一种提高液态发酵制备低聚肽产量的方法与流程

本发明涉及一种提高液态发酵制备低聚肽产量的方法，具体涉及超声波辅助液态发酵制备低聚肽技术，属于发酵工程技术领域。

背景技术：

大豆饼粕，是大豆榨取大豆油脂后剩下的副产物。我国的大豆饼粕资源非常丰富，豆粕年产量可达5000万吨以上。豆粕中含有多种氨基酸，种类较平衡，营养价值较高，目前大约85%的豆粕被用于动物饲养。但是由于豆粕中含有胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子，不利于动物消化吸收，这些问题都限制了豆粕的高值化利用。

目前，研究学者常用发酵法来提高豆粕的价值。该方法通过微生物发酵原料，利用微生物产生的丰富的酶系进行脱苦、脱毒和去抗营养因子处理，极大地简化了生产工艺。其中液态发酵法周期短，产率高，有利于工业化生产，但是成本较高，研究提高发酵生产效率是目前的研究热点之一。近年来，采用超声辅助发酵法来提高液态发酵的次级代谢产物生产效率，取得了显著成果。目前研究最多的是发散式超声处理，陈小林研究结果表明，在最佳发散式超声条件下，发酵液中的monacolink浓度比对照提高了96.4％，红色色素色价提高了22%（陈小林.红曲菌液态发酵产monacolink和红曲色素之研究[d].浙江工业大学,2007.）。

在细胞对数生长期间，细胞分泌产生大量的蛋白酶，并酶解豆粕产生大量的多肽和氨基酸，同时微生物也能将酶解产物转化为细胞内蛋白。大量研究表明低强度的超声能刺激此阶段的微生物加速生长。另外在稳定生长期间，细胞的同化作用趋于平缓，除发酵液中的蛋白酶外，还有大量蛋白酶残留在细胞内，没有得到有效释放。而聚能式超声特征在于，大功率的超声场可直接作用于细胞，超声强度大，细胞破碎率高。因此在发酵稳定期后期，采用高强度的聚能式超声来破坏细胞壁结构，能有效释放胞内蛋白酶，使其在酶解豆粕蛋白的同时也能酶解细胞蛋白，另外聚能式超声也有很好的传质效果，可起到加强蛋白酶酶解的作用。所以在细胞稳定期后期采用聚能式超声能进一步促进发酵生产低聚肽的效率，然而目前在微生物的稳定生长期的后期施加聚能式超声处理促进发酵液多肽生成的研究，还未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是为了克服已有技术存在的问题，提供一种超声促进液态发酵豆粕制备低聚肽的方法，具体为在豆粕发酵的不同的生长期施加不同类型的超声波，以促进微生物的生长和提高低聚肽的生产效率。

为了实现上述发明目的，其具体的技术方案如下：

s1、制备枯草芽孢杆菌发酵种子液，接种于大豆粕液态培养基，进行液态发酵。

s2、在发酵中施加超声处理：

将装有菌液的三角瓶于摇床培养9h进入微生物对数生长期中期，然后进行扫频发散式超声处理0.5~1.5h；再于36℃摇床培养14h左右进入生长稳定期后期，再进行逆流聚能式超声处理0.5~1h，将培养基在45~55℃温度恒温4~6h。

其中不同阶段超声参数设置为：

扫频发散式超声参数：功率密度60w/l、频率24±2khz、间歇比5s∶5s。

逆流聚能式超声参数：功率500w、频率40khz、间歇比5s∶5s、超声处理腔体积50ml，处理液总体积500ml。

上述的菌液不限于枯草芽孢杆菌，还包括一些产蛋白酶的其他菌。例如地衣芽孢杆菌，曲霉菌和毛霉菌。

本发明相比于传统的发酵方法或者一些超声辅助发酵法（比如1、发酵过程中不施加超声；2、在细菌稳定期后期施加聚能式超声；3、在对数生长期初期和后期分别施加扫频超声和聚能式超声；4、在对数生长期初期和稳定期中期分别施加扫频超声和聚能式超声），具有的有益效果为：一方面，发酵对数生长期中期细胞的生长代谢旺盛，对营养物质的吸收强，在此时施加低强度的扫频超声，加强传质效果，有助于细胞内外物质交换，促进微生物生长；另一方面，发酵稳定期后期细胞密度高，胞内蛋白酶含量丰富，在此阶段施加高强度聚能式超声能够有效破坏细胞壁结构，释放胞内蛋白酶和菌蛋白，补充蛋白酶继续酶解蛋白质，大幅提高发酵生产低聚肽效率。

