一种MagnolosideA的提取工艺及其应用的制作方法

本发明属于医药
技术领域：
，具体涉及一种magnolosidea的提取工艺及其应用。
背景技术：
：厚朴（拉丁文名：magnoliaofficinalisrehd.etwils.）属木兰科（magnoliaceae）木兰属（magnolia）植物，包括凹叶厚朴m.officinalissubsp.biloba厚朴（原亚种）m.officinalissubsp.officinalis两个种。中国植物志介绍该植物主要分布于我国南部、东南部以及东北部地区；常见于海拔300-1400米的山区林中。厚朴的各部位均可入药，以树皮为主，为芳香化湿中药，主治：食积气滞；腹胀便秘；湿阻中焦，脘痞吐泻；痰壅气逆；胸满喘咳。现为国家ⅱ级重点保护野生植物。厚朴别名厚皮、重皮、赤朴、烈朴、川朴、紫油厚朴，是中国历史上使用较为传统的一味中药，常用于传统中药方剂中。古籍《伤寒论》中就有记载：大承气汤中以厚朴，具有行气散结，消痞除满的功效，担当佐使的角色；而在半夏厚朴汤中，厚朴主要的功能是下气除满，以散胸中滞气，重在行气，为君药。以上所述足以证明厚朴在中国的传统中药中的份量。现代天然产物研究表明：厚朴中的成分多数为木脂素类和苯乙醇苷类化合物，常见的木脂素类化合物有厚朴酚（magnolol）、异厚朴酚（isomagnolol）、和厚朴酚（honokiol）等含量较高的化合物；苯乙醇苷类化合物主要包括magnolosides系列的化合物。苯乙醇苷类化合物具有广泛的生物活性，而对中药厚朴中苯乙醇苷类化合物的化学成分研究少有报道。magnolosidea是中药材厚朴中的有效成分之一。magnolosidea结构式为：。hasegawatakashi首次报道了从日本厚朴(magnoliaobovata)中分离得到magnolosidea和magnolosideb，并申请了新化合物专利(jp63310899)。其制备步骤如下：日本厚朴用甲醇提取物，混悬于水中，经正丁醇萃取，正丁醇萃取部位反复经硅胶柱层析纯化，最后经hw-40f纯化得到纯品。该方法制备工艺较为复杂，制备周期较长，且没有进行纯度检验。专利cn102391328a公开了同时制备magnolosidea和magnolosideb化学对照品的方法，其中涉及到了magnolosidea的制备，具体为：厚朴干燥树皮8.0kg，粉碎，用4倍量70％乙醇加热回流提取2h，提取3次，浓缩至4l，用4l氯仿萃取3次。水部位经4l的d101大孔树脂分离，5倍柱体积蒸馏水洗脱除杂后，再用5倍柱体积的20％乙醇洗脱，收集20％乙醇洗脱部分，浓缩干燥得棕色浸膏250g。取浸膏50g，用50ml20％甲醇溶解，经微孔滤膜滤过，注入反相中压色谱柱，色谱柱直径5cm，长50cm，色谱柱的填充填料为50μmc18(ymc)，流速控制为100ml/min，检测波长为328nm，流动相梯度为0-100min，11％-35％甲醇-醋酸水(ph＝3)。收集两个主峰，40℃减压旋转浓缩，得到magnolosidea10.5g，magnolosideb7g。反相高压液相制备：取magnolosidea粗品1.5g，溶于10ml20％甲醇水中，经微孔滤膜滤过，吸取1ml滤液经高压反相制备柱分离，柱长度为25cm，内径2cm，流速10ml/min，合理收集主峰得到100mg的magnolosidea，纯度大于98％。吸取5ml滤液经高压反相制备柱分离，柱长度为50cm，内径5cm，流速150ml/min，合理收集主峰得到480mg的magnolosidea，纯度大于98％。外观为淡黄色粉末。该专利中，magnolosidea的提取分离方法较为复杂，且操作繁琐。magnolosidea自1988年在厚朴中被hasegawat等人分离得到之后便很少有人对其进行药理、药动学方面的研究，其在结构上属于苯乙醇苷类化合物，此类化合物具有较为广泛的药理活性；并且厚朴作为一味传统中药来说也具有非常重要的地位，常作为君药或者臣药用于各种汤剂中，用于治疗各种胃肠道实症。magnolosidea作为厚朴中的含量较大的一种苯乙醇苷类化合物，研究其药理活性有相当的必要性。