抗菌六肽及其衍生物和应用的制作方法

本发明涉及一种抗菌六肽及其衍生物及它们的应用，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：全球每年的细菌感染病患高达15亿人，其中死亡人数460万，特别是多药耐药菌(mdrb)感染导致的高死亡率，严重威胁公众健康。欧洲与美国每年因细菌感染防治的支出高达70亿欧元和65亿美元，而发展中国家则需为此承担更为高昂的代价。mdrb感染在全球的快速蔓延与抗生素滥用及其研发断代密切相关，即1962至2000年间并未开发出新结构类型的抗生素；2000年以来仅有3个新结构类型的抗菌药物进入市场。美国感染病学会(idsa)自2004年开始呼吁振兴抗生素研发并给予项目资助，拟在2020年前开发10个结构全新的抗菌药物。可以预测，抗mdrb感染药物的研发将获得快速发展。鲍曼不动杆菌(ab)是一种严重的医源性病原菌，导致呼吸道、血液、尿道、软组织及中枢神经系统感染，在病患之间通过直接或间接接触方式传播。根据2006-2007年国内外院内感染监测数据资料显示，鲍曼不动杆菌在院内感染中的检出率居前四位，在免疫力低下的患者中，可以引起严重的甚至致死性的感染。它可以引起呼吸机相关性肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎、皮肤软组织感染、泌尿系统感染和中枢神经系统感染等严重感染性疾病。由于鲍曼不动杆菌感染引起的发病率和病死率增加，其被称为“革兰阴性的mrsa”。在常规ab感染中，多药耐药鲍曼不动杆菌(mrab)的发生率从2004年的23％上升到2014年的63％，其平均发生率也显著高于其他革兰氏阴性菌(44％vs13％)。目前，95％的mrab对头孢曲松有抗性，90％的mrab对头孢他啶、左氧氟沙星、美罗培南、哌拉西林-他唑巴坦等药物耐药，是临床耐药菌感染疾病治疗的一大难题。因此，筛选结构新颖的抗菌药物以应对mrab感染将成为新药研发的热点。抗菌肽(amp)是存在于所有生物体中的一类短肽，具有阳离子性和两亲性的特点且结构多样，是生物体天然免疫系统对抗病原菌入侵的重要组成部分，在生物进化过程中保持稳定和高效。截至目前，文献已报道约5000条amp序列，其中74条已进入药物开发阶段。由于amp主要以细菌细胞膜为作用靶标，与传统抗生素的作用机制存在显著区别，对mdrb具有显著的抗菌效果，是对抗mdrb最具发展潜力的候选结构类型。然而，天然amp仍然存在氨基酸序列长、生产成本高，耐酶稳定性差、体内易降解，以及细胞溶解毒性等问题，其在临床应用上面临严重困境。通过化学合成方法获得的非天然小分子抗菌肽(samp)，其序列仅由3-9氨基酸残基构成，由于非天然氨基酸(如d-型氨基酸或氨基酸残基修饰物)的存在，使其具有活性显著、结构简单、易于合成、稳定性好、安全性高等优势，受到研究人员的广泛关注。因此，通过化学合成方法发现抗菌活性强、耐酶稳定性好、体内安全性高的samp及其类似物，是解决mrab感染问题的有效途径。技术实现要素：针对现有的问题，本发明的第一目的在于提供一种抗菌六肽。本发明的第二目的在于提供该种抗菌六肽的应用，本发明的第三目的在于提供一种抗菌六肽衍生物，第四目的在于提供该抗菌六肽衍生物的应用。该抗菌六肽及抗菌六肽衍生物对革兰氏细菌有广谱抗菌活性，其中抗菌六肽衍生物对耐药鲍曼不动杆菌的生长表现出高效的抑制作用，并且该抗菌六肽及其衍生物的毒性小。为了实现上述第一目的，本发明的技术方案为：一种抗菌六肽，其特征在于：该抗菌六肽的序列为：arg-arg-trp-trp-arg-trp。为了实现上述第二目的，本发明的技术方案为：上述抗菌六肽应用于制备治疗或预防细菌感染的药物中。为了实现上述第三目的，本发明的技术方案为：一种抗菌六肽衍生物，其特征在于：该抗菌六肽衍生物的序列为：arg-arg-trp-trp-arg-trp-β-苯乙胺(抗菌肽b)。