附图说明

图1为枯草芽孢杆菌的生长曲线图。

图2为扫频超声设备结构示意图：1为培养瓶，2为扫频超声换能器。

图3为聚能式超声设备结构示意图：1为聚能式超声波探头，2为超声杯型腔，3为蠕动泵，4为恒温器。

具体实施方式

下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是，对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限定，该领域的技术工程师可根据上述发明的内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。

实施例中所涉及菌种均为常规市场购买所得。

对照和实施例中生物量的测定和多肽含量测定按照以下方法进行：

（1）生物量的测定:

取发酵液稀释不同浓度，按照gb/t13093-2006进行tsa培养基涂布测定，36℃恒温培养，24h后计数，每个浓度做3次平行。

（2）多肽含量测定:

用15%三氯乙酸等体积沉淀发酵液，离心后取上清液稀释适当倍数，取1ml稀释液，采用双缩脲法测定。

对照例1:

（1）发酵种子液配制

将斜面试管保存的枯草芽孢杆菌菌种接种于100mllb培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉和1%nacl，121℃灭菌25min），在36℃，200r/min摇床中培养20h后转移到冰箱中备用。

（2）枯草芽孢杆菌生长曲线测定

配制上述15瓶豆粕培养基（20%豆粕、1%kh2po4、1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉和1%nacl，ph调为7.0，121℃灭菌25min），接10%的枯草芽孢杆菌菌种，菌液共50ml于200ml三角瓶，调节ph至7.0，于摇床200r/min，36℃培养。每隔2h取出一瓶培养液，并取出1ml菌液，加入9ml蒸馏水使细胞重新悬浮，以蒸馏水为空白，420nm下比浊。以培养时间为横坐标，od值为纵坐标，绘制生长曲线。实验结果如附图1显示，0~1.5h为迟缓期，1.5~16h为对数期，16~24h为稳定期。

（3）枯草芽孢杆菌液体发酵

将装有豆粕培养基的三角瓶中接种10%枯草芽孢杆菌种子液，放置于200r/min，36℃摇床培养24h。

（4）低聚肽的制备

将上述发酵好的菌液，100℃沸水浴灭酶10min，4000r/min离心5min，上清液即为低聚肽提取物，再经活性炭脱色，通过浓缩提取，最后经喷雾干燥即得成品。枯草芽孢杆菌生物量测定为9.2×10⁹cfu/ml，多肽含量测定为25.4mg/ml。

对照例2:

（1）发酵种子液配制

同对照例1步骤1。

（2）枯草芽孢杆菌液体发酵

将装有豆粕培养基的三角瓶中接种10%枯草芽孢杆菌种子液，放置于200r/min，36℃摇床培养23h进入微生物稳定生长期后期，进行逆流聚能式超声处理0.5h（图3），将培养基在45℃温度恒温4h。

逆流聚能式超声参数：功率500w、频率40khz、间歇比5s∶5s、超声处理腔体积50ml，处理液总体积500ml。

（3）低聚肽的制备

同对照例1步骤4。

生物量和多肽含量测定实验结果为：枯草芽孢杆菌生物量测定为8.7×10⁹cfu/ml，多肽含量测定为32.4mg/ml。

对照例3:

（1）发酵种子液配制

同对照例1步骤1。

（2）枯草芽孢杆菌液体发酵

将装有豆粕培养基的三角瓶中接种10%枯草芽孢杆菌种子液，放置于200r/min，36℃摇床培养9h进入微生物对数生长期中期后，将其置于扫频超声水槽中，且超声水槽里的水与三角瓶中菌液液面齐平（图2）。扫频超声处理1.5h后，再于摇床培养6h进入对数期后期，再进行逆流聚能式超声处理0.5h（图3），将培养基在45℃温度恒温4h。