技术实现要素：为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种magnolosidea的提取工艺。本发明的另一目的在于提供了magnolosidea的一种制药用途，即magnolosidea在制备治疗胃溃疡药物中的应用。本发明是通过下述的技术方案来实现的：一种magnolosidea的提取工艺，包括下述的步骤：厚朴干皮，用10倍重量的95%乙醇加热回流提取三次，每次2h，提出后将提取液过滤、合并、减压浓缩后得浸膏；用硅胶拌样，经经石油醚-丙酮洗脱得a部位，经二氯甲烷洗脱得b部位，经二氯甲烷：甲醇（30:1）洗脱得，经二氯甲烷：甲醇（10:1）洗脱得d部位，经纯甲醇洗脱得e部位，将d部位和e部位合并为d′部位，用凝胶分离得d1-d12；d12经制备得到magnolosidea。上述的magnolosidea的提取工艺中，所述硅胶用量为厚朴药材重量的1/5，所述硅胶粒度为200-300目。上述的magnolosidea的提取工艺中，所述凝胶分离为采用凝胶柱sephadexlh-20分离。上述的magnolosidea的提取工艺中，所述d12制备方法为色谱制备，制备液相色谱条件为:先以甲醇/水系统（5%-100%）梯度洗脱30min，其保留时间为14.8min，再用岛津以55%的甲醇/水，流速为7ml•min-1，每次进样150µl，进行制备。上述的magnolosidea在制备治疗胃溃疡药物中的应用。本发明的有益效果在于：（1）本发明提供了一种magnolosidea的简便的提取工艺，通过该工艺提取制备的magnolosidea，其纯度高达98%以上。（2）magnolosidea对乙醇-阿司匹林导致的大鼠胃黏膜损伤具有保护作用，可用于治疗胃溃疡。该用途属于首次公开。附图说明图1为厚朴生药组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部照片。箭头指示为斑点性出血点。图2为和厚朴酚组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部照片。图3为和magnolosidea低剂量组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部照片。箭头指示为些许的出血部位。图4为和magnolosidea高剂量组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部照片。图5为和溃疡组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部照片。箭头指示为严重溃疡区域。图6为和空白组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部照片。箭头指示为严重溃疡区域。图7为厚朴生药组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×40）。图8为厚朴生药组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×100）。图9为和厚朴酚组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×40）。图10为和厚朴酚组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×100）。图11为和厚朴酚组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×200）。图12为magnolosidea低剂量组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×40）。图13为magnolosidea低剂量组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×100）。图14为magnolosidea高剂量组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×40）。