为了实现上述第四目的，本发明的技术方案为：上述抗菌六肽衍生物应用于制备治疗或预防细菌感染的药物中。进一步的：所述细菌为耐药鲍曼不动杆菌。此处的耐药鲍曼不动杆菌为广义上的耐药鲍曼不动杆菌，包括耐单种药的鲍曼不动杆菌和耐多重药的鲍曼不动杆菌。本发明思路如下：在天然抗菌肽lactoferricinb4-9rrwqwr基础上，结合虚拟组合库设计技术，dnastar，bioedit，sequencelogo等分析软件和网站，经过多次试验后发现一条具有抗菌活性的全新多肽序列rrwwrw(arg-arg-trp-trp-arg-trp)，在其c端苯乙胺化后仍具有显著的抗菌活性。新发现的抗菌六肽及其衍生物相比lfcinb4-9杀菌效果更佳，无溶血毒性，尤其是其衍生物对耐药鲍曼不动杆菌表现出更强的杀菌活性，溶血毒性小，有望作为治疗细菌感染尤其是耐药鲍曼不动杆菌的新药研究和开发。利用美国应用系统生物公司生产的pioneer多肽合成仪基于固相合法制备本发明公开的抗菌六肽苯乙胺修饰物(抗菌肽b)和抗菌六肽(抗菌肽a)以及天然抗菌肽lactoferricinb4-9rrwqwr。利用琼脂空板穴扩散法和96孔板法检测本发明抗菌六肽及其衍生物的抑菌和杀菌活性，以预先合成的天然抗菌肽lactoferricinb4-9rrwqwr为对照，进行杀菌活性检测，结果表明本发明的抗菌六肽及其衍生物的杀菌活性显著强于对照的天然抗菌肽lactoferricinb4-9rrwqwr的杀菌活性。与抗菌肽a相比，本发明的抗菌肽b在低浓度的条件下就能高效抑制耐药鲍曼不动杆菌的生长。能够应用于治疗或预防因耐药鲍曼不动杆菌而引起的疾病的药物中，如应用于治疗因耐药鲍曼不动杆菌而引起的呼吸机相关性肺炎、败血症、脑膜炎、中耳炎、皮肤软组织感染、泌尿系统感染和中枢神经系统感染等严重感染性疾病的药物中。抗菌肽在高效杀菌的同时也有可能作用于高等有机体包括人体细胞，因为抗菌肽的作用方式都是在细胞膜上穿孔使得细胞发生渗漏死亡。所以把抗菌肽能否使红细胞发生渗漏作为其是否有毒性的一个标准，如果抗菌肽能使红细胞中的血红蛋白发生渗漏，就可以通过检测其od490值确定毒性的大小。实验表明，在高浓度下本发明的抗菌六肽衍生物溶血率依然非常低，证实本发明抗菌六肽衍生物的溶血毒性极小。本发明的有益效果是：本发明提供的人工设计合成的抗菌六肽及其苯乙胺修饰物，可方便地采用固相合成法获得。该合成抗菌肽及其衍生物对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌具有广谱杀伤活性，尤其其衍生物对耐药鲍曼不动杆菌表现出更强的抗菌活性，溶血毒性极小，能够应用于治疗或预防因耐药鲍曼不动杆菌而引起的疾病的药物中。附图说明图1为本发明抗菌六肽衍生物的质谱图。图2为抗菌六肽的质谱图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的描述：实施例1：化学合成抗菌肽a和抗菌肽b及对照抗菌肽lactoferricinb4-9。抗菌肽a:rrwwrw(arg-arg-trp-trp-arg-trp)抗菌肽b:rrwwrw-pea(arg-arg-trp-trp-arg-trp-β-苯乙胺)1、抗菌肽b(arg-arg-trp-trp-arg-trp-β-苯乙胺)的制备：a.用4倍量dmf洗涤树脂并完全干燥之后，加入10ml20％(哌啶:dmf，质量比)哌啶、dmf混合溶液后振荡1min并干燥，然后再加入10ml20％(哌啶:dmf，质量比)哌啶、dmf混合溶液振荡30min；干燥反应容器并用4倍量的dmf洗涤树脂，确保没有哌啶残留，用茚三酮检查树脂颗粒应为蓝色。b.