扫频发散式超声参数：功率密度60w/l、频率24±2khz、间歇比5s∶5s。

逆流聚能式超声参数：功率500w、频率40khz、间歇比5s∶5s、超声处理腔体积50ml，处理液总体积500ml。

（3）低聚肽的制备

同对照例1步骤4。

生物量和多肽含量测定实验结果为：枯草芽孢杆菌生物量测定为4.1×10⁹cfu/ml，多肽含量测定为17.9mg/ml。

对照例4:

（1）发酵种子液配制

同对照例1步骤1。

（2）枯草芽孢杆菌液体发酵

将装有豆粕培养基的三角瓶中接种10%枯草芽孢杆菌种子液，放置于200r/min，36℃摇床培养9h进入微生物对数生长期中期后，将其置于扫频超声水槽中，且超声水槽里的水与三角瓶中菌液液面齐平（图2）。扫频超声处理1.5h后，再于摇床培养10h进入稳定期中期，再进行逆流聚能式超声处理0.5h（图3），将培养基在45℃温度恒温4h。

扫频发散式超声参数：功率密度60w/l、频率24±2khz、间歇比5s∶5s。

逆流聚能式超声参数：功率500w、频率40khz、间歇比5s∶5s、超声处理腔体积50ml，处理液总体积500ml。

（3）低聚肽的制备

同对照例1步骤4。

生物量和多肽含量测定实验结果为：枯草芽孢杆菌生物量测定为1.2×10¹⁰cfu/ml，多肽含量测定为29.6mg/ml。

实施例1：

（1）发酵种子液配制

同对照例1步骤1。

（2）枯草芽孢杆菌液体发酵

将装有豆粕培养基的三角瓶中接种10%枯草芽孢杆菌种子液，放置于200r/min，36℃摇床培养9h进入微生物对数生长期中期后，将其置于扫频超声水槽中，且超声水槽里的水与三角瓶中菌液液面齐平（图2）。扫频超声处理1.5h后，再于摇床培养14h进入生长稳定期后期，再进行逆流聚能式超声处理0.5h（图3），将培养基在45℃温度恒温4h。

扫频发散式超声参数：功率密度60w/l、频率24±2khz、间歇比5s∶5s。

逆流聚能式超声参数：功率500w、频率40khz、间歇比5s∶5s、超声处理腔体积50ml，处理液总体积500ml。

（3）低聚肽的制备

同对照例1步骤4。

生物量和多肽含量测定实验结果为：枯草芽孢杆菌生物量测定为1.3×10¹⁰cfu/ml，多肽含量测定为36.4mg/ml。

实施例2：

（1）发酵种子液配制

同对照例1步骤1。

（2）枯草芽孢杆菌液体发酵

将装有豆粕培养基的三角瓶中接种10%枯草芽孢杆菌种子液，放置于200r/min，36℃摇床培养9h进入微生物对数生长期中期后，将其置于扫频超声水槽中，且超声水槽里的水与三角瓶中菌液液面齐平（图2）。扫频超声处理0.75h后，再于摇床培养14h进入生长稳定期后期，再进行逆流聚能式超声处理0.75h（图3），将培养基在50℃温度恒温4h。

扫频发散式超声参数：功率密度60w/l、频率24±2khz、间歇比5s∶5s。

逆流聚能式超声参数：功率500w、频率40khz、间歇比5s∶5s、超声处理腔体积50ml，处理液总体积500ml。

（3）低聚肽的制备

同对照例1步骤4。

生物量和多肽含量测定实验结果为：枯草芽孢杆菌生物量测定为2.7×10¹⁰cfu/ml，多肽含量测定为55.3mg/ml。

实施例3：

（1）发酵种子液配制

同对照例1步骤1。

（2）枯草芽孢杆菌液体发酵

将装有豆粕培养基的三角瓶中接种10%枯草芽孢杆菌种子液，放置于200r/min，36℃摇床培养9h进入微生物对数生长期中期后，将其置于扫频超声水槽中，且超声水槽里的水与三角瓶中菌液液面齐平（图2）。扫频超声处理1h后，再于摇床培养14h进入生长稳定期后期，再进行逆流聚能式超声处理1h（图3），将培养基在55℃温度恒温4h。