图15为magnolosidea高剂量组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×100）。图16为magnolosidea高剂量组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×200）。图17为乙醇-阿司匹林致胃溃疡模型组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×40）。图18为乙醇-阿司匹林致胃溃疡模型组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×100）。图19为空白组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×40）。图20为空白组预防乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×100）。图21为空白组magnolosidea与米索前列醇对大鼠胃溃疡预防效果的比较实验结束后大鼠胃部照片。图22为magnolosidea低剂量组magnolosidea与米索前列醇对大鼠胃溃疡预防效果的比较实验结束后大鼠胃部照片。图23为magnolosidea中剂量组magnolosidea与米索前列醇对大鼠胃溃疡预防效果的比较实验结束后大鼠胃部照片。图24为magnolosidea高剂量组magnolosidea与米索前列醇对大鼠胃溃疡预防效果的比较实验结束后大鼠胃部照片。图25为米索前列醇组magnolosidea与米索前列醇对大鼠胃溃疡预防效果的比较实验结束后大鼠胃部照片。图26为溃疡组magnolosidea与米索前列醇对大鼠胃溃疡预防效果的比较实验结束后大鼠胃部照片。图27为空白对照组magnolosidea与米索前列醇对大鼠胃溃疡预防效果的比较实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×100）。图28为magnolosidea低剂量组magnolosidea与米索前列醇对大鼠胃溃疡预防效果的比较实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×100）。图29为magnolosidea中剂量组magnolosidea与米索前列醇对大鼠胃溃疡预防效果的比较实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×100）。图30为magnolosidea高剂量组magnolosidea与米索前列醇对大鼠胃溃疡预防效果的比较实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×100）。图31为米索前列醇组magnolosidea与米索前列醇对大鼠胃溃疡预防效果的比较实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×100）。图32为溃疡组magnolosidea与米索前列醇对大鼠胃溃疡预防效果的比较实验结束后大鼠胃部光镜照片（he，×100）。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。实施例1magnolosidea提取分离：取原药材厚朴干皮15kg，用95%乙醇先浸润两天，后加热回流提取3次，将提取液减压浓缩后得浸膏1.5kg，加水混悬后用3kg硅胶拌样，完全干燥后上硅胶柱（200-300目）。经石油醚-丙酮洗脱得a部位240g，经二氯甲烷洗脱得b部位130g，经二氯甲烷：甲醇（30:1）洗脱得c部位130g，经二氯甲烷：甲醇（10:1）洗脱得d部位，经纯甲醇洗脱得e部位，后经薄层色谱分析发现d部位与e部位重合性较高，于是合并两部位为d′部位（440g）。d′部位的分离纯化用纯甲醇将d′部位充分溶解后经滤纸过滤，后将滤液置于凝胶柱（sephadexlh-20）上，用纯甲醇缓慢匀速洗脱得12个组分：d1、d2、d3、d4、d5、d6、d7、d8、d9、d10、d11、d12。