将fmoc保护氨基酸(1mmol)、2.1ml0.45mhbtm/hobt(1mmol)、248uldiea(2mmol)溶液加入树脂并振荡30min；干燥反应容器并用4倍量dmf洗涤树脂，用茚三酮检查如果为无色，则重新准备树脂，如果为蓝色则继续加入氨基酸进行反应；重复上述氨基酸连接反应直到多肽合成结束；偶联完成后，用低浓度三氟乙酸进行裂解，用醚沉淀，沉淀物加入溶剂(四氢呋喃或者其混合溶剂)中，然后再加入苯乙胺反应，反应结束后用高浓度三氟乙酸脱保护基，用醚沉淀。c.将多肽-树脂加入至1ml乙酸(acoh)、2ml三氟乙醇(tfe)和7ml二氯甲烷(dcm)的混合溶液中，在室温搅拌1h；过滤树脂并用2倍量的tfe/dcm(体积比2:8)混合溶液冲洗，确保回收所有产物；蒸馏浓缩产物溶液至5ml以内；向含有100ml上述浓缩溶液的试管中加入乙醚，查看完全保护的多肽是否溶于乙醚；如果不溶，则再次向试管内加入冰乙醚促使产物析出，抽滤获得产物粗品；如果溶解，则向乙醚中加入水促使产物析出，然后再抽滤获得产物粗品。d.称取100mg干燥后的上述固体多肽粗品，溶于10ml0.1％三氟乙酸(tfa)，样品用0.22μm滤膜过滤之后，在反相高效液相色谱(rp-hplc)上分离纯化；洗脱液为0.1％tfa水溶液(a)和0.1％的乙腈(acn)溶液(b)，洗脱条件为0-60％b梯度洗脱30min，收集洗脱峰置于冻干机(-50℃)中冷冻干燥；纯化干燥后的抗菌肽用hplc测定纯度并用质谱(ms)检测分子质量与理论计算的分子量相符。本文的抗菌肽合成、纯化、鉴定实验在上海紫域生物科技有限公司完成。2、抗菌肽a和抗菌肽lfcinb4-9rrwqwr的制备按照标准的fmoc固相程序人工合成抗菌肽a和抗菌肽lactoferricinb4-9，合成肽经反相hplc(vydac218tp1022柱2.2×25cm)纯化，采用乙腈/水/三氟乙酸系统洗脱，maldi-tof和epi质谱分析。抗菌肽合成由上海紫域生物科技有限公司。实施例2抗菌肽的抗菌活性检测以下所使用的各种标准菌株购于广东省微生物菌种保藏中心，耐药菌由第三军医大学提供。采用琼脂板扩散法对合成抗菌肽b和抗菌肽a的抗菌活性进行检测，并用天然抗菌肽lfcinb4-9作为对照，以评价本发明中抗菌肽b和抗菌肽a的杀菌活性。按以下步骤进行测定抗菌肽的抗菌活性：a.菌种复苏：用接种环分别挑取适量大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、mrsa、耐单种药鲍曼不动杆菌(对头孢他啶耐药，下同)、多重耐药鲍曼不动杆菌(对庆大霉素和头孢他啶同时耐药，下同)于各自培养基中划线，标记。37℃恒温培养箱倒置培养(12-16h)。b.菌种培养：分别挑选单个菌落到100ml液体mhb培养液，置37℃、160转，摇床培养(12-16h)。c.菌悬液制备：制备菌悬液的浊度在0.5麦氏浊度左右，此时细菌菌落数约为1.5×108cfu/ml，然后再按1:1000稀释成105-106cfu/ml的菌悬液。d.抑菌实验：将稀释好的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、mrsa、耐单种药鲍曼不动杆菌、多重耐药鲍曼不动杆菌菌悬液分别按0.2ml/平板(平板直径为150mm)的量均匀涂于40ml固体lb培养基；待培养基完全凝固后，打孔直径8mm6个/平板，标记为+/-/caz/a/b/c，分别代表阳性对照(庆大霉素)、阴性对照(去离子水)、头孢他啶、三条多肽(a为抗菌肽a；b为抗菌肽b；c为lfcinb64-9)。“+”孔加50ul1mg/ml庆大霉素溶液；“-”孔加50μl去离子水；“caz”孔加50ul1mg/ml头孢他啶溶液；a/b/c孔分别加50ul1mg/ml抗菌肽溶液。4℃静置3h后，37℃恒温培养箱培养，12h后观察肉眼抑菌圈大小并测定抑菌圈直径。每条肽在每种菌种下独立进行3次实验。表11mg/ml抗菌肽对不同细菌的抗菌活性注：caz-头孢他啶；“–”表示无明显抑菌圈从上表1看出本发明的抗菌肽b和抗菌肽a杀菌能力明显且优于天然抗菌肽。