扫频发散式超声参数：功率密度60w/l、频率24±2khz、间歇比5s∶5s。

逆流聚能式超声参数：功率500w、频率40khz、间歇比5s∶5s、超声处理腔体积50ml，处理液总体积500ml。

（3）低聚肽的制备

同对照例1步骤4。

生物量和多肽含量测定实验结果为：枯草芽孢杆菌生物量测定为1.8×10¹⁰cfu/ml，多肽含量测定为45.2mg/ml。

实施例4：

（1）发酵种子液配制

同对照例1步骤1。

（2）枯草芽孢杆菌液体发酵

将装有豆粕培养基的三角瓶中接种10%枯草芽孢杆菌种子液，放置于200r/min，36℃摇床培养9h进入微生物对数生长期中期后，将其置于扫频超声水槽中，且超声水槽里的水与三角瓶中菌液液面齐平（图2）。扫频超声处理0.5h后，再于摇床培养14h进入生长稳定期后期，再进行逆流聚能式超声处理1h（图3），将培养基在55℃温度恒温6h。

扫频发散式超声参数：功率密度60w/l、频率24±2khz、间歇比5s∶5s。

逆流聚能式超声参数：功率500w、频率40khz、间歇比5s∶5s、超声处理腔体积50ml，处理液总体积500ml。

（3）低聚肽的制备

同对照例1步骤4。

生物量和多肽含量测定实验结果为：枯草芽孢杆菌生物量测定为2.1×10¹⁰cfu/ml，多肽含量测定为47.6mg/ml。

实施例5：

（1）发酵种子液配制

同对照例1步骤1。

（2）枯草芽孢杆菌液体发酵

将装有豆粕培养基的三角瓶中接种10%枯草芽孢杆菌种子液，放置于200r/min，36℃摇床培养9h进入微生物对数生长期中期后，将其置于扫频超声水槽中，且超声水槽里的水与三角瓶中菌液液面齐平（图2）。扫频超声处理0.75h后，再于摇床培养14h进入生长稳定期后期，再进行逆流聚能式超声处理1h（图3），将培养基在55℃温度恒温6h。

扫频发散式超声参数：功率密度60w/l、频率24±2khz、间歇比5s∶5s。

逆流聚能式超声参数：功率500w、频率40khz、间歇比5s∶5s、超声处理腔体积50ml，处理液总体积500ml。

（3）低聚肽的制备

同对照例1步骤4。

生物量和多肽含量测定实验结果为：枯草芽孢杆菌生物量测定为2.5×10¹⁰cfu/ml，多肽含量测定为48.6mg/ml。

实施例6：

（1）发酵种子液配制

同对照例1步骤1。

（2）枯草芽孢杆菌液体发酵

将装有豆粕培养基的三角瓶中接种10%枯草芽孢杆菌种子液，放置于200r/min，36℃摇床培养9h进入微生物对数生长期中期后，将其置于扫频超声水槽中，且超声水槽里的水与三角瓶中菌液液面齐平（图2）。扫频超声处理0.5h后，再于摇床培养14h进入生长稳定期后期，再进行逆流聚能式超声处理1h（图3），将培养基在55℃温度恒温4h。

扫频发散式超声参数：功率密度60w/l、频率24±2khz、间歇比5s∶5s。

逆流聚能式超声参数：功率500w、频率40khz、间歇比5s∶5s、超声处理腔体积50ml，处理液总体积500ml。

（3）低聚肽的制备

同对照例1步骤4。

生物量和多肽含量测定实验结果为：枯草芽孢杆菌生物量测定为2.2×10¹⁰cfu/ml，多肽含量测定为44.9mg/ml。

由以上对照例和实施例结果可知，对照例1中进行常规处理的液态发酵，多肽含量为25.4mg/ml；对照例2中在稳定期后期进行逆流式超声处理后，多肽含量为32.4mg/ml；对照例3中在对数期中期进行扫频超声处理，对数期后期进行逆流式超声处理后，多肽含量为17.9mg/ml；对照例4中在对数期中期进行扫频超声处理，在稳定期中期进行逆流式超声处理，多肽含量为29.6mg/ml；而在6个实施例中，均是在对数期中期进行扫频超声处理，然后在稳定期后期进行逆流式超声处理后，多肽含量明显得到提高，最低的36.4mg/ml，比对照例中最高的含量还高出较多，测得最高的含量为55.3mg/ml，比对照例高出3倍多。