本发明属于生物工程技术领域，具体地说，即：通过敲除克雷伯氏肺炎杆菌中编码甲酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶复合体的基因，同时生产1，3-丙二醇和乙偶姻。
背景技术：
随着化石燃料的日益枯竭，可再生新能源引起了越来越多的关注，其中生物柴油因具有可循环性，可降解性及清洁无污染的优势进而日益引起关注。生物柴油主要来自于动植物油脂，通过酯交换或热化学工艺制成制备。所以在生物柴油的生产过程中，会产生大量的副产物甘油，产量约占生物柴油总产量的10％，因此需要有效的方法利用好这些富余甘油。目前，在甘油的利用的方法中，考虑最广泛的就是以甘油为碳源，采用微生物代谢生产高附加值的化合物。其中以克雷伯氏肺炎杆菌(klebsielapneumoniae)利用甘油生产一些大宗化学品，如1，3-丙二醇(1，3-propanediol，1，3-pd)等备受关注。
1，3-pd是一种重要的平台化合物，有多种用途：如1，3-pd可作为单体合成新型聚醋——聚对苯二甲酸丙二醇醋(ptt)。研究表明k.pneumoniae利用甘油生产1，3-pd时，主要副产物为2，3-丁二醇。由于2，3-丁二醇的沸点与1,3-pd相近，因而给后续1,3-pd的精制分离过程造成了很大的困难。
在k.pneumoniae中2，3-丁二醇合成来自于乙偶姻(acetoin，ac)。事实上，同1，3-pd一样，ac也是一种重要的平台化合物，此外ac的沸点要比1，3-pd低得多，因而利用k.pneumoniae共发酵生产1，3-pd与ac显然是一种更经济的甘油利用方法。但是在k.pneumoniae中ac一般不积累，而是合成了副产物2，3-丁二醇。本发明公开了一种k.pneumoniae利用甘油同时生产1，3-pd和ac的方法。该方法通过敲除克雷伯氏杆菌中编码甲酸脱氢酶和丙酮酸脱氢酶复合体的基因，阻断副产物2，3-丁二醇的合成，同现有技术相比不但能同时生产两种高附加值产品，也显著改善了产品分离精制的效率。
在k.pneumoniae中参与转化ac合成2，3-丁二醇的酶有多种，如2，3-丁二醇脱氢酶、甘油脱氢酶等，有些酶还是微生物利用甘油生物合成1，3-pd的关键酶，所以1，3-pd的生物合成总是伴随着副产物2，3-丁二醇的合成。本发明发现，在敲除克雷伯氏肺炎杆菌编码丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvatedehydrogenasecomplex，pdhc)的基因后，显著抑制了菌体的生长和产物1，3-pd的合成，副产物2，3-bd几乎不积累；在此基础上进一步敲除编码一种甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase-n，也称fdnghi、fdh-n)的基因后，菌体生长恢复，1，3-pd的生物合成也大部分恢复，但是ac大量积累，2，3-bd同样没有积累，达到了利用甘油同时生产1，3-pd与ac的目的。经过检索国家知识产权局(www.sipo.gov.cn)、世界产权组织(www.wipo.int)、欧洲专利局(www.espacenet.com)和美国专利商标局(www.uspto.gov)也没有发现与本专利保护请求相同的公开专利或授权专利。
技术实现要素：
本申请的发明人在研究中发现，敲除k.pneumoniae编码pdhc和fdnghi的基因后，重组菌能利用甘油同时生产1,3-pd和ac。所以，本发明目的在于提供一种更有效的利用甘油方法，即：将k.pneumoniae中编码pdhc和fdnghi的基因敲除，利用甘油同时生产高附加值的1，3-pd和ac。与现有的技术相比，利用本发明生物转化甘油时，不但能同时生产两种高附加值产品，也显著改善了产品分离精制的效率。
本发明是通过以下技术方案实现的：将克雷伯氏肺炎杆菌的编码pdhc和fdnghi的基因敲除，同时生产生产1，3-pd和ac。本发明包括种子培养以及发酵罐发酵转化甘油生成1，3-pd和ac。
根据本发明，所述编码丙酮酸脱氢酶复合体(pyruvatedehydrogenasecomplex，ec1.2.4.1)的基因为：acee,acef和lpda三个基因。这三个基因在基因组上成簇排列，分别负责编码丙酮酸脱氢酶复合体组分e1、e2和e3。
根据本发明，所述编码甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase-n，ec1.1.5.6)的基因为：fdng、fdnh和fdni三个基因。这三个基因在基因组上成簇排列，分别负责编码甲酸脱氢酶的三个亚基。