实施例3合成抗菌肽的抑菌活性检测以下所使用的各种标准菌株购于广东省微生物菌种保藏中心，耐药菌由第三军医大学提供。采用96孔板法对合成抗菌肽的杀菌活性进行检测，并用天然抗菌肽lfcinb4-9作为对照，以评价抗菌肽a、b的抑菌活性。按以下步骤进行测定抗菌肽的抑菌活性：a.将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、mrsa、耐单种药鲍曼不动杆菌、多重耐药鲍曼不动杆菌在灭菌na培养基平板上过夜培养，挑取单菌落接种于灭菌mhb培养液，37℃170r/min培养18～24h。b.将培养后的菌液稀释成105-106cfu/ml的菌悬液。分别将有抑菌活性的待测拟肽溶液按2倍连续稀释后加入96孔微量培养板中，第1孔及第12孔留空不用(避免边际效应致使数据不准确)。除第2孔加入稀释菌液160μl外，3-9各孔均加入100μl，继于第2孔加入抗菌肽原液(浓度1280μg/ml)40μl，混合后吸出100μl加入第3孔中，依次稀释至第9孔，弃去100μl。这样待测抗菌拟肽的终浓度分别为:取浓度为1280μg/ml的待测拟肽稀释为如下浓度(μg/ml)：编号a2a3a4a5a6a7a8a9浓度256128643216842第10孔生长对照，第11孔为阳性对照(亚胺培南)，加160μl菌液和40μl同浓度抗生素溶液混合后弃100μl。每个抗菌肽平行做3次。于37℃培养16h后，用elisa酶标仪分别测od600值，最小的od600值所对应的最小浓度便为该抗菌肽的mic值。据此计算抗菌肽a、b分别对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、粪肠球菌、mrsa、耐单种药鲍曼不动杆菌、多重耐药鲍曼不动杆菌的mic。表2抗菌肽对不同细菌的最小抑菌浓度(mic)上表中的最小抑菌浓度值越小，则代表抗菌能力越强。本发明的合成抗菌肽a和b的mic比lfcinb4-9均要小，合成抗菌肽a和b的抗菌能力大大强于抗菌肽lfcinb4-9，但是抗菌肽b特别对耐药细菌鲍曼不动杆菌杀菌效果更佳。实施例4体外溶血活性检测本实施例用于检测合成抗菌肽对人体红细胞是否具有溶血活性，并用固相化学法合成的抗菌肽a和抗菌肽lfcinb4-9作为对照。使用的血样取于无菌绵羊血。溶血活性的检测步骤是：a.将无菌绵羊血离心5min3000rpm/min，并用pbs缓冲液冲洗3次，重复离心操作，弃去上清液，保留红细胞。b.0.1ml红细胞液用9.9mlpbs液稀释(红细胞最终浓度为1％)，分别取浓度为512、256、128、64、32、16、8μg/ml的抗菌肽200μl与200μl稀释红细胞液混合后在37℃孵育1小时，然后在4000rpm/min离心5分钟，取悬浮液转移到96孔elisa板并分别在414nm波长检测悬浮液的吸光值，计算每孔的溶血率。0.01mol/l的pbs作为阴性对照，0.1％triton-x100(聚乙二醇辛基苯基醚)作为阳性对照。溶血率(％)＝(试验管吸光度-阴性对照管吸光度)/(阳性对照管吸光度-阴性对照管吸光度)×100％。c.溶血率实验以抗菌肽a和lfcinb4-9为对照，独立三次重复实验。表4三种抗菌肽溶血活血检测结果抗菌肽的溶血率值越小，则代表抗菌肽的溶血毒性越小。从表中结果可以看出抗菌肽a、b的溶血毒性都在5％以下，即使在浓度升高的情况下其溶血毒性的增加也不明显。相比于对照天然抗菌肽溶血毒性非常低，特别是在高浓度下未有大幅度的溶血现象发生，是下一步成药的重要基础。<210>1<211>6<212>prt<213>人工合成<220><223>抗菌肽a<400>1arg-arg-trp-trp-arg-trp156<210>1<211>6<212>prt<213>人工合成<220><223>抗菌肽b<400>2arg-arg-trp-trp-arg-trp-β-苯乙胺156当前第1页12