其中d12经高效液相分析，以甲醇/水系统（5%-100%）梯度洗脱30min，其保留时间为14.8min，且发现其纯度较高。后用岛津以55%的甲醇/水，流速为7ml•min-1，每次进样150µl，进行制备。后经高效液相分析，用面积归一化法得其纯度为98%，得化合物magnolosidea（d12/10.2g）。对化合物d12进行了鉴定，详情如下：鉴定：。黄色无定型粉末（甲醇），esi-msm/z：623[m-h]-，提示相对分子量为624。碳谱数据中低场区化学位移为169.7的碳，该碳可能是一个羰基碳；18.8的为甲基碳；质谱图中325.0打出的二级质谱中出现162.7的碎片峰，推测该化合物中有葡萄糖的存在，结合碳谱中101.7的糖的端基碳的化学位移证实该化合物中有糖的存在；δ116.0-150.5之间有14个高位移的碳的信号峰，推测该化合物中至少有两个苯环存在；该化合物的波谱数据与文献中magnolosided的波谱数据类似，这两个化合物的区别在于结构中的β-d葡萄糖的数据略有不同，与文献数据（100.6，74.8，68.8，68.9，72.8，65.1）相比该化合物的数据（99.3，74.7，72.0，68.0，71.0，61.5）只在个别的数据上大些或是小些，说明该化合物与magnolosided相比其差距主要在连接葡萄糖的位置不同，通过分析发现该化合物的咖啡酰基连接在葡萄糖的3位而不是6位。以上波谱数据与文献报道一致，故鉴定该化合物为magnolosidea。黄色无定型粉末（甲醇），esi-msm/z：623[m-h]+,1h-nmr（600mhz，cd3od）δ7.48(1h,d,1.7hz,h-2ʹʹ),6.98(1h,dd,7.7,1.7hz,h-6ʹʹʹ),6.69(1h,dd,7.7,1.7hz,h-6),6.68(1h,d,15.5hz,h-αʹʹ),6.46(1h,s,h-3ʹ)；13c-nmr(100mhz,cd3od)δ:132.4(c-1),117.4(c-2),145.5(c-3),146.9(c-4),117.9(c-5),122.2(c-6),73.1(α),37.6(β),99.3(c-1ʹ),74.7(c-2ʹ),72.0(c-3ʹ),68.0(c-4ʹ),73.0(c-5ʹ),63.5(c-6ʹ),128.6(c-1"),116.0(c-2"),150.5(c-3"),147.7(c-4"),117.2(c-5"),123.9(c-6"),116.1(α"),148.1(β"),169.7(co),101.7(c-1ʹʹʹ),76.9(c-2ʹʹʹ),72.9(c-3ʹʹʹ),74.6(c-4ʹʹʹ),70.8(c-5ʹʹʹ),17.8(c-6ʹʹʹ)。下面通过药效学实验来进一步说明其药物活性。一、magnolosidea预防大鼠胃溃疡的药理实验1.1实验材料1.1.1实验动物健康雄性sd大鼠60只，体重（190±10）g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，[许可证号：scxk（鲁）2014-0007]。1.1.2试剂阿司匹林（018160392）石药集团欧意药业有限公司无水乙醇天津市化学试剂一厂甲醛莱阳市康德化工有限公司羧甲基纤维素钠（f20100126）国药集团化学试剂有限公司生理盐水magnolosidea自制厚朴提取物自制（制备方法：取原药材厚朴干皮15kg，用95%乙醇先浸润两天，后加热回流提取3次，将提取液减压浓缩后得浸膏1.5kg，即得厚朴提取物）和厚朴酚陕西永源生物技术有限公司（hplc纯度98%）1.1.3试剂配制1.1%羧甲基纤维素钠溶液（cmc-na）：称取1gcmc-na放入100ml容量瓶中加入纯净水至刻度，倒入烧杯中加热搅拌混匀，常温下静置冷却后可使用。2.阿司匹林200mg·kg-1混悬液：阿司匹林用研钵研细后称取2.0g放入100ml容量瓶中，加入1%cmc-na溶液至刻度，充分混匀，现配现用。3.magnolosidea80mg·kg-1（前期预实验确定）溶液：称取160.0mgmagnolosidea加生理盐水溶至20ml的溶液，现配现用。4.magnolosidea160mg·kg-1溶液：称取320.0mgmagnolosidea加生理盐水溶至20ml的溶液，现配现用。