施例对本发明做详细阐述。实施例1、文蛤多肽mmp13的制备新鲜的文蛤进行去壳处理，用水先后清洗3～4次清洗掉泥沙，将文蛤软体进行充分匀浆，匀浆液经5000g离心10min，取上清真空冷冻干燥，加入60～80％乙醇提取24h，10000g离心30min，取上清液用截留分子量为3kda超滤膜截留后，得mw<3kda的超滤组分。利用sephadexg-25的凝胶层析柱(1.5cm×1.2m，bio-rad公司)对mw<3kda的多肽组分进行凝胶层析分离。以500μl的上样体积和20mg/ml的浓度进行进针加样，以液相恒流泵为动力、一级水为流动相、1ml/min的速度进行洗脱，并通过uv紫外检测器检测各个时间点的洗脱液在280nm处的吸光值。结果见图1由图1结果可见mw<3kda的多肽组分在经凝胶层析法分离后，主要得到5个组分，分别为f1、f2、f3、f4和f5。取f1组分溶解于含0.1v/v％甲酸、2v/v％乙腈的水溶液中，进行在线的纳升液相色谱质谱联用分析，纳升液相色谱为美国absciex公司的eksigent nanolc-ultratm二维系统，质谱为tripletof5600系统。在纳升流量的捕集柱(3μm,)上进样，动力泵以0.1v/v％甲酸、2v/v％乙腈的水溶液、流速为2.5μl/min进行脱盐10min，然后以0.1v/v％甲酸、2v/v％水的乙腈溶液进行梯度洗脱，液相洗脱梯度为50min内b液从5～35％，分析柱为75μm×15cm，c18-3μm，同时进行质谱扫描分析，结果如表1。表1文蛤多肽序列多肽名称氨基酸序列序列编号mmp13lsdrleetggassseqidno:1mmp13-1qlsdrleetggassseqidno:2mmp13-2ieqlsdrleetggassseqidno:3mmp13-3qieqlsdrleetggassseqidno:4mmp13-4lsdrleetggassiqheseqidno:5mmp13-5qieqlsdrleetggassiqheseqidno:6实施例2、抗百草枯诱导的氧化胁迫实验将实施例1制备的文蛤多肽mmp13按照浓度为0.5mm、1mm、2mm和4mm分别加入70mm百草枯造模的秀丽线虫培养液中，阳性对照组加入2mm的还原型谷胱甘肽(gsh)作阳性受试物，同时空白对照组加等体积的smedium，置于20℃培养，每隔约12h统计一次秀丽线虫存活率，直至全部虫子死亡。存活率以生存曲线表示，采用kaplan-meier法分析比较文蛤多肽mmp13及其类似物组和对照组的差异性。结果如图4所示。结果显示，实施例1制备的文蛤多肽mmp13浓度为0.5mm、1mm、2mm和4mm时均具有显著的抗氧化作用，且优于同等浓度下的gsh的抗氧化作用。实施例3、寿命实验将实施例1制备的文蛤多肽mmp13按照1mm、2mm和4mm的浓度，并将实施例1制备的文蛤多肽mmp13的类似物mmp13-1、mmp13-2、mmp13-3、mmp13-4、mmp13-5以4mm的浓度，分别加入到成虫初期的野生型秀丽线虫中，对照组加入等体积的smedium，置于20℃持续培养，并在显微镜下每隔1天统计一次各组秀丽线虫的存活情况，直至所有秀丽线虫死 亡。统计处理各组线虫的存活率，并以生存曲线表示结果，采用kaplan-meier法分析比较文蛤多肽mmp13及其类似物和对照组的差异性。结果如图5-10所示。结果显示，实施例1制备的文蛤多肽mmp13在浓度为1mm、2mm和4mm时，能够延长秀丽线虫在自然条件下的平均生存时间，且在浓度范围内呈现显著的浓度依赖性，且以浓度4mm的延寿效果为最佳；同时，我们发现以最佳浓度为4mm的mmp13-1、mmp13-2、mmp13-3、mmp13-4、mmp13-5也能够显著地延长秀丽线虫在自然条件下寿命，表明本发明所述文蛤多肽mmp13及其类似物具有延缓衰老进程的作用。当前第1页12