根据本发明，用于转化甘油生成1，3-pd和ac的菌株为克雷伯氏肺炎杆菌(k.pneumoniae)。相比现有的转化甘油生产1，3-pd的方法，本发明的方法的优点是：同时生产两种高附加值产品，且产品易于分离纯化。
附图说明
图1：1，3-丙二醇、乙偶姻，1，3-丙二醇、2，3-丁二醇气相色谱图
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明，而非用于限定本发明的范围。
实例中，斜面培养基的配方为：k2hpo43h2o7g/l，(nh4)2so41g/l，kh2po42g/l，mgcl27h2o0.1g/l，酵母膏7g/l，微量元素各0.3ml，调整ph7.0，琼脂2g/l。
种子培养基的配方为：k2hpo43h2o7g/l，(nh4)2so41g/l，kh2po42g/l，mgcl27h2o0.1g/l，酵母膏7g/l，微量元素各0.3ml，调整ph7.0后加入nacl调节渗透压。
发酵罐培养基的配方为：kcl0.75g/l，nah2po41.38g/l，(nh4)2so45.35g/l，na2so40.28g/l，mgso46h2o0.26g/l，柠檬酸0.42g/l，酵母粉2g/l，微量元素各0.3ml，调整ph7.0。
微量元素的配方为：zncl234.2g/l，fecl36h2o2.7g/l，mncl24h2o10g/l，cucl22h2o0.85g/l，cocl22h2o23.8g/l，h3bo30.31g/l，na2moo40.25g/l。
发酵实验具体为：将菌株接入250ml的摇瓶(装液量50ml)进行种子培养20小时，后接入5l发酵罐中(发酵液装液量2l)，按照后续所示的工艺条件控制发酵过程。初始甘油浓度60g/l，发酵温度35℃；通气量1.0vvm；搅拌转速20rpm；在发酵过程中通过加入naoh溶液控制ph值为5.5～7.5。在发酵的各个时期通过补入不同浓度甘油溶液控制甘油浓度在10～60g/l，发酵24小时结束。
实施例中，测定发酵液中菌体干重的方法为：取1.0ml发酵液稀释7￣10倍，以去离子水为对照，在721分光光度计上于620nm读取od。取不同菌浓(即不同620nm吸光值)的菌液10ml，经离心收集菌体，并用去离子水洗涤二遍洗涤，将再次离心收集后的菌体于80℃烘箱中干燥至恒重。称量菌体作出菌体干重与od620的标准曲线，并回归出关系式。以后菌体的干重根据测定的菌液的od620值由标准曲线回归关系式计算得出。发酵液中1，3-pd、2，3-丁二醇和ac的测定采用气相色谱法。
产1，3-pd的菌株采用克雷伯氏肺炎杆菌cctccm2014574，以下简称m2014574。
实施例1、敲除编码pdhc和fdnghi的基因后形成，重组菌体利用甘油同时合成了1，3-pd和ac
将m2014574菌株于lb培养基(0.5％酵母提取物，1％胰蛋白胨，1％nacl，ph7.0)中37℃培养过夜，抽提基因组。以抽提好的m2014574基因组为模板，依据ncbi登录的克雷伯氏肺炎杆菌mgh78578的基因组序列(locus：nc＿009648)上：acee基因(locus＿tag：kpn＿00118)的上游与lpda基因(locus＿tag：kpn＿00120)的下游设计引物。pcr反应结束后胶回收目的条带并测序，测序后对目的条带进行基因分析，与mgh78578上对应的片段基因的相似度为99％。用同源重组办法，敲除m2014574基因组的acee-acef-lpda三个连续的基因(7208bp)，获得的重组菌为m2014574△pdhc。
同样以抽提好的m2014574基因组为模板，依据ncbi登录的克雷伯氏肺炎杆菌mgh78578的基因组序列(locus：nc＿009648)上：fdng基因(locus＿tag：kpn＿01867)的上游与fdni基因(locus＿tag：kpn＿01865)的下游设计引物。pcr反应结束后胶回收目的条带并测序，测序后对目的条带进行基因分析，与mgh78578上对应的片段基因的相似度为99％。用同源重组办法，敲除m2014574基因组的fdng-fdnh-fdni三个连续的基因(3957bp)，获得的重组菌为m2014574△fdnghi。用同源重组办法，敲除m2014574△pdhc基因组的fdng-fdnh-fdni三个连续的基因(3957bp)，获得的重组菌为m2014574△pdhc△fdnghi。
将m2014574与m2014574△pdhc△fdnghi分别接种于250ml的三角瓶中进行种子培养，于5l的发酵罐上发酵24小时，结果如表1所。从表1中可以看出m2014574原来主要产物是1，3-pd和副产物2，3-丁二醇，而敲除编码pdhc和fdnghi的基因的菌株m2014574△pdhc△fdnghi生产不受影响，但是产物发生了变化：不产2，3-丁二醇，发酵甘油生产两种高附加值的平台化合物1，3-pd和ac。m2014574△pdhc△fdnghi同出发菌株m2014574相比，虽然1，3-pd有所下降，但是下降不多，反之生产了40.21g/l的ac，提高了甘油发酵的综合效益。