5.厚朴提取物10g·kg-1溶液：称取厚朴提取物干燥粉20.0g，加入70%乙醇全部溶解后，减压浓缩至约20ml的药液，现配先用。6.和厚朴酚100mg·kg-1混悬液：称取和厚朴酚200.0mg用研钵研细后混悬于加有1%吐温的20ml生理盐水中，现配现用。1.2实验方法1.2.1实验分组60只sd大鼠随机分成6组，每组10只。第一组为空白对照组：灌胃同等量的生理盐水；第二组为：首日给予无水乙醇1ml·200mg-1单次灌胃后1h给予阿司匹林200mg·kg-1连续灌胃4天致胃溃疡组（按照10ml·kg-1量给予灌胃），每日一次；第三组为：连续灌胃厚朴提取物7天组（按照10ml·kg-1量给予灌胃），每日一次；第四组为：连续灌胃和厚朴酚7天组（按照10ml·kg-1量给予灌胃），每日一次；第五组和第六组：分别给予magnolosidea80mg·kg-1和160mg·kg-1连续灌胃7天（按照10ml·kg-1量给予灌胃），每日一次；所有组别每次灌胃前12h禁食不禁水。造模期间：除模型组以及空白对照组以外其余各组在造模前1h给予各药品，1h后再给予阿司匹林；空白对照组在相同时间给予同等量的生理盐水；模型组则在造模前1h给予同等量的生理盐水。所有组别的大鼠均在最后一次灌胃前24h禁食，自由饮水，最后一次灌胃后4h将大鼠脱颈处死，解剖，取胃，用10%甲醛5ml固定15min后沿胃大弯剪开，用生理盐水洗净，观察胃黏膜有无损伤，纪录出血点数，糜烂斑点数，胃黏膜伤口程度，按照guth计数法计算胃溃疡指数（ulcerindex，ui）。并采集标本，制作病理切片，于光镜下观察胃黏膜的病理性改变。1.2.2胃溃疡模型的制备方法参照贡联兵临床合理用药系列讲座(7)抗感冒药物临床合理应用[j].人民军医,2009(1).中制备胃溃疡模型的方法建立乙醇-阿司匹林型胃溃疡：sd大鼠与每次灌胃前禁食12h，自由饮水，第一天灌胃时先灌胃无水乙醇（1ml·200mg-1），灌胃后1h再灌胃阿司匹林（200mg·kg-1），之后连续灌胃4天同等剂量的阿司匹林，每日一次。最后一次灌胃阿司匹林后禁食24h，脱颈处死，解剖，取胃，观察并采集标本。1.2.3胃溃疡指数的计算方法以及he染色下的光镜观察1.guth计数法：斑点，糜烂记作1分，糜烂长度<1mm记作2分，1-2mm记作3分，2-4mm记作4分，>4mm记作5分，最后合计每只sd大鼠的总分为该大鼠的胃溃疡指数。2.he染色下光镜观察：剪取胃窦组织约1.0cm×0.5cm（包括溃疡部分），放入4%多聚甲醛中固定3天，常规脱水，石蜡包埋，切片前将组织石蜡块放入清水中置-20℃冰箱中放30min，后取出，切取约4µm后的胃组织切片，在含有酒精的48℃清水中展开，用载玻片捞起烤片，之后进行he染色，观察各组大鼠的胃黏膜组织的病理学上的改变。按照以下步骤进行染色操作：（1）烤片：载玻片捞起组织切片后，60℃烤片过夜（2）脱蜡至水：将烤好的切片放在载玻片架上，依次放入二甲苯i中10min，二甲苯ii中10min，二甲苯iii中10min，二甲苯iv中10min，100%乙醇i中5min，100%乙醇ii中5min，95%乙醇5min，90%乙醇5min，85%乙醇5min，水中浸洗5min。（3）苏木精染色：5min。（4）流水稍洗去苏木精3s，放入1%盐酸乙醇中3s，稍水洗10s，蒸馏水洗10s。（5）0.5%伊红染色液3min，蒸馏水清洗2s，80%乙醇清洗2s。（6）依次放入80%乙醇1-2s，95%乙醇i2-3s，95%乙醇ii3-5s，无水乙醇5-10min。（7）二甲苯透明3次，每次5min，用中性树胶封片。最后在光学显微镜下观察各组胃黏膜组织学以及病理学形态的变化，并比较各组与溃疡组的差异。1.2.4数据处理及分析实验数据用spss17.0统计学软件进行分析统计：各组间的比较先进行两组完全随机设计资料的方差齐性检验，若方差齐性则进行完全随机设计两总体均数比较的t检验，若方差不齐则进行近似t检验。p<0.05即有统计学意义，则证明两组之间的效果差异有显著性，p<0.01表示差别有高度显著性。1.3实验结果1.1.1表观观察1.