表1：同时敲除编码pdhc和fdnghi的基因后的结果
实施例2、单独敲除编码pdhc或fdnghi的基因的菌株不能产生本发明的效果
以出发菌株m2014574构建单独敲除编码pdhc或fdnghi的菌株，具体方法见实例1，单独敲除编码pdhc的基因的菌株为m2014574△pdhc，单独敲除编码fdnghi的基因的菌株为m2014574△fdnghi。
将m2014574、m2014574△pdhc和m2014574△fdnghi分别接种于250ml的三角瓶中进行种子培养，于5l的发酵罐上发酵24小时，结果如表2所。从表2中可以看出，单独敲除编码pdhc的基因后，虽然不产生2，3-丁二醇，但是菌体生长严重抑制，1，3-丙二醇显著下降，ac也没有生产。而单独敲除编码fdnghi的基因后，m2014574△fdnghi菌株的发酵特性几乎和出发菌株一样。所以只有同时敲除编码pdhc和fdnghi的基因，才能实现本发明的效果。
表2：单独敲除编码pdhc和fdnghi的基因后的结果
实施例3、在克雷伯氏肺炎杆菌基因组中有三种甲酸脱氢酶，只有敲除其中特定的一种，也即编码fdnghi的基因，才能起到本发明的效果。
在k.pneumoniae中存在三种甲酸脱脱氢酶(formatedehydrogenases，fdhs)，分别为：1)fdhf，也即fdh-h，由基因fdhf编码；2)fdoghi，也即fdh-o，含三个亚基，分别由基因fdog、fdoh与fdoi编码；3)fdnghi也即fdh-n，含三个亚基，分别由fdng、fdnh与fdni编码。
以抽提好的m2014574基因组为模板，依据ncbi登录的克雷伯氏肺炎杆菌mgh78578的基因组序列(locus：nc＿009648)上：fdhf基因(locus＿tag：kpn＿04482)的上游与下游设计引物。pcr反应结束后胶回收目的条带并测序，测序后对目的条带进行基因分析，与mgh78578上对应的片段基因的相似度为99％。用同源重组办法，敲除敲除m2014574△pdhc基因组的fdnf基因(1680bp)，获得的重组菌为m2014574△pdhc△fdhf。
以抽提好的m2014574基因组为模板，依据ncbi登录的克雷伯氏肺炎杆菌mgh78578的基因组序列(locus：nc＿009648)上：fdog基因(locus＿tag：kpn＿04190)的上游与fdoi基因(locus＿tag：kpn＿04188)的下游设计引物。pcr反应结束后胶回收目的条带并测序，测序后对目的条带进行基因分析，与mgh78578上对应的片段基因的相似度为99％。用同源重组办法，敲除m2014574△pdhc基因组的fdog-fdoh-fdoi三个连续的基因(3962bp)，获得的重组菌为m2014574△pdhc△fdoghi。
重组菌m2014574△pdhc△fdnghi的获取方法见实例1。
将m2014574、m2014574△pdhc△fdnghi、m2014574△pdhc△fdhf和m2014574△pdhc△fdoghi分别接种于250ml的三角瓶中进行种子培养，于5l的发酵罐上发酵24小时，结果如表3所。从表3可以看出，在敲除编码pdhc的基因后，敲除另外两种编码甲酸脱氢酶(fdhf和fdoghi)的基因，对发酵几乎不产生影响，重组菌的发酵效果和单独敲除pdhc基因的重组菌发酵特性相同。只有在敲除编码pdhc的基因后进一步敲除编码特定的甲酸脱氢酶(fdnghi)的基因后，才会出现菌体生长恢复，同时大量积累1，3-pd和ac的效果。
表3：在敲除pdhc后分别敲除三种甲酸脱氢酶基因的效果
实施例4、同时生产1，3-pd和ac，相比生产1，3-pd和2，3-丁二醇更利于产品的分离精制
目前后续产品的精制都是采用精馏工艺，物质之间沸点的差异决定了精馏的成本的高低与高纯度产品获得的难易。1，3-pd、2，3-丁二醇与乙偶姻三个物质的沸点分别为：214、180与148℃，因此同时生产1，3-pd与ac显然要容易分离得多。
图1为1，3-pd与ac，1，3-pd与2，3-丁二醇的气相图谱，可以形象的说明1，3-pd与ac的分离更容易。图中的气相色谱条件为：气相色谱仪型号为上分gc112a，色谱柱是atse-54(30cm×0.53mm×1.0μm)的毛细管柱，使用的检测器为fid氢火焰离子化检测器，载气为氮气，气相色谱设定温度为：柱箱110℃，进样器250℃，检测器250℃。