厚朴生药组：实验结束后发现该组的大鼠胃黏膜及粘膜皱襞正常，未见糜烂、溃疡，只有如图所示的少许斑点性出血。见附图1。2.和厚朴酚组：连续给药一周后造模5天，发现该组大鼠的胃黏膜表面光滑，无伤口，且发现皱襞正常，未见糜烂、出血和溃疡。见附图2。1.magnolosidea低剂量组：在该组的大鼠胃内发现有白色斑点形状的糜烂，且有些许的部位有出血情况，见附图3。4.magnolosidea高剂量组：胃黏膜表面平整光滑，未见糜烂、出血和溃疡。见附图4。5.溃疡组：该组大鼠胃黏膜出血严重，且糜烂较严重，有椭圆形的溃疡生成，中心呈白色，周围粘膜水肿或是充血，直径约0.3-0.5cm。见附图5。6.空白组：该组的大鼠胃黏膜及粘膜皱襞正常，未见糜烂、溃疡。见附图6。1.1.2光镜观察1.厚朴生药组：照片见附图7和附图8。生药组大鼠胃黏膜固有层血管扩张、充血。未见上皮细胞变性坏死。2.和厚朴酚组：照片见附图9、10、11。发现浅层上皮细胞变性、坏死。3.magnolosidea低剂量组：照片见附图12、13。浅层上皮细胞变性、坏死。4.magnolosidea高剂量组：照片见附图14、15、16。浅层上皮细胞变性、坏死。5.乙醇-阿司匹林致胃溃疡模型组：照片见附图17、18。黏膜腺体消失，黏膜面表层见大量渗出物及坏死组织，其下为肉芽组织，伴大量炎细胞浸润。溃疡处黏膜腺体消失，粘膜层及黏膜下层均以肉芽组织代替，伴大量炎细胞浸润。6.空白组：照片见附图19、20。空白对照组胃黏膜为单层柱状上皮，固有层结缔组织中充满胃底腺，未见上皮细胞变性、坏死。1.1.3各个给药组对乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡预防作用的评价采用统计学软件spss17.0对实验数据进行统计学分析：空白对照组大鼠未发生胃溃疡，和厚朴酚组、生药组以及magnolosidea组的胃溃疡指数（ui）与空白组相比均呈现显著增加，并且各组与空白组的差异均有统计学意义（p＜0.01）；溃疡组发生了明显的溃疡灶，与溃疡组相比较生药组、和厚朴酚组以及magnolosidea低剂量、高剂量组的胃溃疡指数（ui）有所降低，且差异具有统计学意义（p＜0.05）；其具体数据以及评价结果详见表1。表1各个给药组对大鼠胃溃疡指数（ui）的影响（`x±s）组别例数（只）ui空白对照组100.00##生药组105.25±1.49**##和厚朴酚组107.00±2.45**#magnolosidea低剂量组107.25±2.44**#magnolosidea高剂量组107.00±1.41**#溃疡组1015.71±2.14**与空白组相比p＜0.05“*”，p＜0.01“**”；与溃疡组相比p＜0.05“#”，p＜0.01“##”二、magnolosidea与米索前列醇对大鼠胃溃疡预防效果的比较2.1实验材料2.1.1实验动物健康雄性sd大鼠60只，体重（190±10）g，购于济南朋悦实验动物繁育有限公司，[许可证号：scxk（鲁）2014-0007]。2.1.2试剂阿司匹林（018160392）石药集团欧意药业有限公司无水乙醇天津市化学试剂一厂甲醛莱阳市康德化工有限公司羧甲基纤维素钠（f20100126）国药集团化学试剂有限公司生理盐水magnolosidea自制米索前列醇（161102）湖北葛店人福药业有限责任公司2.1.3试剂配制1.1%羧甲基纤维素钠溶液（cmc-na）：称取1.0gcmc-na放入100ml容量瓶中加入纯净水至刻度，倒入烧杯中加热搅拌混匀，常温下静置冷却后可使用。2.阿司匹林200mg•kg-1混悬液：阿司匹林用研钵研细后称取2.0g放入100ml容量瓶中，加入1%cmc-na溶液至刻度，充分混匀，现配现用。3.magnolosidea40mg•kg-1溶液：称取80.0mgmagnolosidea加生理盐水溶至20ml的溶液，现配现用。4.magnolosidea80mg•kg-1溶液：称取160.0mgmagnolosidea加生理盐水溶至20ml的溶液，现配现用。5.magnolosidea160mg•kg-1溶液：称取320.0mgmagnolosidea加生理盐水溶至20ml的溶液，现配现用。6.米索前列醇0.1mg•kg-1溶液：称取0.2mg米索前列醇研细后的粉末，加入1%的cmc-na溶液配制成20ml的溶液，现配现用。2.2实验方法2.2.1实验分组60只sd大鼠随机分成6组，每组10只。第一组为空白对照组：灌胃同等量的生理盐水；第二组为：首日给予无水乙醇1ml•200mg-1单次灌胃后1h给予阿司匹林200mg•kg-1连续灌胃4天致胃溃疡组（按照10ml•kg-1量给予灌胃），每日一次；第三组为：连续灌胃magnolosidea40mg•kg-17天组（按照10ml•kg-1量给予灌胃），每日一次；第四组为：连续灌胃magnolosidea80mg•kg-17天组（按照10ml•kg-1量给予灌胃），每日一次；第五组为：连续灌胃magnolosidea160mg•kg-17天组（按照10ml•kg-1量给予灌胃），第六组为：连续灌胃米索前列醇0.1mg•kg-17天组（按照10ml•kg-1量给予灌胃），每日一次；所有组别每次灌胃前12h禁食不禁水。造模期间：除模型组以及空白对照组以外其余各组在造模前1h给予各药品，1h后再给予阿司匹林；空白对照组在相同时间给予同等量的生理盐水；模型组则在造模前1h给予同等量的生理盐水。所有组别的大鼠均在最后一次灌胃前24h禁食，自由饮水，最后一次灌胃后4h将大鼠脱颈处死，解剖，取胃，用10%甲醛5ml固定15min后沿胃大弯剪开，用生理盐水洗净，观察胃黏膜有无损伤，纪录出血点数，糜烂斑点数，胃黏膜伤口程度，按照guth计数法计算胃溃疡指数（ulcerindex，ui）。并采集标本，制作病理切片，于光镜下观察胃黏膜的病理性改变。2.2.2溃疡模型制备方法以及大鼠胃黏膜损伤评价标准均按照第一部分进行2.3实验结果2.3.1表观观察1.空白对照组：照片见附图21。2.magnolosidea低剂量组：照片见附图22。表面观察发现该组大鼠胃黏膜表面有部分面积出现出血现象，且有1-2mm的伤口出现。3.magnolosidea中剂量组：该组大鼠胃黏膜表面有少量出血点出现，其余胃黏膜表面较为光滑，未见伤口出现。照片见附图23。4.magnolosidea高剂量组：照片见附图24。该组大鼠胃黏膜表面有些许出血点，胃黏膜表面光滑，未发现糜烂。5.米索前列醇组：照片见附图25。胃黏膜表面只有零星的出血点出现，未发现糜烂、伤口。6.溃疡组：照片见附图26。该组大鼠胃黏膜表面出血较严重，糜烂，且伤口较长（一般约为2-4mm，也见大于4mm的伤口），面积广（见于大部分的胃黏膜表面），伤口较深。2.3.2光镜观察1.空白对照组：未见明显异常。2.magnolosidea低剂量组：胃黏膜上皮细胞明显变性坏死，局部凹陷，黏膜下层血管充血出血、高度水肿，有大量炎细胞浸润。3.magnolosidea中剂量组：粘膜层少量出血。4.magnolosidea高剂量组：未见明显异常。5.米索前列醇组：未见明显异常。溃疡组：胃粘膜下层、肌层大量出血，局灶胃黏膜上皮细胞变性坏死，少量炎细胞浸润。2.3.3各给药组对乙醇-阿司匹林致大鼠胃溃疡预防作用的评价采用统计学软件spss17.0对实验数据进行统计学分析：空白对照组大鼠未发生胃溃疡，magnolosidea低剂量组、magnolosidea中剂量组、magnolosidea高剂量组以及米索前列醇组的胃溃疡指数（ui）与空白组相比均呈现显著增加，并且各组与空白组的差异均有统计学意义（p＜0.01）；溃疡组发生了明显的溃疡灶，与溃疡组相比较生药组、和厚朴酚组以及magnolosidea低剂量、高剂量组的胃溃疡指数（ui）有所降低，且差异具有统计学意义（p＜0.05）；其具体数据以及评价结果详见表2。表2各个给药组对大鼠胃溃疡指数（ui）的影响（`x±s）组别例数（只）ui空白组90##magnolosidea低剂量组917.67±2.60**##magnolosidea中剂量组98.78±2.33**##magnolosidea高剂量组98.33±1.57**##米索前列醇组92.33±1.32**##溃疡组926.22±4.71**与空白组相比p＜0.05“*”，p＜0.01“**”；与溃疡组相比p＜0.05“#”，p＜0.01“##”各个组大鼠的ui显示：各个组的ui与溃疡组相比均有显著性差异；米索前列醇能较显著的降低大鼠胃溃疡指数；magnolosidea高剂量组与米索前列醇组的ui相比较p＜0.01即存在显著性差异，证明magnolosidea在乙醇-阿司匹林所致大鼠胃溃疡中降低ui的能力远低于米索前列醇。阿司匹林作为一种常用的非甾体类抗炎药（nsaids），又名乙酰水杨酸，具有良好的解热阵痛作用，主要用于治疗感冒、发热、头痛、牙痛、关节痛、风湿病，除此之外还能抑制血小板聚集，上世纪后期发现其可用于预防和治疗缺血性心脏病、心绞痛、心肺梗塞、脑血栓形成，应用于血管形成术及旁路移植术也有效，故俗称其为“万灵药”。阿司匹林自从其问世至今仍是临床上应用最为广泛的抗炎镇痛药，通常也用作其他药物评价的标准制剂；至今已逾百年的历史。当今时代，随着人民生活水平不断提高，心脑血管疾病日趋年轻化，阿司匹林成为现代中老年人群中的预防和治疗心脑血管疾病的常用药之一，研究其不良反应并且采取对应的措施显得尤为重要。查阅文献可知阿司匹林常见不良反应为胃肠道系统功能紊乱，表现为：恶心、呕吐、腹痛，长期大剂量服用后可引起胃炎、隐性出血、加重胃溃疡形成和消化道出血等。nsaids引发消化性溃疡常发生在胃和十二指肠，其机制为：传统nsaids的抗炎作用是通过抑制环氧合酶（cox-2）实现的,而不良反应则是抑制环氧合酶（cox-1）的结果。胃肠的cox-1被抑制,导致前列腺素（pgs）合成减少,黏膜屏障功能破坏,在胃酸等损害因子作用下,发生溃疡。本实验所用制造胃溃疡模型的方法则是先用乙醇直接刺激大鼠胃黏膜导致急性胃黏膜损伤，此时平常不表达或表达量很少的cox-2将会被诱导发生表达迅速上调而占优势，进而合成前列腺素（pge2）以发挥维持黏膜完整性和促进愈合的作用；而紧接着给予大鼠的阿司匹林则是抑制了大鼠胃黏膜损伤区高表达的cox-2的活性而阻碍了pge2的合成，从而使得大鼠胃黏膜损伤的愈合延缓并加重其损伤，最终保证了实验模型的溃疡效果。本实验第一部分通过上述方法建立大鼠胃溃疡模型，并初步研究了magnolosidea对于乙醇-阿司匹林引起的大鼠慢性胃溃疡是否具有预防作用。实验结果表明：用该方法成功制作了大鼠胃溃疡模型。在对大鼠胃黏膜表面进行直观的观察之后发现：空白对照组的大鼠胃黏膜表面没有发现任何的糜烂、出血，没有溃疡灶形成；厚朴生药组大鼠胃粘膜表面有少量的出血性斑点出现，未出现溃疡；和厚朴酚组以及magnolosidea高剂量组大鼠胃黏膜表面光滑，胃壁无褶皱；magnolosidea低剂量组大鼠胃黏膜出现白色斑点性糜烂；溃疡组大鼠胃黏膜出血严重，且糜烂较严重，有椭圆形的溃疡生成，中心呈白色，周围粘膜水肿或是充血，直径约0.3-0.5cm。通过ui发现magnolosidea可降低ui，且高剂量一组稍显明显，结果显示magnolosidea对胃黏膜具有一定的保护作用。通过对大鼠胃组织进行he染色后的病理学观察发现：空白对照组胃黏膜为单层柱状上皮，固有层结缔组织中充满胃底腺，未见上皮细胞变性、坏死；生药组胃黏膜固有层细胞扩张、充血，但未发现细胞坏死；和厚朴酚组以及magnolosidea低、高剂量组的大鼠胃黏膜只发现浅层上皮细胞变性、坏死；溃疡处黏膜腺体消失，粘膜层及黏膜下层均以肉芽组织代替，伴大量炎细胞浸润。实验二考察了magnolosidea和米索前列醇对乙醇-阿司匹林致胃溃疡大鼠胃黏膜损伤的保护作用，并对其进行了比较。直观观察大鼠胃黏膜表面发现：溃疡组的大鼠胃黏膜出现明显的损伤，模型制作成功；magnolosidea低剂量组的大鼠胃黏膜也有大面积的出血，且伴有糜烂，但相对于溃疡组较轻；magnolosidea中剂量组和高剂量组的大鼠胃黏膜表面只有少许的出血点出现，胃黏膜较为光滑，未见溃疡形成；米索前列醇组的大鼠胃黏膜表面完整，有少许出血点见于几只大鼠，未见溃疡形成。通过ui发现：各个组的ui与溃疡组相比均有显著性差异；米索前列醇能较显著的降低大鼠胃溃疡指数；magnolosidea高剂量组与米索前列醇组的ui相比较p＜0.01即存在显著性差异，证明magnolosidea在乙醇-阿司匹林所致大鼠胃溃疡中降低ui的能力远低于米索前列醇。综上所述magnolosidea对乙醇-阿司匹林导致的大鼠胃黏膜损伤具有一定的保护作用，可用于治疗胃溃疡。当前第1页12